第一篇：《生物制藥技術(shù)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)-實(shí)驗(yàn)一

《生物制藥技術(shù)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)一 金霉素鏈霉菌培養(yǎng)基的制備（驗(yàn)證型）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、學(xué)會(huì)培養(yǎng)基的配制

2、掌握滅菌方法。實(shí)驗(yàn)原理：

金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦稱“金色鏈霉菌”，放線菌門(Actinobacteria)，放線菌綱(Actinobacteria)，放線菌目(Actinomycetales)，鏈霉菌科(Streptomycetaceae)，鏈霉菌屬(Streptomyces)。在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生金色色素，故名。其菌落為草帽型, 菌落直徑一般為3～5毫米, 表面較平坦, 中間有隆起。菌落開(kāi)始為白色，長(zhǎng)孢子后變青色。在顯微鏡下可以看到短桿狀的菌絲?？咕毓I(yè)上用以生產(chǎn)金霉素。

放線菌是一類介于細(xì)菌與真菌之間的單細(xì)胞微生物。放線菌在土壤中分布最多，大多數(shù)生活在含水量較低、有機(jī)質(zhì)豐富和微堿性的土壤中。多數(shù)情況下，泥土中散發(fā)出的“泥腥味”就是由放線菌中鏈霉菌產(chǎn)生的土腥素造成的。放線菌大都好氧，屬于化能異養(yǎng)，菌絲纖細(xì)，分枝，常從一個(gè)中心向周圍輻射生長(zhǎng)。因其生長(zhǎng)具輻射狀，故名放線菌。放線菌能像真菌那樣形成分枝菌絲，并在菌絲末端產(chǎn)生外生的分生孢子，有些種類甚至形成孢子囊，因而曾被誤認(rèn)是真菌。但其菌落較小而致密，不易挑取。不少菌種在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上廣泛應(yīng)用，可產(chǎn)生抗菌素，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)和分離出的由放線菌產(chǎn)生的抗生素多達(dá)4 000多種，其中，有50多種抗生素已經(jīng)廣泛地得到應(yīng)用，如鏈霉素、紅霉素、土霉素、四環(huán)素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于臨床治療人的多種疾??；有些可生產(chǎn)蛋白酶、葡萄糖異構(gòu)酶；有的用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如滅瘟素、井岡霉素、慶豐霉素等。

四環(huán)素類抗生素是由鏈霉菌生產(chǎn)或經(jīng)半合成制取的一類廣譜抗生素?？咕V極廣，包括革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌、立克次體、衣原體、支原體和螺旋體。品種主要包括金霉素、四環(huán)素和土霉素。四環(huán)素早在1948年即開(kāi)始用于臨床，至今已有50余年歷史?，F(xiàn)在四環(huán)素已被收入中國(guó)藥典2005版，還被收入美國(guó)、英國(guó)、日本等許多國(guó)家的藥典。上世紀(jì)70～80年代四環(huán)素產(chǎn)銷處于全盛時(shí)期，我國(guó)有上百家企業(yè)生產(chǎn)，臨床用量很大。多年來(lái)由于四環(huán)素類的廣泛應(yīng)用，臨床常見(jiàn)病原菌對(duì)金霉素耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。1950年，國(guó)外有報(bào)道四環(huán)素族藥物引起牙著色，病因是在牙的發(fā)育礦化期服用四環(huán)素族藥物，可被結(jié)合到牙組織內(nèi)，使牙著色。四環(huán)素還可在母體通過(guò)胎盤引起乳牙著色。其后又后續(xù)報(bào)道四環(huán)素沉積于牙、骨骼以至指甲等，而且還能引起釉質(zhì)發(fā)育不全。在這方面，國(guó)內(nèi)直至70年代中期方引起注意。自20世紀(jì)80年代后期起，因細(xì)菌耐藥性增加以及新的抗生素大量上市等原因，四環(huán)素產(chǎn)銷逐漸萎縮，市場(chǎng)疲軟。因?yàn)楦弊饔么?，只外用，用于治療結(jié)膜炎、沙眼。材料、試劑和器材： 試劑：

NaBr母液（100 g／L）KCl母液（100 g／L）

M-促進(jìn)劑母液（2.5 g／L）器材：

1ml移液槍；不銹鋼鍋；電爐；臺(tái)秤、天平其它物品：

蒸餾水、250ml三角瓶、500ml三角瓶、鑰匙、燒杯、玻璃棒、量筒、紗布、剪刀、棉花塞、報(bào)紙、線繩、皮筋、記號(hào)筆、1.5mL離心管、1ml移液槍頭、槍頭盒 實(shí)驗(yàn)步驟： 1．種子培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉40，黃豆餅粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO3 4，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。

先稱取黃豆餅粉20g，單獨(dú)煮沸10分鐘，加入少量涼水降溫，4層紗布?jí)赫ト≈?，與其它稱好的各成分混合，定容至1L。

每50ml分裝到250ml三角瓶中，每組2瓶。2．定向發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉100，黃豆餅粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，(NH4)2SO4 3，酵母粉2.5，MgSO4·7H2O 0.25，α—淀粉酶0.1。

配制方法同種子培養(yǎng)基，配好后分裝到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分別加入如下成分，比較它們對(duì)四環(huán)素產(chǎn)量的影響：

(1)對(duì)照(不加其他成分)；

(2)加入NaBr母液至終濃度為2g／L；(3)加入KCl母液至終濃度為2g／L；

(4)加入NaBr母液至終濃度為2g／L及M-促進(jìn)劑母液至終濃度為0.025g／L。每?jī)山M配一套。3．滅菌

將封好口的培養(yǎng)基121℃滅菌30min。同時(shí)滅1ml 剪口移液槍頭、1.5mL離心管。（總過(guò)程：稱量——溶化——定容——分裝——封口——滅菌）注意事項(xiàng)：

1．黃豆餅粉煮沸取汁。

2．培養(yǎng)基封口最好用8層紗布或棉花塞，最好不用橡膠塞，以增加透氣性。3．滅菌時(shí)鍋內(nèi)要補(bǔ)足水分。由于滅菌鍋較大，升溫排氣一定要充分（10min）。補(bǔ)充閱讀：

