第一篇：基因工程和細(xì)胞工程

專題八 現(xiàn)代生物科技專題

第一講 基因工程和細(xì)胞工程

1.(2009·浙江卷，1)用動(dòng)、植物成體的體細(xì)胞進(jìn)行離體培養(yǎng)，下列敘述正確的是（）A．都需要用CO2培養(yǎng)箱 B．都需要用液體培養(yǎng)基 C．都要在無菌條件下進(jìn)行 D．都可體現(xiàn)細(xì)胞的全能性

2．下列關(guān)于運(yùn)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生新個(gè)體的敘述，錯(cuò)誤的是

A．屬于無性生殖

B．主要理論依據(jù)是植物細(xì)胞具有全能性

C．培養(yǎng)過程中由于人工培養(yǎng)基含大量營養(yǎng)，不需光照就能發(fā)育成完整植株

D．人工培養(yǎng)基中含植物生長發(fā)育所需的全部營養(yǎng)物質(zhì)，包括礦質(zhì)元素、糖、維生素等 3．(2009·安徽卷，4)2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了“發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了水母綠色熒光蛋白”的三位科學(xué)家。將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個(gè)融合基因，再將該融合基因轉(zhuǎn)入真核生物細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)就會(huì)帶有綠色熒光。綠色熒光蛋白在該研究中的主要作用是

（）A．追蹤目的基因在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程 B．追蹤目的基因插入到染色體上的位置 C．追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布 D．追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

4．限制酶是一種核酸內(nèi)切酶，可識(shí)別并切割DNA分子上特定的核苷酸序列。下圖為四種限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ和BglⅡ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：

()

切割出來的DNA黏性末端可以互補(bǔ)配對(duì)的是

A．BamHⅠ和EcoRⅠ B．BamHⅠ和HindⅢ C．BamHⅠ和BglⅡ D．EcoRⅠ和HindⅢ

5．對(duì)于不同的生物，將重組基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有差異，下列方法不合適的是

（）A．以質(zhì)粒為運(yùn)載體，利用大腸桿菌生產(chǎn)人的胰島素時(shí)，可用氯化鈣處理大腸桿菌 B．以噬菌體為運(yùn)載體，利用大腸桿菌生產(chǎn)人的凝血因子時(shí)，可使其直接侵染大腸桿菌 C．以質(zhì)粒為運(yùn)載體，利用轉(zhuǎn)基因羊生產(chǎn)人的乳鐵蛋白時(shí)，可用顯微注射技術(shù)將重組基 因?qū)胧芫?/p>

（）D．以質(zhì)粒為運(yùn)載體，培育轉(zhuǎn)基因植物時(shí)，可借鑒質(zhì)粒侵染細(xì)胞的途徑，用重組質(zhì)粒侵染植物細(xì)胞

6．蛋白質(zhì)工程與基因工程相比，其突出特點(diǎn)是（）A．基因工程原則上能生產(chǎn)任何蛋白質(zhì)

B．蛋白質(zhì)工程能對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)

C．蛋白質(zhì)工程可以不通過轉(zhuǎn)錄和翻譯來實(shí)現(xiàn)

D．蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上，延伸出來的第二代基因工程 7．如圖所示為農(nóng)作物新品種的育種方式，相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()

A．②③過程分別稱為脫分化和再分化 B．①過程代表植物體細(xì)胞雜交 C．⑤過程中常用的基因表達(dá)載體是質(zhì)粒

D．圖中育種方式突出優(yōu)點(diǎn)是克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙 8．下列關(guān)于原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)的敘述，錯(cuò)誤的是（）A．都屬于動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)，需要一定的培養(yǎng)條件

B．第一次分瓶之前的培養(yǎng)屬于原代培養(yǎng)，以后的培養(yǎng)均屬于傳代培養(yǎng) C．50代以后的培養(yǎng)，少部分細(xì)胞會(huì)獲得不死性 D．培養(yǎng)至50代以后的細(xì)胞稱為細(xì)胞株

9．(2010·江蘇卷，18)下列關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物的敘述，正確的是（）A．轉(zhuǎn)入到油菜的抗除草劑基因，可能通過花粉傳入環(huán)境中 B．轉(zhuǎn)抗蟲基因的植物，不會(huì)導(dǎo)致昆蟲群體抗性基因頻率增加 C．動(dòng)物的生長激素基因轉(zhuǎn)入植物后不能表達(dá)

D．如轉(zhuǎn)基因植物的外源基因來源于自然界，則不存在安全性問題

10．番木瓜，俗稱木瓜，有“百果之王”的美稱，在人們所食的38種常見水果中，營養(yǎng)價(jià)值居首位，從種植到結(jié)果只要9～15個(gè)月，所以人們一直希望找到與番木瓜果實(shí)質(zhì)量、產(chǎn)量、抗病性、環(huán)境適應(yīng)性等有關(guān)的基因，更難得的是它是第一種進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的水果。2004年12月，我國南開大學(xué)與美國夏威夷大學(xué)共同主持番木瓜的基因組測序工作，30余家單位參與該工作，并于2008年4月在《自然》雜志上以封面文章的形式發(fā)表了《轉(zhuǎn)基因熱帶水果植物——木瓜的基因組草圖》的成果論文。請(qǐng)回答下列有關(guān)問題：

(1)研究組首先從番木瓜細(xì)胞中提取出DNA，使用“鳥槍法”將其打成碎片，需要用的工具酶是______________。經(jīng)過定位和測序后，再重新連接成整體，用到的工具酶是__________________________。

(2)“抗環(huán)斑病毒的番木瓜”細(xì)胞中的抗病毒基因的表達(dá)過程(圖解表示)是： ______________________________________________________。

(3)將已導(dǎo)入抗病毒基因的木瓜細(xì)胞培養(yǎng)成植株，需要通過下列過程①――→②――→③―→④，①能被培養(yǎng)成為④的根本原因是________________。這個(gè)過程中需要用到

脫分化

再分化____________________(激素)；②表示__________，它的特點(diǎn)是______________________。

11．(2011·海南卷，31)回答有關(guān)基因工程的問題：

(1)構(gòu)建基因工程表達(dá)載體時(shí)，用不同類型的限制酶切割DNA后，可能產(chǎn)生黏性末端，也可能產(chǎn)生________末端。若要在限制酶切割目的基因和質(zhì)粒后使其直接進(jìn)行連接，則應(yīng)選擇能使二者產(chǎn)生________(相同、不同)黏性末端的限制酶。

