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      基因工程課程設(shè)計(范文)

      時間:2019-05-14 09:01:03下載本文作者:會員上傳
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      第一篇:基因工程課程設(shè)計(范文)

      RNA干擾研究進展

      摘要 :RNA干擾(RNAi)是廣泛存在于真菌、動物、植物的一種自身調(diào)控機制,是雙鏈RNA誘發(fā)的使同源mRNA高效特異性降解的基因沉默現(xiàn)象,也是近幾年生命科學(xué)的研究熱點,具有廣泛的應(yīng)用前景。本文主要介紹了RNAi的發(fā)現(xiàn)、作用機理和在各個領(lǐng)域的應(yīng)用。關(guān)鍵詞: RNAi;dsRNA;siRNA;RISC;基因沉默

      Progress of the study on RNA interference Abstract: RNAi is somekind Self-regulatory mechanism which widely exists in epiphyte, plants and animals,it is a phenomenon of gene silencing induced by double strandRNA,and also is the hotspot on life science with a wide range of application prospects.This study aimed to introduce the discovery , Mechanism and the apply in some fields of RNAi.Key words: RNAi;dsRNA;siRNA;RISC;Gene silencing RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)誘發(fā)的導(dǎo)致同源mRNA高效特異性降解的基因沉默現(xiàn)象。當(dāng)細胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時,該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達沉默。與其它基因沉默現(xiàn)象不同的是,在植物和線蟲中,RNAi具有傳遞性,可在細胞之間傳播,此現(xiàn)象被稱作系統(tǒng)性RNA干擾(systemic RNAi)。RNAi是基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種方式,是生物界古老而且進化的高度保守的現(xiàn)象之一。

      RNAi廣泛存在于生物界,是生物體抵御病毒或其它外來核酸入侵以及保持自身遺傳穩(wěn)定的保護性機制。RNAi是通過siRNA介導(dǎo)的特異性高效抑制基因表達途徑,由siRNA介導(dǎo)識別并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反應(yīng)特征,反應(yīng)中需要多種蛋白因子以及ATP的參與。RNAi在基因功能研究和基因藥物應(yīng)用具有廣泛的前景。1.RNAi的發(fā)現(xiàn)歷史

      1990年,為加深矮牽?;ǖ淖仙?,Jorgensen等導(dǎo)入了一個強啟動子控制的色素基因,可是結(jié)果與預(yù)期相反,許多花瓣顏色并未加深,反而呈雜色甚至白色,這是由于轉(zhuǎn)基因和同源內(nèi)源基因的表達都被抑制了,Jorgensen把這個現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression)。

      1995年,Guo等發(fā)現(xiàn)注射正義RNA和反義RNA均能有效并特異性地抑制秀麗新小桿線蟲par-1基因的表達,該結(jié)果不能使用反義RNA技術(shù)的理論做出合理的解釋。

      1998年,F(xiàn)ire和Tabara首次將雙鏈dsRNA—正義鏈與反義鏈的混合物注入線蟲,結(jié)果表現(xiàn)出比單獨注入單鏈要強得多的沉默,并且導(dǎo)致子一代同源基因的沉默,這也是人們第一次應(yīng)用RNAi技術(shù)。

      隨后,Hammond還發(fā)現(xiàn),不僅在線蟲中,在果蠅的研究中同樣發(fā)現(xiàn)RNAi,盡管采用能生產(chǎn)dsRNA的酵母喂食果蠅的實驗以失敗告終,但是通過顯微注射或者通過基因槍將dsRNA注入果蠅胚胎中或者將帶有反向重復(fù)序列的DNA導(dǎo)入果蠅中能夠引發(fā)基因沉默。后來RNAi相繼在錐形蟲(trypanosomes)、渦蟲(planarian)、水螅(hydra)、斑馬魚(zebrafish)、真菌(fungi)、植物以及小鼠等不同種屬的生物體中得以發(fā)現(xiàn)。

      2002年,Zernicka-Coetz等用雙鏈RNA注射小鼠受精卵和著床前的胚胎,結(jié)果發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入的雙鏈RNA可以特異性地抑制C-mos(c-mos是莫洛尼氏鼠類肉瘤病毒癌基因的同源基因)、鈣粘附蛋白(E-cadherin)和綠色熒光蛋白(GFP)基因的表達。JudyLiebem1an和Premlata Shankar首先向公眾宣布了在動物中利用RNAi技術(shù)治療疾病的研究進展。

      由于Fire和Mello解釋了先前Guo S等無法解釋的基因抑制現(xiàn)象而于2006年被授予諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。2.RNAi的作用機制

      目前有關(guān)RNAi在植物、動物、果蠅中的研究表明其大體分為起始階段、效應(yīng)階段、循環(huán)階段。

      2.1起始階段 2.1.1 dsRNA的形成

      細胞中dsRNA的形成是RNAi 的第一步。外源DNA、RNA序列均可引起細胞產(chǎn)生相應(yīng)的dsRNA,dsRNA可以是一個RNA分子回折自身互補而形成分子內(nèi)雙鏈,也可以是分開的兩個RNA分子互補形成的分子間雙鏈。如基因組中DNA 反向重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者同時轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA 或者病毒RNA 復(fù)制中間體以及以細胞中單鏈RNA 為模板由細胞或病毒的RNA 依賴的RNA 聚合酶(RdRp)催化合成dsRNA等。在線蟲(c.elegans)可以直接注射dsRNA 或把線蟲浸泡在含dsRNA 溶液中等方式引入外源dsRNA ,還可以通過喂養(yǎng)表達正義和反義RNA 的細菌獲得dsRNA。

      2.1.2 siRNA的形成和參與RNAi的蛋白因子

      當(dāng)細胞中的dsRNA擴增達到一定量時,dsRNA會在一種具有RNase Ⅲ樣活性的核酸酶作用下加工裂解成21~23 nt(nucleotide)由正義和反義序列組成的小分子干擾RNA片段(small interferingRNAs,siRNA),每個siRNA分子互補雙鏈兩側(cè)3′末端具有2 nt的突出,5′端的磷酸基團會被一種特殊的激酶保護起來。

      果蠅中RNase III 樣核酸酶稱為Dicer。Dicer 含有解旋酶(helicase)活性以及dsRNA 結(jié)合域。迄今為止已鑒定出包括Dicer在內(nèi)的若干個與RNAi有關(guān)的蛋白因子。在果蠅(Drosophila melanogaster)RISC中,已知存在著稱為Argonaute2(AGO2)的因子,AGO2蛋白的表達受到抑制時,RNAi效應(yīng)缺失,也就是說AGO2是果蠅RNAi機制的必須因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性(slicer activity),RNAi機制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主導(dǎo)。另外,幾個RNA解旋酶(RNA helicase)也被鑒定為參與RNAi機制的因子。

      在秀麗隱桿線蟲(C.elegans)的RNAi中必須的因子有EGO1。這是一種RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase),植物中也存在該蛋白同系物。RNAi中RdRP是將標(biāo)靶mRNA作為模板,以導(dǎo)入的dsRNA(或siRNA)作為引物合成RNA,在細胞內(nèi)針對于標(biāo)靶mRNA合成新siRNA的酶。這一反應(yīng)在一些生物的RNAi中為必須,但RdRP活性在人和果蠅的RNAi中是非必須的,這說明在不同物種之間RNAi機制的基本框架雖然相同,但存在著微妙差異。2.1.3 siRNA的結(jié)構(gòu)特點

      已發(fā)現(xiàn)在擬南芥(Arabidopsis)、線蟲(c.elegans)、裂殖酵母(charomyces)以及哺乳動物中也存在Dicer 同類物干擾性小RNA(small interfering RNA ,或short interfering RNAs , siRNA)是RNAi賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。

      siRNA 是一類長約21~25 個核苷酸(nt)的特殊雙鏈RNA(dsRNA)分子,具有特征性結(jié)構(gòu),即siRNA 的序列與所作用的靶mRNA 序列具有同源性,siRNA 兩條單鏈末端為5′端磷酸和3′端羥基,此外,每條單鏈的3′端均有2~3 個突出的非配對的堿基。