工業(yè)發(fā)酵中利用生產(chǎn)菌發(fā)酵得出最終產(chǎn)物是一個(gè)逐級(jí)放大的過(guò)程，各個(gè)不同的階段對(duì)于營(yíng)養(yǎng)成分的要求也各有特點(diǎn)，根據(jù)發(fā)酵不同階段的要求，培養(yǎng)基可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種。

孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，對(duì)這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長(zhǎng)，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并要求這種培養(yǎng)基不易引起菌種發(fā)生變異。所以對(duì)孢子培養(yǎng)基的基本配制要求是：第一，營(yíng)養(yǎng)不要太豐富（特別是有機(jī)氮源），否則不易產(chǎn)孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖－硝酸鹽－其它鹽類的培養(yǎng)基上都能很好地生長(zhǎng)和產(chǎn)孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只長(zhǎng)菌絲而不長(zhǎng)孢子。第二，所用無(wú)機(jī)鹽的濃度要適量，不然也會(huì)影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子培養(yǎng)基的pH和濕度。生產(chǎn)上常用的孢子培養(yǎng)基有：麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米碎屑培養(yǎng)基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養(yǎng)基。大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因?yàn)樗鼈兒可伲杷?、表面積大，所以是較好孢子培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)和大量繁殖菌絲體，并使菌體長(zhǎng)得粗壯，成為活力強(qiáng)的“種子”。所以種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達(dá)到較高的溶解氧，供大量菌體生長(zhǎng)繁殖。種 2 子培養(yǎng)基的成分要考慮在微生物代謝過(guò)程中能維持穩(wěn)定的pH，其組成還要根據(jù)不同菌種的生理特征而定。一般種子培養(yǎng)基都用營(yíng)養(yǎng)豐富而完全的天然有機(jī)氮源，因?yàn)橛行┌被崮艽碳ゆ咦影l(fā)芽。但無(wú)機(jī)氮源容易利用，有利于菌體迅速生長(zhǎng)，所以在種子培養(yǎng)基中常包括有機(jī)及無(wú)機(jī)氮源。最后一級(jí)的種子培養(yǎng)基的成分最好能較接近發(fā)酵培養(yǎng)基，這樣可使種子進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基后能迅速適應(yīng)，快速生長(zhǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長(zhǎng)、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌絲濃度，又要使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長(zhǎng)所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進(jìn)劑等。但若因生長(zhǎng)和生物合成產(chǎn)物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長(zhǎng)和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時(shí)，則可考慮培養(yǎng)基用分批補(bǔ)料來(lái)加以滿足。

第二篇：《生物制藥技術(shù)》實(shí)驗(yàn)

《生物制藥技術(shù)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)一 金霉素鏈霉菌培養(yǎng)基的制備（驗(yàn)證型）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、學(xué)會(huì)培養(yǎng)基的配制

2、掌握滅菌方法。實(shí)驗(yàn)原理：

金霉素鏈霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦稱“金色鏈霉菌”，放線菌門(Actinobacteria)，放線菌綱(Actinobacteria)，放線菌目(Actinomycetales)，鏈霉菌科(Streptomycetaceae)，鏈霉菌屬(Streptomyces)。在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生金色色素，故名。其菌落為草帽型, 菌落直徑一般為3～5毫米, 表面較平坦, 中間有隆起。菌落開(kāi)始為白色，長(zhǎng)孢子后變青色。在顯微鏡下可以看到短桿狀的菌絲?？咕毓I(yè)上用以生產(chǎn)金霉素。

放線菌是一類介于細(xì)菌與真菌之間的單細(xì)胞微生物。放線菌在土壤中分布最多，大多數(shù)生活在含水量較低、有機(jī)質(zhì)豐富和微堿性的土壤中。多數(shù)情況下，泥土中散發(fā)出的“泥腥味”就是由放線菌中鏈霉菌產(chǎn)生的土腥素造成的。放線菌大都好氧，屬于化能異養(yǎng)，菌絲纖細(xì)，分枝，常從一個(gè)中心向周圍輻射生長(zhǎng)。因其生長(zhǎng)具輻射狀，故名放線菌。放線菌能像真菌那樣形成分枝菌絲，并在菌絲末端產(chǎn)生外生的分生孢子，有些種類甚至形成孢子囊，因而曾被誤認(rèn)是真菌。但其菌落較小而致密，不易挑取。不少菌種在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上廣泛應(yīng)用，可產(chǎn)生抗菌素，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)和分離出的由放線菌產(chǎn)生的抗生素多達(dá)4 000多種，其中，有50多種抗生素已經(jīng)廣泛地得到應(yīng)用，如鏈霉素、紅霉素、土霉素、四環(huán)素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于臨床治療人的多種疾??；有些可生產(chǎn)蛋白酶、葡萄糖異構(gòu)酶；有的用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，如滅瘟素、井岡霉素、慶豐霉素等。

四環(huán)素類抗生素是由鏈霉菌生產(chǎn)或經(jīng)半合成制取的一類廣譜抗生素?？咕V極廣，包括革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌、立克次體、衣原體、支原體和螺旋體。品種主要包括金霉素、四環(huán)素和土霉素。器材：

1ml移液槍；鋁鍋；電爐 試劑：

NaBr母液（100 g／L）KCl母液（100 g／L）

M-促進(jìn)劑母液（2.5 g／L）實(shí)驗(yàn)步驟： 1．種子培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉40，黃豆餅粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO3 4，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。

先稱取黃豆餅粉20g，單獨(dú)煮沸10分鐘，加入少量涼水降溫，4層紗布?jí)赫ト≈?，與其它稱好的各成分混合，定容至1L。

每50ml分裝到250ml三角瓶中，每組2瓶。2．定向發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基(g／L)：可溶性淀粉100，黃豆餅粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，酵母粉2.5，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，α—淀粉酶0.1。

