第一篇：基因工程

基因工程

添加時間：2008.10.29 | 作者：admin

基因工程實驗注意事項

1． 上實驗課的學生每三人分為一個小組。

2． 課前要預(yù)習實驗內(nèi)容，弄懂實驗設(shè)計的原理，理清實驗順序。認真制定實驗方案（沒有方案或方案不合理者不能進入實驗操作）。

3． 實驗指導(dǎo)中所寫的實驗

一、實驗二等并非嚴格的實驗順序，只是提供一種相關(guān)的實驗操作技術(shù)。各小組學生應(yīng)根據(jù)整體的實驗策略制定自己的實驗順序和計劃。

4． 由于實驗內(nèi)容多，時間短，多數(shù)實驗需要同時或穿插進行，一定要做好統(tǒng)籌安排。

5． 本實驗課中的所有單項實驗都屬于一個整體流程。實驗時間安排上沒有上下午晚上等嚴格的作息安排，一切服從實驗進度，必須在兩周之內(nèi)完成。

6． 實驗的每一步都要詳細地記錄操作內(nèi)容、時間、步驟、結(jié)果等，以備查詢！

7． 對任何自己不熟悉的實驗儀器都不要隨意操作（尤其是微量移液器和離心機?。Ｔ诓僮鞯倪^程中發(fā)現(xiàn)任何意外的現(xiàn)象都要及時向任課教師匯報。

8． 寫作實驗報告和實驗論文一定要文理通順、邏輯清晰、圖表說明詳細，討論分析透徹（包括操作的錯誤）。

9． 在實驗室內(nèi)不能大聲喧嘩。

10．在實驗的過程中制造的任何垃圾都要丟到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），嚴禁隨地投棄！特別注意對廢棄細菌的殺滅和有毒垃圾的定點投放。

11．實驗結(jié)束后要把用過的器皿清洗后歸放整齊并清點數(shù)目，向教師匯報征得同意后方可離開實驗室。12．值日組的同學最后離開，等待清掃實驗室的衛(wèi)生，關(guān)閉門窗水電。13．實驗時損壞的任何物品都要及時申報。

實驗流程參考圖

PCR擴增CHI

制備感受態(tài)菌XL1-Blue

提質(zhì)粒pBS-CHI，Pinpoint?xa-3 11ppMD18-TppMD18-T

EcoRV+BamHI酶切

與pUCm-T連接

轉(zhuǎn)化XL1-Blue

篩選鑒定

提重組質(zhì)粒pUCm-T-CHI

回收Pinpoint?xa-3

EcoRV+BamHI酶切

回收CHI片段

重組質(zhì)粒Pinpoint?xa-3-CHI

IPTG誘導(dǎo)表達

SDS-PAGE檢測

轉(zhuǎn)化XL1-Blue

與Pinpoint?xa-3連接

Pinpoint?xa-3

pBS-CHI

XL1-Blue

XL1-Blue BL21（DE3）

篩選鑒定

提重組質(zhì)粒Pinpoint?xa-3-CHI

轉(zhuǎn)化XL1-Blue

重組質(zhì)粒pUCm-T-CHI

第一部分質(zhì)粒DNA的提取和酶切電泳鑒定

實驗一 質(zhì)粒DNA的小量制備

1．目的

學會最常用的小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解方法。2．原理

根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性DNA在拓撲學上的差異來分離。在pH12.0~12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性。盡管在這項的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會變性，但兩條互補鏈彼此互相盤繞，仍會緊密結(jié)合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，經(jīng)過離心與蛋白質(zhì)和大分子RNA一起沉淀下去。3．器材

超凈工作臺，接種環(huán)，酒精燈，臺式離心機，旋渦混合器，微量移液取樣器，1.5ml微量離心管，恒溫搖床，搖菌試管，雙面微量離心管架，試管架，標簽紙，磁力攪拌器等。4．試劑

Pinpoint?xa-3質(zhì)粒載體菌，pBS-CHI載體菌，LB培養(yǎng)基1000ml（含100μg/ml氨芐青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I），NaOH/SDS溶液(溶液 II)，KAc溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙醇，TE buffer（pH8.0）。5．實驗準備

氨芐青霉素儲存液（無菌水配制5mg/ml，分裝后-20°C保存），配制LB培養(yǎng)基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g加200ml ddH2O 攪拌完全溶解，用約200ml 5N NaOH調(diào)pH至7.0，加ddH2O至1L，121°C 20min滅菌）；溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA pH8.0）；溶液II（0.2mol/L NaOH，1% SDS）；溶液III（60ml 5mol/L Kac，加冰乙酸調(diào)pH4.8，補dd H2O至100ml），75%乙醇（-20°C保存），TE buffer（10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0）；10mg /ml RNase A（RNA酶A溶于10mmol/L Tris HCl pH7.5，15mmol/L NaCl中）；搖菌試管洗凈并蓋上棉塞、1.5ml離心管裝入鋁制飯盒、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒，一起高壓滅菌（121°C 30min）。6．操作步驟

（1）在超凈工作臺中取5ml LB（Amp），加入滅菌的搖菌試管中。

（2）從超低溫冰箱中取出保存Pinpoint?xa-3載體的菌種和pBS-CHI的菌種（操作完后迅速把菌種放回超低溫冰柜中，切不可將菌融化！），在超凈工作臺上用燒紅的接種環(huán)刮一下，再把接種環(huán)于無菌LB培養(yǎng)液（含100μg/ml氨芐青霉素）中攪拌一下，37°C搖床中搖12~16h。

Pinpoint?xa-3菌： 接種于5ml LB（Amp）； pBS-CHI菌：接種于2ml LB（Amp）。（3）取1.5ml的菌液于1.5ml離心管中，15000rpm離心1min，棄上清液（盡量棄干凈），留沉淀備用。

Pinpoint?xa-3菌：3管（3×1.5ml）； pBS-CHI菌：1管（1.5ml）。

（4）在沉淀中加入100μl 溶液I，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置5min。（等待的同時，取一個塑料盒，裝上適量的冰塊備用。）

（5）加入200μl 溶液II，蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min。（6）加入150μl 溶液III，蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min。

（7）15000rpm離心5min，小心吸取400μl 上清液于另一個干凈的1.5ml離心管中，（不要將白色沉淀物帶入?。尤?00μl 無水乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置5min。（8）15000rpm離心10 min，小心棄掉上清液，加入500μl 75%乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。15000rpm離心10 min，小心棄掉上清液，盡量倒置棄干凈。

（9）再加入500μl 75% 乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。15000rpm離心10 min，小心棄掉上清液，盡量倒置棄干凈。

（10）離心管倒置于37°C培養(yǎng)箱中（或室溫）空氣干燥。（管底的沉淀質(zhì)粒DNA用肉眼幾乎看不見?。?。（11）pBS-CHI加入30μl 無菌蒸餾水或TE緩沖液； 3管質(zhì)粒中每管加入10μl蒸餾水混勻后收集到一個管中，渦旋混合器上混勻，在離心機中瞬時轉(zhuǎn)一下，使溶液集中在管底。待電泳確認（見實驗二）后再在Pinpoint?xa-3質(zhì)粒中加入1μl RNaes A。用記號筆標記后放入冰箱中備用。

r

r

r（12）清理桌面，清洗儀器，撰寫實驗報告。7．思考

（1）影響本實驗結(jié)果的因素有哪些？

實驗二 質(zhì)粒DNA電泳鑒定

1．目的

學會常用的DNA瓊脂糖凝膠電泳、。2．原理

DNA雙螺旋分子骨架兩側(cè)帶有含負電荷的磷酸根，在電場中會向正極方向移動。不同長度的DNA由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同，表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開。3．器材

電泳儀，水平凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊，250ml三角瓶，微波爐，臺式離心機，旋渦混合器，凝膠成像系統(tǒng)，分光光度計，微量移液取樣器，1.5ml離心管，雙面微量離心管架，試管架等。4．試劑

Pinpoint?xa-3質(zhì)粒，pBS-CHI載體，TAE電泳緩沖液，熒光染料，電泳級瓊脂糖粉，10′加樣緩沖液（或6′加樣緩沖液），DNA分子量標準（DL2000）。5．實驗準備

配制TAE電泳緩沖液（50′儲存液，pH約8.5：Tris堿 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，ddH2O 定容至1L），10′加樣緩沖液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚藍）；6′加樣緩沖液（0.25%溴酚藍，40%蔗糖水溶液）；1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）。6．操作步驟

（1）稱取0.5g瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE電泳緩沖液(1′)，放入微波爐中燒開（1min）。50ml 正好倒兩塊小膠。（2）注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停止微波爐（切不可讓膠溶液溢出到微波爐中！）。（3）戴上線手套，從微波爐中取出三角瓶，置桌面上冷卻致不燙手（約50~60°C）。

（4）把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至與模具的矮邊緣相平即可，不要把膠溶液溢到外面。在桌面上靜置10~20分鐘待膠完全凝固。（剩下的膠溶液封口后留待以后再熔化使用）。

（5）在水平電泳槽中加滿1′TAE電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至170V(10V/cm)，注意正負電極的位置連接正確。

（6）待膠完全凝固后（15~20分鐘），小心拔出梳子。用手指捏住模具兩側(cè)的高邊緣取出模具和凝膠放入電泳槽中間的平臺上，凝膠要沒入電泳液中。凝膠上有樣品孔的一側(cè)要朝向電泳槽的負極。（7）剪1片光面紙（或封口膜），點6μl蒸餾水、1μl 10′加樣緩沖液，再加入3μl質(zhì)粒DNA溶液制成10μl DNA樣品。

（8）在凝膠上選擇相鄰的加樣孔。用10μl的吸液頭分別將管中的樣品加入凝膠的加樣孔中（如果需要時，在相鄰的加樣孔中加入1.5-3μl DNA分子量標準物）。加樣時持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住這只手的手腕，以減少移液器的抖動。看到藍色的樣品吸管尖頭伸進加樣孔后（不能伸得太深，以免穿破凝膠的底部）緩緩將藍色的樣品壓入加樣孔中。切不可使藍色樣品流到孔外。

（9）打開電源開關(guān)，樣品將形成一條藍色的橫帶向前移動（如果發(fā)現(xiàn)藍色向后移動，立即關(guān)閉電源，調(diào)換電極）。電泳將進行約30分鐘。

（10）當藍色的溴酚藍遷移到距凝膠邊緣1cm時，關(guān)閉電源。取出模具和凝膠。（11）把凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

（12）清理桌面垃圾，清洗實驗儀器，撰寫實驗報告。7．思考

（1）泳道中的質(zhì)粒DNA有幾條帶？為什么？（2）溴酚藍的遷移率相當于多少bp的DNA?（3）影響本實驗結(jié)果的因素有哪些？

實驗三 質(zhì)粒DNA的酶切

1．目的

學會用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA。2．原理

II型限制性內(nèi)切酶能識別雙鏈DNA內(nèi)部的特殊序列并在識別位點處將雙鏈切斷，形成粘性末端或齊平末端，通過電泳酶切后的DNA混合物能夠確認和分離酶切片段。3．器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml微量離心管，雙面微量離心管架，水漂，恒溫水浴。4．試劑

Pinpoint?xa-3質(zhì)粒，EcoR V，BamH I，內(nèi)切酶緩沖液（10×），10×電泳加樣緩沖液，熒光染料。5．實驗準備

配制TAE電泳緩沖液（50′儲存液），10′加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）。6．操作步驟

（1）混合下列溶液于一個無菌的1.5ml微量離心管中： Pinpoint?xa-3 DNA(或pUCm-T-CHI)6 μl 10×酶切緩沖液（用EcoRV的緩沖液）μl ddH2O 30 μl EcoRV 1μl BamHI 1μl 總體積 40μl

（2）先準備一個冰盒并放入一定量的冰塊。從-20℃冰柜中取出限制性內(nèi)切酶，立即插入冰塊中。（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部（以免手指的給酶液加溫），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 μl限制性內(nèi)切酶。（4）在酶切樣品混合液中加入限制性內(nèi)切酶后（立即把內(nèi)切酶原液送回冰柜?。p輕震動微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機中1000rpm離心10秒。取出后插到水漂的孔中，在推薦的最適酶切溫度水浴中溫育1~3 h（一般是 37℃）。