      The structure of siRNA 對于體外人工合成的siRNA 來說,其活性發(fā)揮完全需要其雙鏈中與靶RNA 互補的一條鏈5′端磷酸化,有時也需要與靶RNA 序列一致的另一條鏈5′端磷酸化。5′端磷酸化的siRNA 其活性明顯高于非磷酸化siRNA。

      在果蠅胚細胞裂解物中,新生成siRNA 的磷酸化由一種能特異識別siRNA 的激酶催化生成,從而允許siRNA 參與多輪靶RNA 的裂解,該過程為ATP 依賴性。這種激酶能夠區(qū)分

      siRNA 5′-核糖和5′-脫氧核糖。siRNA 的結(jié)構(gòu)特征,即長21~23 nt、雙鏈的兩端各有2 個突出的3′堿基,5′的磷酸化使siRNA 不同于其它小dsRNA ,這是細胞賴以區(qū)分真正的siRNA 和其它dsRNA 的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ), 特異性激酶只保持真正siRNA 的5′端磷酸化狀態(tài),而對其它dsRNA 不發(fā)生作用,從而保證只有真正的siRNA 才能進入RNAi 途徑并引發(fā)靶mRNA 的裂解。靶RNA 中的裂解位點受siRNA 中互補鏈5′端序列的影響,該鏈5′端的額外序列將導(dǎo)致靶RNA 中裂解位點的改變,而3′端的額外序列對靶RNA 中的裂解位點無明顯影響。因此,siRNA 5′磷酸可能充當(dāng)靶RNA 裂解位點的一種分子參照。

      Elbashir 等對果蠅胚細胞裂解物中siRNA 任意一條鏈或兩條鏈同時進行2′-脫氧或2′-氧-甲基修飾,結(jié)果siRNA 不能介導(dǎo)RNAi ,但對siRNA 3′端多個堿基進行2′-脫氧核苷酸替代修飾時仍具有RNAi作用。siRNA 識別靶序列的過程雖然高度特異,但并非siRNA 中的每一個位點對靶序列的識別均具有同等作用,siRNA 雙鏈中心的堿基錯配將不能引發(fā)靶

      RNA 的降解。

      Boutla 等研究顯示,不同的合成siRNA 可引發(fā)果蠅胚胎細胞的RNAi ,這些siRNA 的點突變僅使其基因沉默功能輕度下降,提示基因沉默機制雖然要求一定的序列特異性,但并不過分嚴格。2.2效應(yīng)階段

      siRNA的反義鏈可指導(dǎo)形成一種核酸內(nèi)切酶復(fù)合體,稱為RNA induced silencing complexes(RISC)。RISC是由多種蛋白成分組成的,包括:內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA鏈搜索活性等,其第一個亞單位為siRNA。RISC可利用結(jié)合在其上的內(nèi)切核酸酶活性切割靶mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域,從而干擾基因的表達。線C.elegans 中的MUT7(一種RNase D 樣蛋白)可能是一種3′5′-外切核酸酶。此外, PAZPPiwi 蛋白家族成員可能是RISC中的構(gòu)成組分,如Arabidposis中的AGO1 ;N.Crassa中的QDE2 ;C.elegans 中的RDE1 等,以上這些蛋白與翻譯因子eIF2C 同源。最新的研究進一步揭示,ATP 在siRNA 介導(dǎo)的RNAi 中具有重要作用。較長dsRNA 向siRNA 的轉(zhuǎn)變要有ATP 參與,siRNA 與蛋白因子形成一個無活性的約360 kD 的蛋白PRNA 復(fù)合體,隨之, siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)解旋并形成有活性的蛋白PRNA 復(fù)合體(RISC),此步具有ATP 依賴性。

      ATP 使siRNA 5′端帶上磷酸分子,且對siRNA 的功能具有重要作用。上述過程中siRNA 雙鏈結(jié)構(gòu)解旋很可能是一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)改變,因為siRNA 雙鏈體與細胞裂解物、ATP 等孵育后再除去ATP 及其它輔助因子,引導(dǎo)RISC與靶mRNA結(jié)合時,siRNA 3′端倒數(shù)第2個堿基起的作用非常大,因此此處不能出現(xiàn)錯配現(xiàn)象。2.3循環(huán)階段

      含有siRNA 的活性復(fù)合體仍能識別和切割靶mRNA 分子。siRNA 可作為一種特殊引物,在RNA 依賴RNA聚合酶(RdRp)作用下以靶mRNA 為模板合成dsRNA ,后者可被降解形成新的siRNA,新生成的siRNA又可進入上述循環(huán)。這種過程稱為隨機降解性多聚酶鏈反應(yīng)(random degradative PCR)。新生的dsRNA 反復(fù)合成和降解,不斷產(chǎn)生新的siRNA ,從而使靶mRNA 漸進性減少,呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。RdRp 一般只對所表達的靶mRNA 發(fā)揮作用,這種在RNAi 過程中對靶mRNA 的特異性擴增作用有助于增強RNAi的特異性基因監(jiān)視功能。每個細胞只需要少量dsRNA 即能完全關(guān)閉相應(yīng)基因表達,可見RNAi 過程具有生物催化反應(yīng)的基本動力學(xué)特征。siRNA特異性地與mRNA結(jié)合,siRNA作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶作用下通過類似PCR的擴增作用再次形成dsRNA,新的dsRNA又被RNAase樣的Dicer內(nèi)切酶切割產(chǎn)生次級siRNA,次級siRNA又可以進入下輪循環(huán)。3.RNAi的應(yīng)用與相關(guān)討論

      RNAi 是植物、線蟲、真菌、昆蟲、原生動物以及動物的一種強有力的基因表達抑制途徑,在生物體的發(fā)生發(fā)育及防御系統(tǒng)的構(gòu)成等方面均具有十分重要的作用。已證實無脊椎動物和植物中的RNAi 機制可抑制侵入宿主體內(nèi)的病毒和轉(zhuǎn)座子(transposon),減弱和清除其基因毒性作用。在基因工程中將一轉(zhuǎn)移基因?qū)胫参锛毎麜r出現(xiàn)的基因沉默作用也是宿主細胞的一種通過RNAi 機制實現(xiàn)的自我保護性反應(yīng)。3.1 RNAi在動植物中的應(yīng)用

      目前尚不清楚RNAi 在哺乳動物系統(tǒng)中所起的作用。哺乳動物基因組常面臨高負荷病毒和自私DNA(selfish DNA)的侵襲以及轉(zhuǎn)錄異常所帶來的危害,對這些危及正?;蚪M完整性的因素來說,RNAi 可能是整個防御網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。dsRNA 介導(dǎo)的特異性基因沉默作用也可能在哺乳動物基因表達的調(diào)控中起重要作用,例如X 基因的滅活等??傊?在動物和植物中RNAi 的功能之一是通過抑制生殖細胞中轉(zhuǎn)座子的遷移和DNA 重復(fù)序列的積累來保持基因組的完整性和穩(wěn)定性。3.2 RNAi的細胞毒作用

      此外,RNAi 也可作為一種防御機制抵抗病毒感染,2001年,Tuschl等將siRNA導(dǎo)入到哺乳動物細胞中并由此解決了在哺乳細胞內(nèi)導(dǎo)入長的雙鏈RNA時引發(fā)的干擾素效應(yīng),由此拓展了RNAi在基因治療上應(yīng)用前景。