配制方法同種子培養(yǎng)基，配好后分裝到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分別加入如下成分，比較它們對(duì)四環(huán)素產(chǎn)量的影響：

(1)對(duì)照(不加其他成分)；

(2)加入NaBr母液至終濃度為2g／L；(3)加入KCl母液至終濃度為2g／L；

(4)加入NaBr母液至終濃度為2g／L及M-促進(jìn)劑母液至終濃度為0.025g／L。每?jī)山M配一套。3．滅菌

將封好口的培養(yǎng)基121℃滅菌30min。同時(shí)滅1ml 剪口移液槍頭、1.5mL離心管。（總過(guò)程：稱量——溶化——定容——分裝——封口——滅菌）注意事項(xiàng)：

1．黃豆餅粉煮沸取汁。

2．培養(yǎng)基封口最好用8層紗布或棉花塞，最好不用橡膠塞，以增加透氣性。3．滅菌時(shí)鍋內(nèi)要補(bǔ)足水分。由于滅菌鍋較大，升溫排氣一定要充分（10min）。補(bǔ)充閱讀：

工業(yè)發(fā)酵中利用生產(chǎn)菌發(fā)酵得出最終產(chǎn)物是一個(gè)逐級(jí)放大的過(guò)程，各個(gè)不同的階段對(duì)于營(yíng)養(yǎng)成分的要求也各有特點(diǎn)，根據(jù)發(fā)酵不同階段的要求，培養(yǎng)基可分為孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基三種。

孢子培養(yǎng)基孢子培養(yǎng)基是供菌種繁殖孢子的一種常用固體培養(yǎng)基，對(duì)這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長(zhǎng)，產(chǎn)生較多優(yōu)質(zhì)的孢子，并要求這種培養(yǎng)基不易引起菌種發(fā)生變異。所以對(duì)孢子培養(yǎng)基的基本配制要求是：第一，營(yíng)養(yǎng)不要太豐富（特別是有機(jī)氮源），否則不易產(chǎn)孢子。如灰色鏈霉在葡萄糖－硝酸鹽－其它鹽類的培養(yǎng)基上都能很好地生長(zhǎng)和產(chǎn)孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只長(zhǎng)菌絲而不長(zhǎng)孢子。第二，所用無(wú)機(jī)鹽的濃度要適量，不然也會(huì)影響孢子量和孢子顏色。第三，要注意孢子培養(yǎng)基的pH和濕度。生產(chǎn)上常用的孢子培養(yǎng)基有：麩皮培養(yǎng)基、小米培養(yǎng)基、大米培養(yǎng)基、玉米碎屑培養(yǎng)基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食鹽等配制成的瓊脂斜面培養(yǎng)基。大米和小米常用作霉菌孢子培養(yǎng)基，因?yàn)樗鼈兒可?，疏松、表面積大，所以是較好孢子培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)和大量繁殖菌絲體，并使菌體長(zhǎng)得粗壯，成為活力強(qiáng)的“種子”。所以種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也要高些，但總濃度以略稀薄為好，這樣可達(dá)到較高的溶解氧，供大量菌體生長(zhǎng)繁殖。種子培養(yǎng)基的成分要考慮在微生物代謝過(guò)程中能維持穩(wěn)定的pH，其組成還要根據(jù)不同菌種的生理特征而定。一般種子培養(yǎng)基都用營(yíng)養(yǎng)豐富而完全的天然有機(jī)氮源，因?yàn)橛行┌被崮艽碳ゆ咦影l(fā)芽。但無(wú)機(jī)氮源容易利用，有利于菌體迅速生長(zhǎng)，所以在種子培養(yǎng)基中常包括有機(jī)及無(wú)機(jī)氮源。最后一級(jí)的種子培養(yǎng)基的成分最好能較接近發(fā)酵培養(yǎng)基，這樣可使種子進(jìn)入發(fā)酵培養(yǎng)基后能迅速適應(yīng)，快速生長(zhǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基是供菌種生長(zhǎng)、繁殖和合成產(chǎn)物之用。它既要使種子接種后能迅速生長(zhǎng)，達(dá)到一定的菌絲濃度，又要使長(zhǎng)好的菌體能迅速合成需產(chǎn)物。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長(zhǎng)所必需的元素和化合物外，還要有產(chǎn)物所需的特定元素、前體和促進(jìn)劑等。但若因生長(zhǎng)和生物合成產(chǎn)物需要的總的碳源、氮源、磷源等的濃度太高，或生長(zhǎng)和合成兩階段各需的最佳條件要求不同時(shí)，則可考慮培養(yǎng)基用分批補(bǔ)料來(lái)加以滿足。

實(shí)驗(yàn)二 金霉素鏈霉菌的定向發(fā)酵（驗(yàn)證型）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、學(xué)習(xí)和掌握無(wú)菌操作技術(shù)。

2、掌握定向發(fā)酵四環(huán)素的原理。實(shí)驗(yàn)原理：

定向發(fā)酵是指通過(guò)改變培養(yǎng)基組分(加入某些物質(zhì))改變微生物代謝途徑，使發(fā)酵按主觀要求產(chǎn)生較多的產(chǎn)物。

金霉素、四環(huán)素和土霉素，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)極為相似：

R1 R2 Cl H H OH H H

金霉菌原是產(chǎn)生金霉素（Chlortetracycline）的菌種，但因金霉素比四環(huán)素只多一個(gè)氯離子，所以只要在發(fā)酵液中加入某些物質(zhì)，阻止氯離子進(jìn)入四環(huán)素分子，從而使菌種產(chǎn)生較多的四環(huán)素。另外，金色鏈霉菌在30℃以下時(shí)，合成金霉素的能力較強(qiáng)；當(dāng)溫度超過(guò)35℃時(shí)則只合成四環(huán)素。

本實(shí)驗(yàn)中，利用溴離子在生物合成過(guò)程中對(duì)氯離子有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M—促進(jìn)劑，分子式：C7H5NS2，通常作為橡膠硫化促進(jìn)劑)抑制氯化酶的作用，從而增加四環(huán)素的產(chǎn)量。材料和試劑：