（5）酶切后取少量酶切產(chǎn)物與合適的已知分子量的DNA（如先前的PCR產(chǎn)物）對比電泳，以確認切下的片斷是否為自己想要的片斷。

（6）酶切后的質(zhì)?？梢曰厥諅溆茫ㄒ妼嶒灹簭沫傊悄z中回收DNA片段）。（7）清理桌面垃圾，清洗實驗儀器。撰寫實驗報告。7．思考

（1）酶切反應(yīng)混合物的體積是否對酶切效果有影響？為什么？

（2）如何估計DNA用量和酶的用量？

（3）在吸取內(nèi)切酶的時候如何操作才能避免浪費？

第二部分 目的基因的獲得和重組載體的構(gòu)建

實驗四 PCR擴增制備目的基因

1．目的

學會PCR操作的基本技術(shù)。2．原理

是將待擴增的DNA模板加熱變性，與其兩側(cè)互補的寡聚核苷酸引物復(fù)性，然后經(jīng)過耐熱的DNA聚合酶延伸。再進入下一輪變性—復(fù)性—延伸的循環(huán)，n次循環(huán)后DNA可被擴增（1+X）倍。其中<25nt的引物退火溫度Tm=2（A+T）+4（G+C）。3．器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，0.2ml PCR微量管，雙面微量離心管架，PCR儀，臺式離心機，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，水漂，恒溫水浴。4．試劑

n 5U/μl Taq DNA聚合酶，PCR緩沖液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板質(zhì)粒pBS-CHI，無菌ddH2O。5．實驗準備

dNTP混合液（每種25mM），TAE電泳緩沖液，熒光染料，10′加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）。

合成的引物：Sense primer 5＇-GGATCCACAATGATGAGAGCC-３＇

Antisense primer ５＇-GATATCATGGTGAGGTAGCTAGCTT-３＇

目的基因模板質(zhì)粒：已經(jīng)克隆在pBS載體上的1128bp幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）基因。

待擴增的CHI片段長度：996bp。6．操作步驟

（1）在0.2ml PCR 微量離心管中配制50μl反應(yīng)體系。（以下加樣量供參考，括號內(nèi)是最終需要量，實驗時需參照Taq酶說明書計算）

ddH2O 32μl

10×PCR buffer（不含MgCl2）

5μl

25mM MgCl2 3μl

2.5mmol/L dNTP 4μl（每種dNTP終濃度0.2mM）

10μmol/L Primer1 2μl（12.5~25pmoles）

10μmol/L primer2 2μl（12.5~25pmoles）

模板質(zhì)粒 1μl（1×10pmoles）

5U/μl Taq酶 1μl（5U）

總體積

50μl

（2）根據(jù)廠商的操作手冊設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序：

-3 ① 94℃ 5min ② 94℃ 1min ③ 54℃ 1min ④ 72℃ 1min50s ⑤ goto② 29 times ⑥ 72℃ 10min（3）PCR結(jié)束后，取10μl產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。觀察膠上是否有預(yù)計的主要產(chǎn)物帶。（4）清理桌面，撰寫實驗報告。

（5）PCR產(chǎn)物可以直接與T載體連接（見實驗五），然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞（見實驗八）。7．思考

（1）復(fù)性溫度如何確定？

（2）為什么要在最后延伸10min？

（3）是否有非特異性擴增產(chǎn)物（或引物二聚體），如何才能消除？

實驗五 目的基因片段與載體連接

1．目的

學會DNA片段的體外連接技術(shù)。2．原理

在Mg和ATP存在下，T4 DNA連接酶能催化載體分子的粘性末端與外源DNA的相同粘性末端聯(lián)接成重組DNA分子。3．器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式離心機，干式恒溫氣浴。2+4．試劑

pUCm-T 載體，Pinpoint?xa-3酶切載體，CHI插入片斷，T4 DNA 連接酶，連接酶緩沖液，無菌ddH2O。

5．實驗準備

1.5ml離心管裝入飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）；平板培養(yǎng)基（含Amp）。6．操作步驟

1）PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體直接連接：

（1）事先將干式恒溫儀（或冰盒里的水）溫度設(shè)定在14～16°C。（2）取一個滅菌的0.2ml微量離心管，加入： 4μl PCR 產(chǎn)物混合液 1μl pUCm-T載體

0.5μl T4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul）1μl 連接酶緩沖液 3.5μl ddH2O 總量 10μl 體系

（3）上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于16°C水中保溫過夜。（4）連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞或置4°C冰箱備用。

2）DNA回收片斷（CHI）與載體（Pinpoint?xa-3）連接：（1）取一個滅菌的0.2ml微量離心管，加入 4μl 回收DNA片斷 1μl 酶切后回收的載體

0.5μl T4 DNA連接酶（TAKARA, 350U/ul）1μl 連接酶緩沖液 3.5μl ddH2O 總量 10μl 體系

（2）上述混合液輕輕震蕩后再短暫離心，然后置于16°C干式恒溫儀（或16°C水中）中保溫過夜。（3）連接后的產(chǎn)物可以立即用來轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞或置4°C冰箱備用。7．思考

（1）連接酶的最適溫度室多少？

（2）為什么要采用16°C下連接？

（3）如何確定插入片段的用量與質(zhì)粒載體的用量？

實驗六 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段

1．目的

學會從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的基本技術(shù)。2．原理

限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片斷經(jīng)過電泳后，按分子量大小被分開，排列在瓊脂糖凝膠中，可以將特定的某條DNA帶所在的凝膠切下來，加熱或用特殊的試劑熔解凝膠，使DNA溶回到溶液中，再經(jīng)過乙醇沉淀或過柱即可獲得目的DNA酶切片段。3．器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式離心機，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，微波爐，水漂，恒溫水浴。4．試劑

電泳緩沖液，熒光染料，電泳級瓊脂糖粉，10′加樣緩沖液，DNA分子量標準（DL2000），DNA凝膠回收試劑盒。5．實驗準備

配制TAE電泳緩沖液（10′儲存液），10′加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）； 6．操作步驟（1）用1′TAE配制1%瓊脂糖凝膠。DNA用合適的酶切。

（2）在膠上選定兩個加樣孔，分別加入少量（10μl）和大量（50μl）DNA酶切產(chǎn)物，電泳。

（3）電泳結(jié)束后用刀片切下含有少量DNA酶切產(chǎn)物的泳道（一般選擇位于凝膠的邊緣），在紫外燈下找到目的DNA帶，用刀片切在帶的下上下邊緣各切一個小口作為標記。注意：含有大量DNA酶切產(chǎn)物的凝膠既不用加熒光染料，也不用紫外燈照射！

（4）將做好標記的凝膠條與未染色的凝膠原位對齊，根據(jù)小膠條上的標記估計未染色的大膠上DNA酶切產(chǎn)物的位置，用刀片切下大膠中DNA產(chǎn)物所在的凝膠（盡量不要多余的凝膠），轉(zhuǎn)移至一個稱量過的干凈的1.5ml微量離心管中。再稱量后計算出膠的重量。

（5）按照北京鼎國生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DNA快速純化/回收試劑盒操作說明，純化回收目的片段。純化/回收試劑盒組成：

溶液A：6M NaClO4，0.03M NaAc，pH5.2，少量酚紅；

溶液B：3M NaAc；

溶液C：用時加入35ml無水乙醇；

溶液D：TE緩沖液。膠回收步驟如下：

① 將切下的膠帶放入1.5ml離心管中，按照1：3(膠帶重量：溶液A的體積)的比例加入溶液A；

② 50℃水溶10min，膠帶完全要求完全溶化，其間可振蕩助溶2～3次，待溶化后置室溫加入15μl溶液B，充分混勻；

③ 將溶液置于離心柱中，靜置2min，10000rpm離心20s；

④ 倒掉液體，加入500μl溶液C于離心柱中10000rpm離心20s，棄液體，重復(fù)該步驟一次；

⑤ 12000rpm離心1min，甩干剩余液體以除去殘余乙醇；

⑥ 將離心柱置于新的離心管中，室溫敞開離心管蓋放置5～10min，使乙醇揮發(fā)殆盡； ⑦ 加入20～30μl溶液D(使用前50℃水浴)，靜置2min；

⑧ 12000rpm離心1min，管底溶液即為所需DNA，將DNA貯存于-20℃可長期保存。（6）清理桌面，撰寫實驗報告。7．思考

（1）為何避免用熒光染料染色和用紫外燈照射目的DNA？

第三部分 感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化及篩選鑒定

實驗七 感受態(tài)菌的制備

1．目的

學會CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞。2．原理

細菌在0℃ CaCl2低滲溶液中脹成球形，丟失部分膜蛋白，成為容易吸收外源DNA的狀態(tài)。3．器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)。4．試劑

E.coli XL1-Blue，LB培養(yǎng)基，0.1 mol/L CaCl2溶液，無菌ddH2O 5．實驗準備

1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）；平板培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基（滅菌），冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液（滅菌），無菌ddH2O，搖菌試管（滅菌），三角燒瓶（滅菌）。6．操作步驟

（1）取一支無菌的搖菌試管，在超凈工作臺中加入2ml LB（不含抗菌素?。┡囵B(yǎng)基。

（2）從超低溫冰柜中取出XL1-Blue菌種，放置在冰上。在超凈工作臺中用燒紅的接種環(huán)插入凍結(jié)的菌中，然后接入含2ml LB培養(yǎng)基的試管中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。（3）取0.5ml上述菌液轉(zhuǎn)接到含有50ml LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃下250r/min搖床培養(yǎng)2~3h，測定OD600為0.375（<0.4~0.6，細胞數(shù)<10/ml，此為關(guān)鍵參數(shù)！）。以下操作除離心外，都在超凈工作臺中進行。

（4）將菌液分裝到1.5ml預(yù)冷無菌的聚丙烯離心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm離心10min。

（5）將離心管倒置以倒盡上清液，加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在渦旋混合器上混勻，插入冰中放置30min。

（6）4℃，5000rpm離心10min，棄上清液后，用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸，插入冰中放置30min。

（7）4℃，5000rpm離心10min，棄上清液后，用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂懸，超凈工作臺中按每管100ml分裝到1.5ml離心管中?？梢灾苯佑米鬓D(zhuǎn)化實驗，或立即放入-80℃超低溫冰柜中保藏（可存放數(shù)月）。

（8）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。7．思考

（1）制作感受態(tài)菌的過程中，應(yīng)注意那些關(guān)鍵步驟？

（2）CaCl2溶液的作用是什么？

實驗八 細菌轉(zhuǎn)化

1．目的

學會質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)受體菌的技術(shù)。2．原理

質(zhì)粒DNA粘附在細菌細胞表面，經(jīng)過42°C短時間的熱擊處理，促進吸收DNA。然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長。3．器材

8旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯票鶛C，恒溫搖床，培養(yǎng)皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。4．試劑

LB培養(yǎng)基（不加抗菌素），LB培養(yǎng)基（加抗菌素），無菌ddH2O，IPTG，X-gal。5．實驗準備

無菌ddH2O，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。6．操作步驟

（1）事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。

（2）從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100μl）感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10min。

（3）加入5μl連接好的質(zhì)粒混合液（DNA含量不超過100ng），輕輕震蕩后放置冰上20min。（4）輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5min。（5）在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500μl LB培養(yǎng)基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h。

（6）在超凈工作臺中取上述轉(zhuǎn)化混合液100~300μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂）。（7）如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

（8）在涂好的培養(yǎng)皿上做上標記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜。

（9）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。

（10）觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。7．思考（1）影響轉(zhuǎn)化效率的因素有哪些？

（3）白色菌落出現(xiàn)的原理是什么？

實驗九 轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定

1．目的

學會用酶切法或PCR法篩選重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功的克隆菌。2．原理

利用轉(zhuǎn)化后宿主菌所獲得的抗菌素抗性性狀篩選出獲得質(zhì)粒的菌落克隆。再從這些菌落中鑒定出質(zhì)粒上帶有外源基因插入片段的克隆菌落。3．器材

旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機，恒溫搖床，超凈工作臺，酒精燈，無菌牙簽，搖菌管。4．試劑

LB培養(yǎng)基（加抗菌素），PCR用試劑，引物，質(zhì)粒提取用試劑，酶切需要的限制性內(nèi)且酶及其緩沖液，70%甘油（70%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris-HCl pH8.0）。5．實驗準備

無菌ddH2O，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌）；牙簽（滅菌），搖菌管（滅菌），100mg/ml氨芐青霉素。6．操作步驟

方法一：酶切鑒定

（1）在超凈工作臺中取3支無菌搖菌管，各加入3ml LB（含50mg/ml氨芐青霉素），用記號筆寫好編號。（2）在超凈工作臺中將70%乙醇浸泡的小鑷子頭用酒精燈烤過，鑷取一支無菌牙簽。用牙簽的尖部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上的一個白色菌落，然后將牙簽放入盛有3ml LB（含50mg/ml Amp）的搖菌管中。用此法隨機取3個白色菌落，分別裝入3個搖菌管中。