      RNAi機制普遍存在于動植物,尤其是低等生物中。因此被認為是進化上相對保守的基因表達調(diào)控機制。一種假說為,RNAi機制是作為在RNA水平上抵御病毒入侵的防御機制而存在的。在病毒自身基因組所包含的,或在病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA可以被Dicer識別,從而引起病毒RNA降解。但是許多病毒為抵抗宿主的RNA干擾機制,會產(chǎn)生抑制宿主RNA干擾的蛋白,以保護病毒基因在宿主體內(nèi)的順利復(fù)制。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以抑制宿主RNA干擾的病毒蛋白有potyviruses編碼的HC-PRO蛋白、馬鈴薯X病毒編碼的Cmv2b蛋白、獸棚病毒編碼的B2蛋白等。RNA干擾也是抑制破壞基因結(jié)構(gòu)的一種DNA片段轉(zhuǎn)座子活性的重要方式。轉(zhuǎn)座子通常以逆轉(zhuǎn)座的方式在基因組中擴增。在逆轉(zhuǎn)座過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA分子可以被Dicer識別,從而被降解。3.3抗腫瘤方面的應(yīng)用

      腫瘤的發(fā)生是一種多基因協(xié)同作用的結(jié)果,利用RNAi技術(shù)可同時阻斷多個癌基因的轉(zhuǎn)錄表達,從而有效抑制腫瘤的生長,達到治療腫瘤的目的。

      尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)是一種在肝癌細胞中高表達的蛋白,Salvi等用RNAi技術(shù)沉默肝癌細胞中尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)的表達,結(jié)果轉(zhuǎn)染靶向uPA的siRNA的肝癌細胞其侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖能力顯著下降。Pardridge等以人表皮生長因子受體(HEGFR)為靶點,應(yīng)用RNAi技術(shù)干擾其表達從而抑制顱內(nèi)腫瘤的生長。

      腫瘤的生長具有血管依賴性血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種重要的血管生長因子。Han等報道用RNAi技術(shù)研究分析了血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)5種同型異構(gòu)體基因功能,進一步

      對血管生成基因進行敲除治療癌癥,并顯示了較好的治療結(jié)果。

      因此,用RNAi技術(shù)沉默腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中過表達的癌基因可抑制腫瘤的生長。RNAi還可用于研究與腫瘤細胞生長分化相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路,并通過干擾細胞信號傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵蛋白的表達,達到抑制腫瘤生長的作用,為惡性腫瘤的基因治療提供了新的技術(shù)方法。

      3.4 RNAi在藥物研究中的應(yīng)用

      利用RNAi能夠特異高效地抑制基因表達,獲得去基因功能表型,能夠在短時間內(nèi)大規(guī)模篩選靶點,從而實現(xiàn)了在細胞水平和動物水平篩選藥靶和評定藥靶。Hamamichi利用RNAi和基因敲除技術(shù)系統(tǒng)屏蔽帕金森病模型中將近900個候選基因和通路,找到了兩個帕金森病遺傳易感性位點和治療靶點,從而為該疾病的治療奠定基礎(chǔ)。

      RNAi在被廣泛應(yīng)用于功能基因組研究確定了大量潛在的藥物作用靶點的同時,也被證實了其作為新一代基因治療藥物的可能性。2006年,美國Acuity制藥公司生產(chǎn)的用于治療濕性老年斑病變的RNAi藥物—Bevasiranib在RNAi臨床實驗方面取得成功,它在療效、安全性方面都優(yōu)于常規(guī)藥物。

      目前,FDA已經(jīng)批準(zhǔn)Bevasiranib進入III期臨床實驗,而最終的試驗結(jié)果將于2009年獲得。

      RNAi藥物其他方面的應(yīng)用,如治療Huntington病和哮喘以及COPD也進入臨床前研究階段,但是RNAi藥物仍存在如給藥途徑、使用安全性等方面的問題。

      另外,發(fā)現(xiàn)RNAi機制中的相關(guān)一些因子如內(nèi)源性雙鏈RNA及蛋白因子可以在多種層次上對基因表達進行調(diào)控,其范圍已經(jīng)超越了PTGS(post transcriptional gene silencing),如RNAi機制同樣參與了轉(zhuǎn)錄水平上的基因表達調(diào)控過程中。

      從理論上講,RNAi技術(shù)能選擇性地沉默基因組中任何基因的表達。在實驗室中,RNAi已經(jīng)被廣泛用來研究生命現(xiàn)象的遺傳奧秘,特別是在哺乳動物中抑制那些無法敲除的基因的表達,已經(jīng)發(fā)展成為研究基因功能有利的工具。與其他幾種進行功能喪失的技術(shù)相比,RNAi技術(shù)具有明顯的優(yōu)點,它比反義RNA技術(shù)和同源共抑制更有效,更容易產(chǎn)生功能喪失,與造成的功能永久性缺失技術(shù)相比,RNAi技術(shù)更受人們青睞。而且通過與細胞特異性啟動子及可誘導(dǎo)系統(tǒng)結(jié)合使用,可以在發(fā)育的不同時期或不同器官中有選擇的進行。4.展望

      自從1998年Fire首次報導(dǎo)以來,RNAi研究迅猛發(fā)展,掀起了dsRNA介導(dǎo)的基因沉默作用分子機制及其生物學(xué)功能研究的熱潮,使RNAi成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最熱門的研究課題之一。在美國《科學(xué)》雜志評出的2002年十大科技進展的排行榜中名列榜首。

      由于RNAi干擾作用具有高效性和高特異性特點,能有效阻抑不必要或有害基因表達,對細胞及機體正常功能的發(fā)揮和維持至關(guān)重要。為多種病毒性或遺傳性疾病以及腫瘤癌癥等醫(yī)學(xué)頑癥的根治開辟了一條新的有效途徑。RNAi不僅能大大推動人類后基因組計劃的發(fā)展,還將應(yīng)用于基因治療、新藥開發(fā)、生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域。因此,RNAi的研究與應(yīng)用具有極其重要的理論和實際意義,將對醫(yī)學(xué)生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生深遠的影響。

      但我們注意到RNAi在其發(fā)展的過程中仍然存在許多問題需要解決,需要我們對它進一步研究和應(yīng)用,并在生命的各個領(lǐng)域做出貢獻。

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      第二篇:基因工程

      寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院考核答題紙

      (2011--2012學(xué)年第 學(xué)期)

      課號::EK5G04A00

      課程名稱:現(xiàn)代生物技術(shù)概論

      閱卷教師:

      班級:10級生物工程

      學(xué)號:104177306

      姓名:郭兆峰

      成績:

      基因工程

      摘要:基因工程是20世紀70年代在分子遺傳學(xué)、細胞生物學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,是一種可以按照人們的意愿設(shè)計、改造和組建生物品種的新技術(shù)。包括它通過基因操作,將目的基因活DNA片段與合適的載體連接轉(zhuǎn)入目標(biāo)生物細胞,通過復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯外源目的基因以及蛋白質(zhì)的活性表達,使轉(zhuǎn)基因生物獲得新的遺傳性狀。

      關(guān)鍵詞:生物技術(shù);基因工程

      一、基因工程的誕生:

      從20世紀40年代開始,受分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)發(fā)展的影響,基因分子生物學(xué)取得巨大進步,為基因工程的誕生奠定了基礎(chǔ)?,F(xiàn)在人們公認的誕生日期是1973年,其中現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域上的三大發(fā)現(xiàn)及技術(shù)上的三大發(fā)明起了決定性作用。

      理論上的三大發(fā)現(xiàn)包括:第一,20世紀40年代,Avery 在美國的一次學(xué)術(shù)會上報道了肺炎球菌的轉(zhuǎn)化,證明了遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì);第二,1953年,Watson 和 Crick 提出的DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)以及半保留復(fù)制機理,解決了基因的自我復(fù)制和傳遞問題;第三,20世紀50年代末的“中心法則”,60年代由Monod 和 Jacob 提出的操縱分子學(xué)說,并成功的由一批科學(xué)家破譯了遺傳密碼從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題。