金霉素鏈霉菌：購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（菌種保藏號(hào)：CGMCC4.1043；訂單號(hào)20111133 550元）。實(shí)驗(yàn)步驟：

前期準(zhǔn)備工作：配制斜面培養(yǎng)基（可選，1號(hào)培養(yǎng)基由菌種保藏中心提供）

1、麩皮36.0 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2HPO4 3 g，瓊脂 15～20 g，定容至1L，pH 7。

2、可溶性淀粉20g，KN O3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl

0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，定容至1L，pH 7.2~7.5。

1、制備斜面孢子：將保藏的菌種的比例接種于液體培養(yǎng)基中（不加瓊脂的斜面培養(yǎng)基），28℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)，將活化1d后的金霉素鏈霉菌種接入斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5～7天，金霉素 土霉素 四環(huán)素

待孢子長(zhǎng)成灰色，于4℃冰箱中保藏。

2、種子培養(yǎng)：在斜面上用接種鏟挑取1cm2左右生長(zhǎng)良好的菌體接入裝有50ml四環(huán)素種子培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，230 r/min、28℃下振蕩培養(yǎng)20～24h。

3、發(fā)酵培養(yǎng)：以剪口移液槍頭取10 ml種子液接入裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)液的500ml錐形瓶中（注意：同一處理組用同一瓶種子液接種），230 r/min、28℃下振蕩培養(yǎng)5 d。用于后面的測(cè)定效價(jià)和薄層層析實(shí)驗(yàn)。

四環(huán)素的提取和精制（選作）

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．掌握沉淀法精制四環(huán)素的原理、方法和基本操作技術(shù)。2 ．熟悉pH 的控制與產(chǎn)量、質(zhì)最的關(guān)系。

二、實(shí)驗(yàn)原理

四環(huán)素為兩性化合物，其等電點(diǎn)為5.4。當(dāng)溶液pH 等于等電點(diǎn)時(shí)，四環(huán)素呈游離堿形式，從水溶液中沉淀出來(lái)。利用四環(huán)素的這一性質(zhì)，可將四環(huán)素從發(fā)酵液中提取出來(lái)。

在連續(xù)結(jié)晶過(guò)程中，pH 的高低對(duì)產(chǎn)量、質(zhì)量都有一定的影響。四環(huán)素的等電點(diǎn)為5.4 , 在pH 4.5~7.5 之間，游離堿在水中的溶解度乎不變。若pH 控制在接近等電點(diǎn)時(shí)，沉淀結(jié)品雖然比較完全，收率也高，但此時(shí)會(huì)有大量雜質(zhì)同時(shí)析出，影響產(chǎn)品的色澤和質(zhì)量；若pH控制得較低一些，對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量雖有好處，但沉淀結(jié)晶不夠完全，收率會(huì)低些，影響產(chǎn)量。因此，在選擇沉淀結(jié)晶pH 時(shí)，就必須同時(shí)考慮到產(chǎn)量、質(zhì)量的效果。在正常情況下，工藝上控制pH4.8左右。若沉淀結(jié)晶質(zhì)量較差，pH可控制得稍低些，有利于結(jié)晶質(zhì)量的改善，但不能低于4.5，否則收率低，影響產(chǎn)量。

四環(huán)素的提取和精制分酸化、純化、過(guò)濾、結(jié)晶和淋洗五個(gè)步驟。

(1)酸化加入草酸，使積聚在菌絲體內(nèi)的四環(huán)素盡可能多地成為可溶性鹽，而轉(zhuǎn)入液相。四環(huán)素在酸性條件下較隱定，且草酸與鈣離子反應(yīng)生成不溶性的草酸鈣，析出的草酸鈣能促進(jìn)蛋白質(zhì)的凝固，提高濾液的純度和過(guò)濾速度。

(2）純化 純化劑（黃血鹽、硫酸鋅和硼砂）與草酸一起混合作用，可以除去發(fā)酵液中大量酸溶性蛋白質(zhì)、鐵離子和其他多種離子色素以及其他雜質(zhì)，從而使濾液純凈，并減少發(fā)酵液的粘度，利于過(guò)濾。其中純化劑黃血鹽能與發(fā)酵液中的鐵離子作用，生成普魯士鹽而除去鐵離子。

(3）過(guò)濾 通過(guò)過(guò)濾，使四環(huán)素溶液與菌絲體以及其他雜質(zhì)分離，再經(jīng)過(guò)復(fù)濾、精濾，進(jìn)一步提高濾液質(zhì)址，得到澄清的濾液。

(4)結(jié)晶

將濾液的pH調(diào)節(jié)到等電點(diǎn)，在較低溫度下析出純凈的四環(huán)素。

(5）淋洗 雖然發(fā)酵液經(jīng)酸化后大部分四環(huán)素已溶入溶液中，但仍有部分殘存在菌渣中，且過(guò)濾不可能十分徹底。所以用酸水淋洗，以提高收率。

三、實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 1．試劑

300 g/L草酸溶液、200 g/L 黃血酸鉀溶液、200 g/L 硫酸鋅溶液、200 g/L 硼砂溶液、濃氮水、3 g/L草酸溶液。2．儀器

1000 mL 燒杯、攪拌器、布氏漏斗、抽濾瓶、濾紙、量筒、pH 試紙、酸度計(jì)、溫度計(jì)、水泵、表面皿。

四、實(shí)驗(yàn)步驟 1．酸化

取600ml 四環(huán)素發(fā)酵液，置裝有機(jī)械攪拌的1000 mL燒杯中，開(kāi)始攪拌，待發(fā)酵液溫度降至20 ℃ 以下時(shí)，緩緩加入草酸溶液，草酸加入量為27～35g/L，并不時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的pH。當(dāng)發(fā)酵液pH為1.7~1.8 時(shí)（用酸度計(jì)測(cè)定），酸化完畢。2．純化