(2)利用大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素時(shí)，構(gòu)建的表達(dá)載體含有人胰島素基因及其啟動(dòng)子等，其中啟動(dòng)子的作用是________________________________________________________。在用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，常用________處理大腸桿菌，以利于表達(dá)載體進(jìn)入；為了檢測胰島素基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA，可用標(biāo)記的胰島素基因片段作探針與mRNA雜交，該雜交技術(shù)稱為________________。為了檢測胰島素基因轉(zhuǎn)錄的mRNA是否翻譯成________，常用抗原—抗體雜交技術(shù)。

(3)如果要將某目的基因通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入植物細(xì)胞，先要將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的________中，然后用該農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，通過DNA重組將目的基因插入植物細(xì)胞的________上。

12．下圖是單克隆抗體制備流程示意圖。

(1)______________技術(shù)是單克隆抗體技術(shù)的基礎(chǔ)。

(2)根據(jù)培養(yǎng)基的用途分類，圖中培養(yǎng)基屬于________培養(yǎng)基。

(3)單克隆抗體與常規(guī)的血清抗體相比，最大的優(yōu)越性是__________________。(4)動(dòng)物細(xì)胞融合除了采用植物細(xì)胞原生質(zhì)體融合常用誘導(dǎo)劑外，還可以采用____________。

(5)選出的雜交瘤細(xì)胞既具備骨髓瘤細(xì)胞______________________的特點(diǎn)，又具備漿細(xì)胞的________________________的特點(diǎn)。

(6)淋巴細(xì)胞是由動(dòng)物體________中的________細(xì)胞分化、發(fā)育而來的。(7)雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)基中吸收葡萄糖、氨基酸的主要方式是__________。答案

1．C 2．C 3．C 4．C 5．D 6．B 7．B 8．D 9．A

10．(1)限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)DNA連接酶(2)

(3)細(xì)胞具有全能性 生長素和細(xì)胞分裂素(缺一不可)愈傷組織 細(xì)胞排列疏松而無規(guī)則，高度液泡化，呈無定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞

11．(1)平相同(2)提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄 Ca2 DNA

＋－RNA分子雜交 胰島素原(蛋白質(zhì))(3)T-DNA 染色體

12．(1)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(2)選擇(3)特異性強(qiáng)，靈敏度高

(4)滅活的病毒(5)在體外大量增殖 分泌特異性抗體(6)骨髓 造血干(7)主動(dòng)運(yùn)輸

第二篇：細(xì)胞工程

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)過程

對(duì)于單因素或兩因素試驗(yàn)，因其因素少，試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、實(shí)施與分析都比較簡單。但在實(shí)際工作中，常常需要同時(shí)考察3個(gè)或3個(gè)以上的試驗(yàn)因素，若進(jìn)行全面試驗(yàn)，則試驗(yàn)的規(guī)模將很大，往往因?qū)嶒?yàn)條件的限制而難于實(shí)施。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)就是安排多因素試驗(yàn)、尋求最優(yōu)水平組合的一種高效率試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。

一、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的概念及原理

1、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本概念

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是利用正交表來安排與分析多因素試驗(yàn)的一種設(shè)計(jì)方法。它是由試驗(yàn)因素的全部水平組合中，挑選部分有代表性的水平組合進(jìn)行試驗(yàn)的，通過對(duì)這部分試驗(yàn)結(jié)果的分析了解全面試驗(yàn)的情況，找出最優(yōu)的水平組合。

2、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本原理

在試驗(yàn)安排中，每個(gè)因素在研究的范圍內(nèi)選幾個(gè)水平，就好比在選優(yōu)區(qū)內(nèi)打上網(wǎng)格，如果網(wǎng)上的每個(gè)點(diǎn)都做試驗(yàn)，就是全面試驗(yàn)。如上例中，3個(gè)因素的選優(yōu)區(qū)可以用一個(gè)立方體表示（圖10-1），3個(gè)因素各取3個(gè)水平，把立方體劃分成27個(gè)格點(diǎn)。若27個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)都試驗(yàn)，就是全面試驗(yàn)。3因素3水平的全面試驗(yàn)水平組合數(shù)為33=27，4因素3水平的全面試驗(yàn)水平組合數(shù)為34=81，5因素3水平的全面試驗(yàn)水平組合數(shù)為35=243，這在科學(xué)試驗(yàn)中是有可能做不到的。正交設(shè)計(jì)就是從選優(yōu)區(qū)全面試驗(yàn)點(diǎn)（水平組合）中挑選出有代表性的部分試驗(yàn)點(diǎn)來進(jìn)行試驗(yàn)。

3、正交表及其基本性質(zhì)

3.1 正交表

由于正交設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)和分析試驗(yàn)結(jié)果都要用到正交表，因此，我們先對(duì)正交表作一介紹。常用的正交表已由數(shù)學(xué)工作者制定出來，供進(jìn)行正交設(shè)計(jì)師選用（詳見有關(guān)參考書）。正交表記號(hào)為La（bc），其中L代表正交表，a表示試驗(yàn)的次數(shù)即行數(shù)，b表示因素的水平數(shù)，c表示因素的個(gè)數(shù)即列數(shù)。

3.2 正交表的基本性質(zhì)

3.2.1正交性

?任一列中，各水平都出現(xiàn)，且出項(xiàng)的次數(shù)相等；

? 任兩列之間各種不同水平的所有可能組合都出現(xiàn)，且出現(xiàn)的次數(shù)相等；

3.2.2代表性

? 一方面，任一列的各水平都出現(xiàn)，使得部分試驗(yàn)中包括了所有因素的所有水平；任兩列的所有水平組合都出現(xiàn)，使任意兩因素間的試驗(yàn)組合為全面試驗(yàn)。另一方面，由于正交表的正交性，正交試驗(yàn)的試驗(yàn)點(diǎn)必然均衡地分布在全面試驗(yàn)點(diǎn)中，具有很強(qiáng)的代表性。因此，部分試驗(yàn)尋找的最優(yōu)條件與全面試驗(yàn)所找的最優(yōu)條件，應(yīng)有一致的趨勢。

3.2.3綜合可比性

任一列的各水平出現(xiàn)的次數(shù)相等；任兩列間所有水平組合出現(xiàn)次數(shù)相等，使得任一因素各水平的試驗(yàn)條件相同。這就保證了在每列因素各水平的效果中，最大限度地排除了其他因素的干擾。從而可以綜合比較該因素不同水平對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響情況。

根據(jù)以上特性，我們用正交表安排的試驗(yàn)，具有均衡分散和整齊可比的特點(diǎn)。?所謂均衡分散，是指用正交表挑選出來的各因素水平組合在全部水平組合中的分布是均勻的。