（3）37℃搖菌過夜后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒。搖菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。（4）將提取到的3管質(zhì)粒樣品與空質(zhì)粒同時電泳，根據(jù)分子量判斷和選區(qū)有插入片段的質(zhì)粒，然后可用酶切、與目的片段一同電泳來鑒定其上的外源插入片段大小是否與預(yù)期相符。

（5）將經(jīng)過鑒定判斷為正確的質(zhì)粒保存。按照編號找到冰箱中原菌液。根據(jù)需要進行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)?；蜻M行誘導(dǎo)表達，或取500ml菌液與500ml 70%甘油混合后-80℃保存。（6）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。方法二：快速PCR篩選法

（1）在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機選取3個邊緣清晰的白色菌落，并用記號筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫圈做標記編號。

（2）在0.2ml PCR 微量離心管中配制25μl反應(yīng)體系。

ddH2O 16μl

10×PCR buffer（不含MgCl2）2.5μl

25mM MgCl2 1.5μl

2.5mmol/L dNTP 2μl（每種dNTP終濃度0.2mM）

10μmol/L Primer1 1μl（12.5~25pmoles）

10μmol/L primer2 1μl（12.5~25pmoles）

Taq酶 0.5μl（1.5U）

總體積 25μl

模板質(zhì)粒： 用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落，伸入PCR混合液中洗一洗。（2）根據(jù)廠商的操作手冊設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序：

① 94℃ 5min ② 94℃ 1min ③ 54℃ 1min ④ 72℃ 1min50s ⑤ goto② 29 times ⑥ 72℃ 10min（2）PCR結(jié)束后，取10μl產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳（與原始插入片段同時比對）。觀察膠上是否有預(yù)計的主要產(chǎn)物帶。

（3）按照編號找到培養(yǎng)皿中的原菌斑，根據(jù)需要進行放大培養(yǎng)提取其質(zhì)粒。

（4）提取到的質(zhì)粒與原先的空載體（或已知分子量的質(zhì)粒）再對比電泳，用酶切以進一步確認。

7．思考

（1）PCR法篩選的優(yōu)點和缺點是什么？（2）酶切法與PCR法篩選方案哪個更可靠？

（3）最終確認克隆的方法有哪些？

第四部分 目的基因在原核細胞中表達與SDS-PAGE鑒定

實驗十 外源基因的誘導(dǎo)表達

1．目的

了解外源基因在原核細胞中表達的特點和方法。2．原理

外源基因克隆在含有l(wèi)ac啟動子的表達系統(tǒng)中。先讓宿主菌生長，lac I產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結(jié)合抑制下游的外源基因轉(zhuǎn)錄。向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表達。表達的蛋白可經(jīng)SDS-PAGE或Western-blotting檢測。3．器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml 微量離心管，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機，制冰機，恒溫搖床，分光光度計，超凈工作臺，恒溫培養(yǎng)箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)。4．試劑

LB培養(yǎng)基（加抗菌素），100mg/ml IPTG，20%葡萄糖。5．實驗準備

無菌ddH2O，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒（滅菌），牙簽（滅菌），搖菌管（滅菌），100mg/ml IPTG（過濾滅菌）（100ml分裝，-20°C保存），100mg/ml氨芐青霉素（過濾滅菌）（100ml分裝，-20°C保存），配制20%葡萄糖（8磅滅菌20分鐘，添加至上述LB中，終濃度為0.2%）。6．操作步驟

（1）晚上9：00接種。在超凈工作臺中接種含有Pinpoint?xa-3-CHI重組載體的菌株，培養(yǎng)于兩個三角燒瓶各20ml LB-葡萄糖培養(yǎng)基（含抗菌素Amp 120μg/ml）的搖菌管中，慢速70~90轉(zhuǎn)/分鐘30°C搖菌過夜。

（2）至第二天上午8：30 OD600約為0.5，加IPTG至 100μg/ml，150~170轉(zhuǎn)/分鐘37°C誘導(dǎo)1.5-3h。同時做不加IPTG誘導(dǎo)和非轉(zhuǎn)化的空菌誘導(dǎo)的對照培養(yǎng)。

（3）4000rpm離心15min棄掉上清液，收獲菌體，用SDS-PAGE電泳分析（表達蛋白分子量為30kDa）。菌體也可放在-20°C以下保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。7．思考

（1）IPTG的作用原理是什么？

（2）為什么要增加抗菌素的用量？

實驗十一 SDS-PAGE檢測表達蛋白

1．目的

學習SDS-PAGE的基本操作，學會用SDS-PAGE檢測蛋白。2．原理

蛋白質(zhì)在加熱變性以后與SDS結(jié)合，帶上負電荷，在電場的作用下，向正極移動，結(jié)果按分子量大小排列在膠板上，含量多的蛋白帶紋粗。3．器材 旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，臺式冷凍離心機，制冰機，超聲波破碎儀，電磁爐，電泳儀，垂直電泳槽及配套的玻璃和密封條、梳子等。4．試劑

SDS（十二烷基磺酸鈉），Acr（丙烯酰胺），Bis（N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺），Tris（三羥甲基氨基甲烷），甘氨酸，鹽酸，Aps（過硫酸氨），TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量標準（97.4，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3 kDa），溴酚藍，甘油，冰醋酸，乙醇，b-2-巰基乙醇，考馬斯亮藍R250，甲醇，乙醇。5．實驗準備

1.0mol/L Tris HCl，pH8.8（4°C保存）；0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8（4°C保存）；10%SDS（室溫保存）；30%Acr/Bis（30g Acr+0.8g Bis dd water 定容至100ml，4°C保存）；10%Aps（-20°C保存）；2′上樣緩沖液（0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2ml，甘油2ml，20%SDS 2ml，0.1%溴酚藍 0.5ml，b-2-巰基乙醇 1.0ml，ddH2O 2.5ml，室溫存放）；5′電泳緩沖液（Tris 7.5g，甘氨酸36g，SDS 2.5g，加ddH2O至500ml，使用時稀釋五倍）；考馬斯亮藍染色液（考馬斯亮藍R250 0.25g + 45ml甲醇+10ml冰醋酸，用ddH2O定容至100ml）；脫色液（95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，體積比）； 6．操作步驟

（1）將表達后的菌體與2′上樣緩沖液按1：1混勻于微量離心管中。

（2）用超聲波破碎儀脈沖10次，每次10秒。中間間隔時放入冰中降溫。注意一定要將超聲波探頭插入溶液底部，在溶液表面或上部時容易起泡！

（3）將上述微量離心管插入水漂中，放在電磁爐鍋里的沸水中煮3~5min。然后立即插入冰中。（可在-20°C冰柜中保存）。

（4）按照教師的演示組裝電泳玻璃并用細橡膠管密封底部和側(cè)面然后用夾子夾?。ú荒軍A玻璃的上端以免夾斷玻璃的突出段?。２迦胧嶙雍笤诓Ａ暇嚯x梳子齒底部1cm的地方做一個標記。（5）配制10%分離膠。按順序和量（注意體積單位?。┤∠铝腥芤夯煸谝粋€50ml的小燒杯中（注意Tris為 pH8.8）：

Acrylamide-bis 3.96 ml 1M Tris PH8.8 4.38 ml ddH2O 3.432 ml 10% SDS 118.8 μl

TEMED 9.9 μl 10%APS 118.8μl

（6）加完APS后拿起燒杯輕輕轉(zhuǎn)動幾下底部將溶液混勻后，立刻緩緩倒入玻璃夾縫中，直到液面與所作的標記齊平。剩下的膠液留在小燒杯中，傾斜放置。然后在上部用1000ml微量移液器輕輕地沿玻璃壁來回移動加滿ddH2O（盡可能不破壞下面的膠液）。然后靜置30min。直到燒杯中剩余的溶液凝固。倒出蒸餾水，并倒置玻璃盡可能將水倒盡。

（7）配支持膠。按順序和量（注意體積單位?。┤∠铝腥芤夯煸谝粋€50ml的小燒杯中（注意Tris為 pH6.8）：

Acrylamide-bis 0.675 ml 0.5M Tris pH6.8 0.563 ml ddH2O 3.165 ml 10% SDS 45 μl TEMED 7.5 μl 10% APS 45μl

（8）加完APS后拿起燒杯輕輕轉(zhuǎn)動幾下底部將溶液混勻后，立刻倒入玻璃夾縫中，液面與玻璃上邊緣齊平。然后再慢慢插入梳子，靜置約20min。燒杯中剩下的溶液傾斜放置直到溶液凝固。（此狀態(tài)可以用塑料薄膜包起來放入冰箱過夜）。

（9）小心拔出梳子以后，用注射器針頭（剪平尖部）吸取梳子齒形成的加樣槽中的水，并修平加樣槽底部的膠面。

（10）選取幾個形態(tài)好的加樣槽，在一張紙上做好對應(yīng)的標記，用微量移液器在側(cè)面的一個加樣槽中加入20μl 蛋白分子量標準Marker，其它槽中加入10～20μl自己制作的樣品。（11）加完樣品后，再用微量移液器吸取電泳緩沖液小心把加樣槽液面都補平。電泳槽上部倒?jié)M電泳緩沖液（約250ml,淹沒過加樣槽的液面！），電泳槽的下部倒入一半電泳緩沖液（約180ml）。

（12）接好電極，將電流調(diào)至10mA，待溴酚藍移到分離膠后，在將電流調(diào)至18mA，電泳約2~3h，期間隨時觀察電泳槽上部的液體是否有泄漏（泄漏導(dǎo)致液面下降，電流中斷）！當溴酚藍移到玻璃距底部0.5cm時切斷電源。

（13）在一個搪瓷盤里準備適量的考馬斯亮藍染色液。

（14）倒掉電泳槽中的緩沖液，取下玻璃，小心用鏟子從下部將帶有缺口的玻璃板撬起（切不可損壞膠！）。用鏟子切去上部的支持膠，并把分離膠從玻璃上剝離倒染液搪瓷盤里（切不可損壞膠！）。（15）染色2h后，將染液倒回瓶子里以備重復(fù)使用。把膠移入脫色液，過夜。

（16）觀察脫色后膠里的藍色帶紋，與對照比較或?qū)ふ耶惓４值膸Ъy，并比較其分子量（CHI蛋白約30kDa），判斷是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物。（17）清理桌面，寫實驗報告。7．思考

（1）影響表達的因素都有哪些？

（2）如何確定凝膠上的某條蛋白質(zhì)帶就是所要表達的外源基因產(chǎn)物？（3）表達產(chǎn)物的形式是包涵體還是可溶性蛋白？

（4）本實驗?zāi)芊衽袛啾磉_產(chǎn)物一定是CHI蛋白？還需要什么方法？（5）如何估計表達產(chǎn)物的分子量？

附錄1：表達載體Pinponit?xa-3的圖譜：

附錄2：所用的chitinase（玉米幾丁質(zhì)酶）序列（GenBank：L00973）：

>L00973

gcaacaccag cttctctaaa gatcacaatg atgagagccc tggcgtggtg gccatgctgg cccgccttct tcgctgtgcc cgctcgcgcc gagcagtgcg ggtcgcaggc cggcggcgcg ctgtgcccca actgcctgtg ctgcagccag ttcgggtggt gcggcagctc cgactactgc ggcagcgggt gccagagcca gtgcagcgca gcctgcagca ccccgaaccc gccgagcagc ggcggcgtgg cgtccatcat ccccgagtcg ctcttcaacc agatgctgct gcaccgcaac gacgcggcgt gccccgccaa cggcttctac acctacgcgg gcttcatcgc ggcggccaac gcgttcccgg gcttggcacc acgggtgcgg cccgacgtgc agaagcgcga gctggcggcg ttcctggcgc agacgtccca cgagacgacg ggcgggtggg cgacggcgcg acggccctac gcctggggct actgcttcaa ggaggagcag ggcggcgcgt cggggccgga ctactgcgag cccagcgccc agtggccgtg cgccgcgggg aagaagtact acgggccgcg ggccatccag atctccatca acatcaacat cgggcccgct ggcaggccat cggcgcccgg catcctcgcc aacccggacc tggtggccac ccgaccccac cgtgtcgttc gaagaccgcc gtctggttct gggatgaccc cgcagtcgcc caagccgtcg tgcaccgacg tcatgacggg gcagtggacg ccctccgccg ctgacacggc cgccggcagg ctgccgggct acggcgtcgt caccaacatc tccaacggcg gcctcgagtg cggccatggc gctgacagcc gcgtcgccga ccggatcggc ttctacaaac gatactgtga cttgcttggg gtcagctacg gcgacaactt ggactgcgcc aaccagacgc ctttcaacgg ctagttaata agctagctac ctcaccatgc atgtctgcct tattattaga gacacaataa gacctgatcg atatgatgat gggtatgcat gtattacttt actacacgca gatccagcaa tcaagaataa agcaaattaa tgtttact