      以上問題的解決使得人們自主改造生物遺傳性狀從理論上成為現(xiàn)實。

      技術(shù)上的三大發(fā)明:第一,1967年發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶,以及1979年發(fā)現(xiàn)的具有更高活性的T4 DNA連接酶。在1970年Smith和 Wilcox從流感嗜血桿菌中分離并純化的限制性核酸內(nèi)切酶HindⅡ和1972年發(fā)現(xiàn)的EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶。后來發(fā)現(xiàn)的大量的限制性核酸內(nèi)切酶。第二,一些病毒、質(zhì)粒和噬菌體等載體技術(shù)的發(fā)現(xiàn)使把目的基因的導(dǎo)入更加容易。第三,DNA分子序列分析及瓊脂糖凝膠電泳、Southern雜交技術(shù)的發(fā)展使得基因工程的誕生越來越近。1973年,斯坦福大學(xué)將抗四環(huán)素質(zhì)粒和抗新霉素的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶切割并連接成重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中是基因工程誕生的標(biāo)志。

      二、基因工程有幾個重要特征:(1)、打破了物種的界限,實現(xiàn)跨物種的基因轉(zhuǎn)移;(2)、通過已知功能基因的遺傳轉(zhuǎn)化,進行物種的定向改良;(3)、創(chuàng)造出自然界中本來不存在的物種。

      三、基因工程技術(shù)流程包括:(1)、目的基因克隆,即從特定生物基因組和cDNA中分離提純和擴大繁殖目的基因;(2)、選擇合適的載體,并對載體DNA進行克??;(3)、將目的基因與載體寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院考核答題紙

      (2011--2012學(xué)年第 學(xué)期)

      課號::EK5G04A00

      課程名稱:現(xiàn)代生物技術(shù)概論

      閱卷教師:

      班級:10級生物工程

      學(xué)號:104177306

      姓名:郭兆峰

      成績:

      連接;(4)、將重組DNA導(dǎo)入到大腸桿菌或酵母菌體內(nèi)培養(yǎng);(5)、利用載體上的標(biāo)記基因進行篩選,獲得轉(zhuǎn)目的基因的細胞或植株。

      四、基因工程的應(yīng)用:

      (1)基因工程應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面:農(nóng)業(yè)領(lǐng)域是目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域之一。農(nóng)作物生物技術(shù)的目的是提高作物產(chǎn)量,改善品質(zhì),增強作物抗逆性、抗病蟲害的能力。基因工程在這些領(lǐng)域已取得了令人矚目的成就。

      (2)基因工程應(yīng)用于醫(yī)藥方面:目前,以基因工程藥物為主導(dǎo)的基因工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一,發(fā)展前景廣闊?;蚬こ趟幬镏饕毎蜃?、抗體、疫苗、激素和核苷酸藥物等。它們對預(yù)防人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內(nèi)的各種傳染病、類風(fēng)濕疾病等有重要作用。在很多領(lǐng)域特別是疑難病癥上,基因工程工程藥物起到了傳統(tǒng)化學(xué)藥物難以達到的作用。我們最為熟悉的干擾素(IFN)就是一類利用基因工程技術(shù)研制成的多功能細胞因子,在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病。

      (3)基因工程應(yīng)用于環(huán)保方面:基因工程技術(shù)可提高微生物凈化環(huán)境的能力。美國利用DNA重組技術(shù)把降解芳烴、萜烴、多環(huán)芳烴、脂肪烴的4種菌體基因鏈接,轉(zhuǎn)移到某一菌體中構(gòu)建出可同時降解4種有機物的“超級細菌”,用之清除石油污染,在數(shù)小時內(nèi)可將水上浮油中的2/3烴類降解完,而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢桿菌、且表達成功。它能釘死蚊蟲與害蟲,而對人畜無害,不污染環(huán)境?,F(xiàn)已開發(fā)出的基因工程菌有凈化農(nóng)藥的DDT的細菌、降解水中的染料、環(huán)境中有機氯苯類和氯酚類、多氯聯(lián)苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸藥的工程菌及用于吸附無機有毒化合物(鉛、汞、鎘等)的基因工程菌及植物等。90年代后期問世的DNA改組技術(shù)可以創(chuàng)新基因,并賦予表達產(chǎn)物以新的功能,創(chuàng)造出全新的微生物,如可將降解某一污染物的不同細菌的基因通過PCR技術(shù)全部克隆出來,再利用基因重組技術(shù)在體外加工重組,最后導(dǎo)入合適的載體,就有可能產(chǎn)生一種或幾種具有非凡降解能力的超級菌株,從而大大地提高降解效率。

      五、基因工程的安全性問題:

      自基因工程誕生以來,基因工程的安全性問題就受到人們極大的關(guān)注,關(guān)于重組DNA潛在的危險性問題的爭論,在基因工程還處于醞釀階段的時候就已經(jīng)開始。爭論的焦點是擔(dān)心基因工程寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院考核答題紙

      (2011--2012學(xué)年第 學(xué)期)

      課號::EK5G04A00

      課程名稱:現(xiàn)代生物技術(shù)概論

      閱卷教師:

      班級:10級生物工程

      學(xué)號:104177306

      姓名:郭兆峰

      成績:的雜種生物會從實驗室溢出,在自然界造成難以抑制的災(zāi)難,有害的雜種菌或病毒與化學(xué)物質(zhì)不同,它們會在自然界不斷繁殖,造成的危害更大。

      在1975年2月,美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)在加利福尼亞州的Asilomar 會議中心內(nèi),160名來自美國和16個國家的專家學(xué)者對重組DNA的危害辯論,雖然與會代表分歧挺大,但最后也達成了一些重要的共識,在1976年6月23日美國NIH制定并公布了《重組DNA研究準(zhǔn)則》。為了避免可能造成的危害,除了規(guī)定禁止若干類型的重組DNA實驗外,還制定了許多具體的規(guī)定條文。

      六、基因工程的前景展望:基因工程技術(shù)是繼工業(yè)革命、信息革命之后 對人類社會產(chǎn)生深遠影響的一場革命。它在基因制藥、基因診斷、基因治療、基因芯片和基因克隆等技術(shù)方面取得的革命性成果,將極大地改變?nèi)祟惿蜕蠲婷病?/p>

      參考文獻:

      1、基因工程/樓士林,楊盛昌,龍敏南等主編.—北京:科學(xué)出版社,2002

      2、基因工程技術(shù)/鐘衛(wèi)鴻主編.—北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007.6

      3、基因工程/何水林主編.—北京:科學(xué)出版社,2008

      4、基因工程原理與技術(shù)/劉志國主編.—2版.—北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010,12

      5、基因工程:原理、方法與應(yīng)用/徐煜泉等編著.—北京:北京大學(xué)出版社,2008.12

      第三篇:基因工程

      《基因工程論文》

      嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構(gòu)建

      學(xué)

      院:生命科學(xué)學(xué)院 班

      級:生物技術(shù)12-2 學(xué)

      號:7011208209 姓

      名:陳 昆 任課教師:張銳

      嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構(gòu)建

      摘要﹕從以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長的解烴菌———地芽孢桿菌MD-2細胞中獲得了1個新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA。將基因sladA克隆到質(zhì)粒pSTE33上,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSTalk。通過電轉(zhuǎn)化將pSTalk轉(zhuǎn)化入嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3內(nèi),構(gòu)建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜熱和解烴的功能,在70℃條件下,14d后對原油的降解率達75.08%。研究結(jié)果表明,可以通過體外重組的方式向嗜熱菌中引入烴降解基因,從而構(gòu)建嗜熱解烴基因工程菌。關(guān)鍵詞:微生物采油;烴類降解菌;嗜熱解烴基因;質(zhì)粒;基因工程菌