所謂均衡分散，是指用正交表挑選出來的各因素水平組合在全部水平組合中的分布是均勻的5、試驗(yàn)結(jié)果分析

? 分清各因素及其交互作用的主次順序，分清哪個(gè)是主要因素，哪個(gè)是次要因素； 判斷因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響的顯著程度； 找出試驗(yàn)因素的優(yōu)水平和試驗(yàn)范圍內(nèi)的最優(yōu)組合，即試驗(yàn)因素各取什么水平時(shí)，試驗(yàn)指標(biāo)最好； 分析因素與試驗(yàn)指標(biāo)之間的關(guān)系，即當(dāng)因素變化時(shí)，試驗(yàn)指標(biāo)是如何變化的。找出指標(biāo)隨因素變化的規(guī)律和趨勢，為進(jìn)一步試驗(yàn)指明方向； 了解各因素之間的交互作用情況； 估計(jì)試驗(yàn)誤差的大小。

5.1直觀分析法——極差分析法

計(jì)算簡便，直觀，簡單易懂，是正交試驗(yàn)結(jié)果分析最常用方法。

Rj為第j列因素的極差，反映了第j列因素水平波動(dòng)時(shí)，試驗(yàn)指標(biāo)的變動(dòng)幅度。Rj越大，說明該因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。根據(jù)Rj大小，可以判斷因素的主次順序。

Kjm為第j列因素m水平所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)指標(biāo)和，kjm為Kjm平均值。由kjm大小可以判斷第j列因素優(yōu)水平和優(yōu)組合。

5.1.1確定試驗(yàn)因素的優(yōu)水平和最優(yōu)水平組合分析A因素各水平對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響。根據(jù)正交設(shè)計(jì)的特性，對(duì)A1、A2、A3、A4來說，四組試驗(yàn)的試驗(yàn)條件是完全一樣的（綜合可比性），可進(jìn)行直接比較。如果因素A對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)無影響時(shí)，那么kA1、kA2、kA3、kA4應(yīng)該相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。說明，A因素的水平變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響。因此，根據(jù)kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判斷A1、A2、A3、A4對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響大小。由于試驗(yàn)指標(biāo)為產(chǎn)率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可斷定A2為A因素的優(yōu)水平。

同理，可以計(jì)算并確定B、C、D因素的優(yōu)水平。

5.1.1確定試驗(yàn)因素的優(yōu)水平和最優(yōu)水平組合分析A因素各水平對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響。根據(jù)正交設(shè)計(jì)的特性，對(duì)A1、A2、A3、A4來說，四組試驗(yàn)的試驗(yàn)條件是完全一樣的（綜合可比性），可進(jìn)行直接比較。如果因素A對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)無影響時(shí)，那么kA1、kA2、kA3、kA4應(yīng)該相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。說明，A因素的水平變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響。因此，根據(jù)kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判斷A1、A2、A3、A4對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響大小。由于試驗(yàn)指標(biāo)為產(chǎn)率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可斷定A2為A因素的優(yōu)水平。

同理，可以計(jì)算并確定B、C、D因素的優(yōu)水平。

5.1.2確定因素的主次順序

根據(jù)極差Rj的大小，可以判斷各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響主次。極差越大的，該因素對(duì)產(chǎn)率的影響越大，反之越小。

5.1.3繪制因素與指標(biāo)趨勢圖

以各因素水平為橫坐標(biāo)，試驗(yàn)指標(biāo)的平均值（kjm）為縱坐標(biāo)，繪制因素與指標(biāo)趨勢圖。由因素與指標(biāo)趨勢圖可以更直觀地看出試驗(yàn)指標(biāo)隨著因素水平的變化而變化的趨勢，可為進(jìn)一步試驗(yàn)指明方向。

最后得出試驗(yàn)的最優(yōu)組合和次優(yōu)組合。

5.2方差分析

極差分析法簡單明了，通俗易懂，計(jì)算工作量少便于推廣普及。但這種方法不能將試驗(yàn)中由于試驗(yàn)條件改變引起的數(shù)據(jù)波動(dòng)同試驗(yàn)誤差引起的數(shù)據(jù)波動(dòng)區(qū)分開來，也就是說，不能區(qū)分因素各水平間對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果的差異究竟是由于因素水平不同引起的，還是由于試驗(yàn)誤差引起的，無法估計(jì)試驗(yàn)誤差的大小。此外，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大小無法給以精確的數(shù)量

估計(jì)，不能提出一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來判斷所考察因素作用是否顯著。為了彌補(bǔ)極差分析的缺陷，可采用方差分析。

方差分析基本思想是將數(shù)據(jù)的總變異分解成因素引起的變異和誤差引起的變異兩部分，構(gòu)造F統(tǒng)計(jì)量，作F檢驗(yàn)，即可判斷因素作用是否顯著。

方差分析基本思想是將數(shù)據(jù)的總變異分解成因素引起的變異和誤差引起的變異兩部分，構(gòu)造F統(tǒng)計(jì)量，作F檢驗(yàn)，即可判斷因素作用是否顯著

5.2.1 偏差平方和

1616

nS總?（y?

n?1

2?y）?2

j2?n?12jyn?CT?IV2j2CT?G21616,G??n?1yn,f總?16?1?15S因素?Ij?II?III4?CT

Ij、IIj、IIIj、IVj分別表示第j列中1,2,3,4水平對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果之和。

總偏差平方和＝各列因素偏差平方和+誤差偏差平方和。

5.2.2自由度

f總=試驗(yàn)的次數(shù)-1；f因=因素的水平數(shù)-1。

5.2.3方差

A因素的方差=A因素的偏差平方和/A因素的自由度

誤差的方差=誤差的偏差平方和/誤差的自由度

5.2.4構(gòu)造F統(tǒng)計(jì)量

5.2.5列方差分析表，作F檢驗(yàn)

? 當(dāng)FA>F0.01(f1，f2)時(shí)，說明該因子水平的改變，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有高度顯著地影響，記作**。當(dāng)F0.01(f1,f2)>FA>F0.05(f1,f2)時(shí)，說明該因子水平的改變，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著地影響，記作*。當(dāng)F0.05(f1,f2)>FA>F0.10(f1,f2)時(shí)，說明該因子水平的改變，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，記作*-。

查表可得F0.01(f1，f2)、F0.05(f1,f2)、F0.10(f1,f2)的值。

6、驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)結(jié)果分析得出最優(yōu)生產(chǎn)條件，進(jìn)行最優(yōu)試驗(yàn)條件的驗(yàn)證。