在酸化反應(yīng)的燒壞中，按酸化的發(fā)酵液凈體積，攪拌下依次緩慢加入純化劑（黃血酸鉀溶液、硫酸鋅溶液、硼砂溶液），每種溶液終濃度均為2 g/L，加入時(shí)間間隔15min，以便作用完全。3．過(guò)濾

將布氏漏斗裝于抽濾瓶上，鋪好濾紙，開(kāi)啟水泵，用少量水將濾紙濕潤(rùn)，并使濾紙緊貼布氏漏斗。將純化后的溶液緩緩倒入布氏漏斗，過(guò)濾濾液應(yīng)完全澄清，否則必須重新過(guò)濾，直到完全澄清。4.結(jié)晶

將抽濾瓶中的濾液倒入裝有機(jī)械攪拌的1000 mL燒杯中，開(kāi)動(dòng)攪拌，并用水或冰水冷卻。待濾液溫度冷至5 ～ 7 ℃ 時(shí)，徐徐加入經(jīng)過(guò)濾的濃氨水，并隨時(shí)用pH 試紙測(cè)定溶液的pH，當(dāng)pH 達(dá)到4.6 ～4.8 時(shí)（用酸度計(jì)測(cè)定），停止加入氨水，并繼續(xù)攪拌2 h，使結(jié)晶完全。

裝好布氏漏斗后，將上述液緩緩倒人布氏漏斗，過(guò)濾。結(jié)晶液全部倒入后，抽干。用35～45 ℃ 的熱水充分洗滌粗堿3 次，抽干，再用0.3 ％草酸洗滌，抽干。

五、注意事項(xiàng)

1．純化攪拌時(shí)間不應(yīng)少于2h，溶液溫度保持在15 ℃ 以下。2．pH 要調(diào)準(zhǔn)確。

六、結(jié)果與討論 ．計(jì)算四環(huán)素的得率。．討論影響四環(huán)素得率和純度的因素。

實(shí)驗(yàn)三 四環(huán)素、金霉素的薄層層析鑒定（驗(yàn)證型）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

掌握薄層層析的原理，四環(huán)素族抗生素的定性鑒定方法。實(shí)驗(yàn)原理：

層析（色譜，chromatograpby）是相當(dāng)重要、且相當(dāng)常見(jiàn)的一種技術(shù)，在把微細(xì)分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動(dòng)相的系統(tǒng)中（根據(jù)移動(dòng)相種類的不同，分為液相層析和氣相層析二種），使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動(dòng)，利用各成分對(duì)固定相親和力不同所引起的移動(dòng)速度差，將它們彼此分離開(kāi)的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。用作固定相的有硅膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無(wú)活性的載體上附著適當(dāng)?shù)囊后w。將作為固定相的微細(xì)粉末狀物質(zhì)裝入細(xì)長(zhǎng)形圓筒中進(jìn)行的層析稱為柱層析（column chromatography），在玻璃板上涂上一層薄而均的支持物（硅膠、纖維素和淀粉等）作為固定相的稱為薄層層析（thin layer chromatography），或者用濾紙作為固定相的紙上層析。層析根據(jù)固定相與溶質(zhì)（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型層析等類型。但這并不是很嚴(yán)格的，有時(shí)常見(jiàn)到其中間類型。此外，近來(lái) 5 也應(yīng)用親和層析，即將與基質(zhì)類似的化合物（通常為共價(jià)鍵）結(jié)合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對(duì)應(yīng)的特定的酶或蛋白質(zhì)。

分配層析在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相和有機(jī)溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等親水物質(zhì)，這些物質(zhì)能儲(chǔ)留相當(dāng)量的水。被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解，但分配系數(shù)不同，展層時(shí)就會(huì)形成以不同速度向前移動(dòng)的區(qū)帶。一種溶質(zhì)在兩種互不混溶的溶劑系統(tǒng)中分配時(shí)，在一定溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相溶劑中的濃度之比為一常數(shù)，稱為分配系數(shù)。當(dāng)欲被分離的各種物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同時(shí)，它們就能被分離開(kāi)。分配系數(shù)大的移動(dòng)快（阻力小）。

薄層層析是以薄層材料為支持物，在密閉容器中，樣品在其上展開(kāi)。當(dāng)斑點(diǎn)不易為肉眼觀察時(shí)，可利用適當(dāng)?shù)娘@色劑，或通過(guò)紫外燈下產(chǎn)生熒光的方法進(jìn)行觀察。通過(guò)這種展開(kāi)操作，各成分呈斑點(diǎn)狀移動(dòng)到各自的位置上，再根據(jù)Rf值的測(cè)定進(jìn)行鑒定。薄層色譜法具有分離與鑒定的雙重功能，通過(guò)薄層圖譜與對(duì)照品的圖譜相比較，除了能鑒出有效成分或特征成分外，還以完整的色譜圖作為一個(gè)整體對(duì)制劑加以鑒別。薄層色譜分析法由于簡(jiǎn)便、快速，能有效地、直觀地反映藥品地真實(shí)性、穩(wěn)定性，現(xiàn)已成為藥物制劑的鑒別和質(zhì)量控制的行之有效的方法之一。薄層層析是鑒別抗生素的方法之一，層析后進(jìn)行顯色，并繪制層析圖譜，根據(jù)層析圖譜對(duì)抗生素進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)以四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對(duì)照對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鑒定。

儀器和設(shè)備：

1.玻璃層析缸

2.層析板（薄層層析硅膠煙臺(tái)芝罘區(qū)黃務(wù)硅膠開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)廠有售）3.毛細(xì)玻璃管或微量注射器 4.紫外投射儀 試劑：

四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品 用0.01M鹽酸溶解定容，4℃冰箱保存（可使用7天）。展開(kāi)劑：正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)2L。凡士林 實(shí)驗(yàn)步驟：

1．層析板處理

層析板105℃烘烤過(guò)夜，均勻噴上0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PH4.5)，于空氣中晾干、備用。