      微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要機理之一。研究結(jié)果表明,在解烴菌作用下原油的族組分發(fā)生變化,輕質(zhì)組分增加,粘度下降,改善了原油的流動性;同時,解烴菌還可以將烴類分子轉(zhuǎn)化成有機溶劑、表面活性劑、酸和氣體等驅(qū)油物質(zhì)。迄今為止,從自然界篩選的高效解烴菌絕大多數(shù)為嗜溫微生物,最適合生長溫度一般為20-45℃,很難適應(yīng)油藏的高溫環(huán)境。筆者從1株解烴菌細胞中分離出1個新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段將此基因轉(zhuǎn)化到另外1株最適合生長溫度為70℃的嗜熱菌體內(nèi),構(gòu)建了嗜熱解烴基因工程菌SL-21。該基因工程菌既具有高效的解烴功能,又能適應(yīng)油藏高溫環(huán)境,在微生物采油中具有良好的應(yīng)用前景。1.1 實驗材料

      實驗材料包括限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR片斷回收試劑盒;大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coliDH5α;pGEM-T easy載體;質(zhì)粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培養(yǎng)基按文獻配制。無機鹽培養(yǎng)基組成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸餾水100mL;pH值為7.2。嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3,分離自勝利油區(qū)孤島油田中一區(qū)館3區(qū)塊采出液,最適合生長溫度為70℃;地芽孢桿菌MD-2,以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長,分離自勝利油區(qū)原油污染土壤。1.2 實驗方法

      DNA的操作 基因組DNA小量提取,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對DNA擴增、PCR產(chǎn)物的回收、酶切與連接,質(zhì)粒DNA提取和基因序列測定等均按文獻[13-14]方法進行。菌株培養(yǎng) 所涉及到的菌株培養(yǎng)均在溫度為70℃,轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下進行振蕩培養(yǎng)。基因工程菌的構(gòu)建和篩選方法 ZJ-3感受態(tài)細胞的制備按文獻[13-14]方法進行。用構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSTalk在最佳條件下電轉(zhuǎn)化ZJ-3感受態(tài)細 胞構(gòu)建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB瓊脂平板上挑選10個陽性克隆接種到5mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜,獲得種子液。將該種子液接種到200mL以液蠟為惟一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5d后用CCl4抽提剩余的液蠟,用紅外測油儀測定烴的剩余量,根據(jù)菌株降解液蠟的速率篩選出目的基因工程菌?;蚬こ叹恼T導(dǎo)表達及SDS-PAGE檢測挑取陽性克隆接種于含100μg/mL Amp的10mL的LB液體培養(yǎng)基中,180r/min下振蕩培養(yǎng)至光密度值達到0.6(檢測光波波長為600nm),加誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為1mmol/L,振蕩培養(yǎng)8h,收集表達菌體,加SDS上樣緩沖液,于100℃水浴10min后上樣,用12%的SDS-PAGE電泳檢測?;蚬こ叹涤湍芰y試 將基因工程菌接入20mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12h,以5 000r/min的速度離心5min收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌菌體1次,加20mL無菌生理鹽水懸浮,作為菌株利用烷

      烴生長的種子液。取菌懸液按1%接種量接入200mL無機鹽培養(yǎng)基中,加入2%孤島油田中一區(qū)館3區(qū)塊原油或2%的液體石蠟作為惟一碳源培養(yǎng),取樣稀釋涂布計數(shù)。原油降解實驗 在無機鹽培養(yǎng)基中添加2%的原油,按1%接種量接入基因工程菌,培養(yǎng)14d。用正己烷萃取降解后的原油,用氣相色譜儀測定原油飽和烴組分的降解情況。原油降解率為菌株降解前、后原油量的差值與菌株降解前原油量的比值。2 實驗結(jié)果與分析

      2.1 MD-2基因組DNA的檢測

      對MD-2基因組進行提取和純化。提取后的染色體DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,相對分子質(zhì)量不小于23kb,說明提取的DNA完好。在檢測光波波長為260280nm條件下分別測出DNA的光密度,其比值為1.95,換算出DNA的質(zhì)量濃度為1 400g/mL,表明DNA純度較好,無蛋白、RNA、酚和多糖物質(zhì)的干擾。2.2 烷烴單加氧酶基因的克隆與序列分析依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院基因序列數(shù)據(jù)庫(Genbank)中的烷烴單加氧酶基因開放閱讀框兩端保守序列,設(shè)計了一對兼并引物以MD-2基因組DNA為模板進行PCR擴增,將約1.3kb的PCR產(chǎn)物回收后連接到pGEM-T easy載體上,轉(zhuǎn)入E.coliDH5α,挑取陽性克隆質(zhì)粒進行測序。測序結(jié)果經(jīng)Genbank檢索,表明該DNA序列是個新的烷烴單加氧酶基因,命名為sladA。2.3 基因工程菌的構(gòu)建及篩選

      通過PCR擴增sladA后,將PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分離純化出1 329bp的片斷,與經(jīng)EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33質(zhì)粒連接,構(gòu)建成含sladA的重組質(zhì)pSTalk。經(jīng)電泳鑒定表明(圖1),重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

      2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的誘導(dǎo)表達

      由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE圖譜可見(圖2),在烷烴單加氧酶基因sladA對應(yīng)蛋白大小的地方掃描到高信號強度,表明sladA基因在SL-21中得以表達。2.5 基因工程菌SL-21碳源生長

      基因工程菌SL-21在以原油和液體石蠟為惟一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng),在70℃和180r/min條件下,經(jīng)過3d的延滯期后進入對數(shù)期,菌體數(shù)增加。17d后,菌體數(shù)為接菌初期的5倍,表明SL-21能夠利用原油或液體石蠟作為惟一碳源生長。2.6 對原油的降解作用

      由原油飽和烴組分的降解情況可看出(圖3),基因工程菌對原油有很明顯的降解效果,幾乎將飽和烴降解完全。經(jīng)對氣相色譜各峰面積對比,計算出各峰面積的含

      量和飽和烴組分降解率(表2)?;蚬こ叹鶶L-21對原油的降解率為75.08%。

      實驗結(jié)果表明,烴類降解菌地芽孢桿菌MD-2細胞提取的烷烴單加氧酶基因sladA可以在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中表達。但不同的基因工程菌株中烷烴單加氧酶基因sladA表達的效率不同,需要通過菌株對原油的降解評價進一步篩選。獲得的對原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高溫條件下生長,并且對原油降解效果明顯。因此以體外重組方式向嗜熱菌中引入烴類降解基因構(gòu)建嗜熱解烴基因工程菌在技術(shù)上是可行的。3 結(jié)論

      以地芽孢桿菌MD-2為目標(biāo)菌株,克隆和表達了降解長鏈烷烴的單加氧酶基因sladA,并在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中正確表達了基因sladA,構(gòu)建了基因工程菌SL-21?;蚬こ叹鶶L-21在70℃條件下,能以原油或液體石蠟為惟一碳源生長。14d對原油的降解率為75.08%,對原油飽和烴組分均有明顯的降解效果。該基因工程菌既可以用于微生物驅(qū)油技術(shù),又可以用于高溫油田污水的生物處理。利用基因工程的方法可以獲得既能耐受極端環(huán)境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌種選育的重要方向。參考文獻: [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烴降解菌的篩選及性能研究[J].大慶石油地質(zhì)與開發(fā),2007,26(6):119-123.[2] 汪衛(wèi)東,汪竹,耿雪麗,等.美國微生物采油技術(shù)現(xiàn)場應(yīng)用效果分析[J].油氣地質(zhì)與采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁長忠,宋永亭,段傳慧.微生物采油用營養(yǎng)物質(zhì)在石英砂上的靜態(tài)和動態(tài)吸附規(guī)律[J].油氣地質(zhì)與采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龍,董漢平,俞理,等.微生物提高采收率數(shù)值模擬研究現(xiàn)狀[J].油氣地質(zhì)與采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花麗.本源微生物降解原油的飽和烴色譜分析[J].油氣地