7、結(jié)論

通過了驗(yàn)證試驗(yàn)，最后可以得出結(jié)論。

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S因素

F因素?f因素S誤差

f誤差

第三篇：基因工程

寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院考核答題紙

（2011--2012學(xué)年第 學(xué)期）

課號(hào)：:EK5G04A00

課程名稱：現(xiàn)代生物技術(shù)概論

閱卷教師：

班級(jí)：10級(jí)生物工程

學(xué)號(hào)：104177306

姓名：郭兆峰

成績：

基因工程

摘要：基因工程是20世紀(jì)70年代在分子遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是一種可以按照人們的意愿設(shè)計(jì)、改造和組建生物品種的新技術(shù)。包括它通過基因操作，將目的基因活DNA片段與合適的載體連接轉(zhuǎn)入目標(biāo)生物細(xì)胞，通過復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯外源目的基因以及蛋白質(zhì)的活性表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因生物獲得新的遺傳性狀。

關(guān)鍵詞：生物技術(shù)；基因工程

一、基因工程的誕生：

從20世紀(jì)40年代開始，受分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)發(fā)展的影響，基因分子生物學(xué)取得巨大進(jìn)步，為基因工程的誕生奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)在人們公認(rèn)的誕生日期是1973年，其中現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域上的三大發(fā)現(xiàn)及技術(shù)上的三大發(fā)明起了決定性作用。

理論上的三大發(fā)現(xiàn)包括：第一，20世紀(jì)40年代，Avery 在美國的一次學(xué)術(shù)會(huì)上報(bào)道了肺炎球菌的轉(zhuǎn)化，證明了遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì)；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)以及半保留復(fù)制機(jī)理，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞問題；第三，20世紀(jì)50年代末的“中心法則”，60年代由Monod 和 Jacob 提出的操縱分子學(xué)說，并成功的由一批科學(xué)家破譯了遺傳密碼從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。

以上問題的解決使得人們自主改造生物遺傳性狀從理論上成為現(xiàn)實(shí)。

技術(shù)上的三大發(fā)明：第一，1967年發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶，以及1979年發(fā)現(xiàn)的具有更高活性的T4 DNA連接酶。在1970年Smith和 Wilcox從流感嗜血桿菌中分離并純化的限制性核酸內(nèi)切酶HindⅡ和1972年發(fā)現(xiàn)的EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶。后來發(fā)現(xiàn)的大量的限制性核酸內(nèi)切酶。第二，一些病毒、質(zhì)粒和噬菌體等載體技術(shù)的發(fā)現(xiàn)使把目的基因的導(dǎo)入更加容易。第三，DNA分子序列分析及瓊脂糖凝膠電泳、Southern雜交技術(shù)的發(fā)展使得基因工程的誕生越來越近。1973年，斯坦福大學(xué)將抗四環(huán)素質(zhì)粒和抗新霉素的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶切割并連接成重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中是基因工程誕生的標(biāo)志。

二、基因工程有幾個(gè)重要特征：（1）、打破了物種的界限，實(shí)現(xiàn)跨物種的基因轉(zhuǎn)移；（2）、通過已知功能基因的遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)行物種的定向改良；（3）、創(chuàng)造出自然界中本來不存在的物種。

三、基因工程技術(shù)流程包括：（1）、目的基因克隆，即從特定生物基因組和cDNA中分離提純和擴(kuò)大繁殖目的基因；（2）、選擇合適的載體，并對(duì)載體DNA進(jìn)行克??；（3）、將目的基因與載體寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院考核答題紙

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課號(hào)：:EK5G04A00

課程名稱：現(xiàn)代生物技術(shù)概論

閱卷教師：

班級(jí)：10級(jí)生物工程

學(xué)號(hào)：104177306

姓名：郭兆峰

成績：

連接；（4）、將重組DNA導(dǎo)入到大腸桿菌或酵母菌體內(nèi)培養(yǎng)；（5）、利用載體上的標(biāo)記基因進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)目的基因的細(xì)胞或植株。

四、基因工程的應(yīng)用：

（1）基因工程應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面：農(nóng)業(yè)領(lǐng)域是目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域之一。農(nóng)作物生物技術(shù)的目的是提高作物產(chǎn)量，改善品質(zhì)，增強(qiáng)作物抗逆性、抗病蟲害的能力。基因工程在這些領(lǐng)域已取得了令人矚目的成就。

（2）基因工程應(yīng)用于醫(yī)藥方面：目前，以基因工程藥物為主導(dǎo)的基因工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，發(fā)展前景廣闊?；蚬こ趟幬镏饕?xì)胞因子、抗體、疫苗、激素和核苷酸藥物等。它們對(duì)預(yù)防人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內(nèi)的各種傳染病、類風(fēng)濕疾病等有重要作用。在很多領(lǐng)域特別是疑難病癥上，基因工程工程藥物起到了傳統(tǒng)化學(xué)藥物難以達(dá)到的作用。我們最為熟悉的干擾素(IFN)就是一類利用基因工程技術(shù)研制成的多功能細(xì)胞因子，在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病。

（3）基因工程應(yīng)用于環(huán)保方面：基因工程技術(shù)可提高微生物凈化環(huán)境的能力。美國利用DNA重組技術(shù)把降解芳烴、萜烴、多環(huán)芳烴、脂肪烴的4種菌體基因鏈接，轉(zhuǎn)移到某一菌體中構(gòu)建出可同時(shí)降解4種有機(jī)物的“超級(jí)細(xì)菌”，用之清除石油污染，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可將水上浮油中的2/3烴類降解完，而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢桿菌、且表達(dá)成功。它能釘死蚊蟲與害蟲，而對(duì)人畜無害，不污染環(huán)境。現(xiàn)已開發(fā)出的基因工程菌有凈化農(nóng)藥的DDT的細(xì)菌、降解水中的染料、環(huán)境中有機(jī)氯苯類和氯酚類、多氯聯(lián)苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸藥的工程菌及用于吸附無機(jī)有毒化合物(鉛、汞、鎘等)的基因工程菌及植物等。90年代后期問世的DNA改組技術(shù)可以創(chuàng)新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新的功能，創(chuàng)造出全新的微生物，如可將降解某一污染物的不同細(xì)菌的基因通過PCR技術(shù)全部克隆出來，再利用基因重組技術(shù)在體外加工重組，最后導(dǎo)入合適的載體，就有可能產(chǎn)生一種或幾種具有非凡降解能力的超級(jí)菌株，從而大大地提高降解效率。

五、基因工程的安全性問題：

自基因工程誕生以來，基因工程的安全性問題就受到人們極大的關(guān)注，關(guān)于重組DNA潛在的危險(xiǎn)性問題的爭論，在基因工程還處于醞釀階段的時(shí)候就已經(jīng)開始。爭論的焦點(diǎn)是擔(dān)心基因工程寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院考核答題紙