2．點(diǎn)樣

選取兩種定向發(fā)酵液加草酸酸化至pH為1.5～2.0，取上清約l.2 ml于1.5ml離心管中，10000 rpm，5min，備用。在距層析板底邊2.5~3 cm起始線上(用鉛筆劃線，做出點(diǎn)樣點(diǎn)記號(hào))，用毛細(xì)玻璃管在薄層層析板上點(diǎn)四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液3次，發(fā)酵液上清點(diǎn)8～10次，點(diǎn)樣點(diǎn)不大于0.4cm，每次都要吹干后再點(diǎn)。（一般效價(jià)在1000u／ml以上點(diǎn)3次，500～1000u／ml點(diǎn)4次，200～500u／ml點(diǎn)5次）。剩余的發(fā)酵液上清于4℃冰箱保存。

3.層析（展開(kāi)）

用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展開(kāi)劑。層析前需預(yù)先用展開(kāi)劑預(yù)平衡層析缸，可在缸中倒入2cm高的展開(kāi)劑，密閉，一般保持15－30分鐘。然后將層析板置于盛有展開(kāi)劑的層析缸中，在室溫下展層6～8h（與溫度有關(guān)）。封口不嚴(yán)可涂抹凡士林。

4．熒光顯影

待溶劑前沿展至板的一半以上時(shí)將層析板取出，標(biāo)出溶劑前沿，于通風(fēng)櫥中晾干，用氨水熏數(shù)秒鐘后即可在紫外燈下顯影，畫出黃色斑點(diǎn)，分別算出Rf值。（四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品慢和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品快）

無(wú)水四環(huán)素在波長(zhǎng)365nm下顯黃色熒光，根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照可定性測(cè)定。注意事項(xiàng)：

因四環(huán)素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發(fā)酵液中的四環(huán)素濃度不高，預(yù)處理時(shí)通常用草酸將發(fā)酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四環(huán)素盡量溶解。

點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。要控制好點(diǎn)樣量，樣品太少，斑點(diǎn)不清楚，難以觀察，但樣品量太多時(shí)往往出現(xiàn)斑點(diǎn)太大或拖尾現(xiàn)象。

若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點(diǎn)樣，以防樣點(diǎn)過(guò)大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而影響分離效果。

作展開(kāi)劑中極少量強(qiáng)極性溶劑(0.5％)或pH值的改變可顯著改善拖尾現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)四 四環(huán)素的效價(jià)測(cè)定（綜合型）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、了解抗生素效價(jià)的表示方法

2、學(xué)習(xí)抗生素的測(cè)定方法 實(shí)驗(yàn)原理：

實(shí)驗(yàn)利用比色法測(cè)定四環(huán)素和金霉素的效價(jià)。效價(jià)(titer或titre)是評(píng)價(jià)抗生素效能的標(biāo)準(zhǔn)，它代表抗生素對(duì)微生物的抗菌效力，也是衡量發(fā)酵液中抗生素含量的尺度，人們以1μg金霉素或四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品為1個(gè)單位，0.6μg青霉素G鈉鹽為1個(gè)單位。

四環(huán)素和金霉素在酸性條件下，加熱，可產(chǎn)生黃色的脫水金霉素和脫水四環(huán)素，其色度與含量成正比。

在堿性條件下，四環(huán)素較穩(wěn)定，而金霉素則生成無(wú)色的異金霉素：

根據(jù)上述原理，可以在酸性條件下，利用比色法測(cè)定四環(huán)素、金霉素混合液的總效價(jià)；而四環(huán)素效價(jià)的測(cè)定可在堿性條件下，使金霉素生成無(wú)色的異金霉素，然后再在酸性條件下，使四環(huán)素生成黃色的脫水四環(huán)素，經(jīng)比色測(cè)得四環(huán)素效價(jià)?？傂r(jià)與四環(huán)素效價(jià)二者之差即為金霉素的效價(jià)。本實(shí)驗(yàn)只測(cè)定四環(huán)素的效價(jià)。

因四環(huán)素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發(fā)酵液中的四環(huán)素濃度不高，預(yù)處理時(shí)通常用草酸將發(fā)酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四環(huán)素盡量溶解。發(fā)酵液中，由于雜質(zhì)的干擾，將影響比色的正確性，因此加入乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)作為螯合劑，掩飾金屬離子的干擾，改變四環(huán)素脫水條件(降低酸度或延長(zhǎng)加熱時(shí)間)，可以減少雜質(zhì)對(duì)比色反應(yīng)的干擾。實(shí)驗(yàn)步驟：

取上述保存的處理發(fā)酵液上清l ml(效價(jià)約為1000U／m1)于50ml容量瓶中，加入lml濃度為lg／l00ml EDTA溶液，加蒸餾水9ml，再加入lml濃度為3mol／L的NaOH，在20~25℃下保溫15min后，加入2.5ml濃度為6mol／L的HCl，煮沸15min后，冷卻，稀釋至刻度，在分光光度計(jì)上于440nm處測(cè)定其吸光度值。（紫外為100-390nm；可見(jiàn)光為380-780nm，根據(jù)波長(zhǎng)選擇石英比色池或玻璃比色池，否則玻璃對(duì)于紫外光有吸收）

對(duì)照樣品（不加誘導(dǎo)劑）的前處理方法與上述步驟一樣，只是在加入HCl后，不加熱，稀釋至刻度，作為測(cè)定樣品的空白對(duì)照, 調(diào)零。

四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品（1000U/ml）取1ml于50ml容量瓶中，加1ml濃度為6mol／L的HCl，水浴煮沸15min后，冷卻，稀釋至50ml，380nm測(cè)吸光度。（以蒸餾水作為空白測(cè)定）

以定向發(fā)酵培養(yǎng)基中的對(duì)照組作為空白對(duì)照，測(cè)定其它三個(gè)處理組的吸光度。（有時(shí)可能因?qū)φ战M處理不當(dāng)而使其它組的讀數(shù)為負(fù)值，這時(shí)可以以蒸餾水作為空白。）

計(jì)算公式：

發(fā)酵液中四環(huán)素的效價(jià)=

A發(fā)酵 A四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)

×四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)

第三篇：《生物制藥技術(shù)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)-實(shí)驗(yàn)三、四