附：

DL2000分子量標準（bp）低分子量蛋白質(zhì)Marker（kDa）

附錄3：本實驗所用的pUCm-T克隆載體圖譜

選做實驗

實驗一 擬南芥基因組DNA的分離提取

【實驗?zāi)康摹?/p>

F 掌握擬南芥基因組DNA的抽提原理和方法。【實驗原理】

通常采用機械研磨的方法破碎擬南芥的組織和細胞，由于擬南芥細胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。

十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，簡稱SDS)是離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入異戊醇使DNA沉淀，即得擬南芥總DNA?！緦嶒炂鞑摹?/p>

F 試劑耗材：提取液（0.2M Tris-HCl(pH7.5)、0.5%SDS、0.25M NaCl、1%β-巰基乙醇）、異丙醇、氯仿、異戊醇、RNAase A、研缽、液氮、1.5ml離心管。F 儀器：恒溫水浴鍋、離心機?！痉椒ú襟E】

（1）取新鮮的擬南芥葉片2~3片加入1.5ml的離心管中，加入液氮，玻璃棒研碎。（2）研磨以后，加入600~700μl的提取液，混勻，然后在60℃下水浴20~60分鐘。（3）4℃，12000rpm/min離心10分鐘。

（4）把上清轉(zhuǎn)至新的離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1），4℃，12000rpm/min離心7分鐘。

（5）把上清轉(zhuǎn)至新的離心管中，加入70%體積的異丙醇，混勻，4℃，12000rpm/min離心15分鐘。（6）棄上清，70%乙醇洗滌沉淀2次，吹干。

（7）沉淀用20~30μl含有0.1mg/ml RNAase A的ddH2O溶解。（8）用0.8%的瓊脂糖凝膠檢測提取的擬南芥總DNA?！緦嶒灲Y(jié)果】

1.擬南芥總DNA的電泳結(jié)果。【實驗思考】

1.依據(jù)你的理解，擬南芥總DNA的提取過程中應(yīng)注意那些操作？ 【參考文獻】

鄒華文，黃叢林.一種簡單快速的擬南芥基因組DNA的微量提取方法.長江大學學報B（自然科學版），2006，4.實驗二 果蠅白眼突變基因的克隆

【實驗?zāi)康摹?/p>

F 掌握T克隆的原理和方法。F 了解質(zhì)粒提取的原理和方法?！緦嶒炘怼?/p>

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將載體分子與外源DNA分子進行連接。Taq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pMD18-T Vector 末端游離的T堿基互補形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。將攜帶目的基因的T質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌并對其進行藍白斑篩選鑒定，挑選出所需的重組質(zhì)粒?！緦嶒炂鞑摹?/p>

F 試劑耗材：Taq DNA聚合酶、安芐青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T載體、LB培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、涂玻棒、移液槍、槍頭、1.5ml離心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、無水乙醇、RNAase A、DNA Marker。

2+F 儀器：PCR儀、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、恒溫水浴鍋、離心機、無菌操作臺。【方法步驟】

（一）引物設(shè)計

從NCBI上下載果蠅的白眼突變基因序列（GenBank登錄號：X51749），依照此序列用Primer 5.0軟件分別設(shè)計上游和下游擴增引物。

（二）目的基因片段的PCR擴增 25μl反應(yīng)體系：

模板cDNA 1.5μl 10×reaction buffer 2.5μl 2.5mM MgCl2 2μl 2.5mM dNTP 2μl 上游引物 1μl 下游引物 1μl Taq DNA聚合酶 0.2μl 加ddH2O至總體積 25μl 按照以下程序進行PCR擴增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；

72℃總延伸10min，4℃保存。

取5μl PCR產(chǎn)物與熒光染料混合均勻在1%瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE電泳緩沖液、100V恒壓)，用凝膠成像系統(tǒng)照相觀察，確定所得DNA片段的大小和純度。

（三）目的基因片段PCR產(chǎn)物的純化回收

將PCR產(chǎn)物與熒光染料混合均勻進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下用干凈刀片切下含目的基因片段的膠帶。按照北京鼎國生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DNA快速純化/回收試劑盒操作說明，純化回收目的片段。

（四）目的基因片段與克隆載體的連接

PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化回收后，通過T/A克隆的方法，直接與pMD18-T載體連接，連接反應(yīng)體系如下： 純化回收的PCR產(chǎn)物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混勻后16℃連接過夜。產(chǎn)物可于-20℃保存。

（五）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

(1)取出-80℃保存的制備好的感受態(tài)細胞，冰上放置10～20min融化；(2)加入5μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻后冰上放置30～40min；(3)42℃水浴中熱擊90s，輕輕放回冰上冷卻2min；

(4)加入880μl LB液體培養(yǎng)基(不含氨芐青霉素)和20μl葡萄糖，37℃搖蕩培養(yǎng)1h；

(5)制備X-gal平板：取40μl X-gal、4μl IPTG和56μl滅菌雙蒸水混勻后均勻地涂布于含100μg/μl氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，放置1h以充分吸收；

(6)取適量的菌液(200μl)，涂布于X-gal平板上，37℃培養(yǎng)1h后，倒置培養(yǎng)14～16h。

（六）重組質(zhì)粒的篩選

分別挑取白色和藍色單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基中(含100μg/μl氨芐青霉素)，37℃振蕩過夜培養(yǎng)，用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA。步驟如下：

(1)取適量菌液于1.5 ml的離心管中，瞬時離心，倒掉培養(yǎng)基，盡可能倒干凈；(2)加溶液I 100μl，渦旋重新懸浮沉淀；

(3)加溶液II 200μl，輕輕搖勻，在冰上放置3～5min使大腸桿菌裂解，釋放質(zhì)粒DNA；

(4)加預(yù)冷的溶液III 150μl，輕輕顛倒搖勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反應(yīng)；(5)4℃，12000rpm離心8min，轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管；

(6)以體積比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，輕輕搖勻，靜置2分鐘；(7)4℃，12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管；(8)加入400μl三氯甲烷搖勻，4℃，12000rpm離心5min；(9)取上清加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，4℃，12000rpm離心8min；(10)棄上清液,加75%乙醇1000μl洗滌2次，放置干燥；

(11)加50μl 雙蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保溫2h，電泳檢測(電泳中以藍斑質(zhì)粒DNA為對照，出現(xiàn)滯后帶的確認為重組質(zhì)粒)后-20℃保存?zhèn)溆谩?七)重組質(zhì)粒的測序驗證

將提取純化后的質(zhì)粒送至上海生物工程公司進行測序得到克隆基因的堿基序列，分析驗證克隆的目的基因的正確性?！緦嶒灲Y(jié)果】

2.目的基因的PCR電泳結(jié)果。3.質(zhì)粒電泳結(jié)果。4.測序驗證結(jié)果?！緦嶒炈伎肌?/p>

1.目的基因片段與克隆載體連接過程中的注意事項。

2.影響感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實際操作過程中應(yīng)注意的事項。3.簡述熱激法轉(zhuǎn)化和藍白篩選的原理。

4.簡述堿裂解法提取質(zhì)粒的原理以及各試劑的作用?！緟⒖嘉墨I】

1.J.薩姆布魯克，D.W 拉塞爾.《分子克隆實驗指南》（第三版），科學出版社，2002.2.Pepling M, Mount S M.Sequence of a cDNA from the Drosophila melanogaster white gene.Nucleic Acids Res.1990,18(6):1633.實驗三 家蠶油蠶突變基因的克隆

【實驗?zāi)康摹?/p>

F 掌握T克隆的原理和方法。F 了解質(zhì)粒提取的原理和方法?！緦嶒炘怼?外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將載體分子與外源DNA分子進行連接。Taq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pMD18-T Vector 末端游離的T堿基互補形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。將攜帶目的基因的T質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌并對其進行藍白斑篩選鑒定，挑選出所需的重組質(zhì)粒?！緦嶒炂鞑摹?/p>

F 試劑耗材：Taq DNA聚合酶、安芐青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T載體、LB培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、涂玻棒、移液槍、槍頭、1.5ml離心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、無水乙醇、RNAase A、DNA Marker。

F 儀器：PCR儀、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、恒溫水浴鍋、離心機、無菌操作臺?！痉椒ú襟E】

（三）引物設(shè)計

從NCBI上下載家蠶油蠶突變基因序列（GenBank登錄號：AB060285），依照此序列用Primer 5.0軟件分別設(shè)計上游和下游擴增引物。

（四）目的基因片段的PCR擴增 25μl反應(yīng)體系：

模板cDNA 1.5μl 10×reaction buffer 2.5μl 2.5mM MgCl2 2μl 2.5mM dNTP 2μl 上游引物 1μl 下游引物 1μl Taq DNA聚合酶 0.2μl 加ddH2O至總體積 25μl 按照以下程序進行PCR擴增：

2+ 94℃預(yù)變性4min；

94℃變性40s，48℃退火40s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；

72℃總延伸10min，4℃保存。

取5μl PCR產(chǎn)物與熒光染料混合均勻在1%瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE電泳緩沖液、100V恒壓)，用凝膠成像系統(tǒng)照相觀察，確定所得DNA片段的大小和純度。

（三）目的基因片段PCR產(chǎn)物的純化回收

將PCR產(chǎn)物與熒光染料混合均勻進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下用干凈刀片切下含目的基因片段的膠帶。按照北京鼎國生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DNA快速純化/回收試劑盒操作說明，純化回收目的片段。

（四）目的基因片段與克隆載體的連接

PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化回收后，通過T/A克隆的方法，直接與pMD18-T載體連接，連接反應(yīng)體系如下： 純化回收的PCR產(chǎn)物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混勻后16℃連接過夜。產(chǎn)物可于-20℃保存。

（五）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

(1)取出-80℃保存的制備好的感受態(tài)細胞，冰上放置10～20min融化；(2)加入5μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻后冰上放置30～40min；(3)42℃水浴中熱擊90s，輕輕放回冰上冷卻2min；

(4)加入880μl LB液體培養(yǎng)基(不含氨芐青霉素)和20μl葡萄糖，37℃搖蕩培養(yǎng)1h；

(5)制備X-gal平板：取40μl X-gal、4μl IPTG和56μl滅菌雙蒸水混勻后均勻地涂布于含100μg/μl氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，放置1h以充分吸收；

(6)取適量的菌液(200μl)，涂布于X-gal平板上，37℃培養(yǎng)1h后，倒置培養(yǎng)14～16h。

（六）重組質(zhì)粒的篩選 分別挑取白色和藍色單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基中(含100μg/μl氨芐青霉素)，37℃振蕩過夜培養(yǎng)，用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA。步驟如下：

(1)取適量菌液于1.5 ml的離心管中，瞬時離心，倒掉培養(yǎng)基，盡可能倒干凈；(2)加溶液I 100μl，渦旋重新懸浮沉淀；

(3)加溶液II 200μl，輕輕搖勻，在冰上放置3～5min使大腸桿菌裂解，釋放質(zhì)粒DNA；

(4)加預(yù)冷的溶液III 150μl，輕輕顛倒搖勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反應(yīng)；(5)4℃，12000rpm離心8min，轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管；

(6)以體積比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，輕輕搖勻，靜置2分鐘；(7)4℃，12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管；(8)加入400μl三氯甲烷搖勻，4℃，12000rpm離心5min；(9)取上清加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，4℃，12000rpm離心8min；(10)棄上清液,加75%乙醇1000μl洗滌2次，放置干燥；

(11)加50μl 雙蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保溫2h，電泳檢測(電泳中以藍斑質(zhì)粒DNA為對照，出現(xiàn)滯后帶的確認為重組質(zhì)粒)后-20℃保存?zhèn)溆谩?七)重組質(zhì)粒的測序驗證

將提取純化后的質(zhì)粒送至上海生物工程公司進行測序得到克隆基因的堿基序列，分析驗證克隆的目的基因的正確性?！緦嶒灲Y(jié)果】

5.目的基因的PCR電泳結(jié)果。6.質(zhì)粒電泳結(jié)果。7.測序驗證結(jié)果?！緦嶒炈伎肌?/p>

5.目的基因片段與克隆載體連接過程中的注意事項。

6.影響感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實際操作過程中應(yīng)注意的事項。7.簡述熱激法轉(zhuǎn)化和藍白篩選的原理。8.簡述堿裂解法提取質(zhì)粒的原理以及各試劑的作用?！緟⒖嘉墨I】