（2011--2012學(xué)年第 學(xué)期）

課號(hào)：:EK5G04A00

課程名稱：現(xiàn)代生物技術(shù)概論

閱卷教師：

班級(jí)：10級(jí)生物工程

學(xué)號(hào)：104177306

姓名：郭兆峰

成績：的雜種生物會(huì)從實(shí)驗(yàn)室溢出，在自然界造成難以抑制的災(zāi)難，有害的雜種菌或病毒與化學(xué)物質(zhì)不同，它們會(huì)在自然界不斷繁殖，造成的危害更大。

在1975年2月，美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）在加利福尼亞州的Asilomar 會(huì)議中心內(nèi)，160名來自美國和16個(gè)國家的專家學(xué)者對(duì)重組DNA的危害辯論，雖然與會(huì)代表分歧挺大，但最后也達(dá)成了一些重要的共識(shí)，在1976年6月23日美國NIH制定并公布了《重組DNA研究準(zhǔn)則》。為了避免可能造成的危害，除了規(guī)定禁止若干類型的重組DNA實(shí)驗(yàn)外，還制定了許多具體的規(guī)定條文。

六、基因工程的前景展望：基因工程技術(shù)是繼工業(yè)革命、信息革命之后 對(duì)人類社會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響的一場革命。它在基因制藥、基因診斷、基因治療、基因芯片和基因克隆等技術(shù)方面取得的革命性成果，將極大地改變?nèi)祟惿蜕蠲婷病?/p>

參考文獻(xiàn)：

1、基因工程/樓士林，楊盛昌，龍敏南等主編.—北京：科學(xué)出版社，2002

2、基因工程技術(shù)/鐘衛(wèi)鴻主編.—北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.6

3、基因工程/何水林主編.—北京：科學(xué)出版社，2008

4、基因工程原理與技術(shù)/劉志國主編.—2版.—北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010,12

5、基因工程：原理、方法與應(yīng)用/徐煜泉等編著.—北京：北京大學(xué)出版社，2008.12

第四篇：基因工程

《基因工程論文》

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構(gòu)建

學(xué)

院：生命科學(xué)學(xué)院 班

級(jí)：生物技術(shù)12-2 學(xué)

號(hào)：7011208209 姓

名：陳 昆 任課教師：張銳

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構(gòu)建

摘要﹕從以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長的解烴菌———地芽孢桿菌MD-2細(xì)胞中獲得了1個(gè)新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA。將基因sladA克隆到質(zhì)粒pSTE33上,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSTalk。通過電轉(zhuǎn)化將pSTalk轉(zhuǎn)化入嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3內(nèi),構(gòu)建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜熱和解烴的功能,在70℃條件下,14d后對(duì)原油的降解率達(dá)75.08%。研究結(jié)果表明,可以通過體外重組的方式向嗜熱菌中引入烴降解基因,從而構(gòu)建嗜熱解烴基因工程菌。關(guān)鍵詞:微生物采油;烴類降解菌;嗜熱解烴基因;質(zhì)粒;基因工程菌

微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要機(jī)理之一。研究結(jié)果表明,在解烴菌作用下原油的族組分發(fā)生變化,輕質(zhì)組分增加,粘度下降,改善了原油的流動(dòng)性;同時(shí),解烴菌還可以將烴類分子轉(zhuǎn)化成有機(jī)溶劑、表面活性劑、酸和氣體等驅(qū)油物質(zhì)。迄今為止,從自然界篩選的高效解烴菌絕大多數(shù)為嗜溫微生物,最適合生長溫度一般為20-45℃,很難適應(yīng)油藏的高溫環(huán)境。筆者從1株解烴菌細(xì)胞中分離出1個(gè)新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段將此基因轉(zhuǎn)化到另外1株最適合生長溫度為70℃的嗜熱菌體內(nèi),構(gòu)建了嗜熱解烴基因工程菌SL-21。該基因工程菌既具有高效的解烴功能,又能適應(yīng)油藏高溫環(huán)境,在微生物采油中具有良好的應(yīng)用前景。1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料包括限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR片斷回收試劑盒;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α;pGEM-T easy載體;質(zhì)粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培養(yǎng)基按文獻(xiàn)配制。無機(jī)鹽培養(yǎng)基組成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸餾水100mL;pH值為7.2。嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3,分離自勝利油區(qū)孤島油田中一區(qū)館3區(qū)塊采出液,最適合生長溫度為70℃;地芽孢桿菌MD-2,以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長,分離自勝利油區(qū)原油污染土壤。1.2 實(shí)驗(yàn)方法

DNA的操作 基因組DNA小量提取,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)DNA擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的回收、酶切與連接,質(zhì)粒DNA提取和基因序列測定等均按文獻(xiàn)[13-14]方法進(jìn)行。菌株培養(yǎng) 所涉及到的菌株培養(yǎng)均在溫度為70℃,轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)?；蚬こ叹臉?gòu)建和篩選方法 ZJ-3感受態(tài)細(xì)胞的制備按文獻(xiàn)[13-14]方法進(jìn)行。用構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSTalk在最佳條件下電轉(zhuǎn)化ZJ-3感受態(tài)細(xì) 胞構(gòu)建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB瓊脂平板上挑選10個(gè)陽性克隆接種到5mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜,獲得種子液。將該種子液接種到200mL以液蠟為惟一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5d后用CCl4抽提剩余的液蠟,用紅外測油儀測定烴的剩余量,根據(jù)菌株降解液蠟的速率篩選出目的基因工程菌。基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測挑取陽性克隆接種于含100μg/mL Amp的10mL的LB液體培養(yǎng)基中,180r/min下振蕩培養(yǎng)至光密度值達(dá)到0.6(檢測光波波長為600nm),加誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為1mmol/L,振蕩培養(yǎng)8h,收集表達(dá)菌體,加SDS上樣緩沖液,于100℃水浴10min后上樣,用12%的SDS-PAGE電泳檢測?；蚬こ叹涤湍芰y試 將基因工程菌接入20mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12h,以5 000r/min的速度離心5min收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌菌體1次,加20mL無菌生理鹽水懸浮,作為菌株利用烷

烴生長的種子液。取菌懸液按1%接種量接入200mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,加入2%孤島油田中一區(qū)館3區(qū)塊原油或2%的液體石蠟作為惟一碳源培養(yǎng),取樣稀釋涂布計(jì)數(shù)。原油降解實(shí)驗(yàn) 在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加2%的原油,按1%接種量接入基因工程菌,培養(yǎng)14d。用正己烷萃取降解后的原油,用氣相色譜儀測定原油飽和烴組分的降解情況。原油降解率為菌株降解前、后原油量的差值與菌株降解前原油量的比值。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 MD-2基因組DNA的檢測