      質(zhì)與采收率,2008,15(1):77-79.[6] 宋智勇,張君,馬繼業(yè),等.微生物菌液的界面特性[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(3):73-75.[7] 蔣焱,曹功澤,趙鳳敏,等.聚合物驅(qū)后微生物提高采收率的可行性分析[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(5):63-65,68.[8] 陳愛華,方新湘,呂秀榮,等.克拉瑪依油田內(nèi)源微生物驅(qū)油機理探索[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(5):75-77.[9] 宋紹富,劉菊榮,張忠智.微生物采油替代營養(yǎng)源的研究[J].油氣地質(zhì)與采收率,2007,14(2):96-98.[10]李希明.微生物驅(qū)替盲端類剩余油的微觀實驗[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(3):91-92.[11]沈萍.微生物學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2000:143.[12]唐赟,馮露,劉沐之,等.嗜熱解烴菌NG80-2的鑒定及其特[J].南開大學(xué)學(xué)報,2006,39(2):46-50,70.[13] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.分子克隆實驗指南[M].金冬雁,譯.北京:科學(xué)出版社,1992.[14]盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)[M].2版.北京:高等教育出版社,1993.4

      第四篇:基因工程

      基因工程技術(shù)的程序與應(yīng)用

      【摘要】基因工程技術(shù)是一項正在蓬勃發(fā)展的技術(shù),它將給人類社會帶來一場深刻的變革,我們有必要了解基因工程的概念、原理、技術(shù)程序,以及基因工程在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用和進展情況。

      【關(guān)鍵詞】基因工程技術(shù)程序應(yīng)用進展

      基因工程(genetic engineering)又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù),是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ),以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段,在分子水平上對基因進行復(fù)雜的操作,將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍圖,在體外構(gòu)建雜種DNA分子,然后導(dǎo)入活細胞,使這個基因能在受體細胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達,以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)——DNA大分子提取出來,在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M行切割后,把它與作為載體的DNA分子連接起來,然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細胞中,以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶”,進行正常的復(fù)制和表達,從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠緣雜交的不親和障礙?;蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。

      一 基因工程的技術(shù)程序

      基因工程的基本原理是在體外將不同來源的DNA進行剪切和重組,形成鑲嵌DNA分子,然后將之導(dǎo)入宿主細胞,使其擴增表達,從而使宿主細胞獲得新的遺傳特性,形成新的基因產(chǎn)物。它有3個基本的步驟:①從合適材料分離或制備目的基因或DNA片段。②目的基因或DNA片段與載體連接作成重組DNA分子。③重組DNA分子引入宿主細胞,在其中擴增和表達。不同種類生物的生物學(xué)特性不同,其基因工程在操作上和具體技術(shù)上必然有所差異,但技術(shù)核心都是DNA的重組,即利用一系列的DNA限制性內(nèi)切酶、連接酶等分子手術(shù)工具,在某種生物DNA鏈上切下某個目標(biāo)基因或特殊的DNA片段,然后根據(jù)設(shè)計要求,將其接合到受體生物DNA鏈上。

      一個完整的用于生產(chǎn)生產(chǎn)目的的基因工程技術(shù)程序包括的基本內(nèi)容有:①外源目標(biāo)基因的分離、克隆以及目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)與功能研究。②適合轉(zhuǎn)移、表達載體的構(gòu)建或目標(biāo)基因的表達調(diào)控結(jié)構(gòu)重組。③外源基因的導(dǎo)入。④外源基因在宿主基因組上的整合、表達及檢測與轉(zhuǎn)基因生物的篩選。⑤外源基因表達產(chǎn)物的生理功能的檢定。⑥轉(zhuǎn)基因新品系的選育和建立以及轉(zhuǎn)基因新品系的效益分析。⑦生態(tài)與進化安全保障機制的建立。⑧消費安全評價。

      (一)外源目標(biāo)基因的分離、克隆及功能結(jié)構(gòu)分析

      獲合乎人類某種需要的取目的基因是實施基因工程的第一步,也是開展一項基因工程的前提和全部工作的核心。目前人們已經(jīng)能夠通過多種途徑和方法來獲取目標(biāo)基因,其中主要有兩條途徑:一條是從供體細胞的DNA中直接分離基因;另一條是人工合成基因。

      直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”,又叫“散彈射擊法”。鳥槍法的具體做法是:用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段,將這些片段分別載入運載體,然后通過運載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細胞,讓供體細胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分別在各個受體細胞中大量復(fù)制(在遺傳學(xué)中叫做擴增),1

      從中找出含有目的基因的細胞,再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。用鳥槍法獲得目的基因的優(yōu)點是操作簡便,缺點是工作量大,具有一定的盲目性。又由于真核細胞的基因含有不表達的DNA片段,一般使用人工合成的方法。

      目前人工合成基因的方法主要有兩條。一條途徑是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模版,反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA,然后在酶的作用下合成雙鏈DNA,從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列,推測出相應(yīng)的信使RNA序列,然后按照堿基互補配對的原則,推測出它的基因的核苷酸序列,再通過化學(xué)方法,以單核苷酸為原料合成目的基因。如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就可以通過人工合成基因的方法獲得。

      (二)構(gòu)建能在受體生物細胞中表達的重組目標(biāo)基因

      要使一個外源目標(biāo)基因能整合到受體細胞的基因組中并能在整合后在受體基因組的調(diào)控下有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯,就必須事先對目標(biāo)基因的功能結(jié)構(gòu)用DNA重組技術(shù)進行適當(dāng)?shù)男揎?,也就是將目?biāo)基因與一種特別的DNA分子重組,這種特別的DNA分子稱為基因載體,目前所用的載體主要有以下幾類:質(zhì)粒、λ噬菌體、柯斯質(zhì)粒、病毒載體、YAC載體等,各類載體具有獨特的生物學(xué)特性,可用于不同的目標(biāo)基因。

      (三)外源重組目標(biāo)基因的導(dǎo)入

      將重組的外源目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入到宿主細胞中的過程稱為基因?qū)牖蚧蜣D(zhuǎn)移。接受外源基因的細胞稱為受體細胞。由于受體生物學(xué)特征的不同以及基因工程目的不同,外源基因?qū)氲姆椒ㄒ膊煌?,有的是用載體導(dǎo)入,有的是直接用物理的方法導(dǎo)入。目前使用的有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔導(dǎo)入法、基因槍射入法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法等,向細菌等微生物中導(dǎo)入外源目標(biāo)基因常用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和噬菌體轉(zhuǎn)染方法;向植物細胞中導(dǎo)入外源基因常用基因槍注入法和Ti質(zhì)粒導(dǎo)入法;能由原生質(zhì)體再生出植株的植物細胞還可以用電穿孔導(dǎo)入法及脂質(zhì)體融合法;動物的受精卵一般通過人工顯微鏡注射法導(dǎo)入外源基因;動物的體細胞可用電穿孔法和病毒轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入外源基因,但對用于生產(chǎn)目的的基因工程常常避免用病毒轉(zhuǎn)染法。

      (四)轉(zhuǎn)基因細胞或個體的鑒別和篩選

      在對宿主的細胞進行了外源目標(biāo)基因?qū)胩幚硪院?,有些細胞可能并沒有外源基因的進入,另有一些細胞可能在外源基因進入后因各種原因而不能使外源基因表達,因此必須對被進行了基因轉(zhuǎn)移處理的細胞或個體進行鑒別,以篩選出導(dǎo)入外源目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因細胞或個體。鑒別和篩選轉(zhuǎn)基因生物一般在兩個層面上進行:一是檢測目標(biāo)基因是否表達,二是檢測目標(biāo)基因是否整合到了宿主的染色體上和能否穩(wěn)定傳代。表達檢測的方法主要有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的印跡雜交法、免疫印跡檢測法、免疫組織化學(xué)檢測法等。整合檢測可通過DNA分子雜交來確定。