1.J.薩姆布魯克，D.W 拉塞爾.《分子克隆實驗指南》（第三版），科學出版社，2002.2.K?moto N.deleted portion of one of the two xanthine dehydrogenase genes causes translucent larval skin in the oq mutant of the silkworm(Bombyx mori).Insect Biochem Mol Biol.2002 ,32(6):591-597.實驗四 擬南芥葉片花斑突變基因的克隆

【實驗?zāi)康摹?/p>

F 掌握T克隆的原理和方法。F 了解質(zhì)粒提取的原理和方法。【實驗原理】

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將載體分子與外源DNA分子進行連接。Taq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pMD18-T Vector 末端游離的T堿基互補形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。將攜帶目的基因的T質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌并對其進行藍白斑篩選鑒定，挑選出所需的重組質(zhì)粒?！緦嶒炂鞑摹?/p>

F 試劑耗材：Taq DNA聚合酶、安芐青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T載體、LB培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、涂玻棒、移液槍、槍頭、1.5ml離心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、無水乙醇、RNAase A、DNA Marker。

F 儀器：PCR儀、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、恒溫水浴鍋、離心機、無菌操作臺?！痉椒ú襟E】

2+

（五）引物設(shè)計

從NCBI上下載擬南芥葉片花斑突變基因序列（GenBank登錄號：NM_123592），依照此序列用Primer 5.0軟件分別設(shè)計上游和下游擴增引物。

（六）目的基因片段的PCR擴增 25μl反應(yīng)體系：

模板cDNA 1.5μl 10×reaction buffer 2.5μl 2.5mM MgCl2 2μl 2.5mM dNTP 2μl 上游引物 1μl 下游引物 1μl Taq DNA聚合酶 0.2μl 加ddH2O至總體積 25μl 按照以下程序進行PCR擴增：

94℃預(yù)變性4min；

94℃變性40s，45℃退火40s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；

72℃總延伸10min，4℃保存。

取5μl PCR產(chǎn)物與熒光染料混合均勻在1%瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE電泳緩沖液、100V恒壓)，用凝膠成像系統(tǒng)照相觀察，確定所得DNA片段的大小和純度。

（三）目的基因片段PCR產(chǎn)物的純化回收

將PCR產(chǎn)物與熒光染料混合均勻進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下用干凈刀片切下含目的基因片段的膠帶。按照北京鼎國生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DNA快速純化/回收試劑盒操作說明，純化回收目的片段。

（四）目的基因片段與克隆載體的連接

PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化回收后，通過T/A克隆的方法，直接與pMD18-T載體連接，連接反應(yīng)體系如下： 純化回收的PCR產(chǎn)物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混勻后16℃連接過夜。產(chǎn)物可于-20℃保存。

（五）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

(1)取出-80℃保存的制備好的感受態(tài)細胞，冰上放置10～20min融化；(2)加入5μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻后冰上放置30～40min；(3)42℃水浴中熱擊90s，輕輕放回冰上冷卻2min；

(4)加入880μl LB液體培養(yǎng)基(不含氨芐青霉素)和20μl葡萄糖，37℃搖蕩培養(yǎng)1h；

(5)制備X-gal平板：取40μl X-gal、4μl IPTG和56μl滅菌雙蒸水混勻后均勻地涂布于含100μg/μl氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，放置1h以充分吸收；

(6)取適量的菌液(200μl)，涂布于X-gal平板上，37℃培養(yǎng)1h后，倒置培養(yǎng)14～16h。

（六）重組質(zhì)粒的篩選

分別挑取白色和藍色單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基中(含100μg/μl氨芐青霉素)，37℃振蕩過夜培養(yǎng)，用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA。步驟如下：

(1)取適量菌液于1.5 ml的離心管中，瞬時離心，倒掉培養(yǎng)基，盡可能倒干凈；(2)加溶液I 100μl，渦旋重新懸浮沉淀；

(3)加溶液II 200μl，輕輕搖勻，在冰上放置3～5min使大腸桿菌裂解，釋放質(zhì)粒DNA；

(4)加預(yù)冷的溶液III 150μl，輕輕顛倒搖勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反應(yīng)；(5)4℃，12000rpm離心8min，轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管；

(6)以體積比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，輕輕搖勻，靜置2分鐘；(7)4℃，12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管；(8)加入400μl三氯甲烷搖勻，4℃，12000rpm離心5min；(9)取上清加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，4℃，12000rpm離心8min；(10)棄上清液,加75%乙醇1000μl洗滌2次，放置干燥；(11)加50μl 雙蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保溫2h，電泳檢測(電泳中以藍斑質(zhì)粒DNA為對照，出現(xiàn)滯后帶的確認為重組質(zhì)粒)后-20℃保存?zhèn)溆谩?七)重組質(zhì)粒的測序驗證

將提取純化后的質(zhì)粒送至上海生物工程公司進行測序得到克隆基因的堿基序列，分析驗證克隆的目的基因的正確性?！緦嶒灲Y(jié)果】

8.目的基因的PCR電泳結(jié)果。9.質(zhì)粒電泳結(jié)果。10.測序驗證結(jié)果?！緦嶒炈伎肌?/p>

9.目的基因片段與克隆載體連接過程中的注意事項。

10.影響感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實際操作過程中應(yīng)注意的事項。11.簡述熱激法轉(zhuǎn)化和藍白篩選的原理。

12.簡述堿裂解法提取質(zhì)粒的原理以及各試劑的作用?！緟⒖嘉墨I】

1.J.薩姆布魯克，D.W 拉塞爾.《分子克隆實驗指南》（第三版），科學出版社，2002.2.Sakamoto W, Tamura T, Hanba-Tomita Y, et al.The VAR1 locus of Arabidopsis encodes a chloroplastic FtsH and is responsible for leaf variegation in the mutant alleles.Genes Cells.2002,7(8):769-780.實驗五 線蟲unc-22突變基因的克隆

【實驗?zāi)康摹?/p>

F 掌握T克隆的原理和方法。F 了解質(zhì)粒提取的原理和方法。【實驗原理】 外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將載體分子與外源DNA分子進行連接。Taq DNA聚合酶擴增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿基，可以與pMD18-T Vector 末端游離的T堿基互補形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。將攜帶目的基因的T質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌并對其進行藍白斑篩選鑒定，挑選出所需的重組質(zhì)粒?！緦嶒炂鞑摹?/p>

F 試劑耗材：Taq DNA聚合酶、安芐青霉素、葡萄糖、X-gal、IPTG、pMD18-T載體、LB培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、涂玻棒、移液槍、槍頭、1.5ml離心管、PCR管、溶液I、溶液II、溶液III、苯酚、三氯甲烷、95%乙醇、無水乙醇、RNAase A、DNA Marker。

F 儀器：PCR儀、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、恒溫水浴鍋、離心機、無菌操作臺?！痉椒ú襟E】

（七）引物設(shè)計

從NCBI上下載線蟲unc-22基因序列（GenBank登錄號：NM_069873），依照此序列用Primer 5.0軟件分別設(shè)計上游和下游擴增引物。

（八）目的基因片段的PCR擴增 25μl反應(yīng)體系：

模板cDNA 1.5μl 10×reaction buffer 2.5μl 2.5mM MgCl2 2μl 2.5mM dNTP 2μl 上游引物 1μl 下游引物 1μl Taq DNA聚合酶 0.2μl 加ddH2O至總體積 25μl 按照以下程序進行PCR擴增：

2+ 94℃預(yù)變性4min；

94℃變性40s，56℃退火40s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；

72℃總延伸10min，4℃保存。

取5μl PCR產(chǎn)物與熒光染料混合均勻在1%瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE電泳緩沖液、100V恒壓)，用凝膠成像系統(tǒng)照相觀察，確定所得DNA片段的大小和純度。

（三）目的基因片段PCR產(chǎn)物的純化回收

將PCR產(chǎn)物與熒光染料混合均勻進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下用干凈刀片切下含目的基因片段的膠帶。按照北京鼎國生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DNA快速純化/回收試劑盒操作說明，純化回收目的片段。

（四）目的基因片段與克隆載體的連接

PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化回收后，通過T/A克隆的方法，直接與pMD18-T載體連接，連接反應(yīng)體系如下： 純化回收的PCR產(chǎn)物 4μl Ligation SolutionⅠ 5μl pMD18-T Vector DNA 1μl 混勻后16℃連接過夜。產(chǎn)物可于-20℃保存。

（五）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

(1)取出-80℃保存的制備好的感受態(tài)細胞，冰上放置10～20min融化；(2)加入5μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻后冰上放置30～40min；(3)42℃水浴中熱擊90s，輕輕放回冰上冷卻2min；

(4)加入880μl LB液體培養(yǎng)基(不含氨芐青霉素)和20μl葡萄糖，37℃搖蕩培養(yǎng)1h；

(5)制備X-gal平板：取40μl X-gal、4μl IPTG和56μl滅菌雙蒸水混勻后均勻地涂布于含100μg/μl氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，放置1h以充分吸收；

(6)取適量的菌液(200μl)，涂布于X-gal平板上，37℃培養(yǎng)1h后，倒置培養(yǎng)14～16h。

（六）重組質(zhì)粒的篩選 分別挑取白色和藍色單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基中(含100μg/μl氨芐青霉素)，37℃振蕩過夜培養(yǎng)，用堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA。步驟如下：

(1)取適量菌液于1.5 ml的離心管中，瞬時離心，倒掉培養(yǎng)基，盡可能倒干凈；(2)加溶液I 100μl，渦旋重新懸浮沉淀；

(3)加溶液II 200μl，輕輕搖勻，在冰上放置3～5min使大腸桿菌裂解，釋放質(zhì)粒DNA；

(4)加預(yù)冷的溶液III 150μl，輕輕顛倒搖勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，在冰上放置3～5min停止裂解反應(yīng)；(5)4℃，12000rpm離心8min，轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管；

(6)以體積比1:1的比例加入400μl平衡酚和三氯甲烷，輕輕搖勻，靜置2分鐘；(7)4℃，12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至1.5ml離心管；(8)加入400μl三氯甲烷搖勻，4℃，12000rpm離心5min；(9)取上清加2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，4℃，12000rpm離心8min；(10)棄上清液,加75%乙醇1000μl洗滌2次，放置干燥；

(11)加50μl 雙蒸水(含20μg/ml的 RNase)，37℃保溫2h，電泳檢測(電泳中以藍斑質(zhì)粒DNA為對照，出現(xiàn)滯后帶的確認為重組質(zhì)粒)后-20℃保存?zhèn)溆谩?七)重組質(zhì)粒的測序驗證

將提取純化后的質(zhì)粒送至上海生物工程公司進行測序得到克隆基因的堿基序列，分析驗證克隆的目的基因的正確性?！緦嶒灲Y(jié)果】

11.目的基因的PCR電泳結(jié)果。12.質(zhì)粒電泳結(jié)果。13.測序驗證結(jié)果。【實驗思考】

13.目的基因片段與克隆載體連接過程中的注意事項。

14.影響感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實際操作過程中應(yīng)注意的事項。15.簡述熱激法轉(zhuǎn)化和藍白篩選的原理。16.簡述堿裂解法提取質(zhì)粒的原理以及各試劑的作用?！緟⒖嘉墨I】

1.J.薩姆布魯克，D.W 拉塞爾.《分子克隆實驗指南》（第三版），科學出版社，2002.2.Wang,W.and Shakes,D.C.Isolation and sequence analysis of a Caenorhabditis elegans cDNA which encodes a 14-3-3 homologue.Gene.1994, 147(2), 215-218.