對(duì)MD-2基因組進(jìn)行提取和純化。提取后的染色體DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,相對(duì)分子質(zhì)量不小于23kb,說明提取的DNA完好。在檢測光波波長為260280nm條件下分別測出DNA的光密度,其比值為1.95,換算出DNA的質(zhì)量濃度為1 400g/mL,表明DNA純度較好,無蛋白、RNA、酚和多糖物質(zhì)的干擾。2.2 烷烴單加氧酶基因的克隆與序列分析依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院基因序列數(shù)據(jù)庫(Genbank)中的烷烴單加氧酶基因開放閱讀框兩端保守序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)兼并引物以MD-2基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將約1.3kb的PCR產(chǎn)物回收后連接到pGEM-T easy載體上,轉(zhuǎn)入E.coliDH5α,挑取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)Genbank檢索,表明該DNA序列是個(gè)新的烷烴單加氧酶基因,命名為sladA。2.3 基因工程菌的構(gòu)建及篩選

通過PCR擴(kuò)增sladA后,將PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分離純化出1 329bp的片斷,與經(jīng)EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33質(zhì)粒連接,構(gòu)建成含sladA的重組質(zhì)pSTalk。經(jīng)電泳鑒定表明(圖1),重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的誘導(dǎo)表達(dá)

由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE圖譜可見(圖2),在烷烴單加氧酶基因sladA對(duì)應(yīng)蛋白大小的地方掃描到高信號(hào)強(qiáng)度,表明sladA基因在SL-21中得以表達(dá)。2.5 基因工程菌SL-21碳源生長

基因工程菌SL-21在以原油和液體石蠟為惟一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng),在70℃和180r/min條件下,經(jīng)過3d的延滯期后進(jìn)入對(duì)數(shù)期,菌體數(shù)增加。17d后,菌體數(shù)為接菌初期的5倍,表明SL-21能夠利用原油或液體石蠟作為惟一碳源生長。2.6 對(duì)原油的降解作用

由原油飽和烴組分的降解情況可看出(圖3),基因工程菌對(duì)原油有很明顯的降解效果,幾乎將飽和烴降解完全。經(jīng)對(duì)氣相色譜各峰面積對(duì)比,計(jì)算出各峰面積的含

量和飽和烴組分降解率(表2)?；蚬こ叹鶶L-21對(duì)原油的降解率為75.08%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,烴類降解菌地芽孢桿菌MD-2細(xì)胞提取的烷烴單加氧酶基因sladA可以在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中表達(dá)。但不同的基因工程菌株中烷烴單加氧酶基因sladA表達(dá)的效率不同,需要通過菌株對(duì)原油的降解評(píng)價(jià)進(jìn)一步篩選。獲得的對(duì)原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高溫條件下生長,并且對(duì)原油降解效果明顯。因此以體外重組方式向嗜熱菌中引入烴類降解基因構(gòu)建嗜熱解烴基因工程菌在技術(shù)上是可行的。3 結(jié)論

以地芽孢桿菌MD-2為目標(biāo)菌株,克隆和表達(dá)了降解長鏈烷烴的單加氧酶基因sladA,并在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中正確表達(dá)了基因sladA,構(gòu)建了基因工程菌SL-21?；蚬こ叹鶶L-21在70℃條件下,能以原油或液體石蠟為惟一碳源生長。14d對(duì)原油的降解率為75.08%,對(duì)原油飽和烴組分均有明顯的降解效果。該基因工程菌既可以用于微生物驅(qū)油技術(shù),又可以用于高溫油田污水的生物處理。利用基因工程的方法可以獲得既能耐受極端環(huán)境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌種選育的重要方向。參考文獻(xiàn): [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烴降解菌的篩選及性能研究[J].大慶石油地質(zhì)與開發(fā),2007,26(6):119-123.[2] 汪衛(wèi)東,汪竹,耿雪麗,等.美國微生物采油技術(shù)現(xiàn)場應(yīng)用效果分析[J].油氣地質(zhì)與采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁長忠,宋永亭,段傳慧.微生物采油用營養(yǎng)物質(zhì)在石英砂上的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附規(guī)律[J].油氣地質(zhì)與采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龍,董漢平,俞理,等.微生物提高采收率數(shù)值模擬研究現(xiàn)狀[J].油氣地質(zhì)與采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花麗.本源微生物降解原油的飽和烴色譜分析[J].油氣地

質(zhì)與采收率,2008,15(1):77-79.[6] 宋智勇,張君,馬繼業(yè),等.微生物菌液的界面特性[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(3):73-75.[7] 蔣焱,曹功澤,趙鳳敏,等.聚合物驅(qū)后微生物提高采收率的可行性分析[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(5):63-65,68.[8] 陳愛華,方新湘,呂秀榮,等.克拉瑪依油田內(nèi)源微生物驅(qū)油機(jī)理探索[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(5):75-77.[9] 宋紹富,劉菊榮,張忠智.微生物采油替代營養(yǎng)源的研究[J].油氣地質(zhì)與采收率,2007,14(2):96-98.[10]李希明.微生物驅(qū)替盲端類剩余油的微觀實(shí)驗(yàn)[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(3):91-92.[11]沈萍.微生物學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2000:143.[12]唐赟,馮露,劉沐之,等.嗜熱解烴菌NG80-2的鑒定及其特[J].南開大學(xué)學(xué)報(bào),2006,39(2):46-50,70.[13] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].金冬雁,譯.北京:科學(xué)出版社,1992.[14]盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].2版.北京:高等教育出版社,1993.4

第五篇：基因工程

基因工程技術(shù)的程序與應(yīng)用

【摘要】基因工程技術(shù)是一項(xiàng)正在蓬勃發(fā)展的技術(shù)，它將給人類社會(huì)帶來一場深刻的變革，我們有必要了解基因工程的概念、原理、技術(shù)程序，以及基因工程在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用和進(jìn)展情況。

【關(guān)鍵詞】基因工程技術(shù)程序應(yīng)用進(jìn)展

基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行復(fù)雜的操作，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細(xì)胞中，以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙。基因工程技術(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。