      (五)轉(zhuǎn)基因品系的效益分析。

      一個生產(chǎn)性能優(yōu)越的轉(zhuǎn)基因品系,首要的條件是目標(biāo)基因的表達產(chǎn)物必須有正常的生理功能,另一個必要標(biāo)志是其目標(biāo)基因必須有適度的高效表達特性和可持續(xù)生產(chǎn)能力。

      (六)生態(tài)與進化安全保障

      由于轉(zhuǎn)基因生物與其他生物一樣具有可遺傳、易擴散及自主的特性,而且人類對生命、生態(tài)系統(tǒng)、生物的演化實際上還知之甚少,對不同物種間基因的人工組合,外源基因?qū)κ荏w生物進化的可能影響,轉(zhuǎn)基因生物對生態(tài)系統(tǒng)的長期影響

      等都無法進行評估,因此如果人們不事先采取控制措施,轉(zhuǎn)基因生物一旦進入到自然環(huán)境中就可能打破生態(tài)平衡,破壞生態(tài)環(huán)境和自然種質(zhì)資源。對轉(zhuǎn)基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法:物理的方法就是通過各種嚴格的管理措施和物理屏障盡量使轉(zhuǎn)基因生物不能從實驗室逃逸進入到自然環(huán)境里去;生物的方法一般就是造成轉(zhuǎn)基因生物與非轉(zhuǎn)基因生物之間的生殖隔離,如利用三倍體不育的特性將用于生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動物或植物變成三倍體等。

      (七)消費安全評價

      消費安全評價一般要考慮以下一些主要的方面:①導(dǎo)入外源目標(biāo)基因本身編碼的產(chǎn)物是否安全。②外源目標(biāo)基因是否穩(wěn)定。③使用的載體是否安全。④使用的報道基因(就是能產(chǎn)生很容易觀察的性狀的基因)是否會產(chǎn)生有害物質(zhì)。⑤外源基因?qū)牒笫欠駮T導(dǎo)受體生物產(chǎn)生新的有害遺傳性狀或不利于健康的成分。為了保護人類的健康,許多國家都已通過立法或其他形式對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行消費安全評價和嚴格的管理,對進口轉(zhuǎn)基因食品嚴格限制。

      二 基因工程的應(yīng)用

      基因工程在醫(yī)藥業(yè)中的應(yīng)用。許多藥品的生產(chǎn)是從生物組織中提取的。受材料來源限制產(chǎn)量有限,其價格往往十分昂貴。微生物生長迅速,容易控制,適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應(yīng)藥物成分的基因?qū)胛⑸锛毎麅?nèi),讓它們產(chǎn)生相應(yīng)的藥物,不但能解決產(chǎn)量問題,還能大大降低生產(chǎn)成本。如基因工程胰島素、干擾素、人造血液、白細胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),均為解除人類的病苦,提高人類的健康水平發(fā)揮了重大的作用。

      基因診斷與基因治療。遺傳病是長期困擾人類的一類不治之癥,迄今已發(fā)現(xiàn)的有3000多種。其根源于遺傳基因存在缺陷,主要特征是可隨生育而傳代?;蛑委熓前颜;?qū)氩∪梭w內(nèi),使該基因的表達產(chǎn)物發(fā)揮功能,從而達到治療疾病的目的,這是治療遺傳病的最有效的手段?;痉椒ㄊ牵夯蛑脫Q、基因修復(fù)、基因增補和基因失活等。如運用基因工程設(shè)計制造的“DNA探針”檢測肝炎病毒等病毒感染及遺傳缺陷,不但準(zhǔn)確而且迅速。通過基因工程給患有遺傳病的人體內(nèi)導(dǎo)入正?;蚩伞耙淮涡浴苯獬∪说募部?。

      基因工程在農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)上的應(yīng)用。運用基因工程技術(shù),不但可以培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗性好的農(nóng)作物及畜、禽新品種,還可以培養(yǎng)出具有特殊用途的動、植物。如轉(zhuǎn)基因魚(生長快、耐不良環(huán)境、肉質(zhì)好),轉(zhuǎn)基因牛(乳汁中含有人生長激素),轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒,轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄,轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯,不會引起過敏的轉(zhuǎn)基因大豆,抗蟲棉等。

      基因工程在環(huán)境保護工業(yè)方面的應(yīng)用?;蚬こ套龀傻腄NA探針能夠十分靈敏地檢測環(huán)境中的病毒、細菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況,卻不易因環(huán)境污染而大量死亡,甚至還可以吸收和轉(zhuǎn)化污染物。如有一種超級細菌,能快速分解石油,可用于清除被石油污染的海域。這種超級菌是美國科學(xué)家用基因工程方法,把降解不同石油化合物的基因移植到一個菌株內(nèi)而產(chǎn)生的。

      總之,基因工程的發(fā)展將會給人類社會帶來巨大的變化。

      三 基因工程的進展?fàn)顩r

      基因工程技術(shù)是一項正在蓬勃發(fā)展的技術(shù),而且也已經(jīng)取得了許多重要的應(yīng)用成果,但我們也應(yīng)該看到,基因工程技術(shù)不是一項已經(jīng)成熟的技術(shù),仍然還很粗糙和原始,在許多方面尚需完善和改進。

      1.基因工程在技術(shù)上存在一定的不確定性和盲目性。目前的基因工程在技術(shù)上有很多的不確定性。這種不確定性表現(xiàn)在兩個方面,一是技術(shù)方面的不穩(wěn)定性,二是由于對不同生物的生理特性的了解不很深入,如我們將魚類抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)移到不抗寒的羅非魚等熱帶魚中,雖然抗凍蛋白基因得到表達,但并沒有使受體魚產(chǎn)生預(yù)期的抗寒效果。目前我們所進行的基因工程基本上只能對簡單的、單基因控制的性狀進行設(shè)計和改造,操作對象只限于一些比較簡單的單因子基因。但生物絕大部分的重要性狀是由多個基因共同控制的,對這些多基因控制的性狀,現(xiàn)有的基因工程技術(shù)幾乎仍然是束手無策。我們對活的生物體中基因表達調(diào)控的機制知之甚少,有關(guān)的知識僅限于對啟動子和增強子有所了解,對生物體整體的調(diào)節(jié)復(fù)雜性的認識還剛剛開始。

      2.在安全性方面存在著不確定性。對社會大眾來說,最主要和最關(guān)心的是基因工程的安全性問題,基因工程的安全性問題包括兩個方面:一是基因工程產(chǎn)品的消費安全問題,二是轉(zhuǎn)基因生物的生態(tài)安全問題。目前用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)出來的食品因其成分的某些改變是否會對人類的健康產(chǎn)生不良的影響,這需要實驗和時間來驗證。有著某種生存優(yōu)勢的轉(zhuǎn)基因生物如果進入到自然生態(tài)系統(tǒng),就有可能排擠自然種群,降低生態(tài)系統(tǒng)里物種的多樣性,打破生態(tài)平衡。

      所以我們在大力發(fā)展轉(zhuǎn)基因技術(shù)的同時,必須高度重視對轉(zhuǎn)基因動物、植物及微生物品種的生物控制和控制技術(shù)的研究。在轉(zhuǎn)基因品種的安全性沒有進行全面的評估和沒有可靠的生物控制措施之前,應(yīng)嚴格禁止其進行生產(chǎn)和進入開放的自然生態(tài)系統(tǒng),只有其生態(tài)安全性達到了傳統(tǒng)育種方法培育的新品種時,或無生殖能力的轉(zhuǎn)基因動物和植物才能允許進入自然界進行生產(chǎn),也只有這樣才是有益于人類和社會進步的。

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      第五篇:材料基因工程

      材料基因工程

      ——為什么是一項“顛覆性前沿技術(shù)”