第二篇：基因工程

寧波大學科學技術(shù)學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現(xiàn)代生物技術(shù)概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：

基因工程

摘要：基因工程是20世紀70年代在分子遺傳學、細胞生物學基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是一種可以按照人們的意愿設(shè)計、改造和組建生物品種的新技術(shù)。包括它通過基因操作，將目的基因活DNA片段與合適的載體連接轉(zhuǎn)入目標生物細胞，通過復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯外源目的基因以及蛋白質(zhì)的活性表達，使轉(zhuǎn)基因生物獲得新的遺傳性狀。

關(guān)鍵詞：生物技術(shù)；基因工程

一、基因工程的誕生：

從20世紀40年代開始，受分子生物學、分子遺傳學發(fā)展的影響，基因分子生物學取得巨大進步，為基因工程的誕生奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)在人們公認的誕生日期是1973年，其中現(xiàn)代分子生物學領(lǐng)域上的三大發(fā)現(xiàn)及技術(shù)上的三大發(fā)明起了決定性作用。

理論上的三大發(fā)現(xiàn)包括：第一，20世紀40年代，Avery 在美國的一次學術(shù)會上報道了肺炎球菌的轉(zhuǎn)化，證明了遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì)；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)以及半保留復(fù)制機理，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞問題；第三，20世紀50年代末的“中心法則”，60年代由Monod 和 Jacob 提出的操縱分子學說，并成功的由一批科學家破譯了遺傳密碼從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題。

以上問題的解決使得人們自主改造生物遺傳性狀從理論上成為現(xiàn)實。

技術(shù)上的三大發(fā)明：第一，1967年發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶，以及1979年發(fā)現(xiàn)的具有更高活性的T4 DNA連接酶。在1970年Smith和 Wilcox從流感嗜血桿菌中分離并純化的限制性核酸內(nèi)切酶HindⅡ和1972年發(fā)現(xiàn)的EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶。后來發(fā)現(xiàn)的大量的限制性核酸內(nèi)切酶。第二，一些病毒、質(zhì)粒和噬菌體等載體技術(shù)的發(fā)現(xiàn)使把目的基因的導(dǎo)入更加容易。第三，DNA分子序列分析及瓊脂糖凝膠電泳、Southern雜交技術(shù)的發(fā)展使得基因工程的誕生越來越近。1973年，斯坦福大學將抗四環(huán)素質(zhì)粒和抗新霉素的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶切割并連接成重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中是基因工程誕生的標志。

二、基因工程有幾個重要特征：（1）、打破了物種的界限，實現(xiàn)跨物種的基因轉(zhuǎn)移；（2）、通過已知功能基因的遺傳轉(zhuǎn)化，進行物種的定向改良；（3）、創(chuàng)造出自然界中本來不存在的物種。

三、基因工程技術(shù)流程包括：（1）、目的基因克隆，即從特定生物基因組和cDNA中分離提純和擴大繁殖目的基因；（2）、選擇合適的載體，并對載體DNA進行克?。唬?）、將目的基因與載體寧波大學科學技術(shù)學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現(xiàn)代生物技術(shù)概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：

連接；（4）、將重組DNA導(dǎo)入到大腸桿菌或酵母菌體內(nèi)培養(yǎng)；（5）、利用載體上的標記基因進行篩選，獲得轉(zhuǎn)目的基因的細胞或植株。

四、基因工程的應(yīng)用：

（1）基因工程應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面：農(nóng)業(yè)領(lǐng)域是目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域之一。農(nóng)作物生物技術(shù)的目的是提高作物產(chǎn)量，改善品質(zhì)，增強作物抗逆性、抗病蟲害的能力。基因工程在這些領(lǐng)域已取得了令人矚目的成就。

（2）基因工程應(yīng)用于醫(yī)藥方面：目前，以基因工程藥物為主導(dǎo)的基因工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，發(fā)展前景廣闊?；蚬こ趟幬镏饕毎蜃印⒖贵w、疫苗、激素和核苷酸藥物等。它們對預(yù)防人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內(nèi)的各種傳染病、類風濕疾病等有重要作用。在很多領(lǐng)域特別是疑難病癥上，基因工程工程藥物起到了傳統(tǒng)化學藥物難以達到的作用。我們最為熟悉的干擾素(IFN)就是一類利用基因工程技術(shù)研制成的多功能細胞因子，在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發(fā)性硬化癥和類風濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病。

（3）基因工程應(yīng)用于環(huán)保方面：基因工程技術(shù)可提高微生物凈化環(huán)境的能力。美國利用DNA重組技術(shù)把降解芳烴、萜烴、多環(huán)芳烴、脂肪烴的4種菌體基因鏈接，轉(zhuǎn)移到某一菌體中構(gòu)建出可同時降解4種有機物的“超級細菌”，用之清除石油污染，在數(shù)小時內(nèi)可將水上浮油中的2/3烴類降解完，而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢桿菌、且表達成功。它能釘死蚊蟲與害蟲，而對人畜無害，不污染環(huán)境?，F(xiàn)已開發(fā)出的基因工程菌有凈化農(nóng)藥的DDT的細菌、降解水中的染料、環(huán)境中有機氯苯類和氯酚類、多氯聯(lián)苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸藥的工程菌及用于吸附無機有毒化合物(鉛、汞、鎘等)的基因工程菌及植物等。90年代后期問世的DNA改組技術(shù)可以創(chuàng)新基因，并賦予表達產(chǎn)物以新的功能，創(chuàng)造出全新的微生物，如可將降解某一污染物的不同細菌的基因通過PCR技術(shù)全部克隆出來，再利用基因重組技術(shù)在體外加工重組，最后導(dǎo)入合適的載體，就有可能產(chǎn)生一種或幾種具有非凡降解能力的超級菌株，從而大大地提高降解效率。

五、基因工程的安全性問題：

自基因工程誕生以來，基因工程的安全性問題就受到人們極大的關(guān)注，關(guān)于重組DNA潛在的危險性問題的爭論，在基因工程還處于醞釀階段的時候就已經(jīng)開始。爭論的焦點是擔心基因工程寧波大學科學技術(shù)學院考核答題紙

（2011--2012學年第 學期）

課號：:EK5G04A00

課程名稱：現(xiàn)代生物技術(shù)概論

閱卷教師：

班級：10級生物工程

學號：104177306

姓名：郭兆峰

成績：的雜種生物會從實驗室溢出，在自然界造成難以抑制的災(zāi)難，有害的雜種菌或病毒與化學物質(zhì)不同，它們會在自然界不斷繁殖，造成的危害更大。

在1975年2月，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）在加利福尼亞州的Asilomar 會議中心內(nèi)，160名來自美國和16個國家的專家學者對重組DNA的危害辯論，雖然與會代表分歧挺大，但最后也達成了一些重要的共識，在1976年6月23日美國NIH制定并公布了《重組DNA研究準則》。為了避免可能造成的危害，除了規(guī)定禁止若干類型的重組DNA實驗外，還制定了許多具體的規(guī)定條文。

六、基因工程的前景展望：基因工程技術(shù)是繼工業(yè)革命、信息革命之后 對人類社會產(chǎn)生深遠影響的一場革命。它在基因制藥、基因診斷、基因治療、基因芯片和基因克隆等技術(shù)方面取得的革命性成果，將極大地改變?nèi)祟惿蜕蠲婷病?/p>

參考文獻：

1、基因工程/樓士林，楊盛昌，龍敏南等主編.—北京：科學出版社，2002

2、基因工程技術(shù)/鐘衛(wèi)鴻主編.—北京：化學工業(yè)出版社，2007.6

3、基因工程/何水林主編.—北京：科學出版社，2008

4、基因工程原理與技術(shù)/劉志國主編.—2版.—北京：化學工業(yè)出版社，2010,12

5、基因工程：原理、方法與應(yīng)用/徐煜泉等編著.—北京：北京大學出版社，2008.12

第三篇：基因工程

《基因工程論文》

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構(gòu)建

學

院：生命科學學院 班

級：生物技術(shù)12-2 學

號：7011208209 姓

名：陳 昆 任課教師：張銳

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構(gòu)建

摘要﹕從以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長的解烴菌———地芽孢桿菌MD-2細胞中獲得了1個新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA。將基因sladA克隆到質(zhì)粒pSTE33上,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSTalk。通過電轉(zhuǎn)化將pSTalk轉(zhuǎn)化入嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3內(nèi),構(gòu)建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜熱和解烴的功能,在70℃條件下,14d后對原油的降解率達75.08%。研究結(jié)果表明,可以通過體外重組的方式向嗜熱菌中引入烴降解基因,從而構(gòu)建嗜熱解烴基因工程菌。關(guān)鍵詞:微生物采油;烴類降解菌;嗜熱解烴基因;質(zhì)粒;基因工程菌

微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要機理之一。研究結(jié)果表明,在解烴菌作用下原油的族組分發(fā)生變化,輕質(zhì)組分增加,粘度下降,改善了原油的流動性;同時,解烴菌還可以將烴類分子轉(zhuǎn)化成有機溶劑、表面活性劑、酸和氣體等驅(qū)油物質(zhì)。迄今為止,從自然界篩選的高效解烴菌絕大多數(shù)為嗜溫微生物,最適合生長溫度一般為20-45℃,很難適應(yīng)油藏的高溫環(huán)境。筆者從1株解烴菌細胞中分離出1個新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段將此基因轉(zhuǎn)化到另外1株最適合生長溫度為70℃的嗜熱菌體內(nèi),構(gòu)建了嗜熱解烴基因工程菌SL-21。該基因工程菌既具有高效的解烴功能,又能適應(yīng)油藏高溫環(huán)境,在微生物采油中具有良好的應(yīng)用前景。1.1 實驗材料

實驗材料包括限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR片斷回收試劑盒;大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coliDH5α;pGEM-T easy載體;質(zhì)粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培養(yǎng)基按文獻配制。無機鹽培養(yǎng)基組成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸餾水100mL;pH值為7.2。嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3,分離自勝利油區(qū)孤島油田中一區(qū)館3區(qū)塊采出液,最適合生長溫度為70℃;地芽孢桿菌MD-2,以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長,分離自勝利油區(qū)原油污染土壤。1.2 實驗方法

DNA的操作 基因組DNA小量提取,利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)對DNA擴增、PCR產(chǎn)物的回收、酶切與連接,質(zhì)粒DNA提取和基因序列測定等均按文獻[13-14]方法進行。菌株培養(yǎng) 所涉及到的菌株培養(yǎng)均在溫度為70℃,轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下進行振蕩培養(yǎng)?；蚬こ叹臉?gòu)建和篩選方法 ZJ-3感受態(tài)細胞的制備按文獻[13-14]方法進行。用構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSTalk在最佳條件下電轉(zhuǎn)化ZJ-3感受態(tài)細 胞構(gòu)建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB瓊脂平板上挑選10個陽性克隆接種到5mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜,獲得種子液。將該種子液接種到200mL以液蠟為惟一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5d后用CCl4抽提剩余的液蠟,用紅外測油儀測定烴的剩余量,根據(jù)菌株降解液蠟的速率篩選出目的基因工程菌。基因工程菌的誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE檢測挑取陽性克隆接種于含100μg/mL Amp的10mL的LB液體培養(yǎng)基中,180r/min下振蕩培養(yǎng)至光密度值達到0.6(檢測光波波長為600nm),加誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為1mmol/L,振蕩培養(yǎng)8h,收集表達菌體,加SDS上樣緩沖液,于100℃水浴10min后上樣,用12%的SDS-PAGE電泳檢測?；蚬こ叹涤湍芰y試 將基因工程菌接入20mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12h,以5 000r/min的速度離心5min收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌菌體1次,加20mL無菌生理鹽水懸浮,作為菌株利用烷

烴生長的種子液。取菌懸液按1%接種量接入200mL無機鹽培養(yǎng)基中,加入2%孤島油田中一區(qū)館3區(qū)塊原油或2%的液體石蠟作為惟一碳源培養(yǎng),取樣稀釋涂布計數(shù)。原油降解實驗 在無機鹽培養(yǎng)基中添加2%的原油,按1%接種量接入基因工程菌,培養(yǎng)14d。用正己烷萃取降解后的原油,用氣相色譜儀測定原油飽和烴組分的降解情況。原油降解率為菌株降解前、后原油量的差值與菌株降解前原油量的比值。2 實驗結(jié)果與分析

2.1 MD-2基因組DNA的檢測

對MD-2基因組進行提取和純化。提取后的染色體DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,相對分子質(zhì)量不小于23kb,說明提取的DNA完好。在檢測光波波長為260280nm條件下分別測出DNA的光密度,其比值為1.95,換算出DNA的質(zhì)量濃度為1 400g/mL,表明DNA純度較好,無蛋白、RNA、酚和多糖物質(zhì)的干擾。2.2 烷烴單加氧酶基因的克隆與序列分析依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院基因序列數(shù)據(jù)庫(Genbank)中的烷烴單加氧酶基因開放閱讀框兩端保守序列,設(shè)計了一對兼并引物以MD-2基因組DNA為模板進行PCR擴增,將約1.3kb的PCR產(chǎn)物回收后連接到pGEM-T easy載體上,轉(zhuǎn)入E.coliDH5α,挑取陽性克隆質(zhì)粒進行測序。測序結(jié)果經(jīng)Genbank檢索,表明該DNA序列是個新的烷烴單加氧酶基因,命名為sladA。2.3 基因工程菌的構(gòu)建及篩選