《生物制藥技術(shù)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

實(shí)驗(yàn)三 四環(huán)素、金霉素的薄層層析鑒定（驗(yàn)證型）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

掌握薄層層析的原理，四環(huán)素族抗生素的定性鑒定方法。實(shí)驗(yàn)原理：

層析（色譜，chromatograpby）是相當(dāng)重要、且相當(dāng)常見(jiàn)的一種技術(shù)，在把微細(xì)分散的固體或是附著于固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動(dòng)相的系統(tǒng)中（根據(jù)移動(dòng)相種類的不同，分為液相層析和氣相層析二種），使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態(tài)邊移動(dòng)，利用各成分對(duì)固定相親和力不同所引起的移動(dòng)速度差，將它們彼此分離開(kāi)的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。用作固定相的有硅膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹(shù)脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無(wú)活性的載體上附著適當(dāng)?shù)囊后w。將作為固定相的微細(xì)粉末狀物質(zhì)裝入細(xì)長(zhǎng)形圓筒中進(jìn)行的層析稱為柱層析（column chromatography），在玻璃板上涂上一層薄而均的支持物（硅膠、纖維素和淀粉等）作為固定相的稱為薄層層析（thin layer chromatography），或者用濾紙作為固定相的紙上層析。層析根據(jù)固定相與溶質(zhì)（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型層析等類型。但這并不是很嚴(yán)格的，有時(shí)常見(jiàn)到其中間類型。此外，近來(lái)也應(yīng)用親和層析，即將與基質(zhì)類似的化合物（通常為共價(jià)鍵）結(jié)合到固定相上，再利用其特異的親和性沉淀與其對(duì)應(yīng)的特定的酶或蛋白質(zhì)。

分配層析在支持物上形成部分互溶的兩相系統(tǒng)。一般是水相和有機(jī)溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和淀粉等親水物質(zhì)，這些物質(zhì)能儲(chǔ)留相當(dāng)量的水。被分離物質(zhì)在兩相中都能溶解，但分配系數(shù)不同，展層時(shí)就會(huì)形成以不同速度向前移動(dòng)的區(qū)帶。一種溶質(zhì)在兩種互不混溶的溶劑系統(tǒng)中分配時(shí)，在一定溫度下達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相溶劑中的濃度之比為一常數(shù)，稱為分配系數(shù)。當(dāng)欲被分離的各種物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同時(shí)，它們就能被分離開(kāi)。分配系數(shù)大的移動(dòng)快（阻力?。?。

薄層層析是以薄層材料為支持物，在密閉容器中，樣品在其上展開(kāi)。當(dāng)斑點(diǎn)不易為肉眼觀察時(shí)，可利用適當(dāng)?shù)娘@色劑，或通過(guò)紫外燈下產(chǎn)生熒光的方法進(jìn)行觀察。通過(guò)這種展開(kāi)操作，各成分呈斑點(diǎn)狀移動(dòng)到各自的位置上，再根據(jù)Rf值的測(cè)定進(jìn)行鑒定。薄層色譜法具有分離與鑒定的雙重功能，通過(guò)薄層圖譜與對(duì)照品的圖譜相比較，除了能鑒出有效成分或特征成分外，還以完整的色譜圖作為一個(gè)整體對(duì)制劑加以鑒別。薄層色譜分析法由于簡(jiǎn)便、快速，能有效地、直觀地反映藥品地真實(shí)性、穩(wěn)定性，現(xiàn)已成為藥物制劑的鑒別和質(zhì)量控制的行之有效的方法之一。薄層層析是鑒別抗生素的方法之一，層析后進(jìn)行顯色，并繪制層析圖譜，根據(jù)層析圖譜對(duì)抗生素進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)以四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對(duì)照對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鑒定。

材料、試劑和器材： 儀器和設(shè)備：

玻璃層析缸；層析板（薄層層析硅膠煙臺(tái)芝罘區(qū)黃務(wù)硅膠開(kāi)發(fā)實(shí)驗(yàn)廠有售）；吹風(fēng)機(jī)；紫外投射儀；離心機(jī)（1.5ml轉(zhuǎn)子）試劑：

四環(huán)素、金霉素標(biāo)準(zhǔn)品（1000U/ml）用0.1 M鹽酸溶解并稀釋定容，4℃冰箱保存（可使用7天）。

展開(kāi)劑：正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)2L。草酸、氨水 其它物品：

1.5ml離心管、小燒杯、玻璃棒、毛細(xì)玻璃管或微量注射器、pH試紙（pH覆蓋1.0～2.0）（或酸度計(jì)）、飯盒（或大培養(yǎng)皿）、凡士林 實(shí)驗(yàn)步驟：

1．層析板處理

層析板105℃烘烤過(guò)夜，均勻噴上0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PH4.5)，于空氣中晾干、備用。

2．點(diǎn)樣

選取兩種定向發(fā)酵液加草酸酸化至pH為1.5～2.0，取上清約l.2 ml于1.5ml離心管中，10000 rpm，5min，備用。在距層析板底邊2.5~3 cm起始線上(用鉛筆劃線，做出點(diǎn)樣點(diǎn)記號(hào))，用毛細(xì)玻璃管在薄層層析板上點(diǎn)四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液3次，發(fā)酵液上清點(diǎn)8～10次，點(diǎn)樣點(diǎn)不大于0.4cm，每次都要吹干后再點(diǎn)。（一般效價(jià)在1000u／ml以上點(diǎn)3次，500～1000u／ml點(diǎn)4次，200～500u／ml點(diǎn)5次）。剩余的發(fā)酵液上清于4℃冰箱保存。

3.層析（展開(kāi)）

用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展開(kāi)劑。層析前需預(yù)先用展開(kāi)劑預(yù)平衡層析缸，可在缸中倒入2cm高的展開(kāi)劑，密閉，一般保持15－30分鐘。然后將層析板置于盛有展開(kāi)劑的層析缸中，在室溫下展層6～8h（與溫度有關(guān)）。封口不嚴(yán)可涂抹凡士林。