一 基因工程的技術(shù)程序

基因工程的基本原理是在體外將不同來源的DNA進(jìn)行剪切和重組，形成鑲嵌DNA分子，然后將之導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其擴(kuò)增表達(dá)，從而使宿主細(xì)胞獲得新的遺傳特性，形成新的基因產(chǎn)物。它有3個(gè)基本的步驟：①從合適材料分離或制備目的基因或DNA片段。②目的基因或DNA片段與載體連接作成重組DNA分子。③重組DNA分子引入宿主細(xì)胞，在其中擴(kuò)增和表達(dá)。不同種類生物的生物學(xué)特性不同，其基因工程在操作上和具體技術(shù)上必然有所差異，但技術(shù)核心都是DNA的重組，即利用一系列的DNA限制性內(nèi)切酶、連接酶等分子手術(shù)工具，在某種生物DNA鏈上切下某個(gè)目標(biāo)基因或特殊的DNA片段，然后根據(jù)設(shè)計(jì)要求，將其接合到受體生物DNA鏈上。

一個(gè)完整的用于生產(chǎn)生產(chǎn)目的的基因工程技術(shù)程序包括的基本內(nèi)容有：①外源目標(biāo)基因的分離、克隆以及目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)與功能研究。②適合轉(zhuǎn)移、表達(dá)載體的構(gòu)建或目標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)重組。③外源基因的導(dǎo)入。④外源基因在宿主基因組上的整合、表達(dá)及檢測與轉(zhuǎn)基因生物的篩選。⑤外源基因表達(dá)產(chǎn)物的生理功能的檢定。⑥轉(zhuǎn)基因新品系的選育和建立以及轉(zhuǎn)基因新品系的效益分析。⑦生態(tài)與進(jìn)化安全保障機(jī)制的建立。⑧消費(fèi)安全評(píng)價(jià)。

（一）外源目標(biāo)基因的分離、克隆及功能結(jié)構(gòu)分析

獲合乎人類某種需要的取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步，也是開展一項(xiàng)基因工程的前提和全部工作的核心。目前人們已經(jīng)能夠通過多種途徑和方法來獲取目標(biāo)基因，其中主要有兩條途徑：一條是從供體細(xì)胞的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因。

直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分別在各個(gè)受體細(xì)胞中大量復(fù)制（在遺傳學(xué)中叫做擴(kuò)增），1

從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。用鳥槍法獲得目的基因的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便，缺點(diǎn)是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核細(xì)胞的基因含有不表達(dá)的DNA片段，一般使用人工合成的方法。

目前人工合成基因的方法主要有兩條。一條途徑是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，推測出它的基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就可以通過人工合成基因的方法獲得。

（二）構(gòu)建能在受體生物細(xì)胞中表達(dá)的重組目標(biāo)基因

要使一個(gè)外源目標(biāo)基因能整合到受體細(xì)胞的基因組中并能在整合后在受體基因組的調(diào)控下有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，就必須事先對(duì)目標(biāo)基因的功能結(jié)構(gòu)用DNA重組技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，也就是將目?biāo)基因與一種特別的DNA分子重組，這種特別的DNA分子稱為基因載體，目前所用的載體主要有以下幾類：質(zhì)粒、λ噬菌體、柯斯質(zhì)粒、病毒載體、YAC載體等，各類載體具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，可用于不同的目標(biāo)基因。

（三）外源重組目標(biāo)基因的導(dǎo)入

將重組的外源目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞中的過程稱為基因?qū)牖蚧蜣D(zhuǎn)移。接受外源基因的細(xì)胞稱為受體細(xì)胞。由于受體生物學(xué)特征的不同以及基因工程目的不同，外源基因?qū)氲姆椒ㄒ膊煌?，有的是用載體導(dǎo)入，有的是直接用物理的方法導(dǎo)入。目前使用的有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔導(dǎo)入法、基因槍射入法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法等，向細(xì)菌等微生物中導(dǎo)入外源目標(biāo)基因常用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和噬菌體轉(zhuǎn)染方法；向植物細(xì)胞中導(dǎo)入外源基因常用基因槍注入法和Ti質(zhì)粒導(dǎo)入法；能由原生質(zhì)體再生出植株的植物細(xì)胞還可以用電穿孔導(dǎo)入法及脂質(zhì)體融合法；動(dòng)物的受精卵一般通過人工顯微鏡注射法導(dǎo)入外源基因；動(dòng)物的體細(xì)胞可用電穿孔法和病毒轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入外源基因，但對(duì)用于生產(chǎn)目的的基因工程常常避免用病毒轉(zhuǎn)染法。

（四）轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或個(gè)體的鑒別和篩選

在對(duì)宿主的細(xì)胞進(jìn)行了外源目標(biāo)基因?qū)胩幚硪院螅行┘?xì)胞可能并沒有外源基因的進(jìn)入，另有一些細(xì)胞可能在外源基因進(jìn)入后因各種原因而不能使外源基因表達(dá)，因此必須對(duì)被進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)移處理的細(xì)胞或個(gè)體進(jìn)行鑒別，以篩選出導(dǎo)入外源目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或個(gè)體。鑒別和篩選轉(zhuǎn)基因生物一般在兩個(gè)層面上進(jìn)行：一是檢測目標(biāo)基因是否表達(dá)，二是檢測目標(biāo)基因是否整合到了宿主的染色體上和能否穩(wěn)定傳代。表達(dá)檢測的方法主要有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的印跡雜交法、免疫印跡檢測法、免疫組織化學(xué)檢測法等。整合檢測可通過DNA分子雜交來確定。

（五）轉(zhuǎn)基因品系的效益分析。

一個(gè)生產(chǎn)性能優(yōu)越的轉(zhuǎn)基因品系，首要的條件是目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)物必須有正常的生理功能，另一個(gè)必要標(biāo)志是其目標(biāo)基因必須有適度的高效表達(dá)特性和可持續(xù)生產(chǎn)能力。

（六）生態(tài)與進(jìn)化安全保障

由于轉(zhuǎn)基因生物與其他生物一樣具有可遺傳、易擴(kuò)散及自主的特性，而且人類對(duì)生命、生態(tài)系統(tǒng)、生物的演化實(shí)際上還知之甚少，對(duì)不同物種間基因的人工組合，外源基因?qū)κ荏w生物進(jìn)化的可能影響，轉(zhuǎn)基因生物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的長期影響

等都無法進(jìn)行評(píng)估，因此如果人們不事先采取控制措施，轉(zhuǎn)基因生物一旦進(jìn)入到自然環(huán)境中就可能打破生態(tài)平衡，破壞生態(tài)環(huán)境和自然種質(zhì)資源。對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法：物理的方法就是通過各種嚴(yán)格的管理措施和物理屏障盡量使轉(zhuǎn)基因生物不能從實(shí)驗(yàn)室逃逸進(jìn)入到自然環(huán)境里去；生物的方法一般就是造成轉(zhuǎn)基因生物與非轉(zhuǎn)基因生物之間的生殖隔離，如利用三倍體不育的特性將用于生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物變成三倍體等。