通過PCR擴增sladA后,將PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分離純化出1 329bp的片斷,與經(jīng)EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33質(zhì)粒連接,構(gòu)建成含sladA的重組質(zhì)pSTalk。經(jīng)電泳鑒定表明(圖1),重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的誘導(dǎo)表達

由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE圖譜可見(圖2),在烷烴單加氧酶基因sladA對應(yīng)蛋白大小的地方掃描到高信號強度,表明sladA基因在SL-21中得以表達。2.5 基因工程菌SL-21碳源生長

基因工程菌SL-21在以原油和液體石蠟為惟一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng),在70℃和180r/min條件下,經(jīng)過3d的延滯期后進入對數(shù)期,菌體數(shù)增加。17d后,菌體數(shù)為接菌初期的5倍,表明SL-21能夠利用原油或液體石蠟作為惟一碳源生長。2.6 對原油的降解作用

由原油飽和烴組分的降解情況可看出(圖3),基因工程菌對原油有很明顯的降解效果,幾乎將飽和烴降解完全。經(jīng)對氣相色譜各峰面積對比,計算出各峰面積的含

量和飽和烴組分降解率(表2)。基因工程菌SL-21對原油的降解率為75.08%。

實驗結(jié)果表明,烴類降解菌地芽孢桿菌MD-2細胞提取的烷烴單加氧酶基因sladA可以在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中表達。但不同的基因工程菌株中烷烴單加氧酶基因sladA表達的效率不同,需要通過菌株對原油的降解評價進一步篩選。獲得的對原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高溫條件下生長,并且對原油降解效果明顯。因此以體外重組方式向嗜熱菌中引入烴類降解基因構(gòu)建嗜熱解烴基因工程菌在技術(shù)上是可行的。3 結(jié)論

以地芽孢桿菌MD-2為目標菌株,克隆和表達了降解長鏈烷烴的單加氧酶基因sladA,并在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中正確表達了基因sladA,構(gòu)建了基因工程菌SL-21?；蚬こ叹鶶L-21在70℃條件下,能以原油或液體石蠟為惟一碳源生長。14d對原油的降解率為75.08%,對原油飽和烴組分均有明顯的降解效果。該基因工程菌既可以用于微生物驅(qū)油技術(shù),又可以用于高溫油田污水的生物處理。利用基因工程的方法可以獲得既能耐受極端環(huán)境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌種選育的重要方向。參考文獻: [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烴降解菌的篩選及性能研究[J].大慶石油地質(zhì)與開發(fā),2007,26(6):119-123.[2] 汪衛(wèi)東,汪竹,耿雪麗,等.美國微生物采油技術(shù)現(xiàn)場應(yīng)用效果分析[J].油氣地質(zhì)與采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁長忠,宋永亭,段傳慧.微生物采油用營養(yǎng)物質(zhì)在石英砂上的靜態(tài)和動態(tài)吸附規(guī)律[J].油氣地質(zhì)與采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龍,董漢平,俞理,等.微生物提高采收率數(shù)值模擬研究現(xiàn)狀[J].油氣地質(zhì)與采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花麗.本源微生物降解原油的飽和烴色譜分析[J].油氣地

質(zhì)與采收率,2008,15(1):77-79.[6] 宋智勇,張君,馬繼業(yè),等.微生物菌液的界面特性[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(3):73-75.[7] 蔣焱,曹功澤,趙鳳敏,等.聚合物驅(qū)后微生物提高采收率的可行性分析[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(5):63-65,68.[8] 陳愛華,方新湘,呂秀榮,等.克拉瑪依油田內(nèi)源微生物驅(qū)油機理探索[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(5):75-77.[9] 宋紹富,劉菊榮,張忠智.微生物采油替代營養(yǎng)源的研究[J].油氣地質(zhì)與采收率,2007,14(2):96-98.[10]李希明.微生物驅(qū)替盲端類剩余油的微觀實驗[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(3):91-92.[11]沈萍.微生物學[M].北京:高等教育出版社,2000:143.[12]唐赟,馮露,劉沐之,等.嗜熱解烴菌NG80-2的鑒定及其特[J].南開大學學報,2006,39(2):46-50,70.[13] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.分子克隆實驗指南[M].金冬雁,譯.北京:科學出版社,1992.[14]盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學實驗技術(shù)[M].2版.北京:高等教育出版社,1993.4

第四篇：基因工程

基因工程技術(shù)的程序與應(yīng)用

【摘要】基因工程技術(shù)是一項正在蓬勃發(fā)展的技術(shù)，它將給人類社會帶來一場深刻的變革，我們有必要了解基因工程的概念、原理、技術(shù)程序，以及基因工程在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用和進展情況。

【關(guān)鍵詞】基因工程技術(shù)程序應(yīng)用進展

基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學為理論基礎(chǔ)，以分子生物學和微生物學的現(xiàn)代方法為手段，在分子水平上對基因進行復(fù)雜的操作，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細胞，使這個基因能在受體細胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當?shù)墓ぞ呙高M行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶”，進行正常的復(fù)制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠緣雜交的不親和障礙?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。

一 基因工程的技術(shù)程序

基因工程的基本原理是在體外將不同來源的DNA進行剪切和重組，形成鑲嵌DNA分子，然后將之導(dǎo)入宿主細胞，使其擴增表達，從而使宿主細胞獲得新的遺傳特性，形成新的基因產(chǎn)物。它有3個基本的步驟：①從合適材料分離或制備目的基因或DNA片段。②目的基因或DNA片段與載體連接作成重組DNA分子。③重組DNA分子引入宿主細胞，在其中擴增和表達。不同種類生物的生物學特性不同，其基因工程在操作上和具體技術(shù)上必然有所差異，但技術(shù)核心都是DNA的重組，即利用一系列的DNA限制性內(nèi)切酶、連接酶等分子手術(shù)工具，在某種生物DNA鏈上切下某個目標基因或特殊的DNA片段，然后根據(jù)設(shè)計要求，將其接合到受體生物DNA鏈上。

一個完整的用于生產(chǎn)生產(chǎn)目的的基因工程技術(shù)程序包括的基本內(nèi)容有：①外源目標基因的分離、克隆以及目標基因的結(jié)構(gòu)與功能研究。②適合轉(zhuǎn)移、表達載體的構(gòu)建或目標基因的表達調(diào)控結(jié)構(gòu)重組。③外源基因的導(dǎo)入。④外源基因在宿主基因組上的整合、表達及檢測與轉(zhuǎn)基因生物的篩選。⑤外源基因表達產(chǎn)物的生理功能的檢定。⑥轉(zhuǎn)基因新品系的選育和建立以及轉(zhuǎn)基因新品系的效益分析。⑦生態(tài)與進化安全保障機制的建立。⑧消費安全評價。

（一）外源目標基因的分離、克隆及功能結(jié)構(gòu)分析

獲合乎人類某種需要的取目的基因是實施基因工程的第一步，也是開展一項基因工程的前提和全部工作的核心。目前人們已經(jīng)能夠通過多種途徑和方法來獲取目標基因，其中主要有兩條途徑：一條是從供體細胞的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因。

直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞，讓供體細胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分別在各個受體細胞中大量復(fù)制（在遺傳學中叫做擴增），1

從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。用鳥槍法獲得目的基因的優(yōu)點是操作簡便，缺點是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核細胞的基因含有不表達的DNA片段，一般使用人工合成的方法。

目前人工合成基因的方法主要有兩條。一條途徑是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對的原則，推測出它的基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就可以通過人工合成基因的方法獲得。

（二）構(gòu)建能在受體生物細胞中表達的重組目標基因

要使一個外源目標基因能整合到受體細胞的基因組中并能在整合后在受體基因組的調(diào)控下有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，就必須事先對目標基因的功能結(jié)構(gòu)用DNA重組技術(shù)進行適當?shù)男揎?，也就是將目標基因與一種特別的DNA分子重組，這種特別的DNA分子稱為基因載體，目前所用的載體主要有以下幾類：質(zhì)粒、λ噬菌體、柯斯質(zhì)粒、病毒載體、YAC載體等，各類載體具有獨特的生物學特性，可用于不同的目標基因。

（三）外源重組目標基因的導(dǎo)入

將重組的外源目標基因轉(zhuǎn)入到宿主細胞中的過程稱為基因?qū)牖蚧蜣D(zhuǎn)移。接受外源基因的細胞稱為受體細胞。由于受體生物學特征的不同以及基因工程目的不同，外源基因?qū)氲姆椒ㄒ膊煌?，有的是用載體導(dǎo)入，有的是直接用物理的方法導(dǎo)入。目前使用的有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔導(dǎo)入法、基因槍射入法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法等，向細菌等微生物中導(dǎo)入外源目標基因常用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和噬菌體轉(zhuǎn)染方法；向植物細胞中導(dǎo)入外源基因常用基因槍注入法和Ti質(zhì)粒導(dǎo)入法；能由原生質(zhì)體再生出植株的植物細胞還可以用電穿孔導(dǎo)入法及脂質(zhì)體融合法；動物的受精卵一般通過人工顯微鏡注射法導(dǎo)入外源基因；動物的體細胞可用電穿孔法和病毒轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入外源基因，但對用于生產(chǎn)目的的基因工程常常避免用病毒轉(zhuǎn)染法。

（四）轉(zhuǎn)基因細胞或個體的鑒別和篩選

在對宿主的細胞進行了外源目標基因?qū)胩幚硪院?，有些細胞可能并沒有外源基因的進入，另有一些細胞可能在外源基因進入后因各種原因而不能使外源基因表達，因此必須對被進行了基因轉(zhuǎn)移處理的細胞或個體進行鑒別，以篩選出導(dǎo)入外源目標基因的轉(zhuǎn)基因細胞或個體。鑒別和篩選轉(zhuǎn)基因生物一般在兩個層面上進行：一是檢測目標基因是否表達，二是檢測目標基因是否整合到了宿主的染色體上和能否穩(wěn)定傳代。表達檢測的方法主要有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的印跡雜交法、免疫印跡檢測法、免疫組織化學檢測法等。整合檢測可通過DNA分子雜交來確定。

（五）轉(zhuǎn)基因品系的效益分析。

一個生產(chǎn)性能優(yōu)越的轉(zhuǎn)基因品系，首要的條件是目標基因的表達產(chǎn)物必須有正常的生理功能，另一個必要標志是其目標基因必須有適度的高效表達特性和可持續(xù)生產(chǎn)能力。

（六）生態(tài)與進化安全保障

由于轉(zhuǎn)基因生物與其他生物一樣具有可遺傳、易擴散及自主的特性，而且人類對生命、生態(tài)系統(tǒng)、生物的演化實際上還知之甚少，對不同物種間基因的人工組合，外源基因?qū)κ荏w生物進化的可能影響，轉(zhuǎn)基因生物對生態(tài)系統(tǒng)的長期影響

等都無法進行評估，因此如果人們不事先采取控制措施，轉(zhuǎn)基因生物一旦進入到自然環(huán)境中就可能打破生態(tài)平衡，破壞生態(tài)環(huán)境和自然種質(zhì)資源。對轉(zhuǎn)基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法：物理的方法就是通過各種嚴格的管理措施和物理屏障盡量使轉(zhuǎn)基因生物不能從實驗室逃逸進入到自然環(huán)境里去；生物的方法一般就是造成轉(zhuǎn)基因生物與非轉(zhuǎn)基因生物之間的生殖隔離，如利用三倍體不育的特性將用于生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物或植物變成三倍體等。

（七）消費安全評價

消費安全評價一般要考慮以下一些主要的方面：①導(dǎo)入外源目標基因本身編碼的產(chǎn)物是否安全。②外源目標基因是否穩(wěn)定。③使用的載體是否安全。④使用的報道基因（就是能產(chǎn)生很容易觀察的性狀的基因）是否會產(chǎn)生有害物質(zhì)。⑤外源基因?qū)牒笫欠駮T導(dǎo)受體生物產(chǎn)生新的有害遺傳性狀或不利于健康的成分。為了保護人類的健康，許多國家都已通過立法或其他形式對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行消費安全評價和嚴格的管理，對進口轉(zhuǎn)基因食品嚴格限制。