      1.前言

      材料基因組技術(shù)是近幾年興起來的材料研究新理念和新方法,是當(dāng)今世界材料科學(xué)與工程領(lǐng)域的最前沿。材料基因工程借鑒人類基因組計劃,探究材料結(jié)構(gòu)與材料性質(zhì)變化的關(guān)系。并通過調(diào)整材料的原子或配方、改變材料的堆積方式或搭配,結(jié)合不同的工藝制備,得到具有特定性能的新材料。但是材料基因組與人類基因組的又有很大的區(qū)別,材料的微觀結(jié)構(gòu)多樣化,不但成分組成可以不同,微觀形貌等結(jié)構(gòu)也可能千差萬別,其組成-結(jié)構(gòu)-性能之間的關(guān)系更加復(fù)雜。

      2.材料基因組技術(shù)

      2.1材料基因組技術(shù)

      材料基因組計劃是通過“多學(xué)科融合”實現(xiàn)“高通量材料設(shè)計與試驗”;其核心目標(biāo)在于通過“高通量計算、實驗和大數(shù)據(jù)分析”技術(shù)加速材料“發(fā)現(xiàn)-研發(fā)-生產(chǎn)-應(yīng)用”全過程,縮短材料研發(fā)周期,降低材料研發(fā)成本,引發(fā)新材料領(lǐng)域的科技創(chuàng)新和商業(yè)模式變革。

      材料基因組技術(shù)包括高通量材料計算方法、高通量材料實驗方法和材料數(shù)據(jù)庫三大組成要素。

      2.1.1高通量材料計算方法

      高通量計算是指利用超級計算平臺與多尺度集成化、高通量并發(fā)式材料計算方法和軟件結(jié)合,實現(xiàn)大體系材料模擬、快速計算、材料性質(zhì)的精確預(yù)測和新材料的設(shè)計,提高新材料篩選效率和設(shè)計水平,為新材料的研發(fā)提供理論依據(jù)。其中并發(fā)式材料計算方法包括第一原理計算方法、計算熱力學(xué)方法、動力學(xué)過程算法等,跨越原子模型、簡約模型和工程模型等多個層次,并整合了從原子尺度至宏觀尺度等多尺度的關(guān)聯(lián)算法。

      高通量材料集成計算技術(shù)利用第一性原理、分子動力學(xué)與位錯動力學(xué)、合金相圖計算、相場計算等方法,快速并行模擬實驗室中成分與性能優(yōu)化的傳統(tǒng)試錯式材料研發(fā)過程,并基于材料科學(xué)知識,迅速挑選有利于目標(biāo)性能的合金成分與微觀結(jié)構(gòu)特征,從而加速新材料的研發(fā)進程并顯著降低材料研發(fā)成本。

      2.1.2高通量材料實驗方法

      傳統(tǒng)材料研發(fā)模式依賴于成分與工藝的不斷“試錯”實驗優(yōu)化,結(jié)合對結(jié)構(gòu)-性能關(guān)系的不斷理解以獲得滿足性能指標(biāo)的材料。但是,新型關(guān)鍵材料具有成分多元化、復(fù)雜化、微結(jié)構(gòu)多級化等特點,傳統(tǒng)的“試錯”模式在實際材料開發(fā)中不僅耗費巨大,而且?guī)缀蹼y以取得成功。

      高通量實驗平臺是發(fā)展材料基因組技術(shù)具備的條件之一。高通量實驗平臺可以為據(jù)庫提供數(shù)據(jù)支撐;而就高通量集成計算而言,高通量實驗技術(shù)為各種計算模擬工作提供計算目標(biāo)。材料基因組概念中的高通量實驗技術(shù)具有快速制備快速表征各類金屬與非金屬樣品的能力,典型的高通量實驗方法有擴散多元結(jié)與材料基因芯片

      2.1.3材料數(shù)據(jù)庫

      數(shù)據(jù)可以看作是感興趣參量的具體數(shù)值,這些參量在空間與時間上的一系列數(shù)值就構(gòu)成數(shù)據(jù)集,不同的數(shù)據(jù)集結(jié)合到一起并按照一定的協(xié)議實現(xiàn)相互調(diào)用,體量巨大、結(jié)構(gòu)性的數(shù)據(jù)集就構(gòu)成大數(shù)據(jù)。利用物理層面的分布式服務(wù)器對隨時間不斷膨脹的數(shù)據(jù)集進行存放,利用通訊協(xié)議實現(xiàn)服務(wù)器中數(shù)據(jù)集的遠程調(diào)用與管理,利用專門的算法對不同數(shù)據(jù)集自身和數(shù)據(jù)集之間進行分析并提取有價值的信息,并用專門的軟件實現(xiàn)數(shù)據(jù)分析的可視化,就構(gòu)成了基于大數(shù)據(jù)方法的材料數(shù)據(jù)庫技術(shù)。

      材料信息學(xué)通過數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)分析與數(shù)據(jù)協(xié)作,實現(xiàn)從已有數(shù)據(jù)中提取高價值信息和知識的目的。由于計算材料數(shù)據(jù)庫是綜合物理,化學(xué)及生物的交叉學(xué)科的數(shù)據(jù)庫。因此,材料數(shù)據(jù)庫的建立,有利于減少材料的重復(fù)實驗和測試,對縮短新材料的研發(fā)周期,節(jié)約新材料的研發(fā)成本具有非常積極的作用

      2.2結(jié)論

      材料計算模擬是實現(xiàn)“材料按需設(shè)計”的基礎(chǔ),可以幫助縮小高通量材料實驗范圍,提供實驗理論依據(jù);高通量材料實驗起著承上啟下的角色,既可以為材料模擬計算提供海量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和實驗驗證,也可以充實材料數(shù)據(jù)庫,并為材料信息學(xué)提供分析素材,同時還可以針對具體應(yīng)用需求,直接快速篩選目標(biāo)材料;材料數(shù)據(jù)庫可以為材料計算模擬提供計算基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為高通量材料實驗提供實驗設(shè)計的依據(jù),同時計算和實驗所得的材料數(shù)據(jù)亦可以豐富材料數(shù)據(jù)庫的建設(shè)。

      3.結(jié)論

      材料基因組技術(shù)融合了材料科學(xué)、固體力學(xué)、信息科學(xué)、軟件工程、先進實驗方法等學(xué)科,采用數(shù)值模擬、數(shù)據(jù)庫及數(shù)據(jù)挖掘、人工智能等技術(shù)研究材料的工藝過程、微/細觀結(jié)構(gòu)、性能和服役行為等,闡明成分、微結(jié)構(gòu)和工藝對性能的控制機制,引導(dǎo)并支撐實體材料的研發(fā)和應(yīng)用。

      在材料基因工程提出之前,新材料從研發(fā)到市場應(yīng)用實踐跨度非常大,某種材料從最初的研究開發(fā),經(jīng)過性能優(yōu)化、系統(tǒng)設(shè)計與集成、驗證、制造再到投入市場通常需要10-20年時間。部分原因是一直以來過度依賴對材料研發(fā)的科學(xué)自覺與實驗判斷,目前大部分材料的設(shè)計與測試時通過耗時的重復(fù)實驗完成的、而實際上,有些實驗通過理論計算工具就能完成模擬。材料基因工程采用強大的計算分析和理論模擬工具,減少新材料研發(fā)和生產(chǎn)過程中對物理實驗的依賴。改進的數(shù)據(jù)共享系統(tǒng)和一體化的工程團隊將允許設(shè)計、系統(tǒng)工程與生產(chǎn)活動的重疊與互動。這種新的綜合設(shè)計將結(jié)合更多的計算與信息技術(shù),加上實驗與表征方面的進步,將顯著加快材料投入市場的種類及速度,材料的開發(fā)周期可從目前的 10~20 年縮短為 5~10 年。因此說材料基因組技術(shù)是一項“顛覆性前沿技術(shù)”

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