（七）消費(fèi)安全評(píng)價(jià)

消費(fèi)安全評(píng)價(jià)一般要考慮以下一些主要的方面：①導(dǎo)入外源目標(biāo)基因本身編碼的產(chǎn)物是否安全。②外源目標(biāo)基因是否穩(wěn)定。③使用的載體是否安全。④使用的報(bào)道基因（就是能產(chǎn)生很容易觀察的性狀的基因）是否會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)。⑤外源基因?qū)牒笫欠駮?huì)誘導(dǎo)受體生物產(chǎn)生新的有害遺傳性狀或不利于健康的成分。為了保護(hù)人類的健康，許多國家都已通過立法或其他形式對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行消費(fèi)安全評(píng)價(jià)和嚴(yán)格的管理，對(duì)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因食品嚴(yán)格限制。

二 基因工程的應(yīng)用

基因工程在醫(yī)藥業(yè)中的應(yīng)用。許多藥品的生產(chǎn)是從生物組織中提取的。受材料來源限制產(chǎn)量有限，其價(jià)格往往十分昂貴。微生物生長迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應(yīng)藥物成分的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞內(nèi)，讓它們產(chǎn)生相應(yīng)的藥物，不但能解決產(chǎn)量問題，還能大大降低生產(chǎn)成本。如基因工程胰島素、干擾素、人造血液、白細(xì)胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，均為解除人類的病苦，提高人類的健康水平發(fā)揮了重大的作用。

基因診斷與基因治療。遺傳病是長期困擾人類的一類不治之癥，迄今已發(fā)現(xiàn)的有3000多種。其根源于遺傳基因存在缺陷，主要特征是可隨生育而傳代?；蛑委熓前颜；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療疾病的目的，這是治療遺傳病的最有效的手段?；痉椒ㄊ牵夯蛑脫Q、基因修復(fù)、基因增補(bǔ)和基因失活等。如運(yùn)用基因工程設(shè)計(jì)制造的“DNA探針”檢測肝炎病毒等病毒感染及遺傳缺陷，不但準(zhǔn)確而且迅速。通過基因工程給患有遺傳病的人體內(nèi)導(dǎo)入正?；蚩伞耙淮涡浴苯獬∪说募部唷?/p>

基因工程在農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)上的應(yīng)用。運(yùn)用基因工程技術(shù)，不但可以培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗性好的農(nóng)作物及畜、禽新品種，還可以培養(yǎng)出具有特殊用途的動(dòng)、植物。如轉(zhuǎn)基因魚（生長快、耐不良環(huán)境、肉質(zhì)好），轉(zhuǎn)基因牛（乳汁中含有人生長激素），轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒，轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄，轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯，不會(huì)引起過敏的轉(zhuǎn)基因大豆，抗蟲棉等。

基因工程在環(huán)境保護(hù)工業(yè)方面的應(yīng)用?；蚬こ套龀傻腄NA探針能夠十分靈敏地檢測環(huán)境中的病毒、細(xì)菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況，卻不易因環(huán)境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉(zhuǎn)化污染物。如有一種超級(jí)細(xì)菌，能快速分解石油，可用于清除被石油污染的海域。這種超級(jí)菌是美國科學(xué)家用基因工程方法，把降解不同石油化合物的基因移植到一個(gè)菌株內(nèi)而產(chǎn)生的。

總之，基因工程的發(fā)展將會(huì)給人類社會(huì)帶來巨大的變化。

三 基因工程的進(jìn)展?fàn)顩r

基因工程技術(shù)是一項(xiàng)正在蓬勃發(fā)展的技術(shù)，而且也已經(jīng)取得了許多重要的應(yīng)用成果，但我們也應(yīng)該看到，基因工程技術(shù)不是一項(xiàng)已經(jīng)成熟的技術(shù)，仍然還很粗糙和原始，在許多方面尚需完善和改進(jìn)。

1．基因工程在技術(shù)上存在一定的不確定性和盲目性。目前的基因工程在技術(shù)上有很多的不確定性。這種不確定性表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是技術(shù)方面的不穩(wěn)定性，二是由于對(duì)不同生物的生理特性的了解不很深入，如我們將魚類抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)移到不抗寒的羅非魚等熱帶魚中，雖然抗凍蛋白基因得到表達(dá)，但并沒有使受體魚產(chǎn)生預(yù)期的抗寒效果。目前我們所進(jìn)行的基因工程基本上只能對(duì)簡單的、單基因控制的性狀進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造，操作對(duì)象只限于一些比較簡單的單因子基因。但生物絕大部分的重要性狀是由多個(gè)基因共同控制的，對(duì)這些多基因控制的性狀，現(xiàn)有的基因工程技術(shù)幾乎仍然是束手無策。我們對(duì)活的生物體中基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制知之甚少，有關(guān)的知識(shí)僅限于對(duì)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子有所了解，對(duì)生物體整體的調(diào)節(jié)復(fù)雜性的認(rèn)識(shí)還剛剛開始。

2．在安全性方面存在著不確定性。對(duì)社會(huì)大眾來說，最主要和最關(guān)心的是基因工程的安全性問題，基因工程的安全性問題包括兩個(gè)方面：一是基因工程產(chǎn)品的消費(fèi)安全問題，二是轉(zhuǎn)基因生物的生態(tài)安全問題。目前用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)出來的食品因其成分的某些改變是否會(huì)對(duì)人類的健康產(chǎn)生不良的影響，這需要實(shí)驗(yàn)和時(shí)間來驗(yàn)證。有著某種生存優(yōu)勢的轉(zhuǎn)基因生物如果進(jìn)入到自然生態(tài)系統(tǒng)，就有可能排擠自然種群，降低生態(tài)系統(tǒng)里物種的多樣性，打破生態(tài)平衡。

所以我們?cè)诖罅Πl(fā)展轉(zhuǎn)基因技術(shù)的同時(shí)，必須高度重視對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、植物及微生物品種的生物控制和控制技術(shù)的研究。在轉(zhuǎn)基因品種的安全性沒有進(jìn)行全面的評(píng)估和沒有可靠的生物控制措施之前，應(yīng)嚴(yán)格禁止其進(jìn)行生產(chǎn)和進(jìn)入開放的自然生態(tài)系統(tǒng)，只有其生態(tài)安全性達(dá)到了傳統(tǒng)育種方法培育的新品種時(shí)，或無生殖能力的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物才能允許進(jìn)入自然界進(jìn)行生產(chǎn)，也只有這樣才是有益于人類和社會(huì)進(jìn)步的。

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