二 基因工程的應(yīng)用

基因工程在醫(yī)藥業(yè)中的應(yīng)用。許多藥品的生產(chǎn)是從生物組織中提取的。受材料來源限制產(chǎn)量有限，其價格往往十分昂貴。微生物生長迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應(yīng)藥物成分的基因?qū)胛⑸锛毎麅?nèi)，讓它們產(chǎn)生相應(yīng)的藥物，不但能解決產(chǎn)量問題，還能大大降低生產(chǎn)成本。如基因工程胰島素、干擾素、人造血液、白細胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，均為解除人類的病苦，提高人類的健康水平發(fā)揮了重大的作用。

基因診斷與基因治療。遺傳病是長期困擾人類的一類不治之癥，迄今已發(fā)現(xiàn)的有3000多種。其根源于遺傳基因存在缺陷，主要特征是可隨生育而傳代?；蛑委熓前颜；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達到治療疾病的目的，這是治療遺傳病的最有效的手段?；痉椒ㄊ牵夯蛑脫Q、基因修復(fù)、基因增補和基因失活等。如運用基因工程設(shè)計制造的“DNA探針”檢測肝炎病毒等病毒感染及遺傳缺陷，不但準確而且迅速。通過基因工程給患有遺傳病的人體內(nèi)導(dǎo)入正?；蚩伞耙淮涡浴苯獬∪说募部?。

基因工程在農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)上的應(yīng)用。運用基因工程技術(shù)，不但可以培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗性好的農(nóng)作物及畜、禽新品種，還可以培養(yǎng)出具有特殊用途的動、植物。如轉(zhuǎn)基因魚（生長快、耐不良環(huán)境、肉質(zhì)好），轉(zhuǎn)基因牛（乳汁中含有人生長激素），轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒，轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄，轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯，不會引起過敏的轉(zhuǎn)基因大豆，抗蟲棉等。

基因工程在環(huán)境保護工業(yè)方面的應(yīng)用。基因工程做成的DNA探針能夠十分靈敏地檢測環(huán)境中的病毒、細菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況，卻不易因環(huán)境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉(zhuǎn)化污染物。如有一種超級細菌，能快速分解石油，可用于清除被石油污染的海域。這種超級菌是美國科學家用基因工程方法，把降解不同石油化合物的基因移植到一個菌株內(nèi)而產(chǎn)生的。

總之，基因工程的發(fā)展將會給人類社會帶來巨大的變化。

三 基因工程的進展狀況

基因工程技術(shù)是一項正在蓬勃發(fā)展的技術(shù)，而且也已經(jīng)取得了許多重要的應(yīng)用成果，但我們也應(yīng)該看到，基因工程技術(shù)不是一項已經(jīng)成熟的技術(shù)，仍然還很粗糙和原始，在許多方面尚需完善和改進。

1．基因工程在技術(shù)上存在一定的不確定性和盲目性。目前的基因工程在技術(shù)上有很多的不確定性。這種不確定性表現(xiàn)在兩個方面，一是技術(shù)方面的不穩(wěn)定性，二是由于對不同生物的生理特性的了解不很深入，如我們將魚類抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)移到不抗寒的羅非魚等熱帶魚中，雖然抗凍蛋白基因得到表達，但并沒有使受體魚產(chǎn)生預(yù)期的抗寒效果。目前我們所進行的基因工程基本上只能對簡單的、單基因控制的性狀進行設(shè)計和改造，操作對象只限于一些比較簡單的單因子基因。但生物絕大部分的重要性狀是由多個基因共同控制的，對這些多基因控制的性狀，現(xiàn)有的基因工程技術(shù)幾乎仍然是束手無策。我們對活的生物體中基因表達調(diào)控的機制知之甚少，有關(guān)的知識僅限于對啟動子和增強子有所了解，對生物體整體的調(diào)節(jié)復(fù)雜性的認識還剛剛開始。

2．在安全性方面存在著不確定性。對社會大眾來說，最主要和最關(guān)心的是基因工程的安全性問題，基因工程的安全性問題包括兩個方面：一是基因工程產(chǎn)品的消費安全問題，二是轉(zhuǎn)基因生物的生態(tài)安全問題。目前用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)出來的食品因其成分的某些改變是否會對人類的健康產(chǎn)生不良的影響，這需要實驗和時間來驗證。有著某種生存優(yōu)勢的轉(zhuǎn)基因生物如果進入到自然生態(tài)系統(tǒng)，就有可能排擠自然種群，降低生態(tài)系統(tǒng)里物種的多樣性，打破生態(tài)平衡。

所以我們在大力發(fā)展轉(zhuǎn)基因技術(shù)的同時，必須高度重視對轉(zhuǎn)基因動物、植物及微生物品種的生物控制和控制技術(shù)的研究。在轉(zhuǎn)基因品種的安全性沒有進行全面的評估和沒有可靠的生物控制措施之前，應(yīng)嚴格禁止其進行生產(chǎn)和進入開放的自然生態(tài)系統(tǒng)，只有其生態(tài)安全性達到了傳統(tǒng)育種方法培育的新品種時，或無生殖能力的轉(zhuǎn)基因動物和植物才能允許進入自然界進行生產(chǎn)，也只有這樣才是有益于人類和社會進步的。

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第五篇：材料基因工程

材料基因工程

——為什么是一項“顛覆性前沿技術(shù)”

1.前言

材料基因組技術(shù)是近幾年興起來的材料研究新理念和新方法，是當今世界材料科學與工程領(lǐng)域的最前沿。材料基因工程借鑒人類基因組計劃，探究材料結(jié)構(gòu)與材料性質(zhì)變化的關(guān)系。并通過調(diào)整材料的原子或配方、改變材料的堆積方式或搭配，結(jié)合不同的工藝制備，得到具有特定性能的新材料。但是材料基因組與人類基因組的又有很大的區(qū)別，材料的微觀結(jié)構(gòu)多樣化，不但成分組成可以不同，微觀形貌等結(jié)構(gòu)也可能千差萬別，其組成-結(jié)構(gòu)-性能之間的關(guān)系更加復(fù)雜。

2.材料基因組技術(shù)

2.1材料基因組技術(shù)

材料基因組計劃是通過“多學科融合”實現(xiàn)“高通量材料設(shè)計與試驗”；其核心目標在于通過“高通量計算、實驗和大數(shù)據(jù)分析”技術(shù)加速材料“發(fā)現(xiàn)-研發(fā)-生產(chǎn)-應(yīng)用”全過程，縮短材料研發(fā)周期，降低材料研發(fā)成本，引發(fā)新材料領(lǐng)域的科技創(chuàng)新和商業(yè)模式變革。

材料基因組技術(shù)包括高通量材料計算方法、高通量材料實驗方法和材料數(shù)據(jù)庫三大組成要素。

2.1.1高通量材料計算方法

高通量計算是指利用超級計算平臺與多尺度集成化、高通量并發(fā)式材料計算方法和軟件結(jié)合，實現(xiàn)大體系材料模擬、快速計算、材料性質(zhì)的精確預(yù)測和新材料的設(shè)計，提高新材料篩選效率和設(shè)計水平，為新材料的研發(fā)提供理論依據(jù)。其中并發(fā)式材料計算方法包括第一原理計算方法、計算熱力學方法、動力學過程算法等，跨越原子模型、簡約模型和工程模型等多個層次，并整合了從原子尺度至宏觀尺度等多尺度的關(guān)聯(lián)算法。

高通量材料集成計算技術(shù)利用第一性原理、分子動力學與位錯動力學、合金相圖計算、相場計算等方法，快速并行模擬實驗室中成分與性能優(yōu)化的傳統(tǒng)試錯式材料研發(fā)過程，并基于材料科學知識，迅速挑選有利于目標性能的合金成分與微觀結(jié)構(gòu)特征，從而加速新材料的研發(fā)進程并顯著降低材料研發(fā)成本。

2.1.2高通量材料實驗方法

傳統(tǒng)材料研發(fā)模式依賴于成分與工藝的不斷“試錯”實驗優(yōu)化，結(jié)合對結(jié)構(gòu)-性能關(guān)系的不斷理解以獲得滿足性能指標的材料。但是，新型關(guān)鍵材料具有成分多元化、復(fù)雜化、微結(jié)構(gòu)多級化等特點，傳統(tǒng)的“試錯”模式在實際材料開發(fā)中不僅耗費巨大，而且?guī)缀蹼y以取得成功。

高通量實驗平臺是發(fā)展材料基因組技術(shù)具備的條件之一。高通量實驗平臺可以為據(jù)庫提供數(shù)據(jù)支撐；而就高通量集成計算而言，高通量實驗技術(shù)為各種計算模擬工作提供計算目標。材料基因組概念中的高通量實驗技術(shù)具有快速制備快速表征各類金屬與非金屬樣品的能力，典型的高通量實驗方法有擴散多元結(jié)與材料基因芯片

2.1.3材料數(shù)據(jù)庫

數(shù)據(jù)可以看作是感興趣參量的具體數(shù)值，這些參量在空間與時間上的一系列數(shù)值就構(gòu)成數(shù)據(jù)集，不同的數(shù)據(jù)集結(jié)合到一起并按照一定的協(xié)議實現(xiàn)相互調(diào)用，體量巨大、結(jié)構(gòu)性的數(shù)據(jù)集就構(gòu)成大數(shù)據(jù)。利用物理層面的分布式服務(wù)器對隨時間不斷膨脹的數(shù)據(jù)集進行存放，利用通訊協(xié)議實現(xiàn)服務(wù)器中數(shù)據(jù)集的遠程調(diào)用與管理，利用專門的算法對不同數(shù)據(jù)集自身和數(shù)據(jù)集之間進行分析并提取有價值的信息，并用專門的軟件實現(xiàn)數(shù)據(jù)分析的可視化，就構(gòu)成了基于大數(shù)據(jù)方法的材料數(shù)據(jù)庫技術(shù)。

材料信息學通過數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)分析與數(shù)據(jù)協(xié)作，實現(xiàn)從已有數(shù)據(jù)中提取高價值信息和知識的目的。由于計算材料數(shù)據(jù)庫是綜合物理，化學及生物的交叉學科的數(shù)據(jù)庫。因此，材料數(shù)據(jù)庫的建立，有利于減少材料的重復(fù)實驗和測試，對縮短新材料的研發(fā)周期，節(jié)約新材料的研發(fā)成本具有非常積極的作用

2.2結(jié)論

材料計算模擬是實現(xiàn)“材料按需設(shè)計”的基礎(chǔ)，可以幫助縮小高通量材料實驗范圍，提供實驗理論依據(jù)；高通量材料實驗起著承上啟下的角色，既可以為材料模擬計算提供海量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和實驗驗證，也可以充實材料數(shù)據(jù)庫，并為材料信息學提供分析素材，同時還可以針對具體應(yīng)用需求，直接快速篩選目標材料；材料數(shù)據(jù)庫可以為材料計算模擬提供計算基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為高通量材料實驗提供實驗設(shè)計的依據(jù)，同時計算和實驗所得的材料數(shù)據(jù)亦可以豐富材料數(shù)據(jù)庫的建設(shè)。

3．結(jié)論

材料基因組技術(shù)融合了材料科學、固體力學、信息科學、軟件工程、先進實驗方法等學科，采用數(shù)值模擬、數(shù)據(jù)庫及數(shù)據(jù)挖掘、人工智能等技術(shù)研究材料的工藝過程、微/細觀結(jié)構(gòu)、性能和服役行為等，闡明成分、微結(jié)構(gòu)和工藝對性能的控制機制，引導(dǎo)并支撐實體材料的研發(fā)和應(yīng)用。

在材料基因工程提出之前，新材料從研發(fā)到市場應(yīng)用實踐跨度非常大，某種材料從最初的研究開發(fā)，經(jīng)過性能優(yōu)化、系統(tǒng)設(shè)計與集成、驗證、制造再到投入市場通常需要10-20年時間。部分原因是一直以來過度依賴對材料研發(fā)的科學自覺與實驗判斷，目前大部分材料的設(shè)計與測試時通過耗時的重復(fù)實驗完成的、而實際上，有些實驗通過理論計算工具就能完成模擬。材料基因工程采用強大的計算分析和理論模擬工具，減少新材料研發(fā)和生產(chǎn)過程中對物理實驗的依賴。改進的數(shù)據(jù)共享系統(tǒng)和一體化的工程團隊將允許設(shè)計、系統(tǒng)工程與生產(chǎn)活動的重疊與互動。這種新的綜合設(shè)計將結(jié)合更多的計算與信息技術(shù)，加上實驗與表征方面的進步，將顯著加快材料投入市場的種類及速度，材料的開發(fā)周期可從目前的 10~20 年縮短為 5~10 年。因此說材料基因組技術(shù)是一項“顛覆性前沿技術(shù)”

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