4．熒光顯影

待溶劑前沿展至板的一半以上時(shí)將層析板取出，標(biāo)出溶劑前沿，于通風(fēng)櫥中晾干，用氨水熏數(shù)秒鐘后即可在紫外燈下顯影，畫出黃色斑點(diǎn)，分別算出Rf值。（四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品慢和金霉素標(biāo)準(zhǔn)品快）

無(wú)水四環(huán)素在波長(zhǎng)365nm下顯黃色熒光，根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照可定性測(cè)定。注意事項(xiàng)：

因四環(huán)素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發(fā)酵液中的四環(huán)素濃度不高，預(yù)處理時(shí)通常用草酸將發(fā)酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四環(huán)素盡量溶解。

點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。要控制好點(diǎn)樣量，樣品太少，斑點(diǎn)不清楚，難以觀察，但樣品量太多時(shí)往往出現(xiàn)斑點(diǎn)太大或拖尾現(xiàn)象。

若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點(diǎn)樣，但應(yīng)待前次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點(diǎn)樣，以防樣點(diǎn)過(guò)大，造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象，而影響分離效果。

作展開(kāi)劑中極少量強(qiáng)極性溶劑(0.5％)或pH值的改變可顯著改善拖尾現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)四 四環(huán)素的效價(jià)測(cè)定（綜合型）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、了解抗生素效價(jià)的表示方法

2、學(xué)習(xí)抗生素的測(cè)定方法 實(shí)驗(yàn)原理：

實(shí)驗(yàn)利用比色法測(cè)定四環(huán)素和金霉素的效價(jià)。效價(jià)(titer或titre)是評(píng)價(jià)抗生素效能的標(biāo)準(zhǔn)，它代表抗生素對(duì)微生物的抗菌效力，也是衡量發(fā)酵液中抗生素含量的尺度，人們以1μg金霉素或四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品為1個(gè)單位，0.6μg青霉素G鈉鹽為1個(gè)單位。

四環(huán)素和金霉素在酸性條件下，加熱，可產(chǎn)生黃色的脫水金霉素和脫水四環(huán)素，其色度與含量成正比。

在堿性條件下，四環(huán)素較穩(wěn)定，而金霉素則生成無(wú)色的異金霉素：

根據(jù)上述原理，可以在酸性條件下，利用比色法測(cè)定四環(huán)素、金霉素混合液的總效價(jià)；而四環(huán)素效價(jià)的測(cè)定可在堿性條件下，使金霉素生成無(wú)色的異金霉素，然后再在酸性條件下，使四環(huán)素生成黃色的脫水四環(huán)素，經(jīng)比色測(cè)得四環(huán)素效價(jià)?？傂r(jià)與四環(huán)素效價(jià)二者之差即為金霉素的效價(jià)。本實(shí)驗(yàn)只測(cè)定四環(huán)素的效價(jià)。

因四環(huán)素能和鈣鹽形成不溶性化合物，故發(fā)酵液中的四環(huán)素濃度不高，預(yù)處理時(shí)通常用草酸將發(fā)酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四環(huán)素盡量溶解。發(fā)酵液中，由于雜質(zhì)的干擾，將影響比色的正確性，因此加入乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)作為螯合劑，掩飾金屬離子的干擾，改變四環(huán)素脫水條件(降低酸度或延長(zhǎng)加熱時(shí)間)，可以減少雜質(zhì)對(duì)比色反應(yīng)的干擾。材料、試劑和器材： 試劑：

EDTA lg／l00ml、NaOH 3mol／L、HCl 6mol／L、蒸餾水

鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液: 精密稱取鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品0.0410 g 于燒杯中, 用適量蒸餾水(或0.1mol／L的鹽酸溶解)溶解, 轉(zhuǎn)移至200 m l容量瓶中定容配成0.2 m g /m l的溶液。器材：

分光光度計(jì)、玻璃比色池、水浴鍋、電爐、不銹鋼鍋、擦鏡紙、50ml容量瓶（或比色管）、大燒杯、移液槍、1mL槍頭、洗耳球 實(shí)驗(yàn)步驟：

取上述保存的處理發(fā)酵液上清l ml(效價(jià)約為1000U／m1)于50ml容量瓶中，加入lml濃度為lg／l00ml EDTA溶液，加蒸餾水9ml，再加入lml濃度為3mol／L的NaOH，在20~25℃ 3 下保溫15min后，加入2.5ml濃度為6mol／L的HCl，煮沸15min后，冷卻，稀釋至刻度，在分光光度計(jì)上于440nm（或380 nm）處測(cè)定其吸光度值。（紫外為100-390nm；可見(jiàn)光為380-780nm，根據(jù)波長(zhǎng)選擇石英比色池或玻璃比色池，否則玻璃對(duì)于紫外光有吸收）

對(duì)照樣品（不加誘導(dǎo)劑）的前處理方法與上述步驟一樣，只是在加入HCl后，不加熱，稀釋至刻度，作為測(cè)定樣品的空白對(duì)照, 調(diào)零。

取1ml四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品于50ml容量瓶中，加1ml濃度為6mol／L的HCl，水浴煮沸15min后，冷卻，稀釋至50ml，440nm（或380 nm）測(cè)吸光度。（以蒸餾水作為空白測(cè)定）

以定向發(fā)酵培養(yǎng)基中的對(duì)照組作為空白對(duì)照，測(cè)定其它三個(gè)處理組的吸光度。（有時(shí)可能因?qū)φ战M處理不當(dāng)而使其它組的讀數(shù)為負(fù)值，這時(shí)可以以蒸餾水作為空白。）

計(jì)算公式：

發(fā)酵液中四環(huán)素的效價(jià)= A發(fā)酵 A四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)

×四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)

第四篇：實(shí)驗(yàn)一認(rèn)識(shí)現(xiàn)代教育技術(shù)

實(shí)驗(yàn)一認(rèn)識(shí)現(xiàn)代教育技術(shù)

1、以“教育技術(shù)”“學(xué)習(xí)資源”、“現(xiàn)代教育技術(shù)”為關(guān)鍵詞，檢索并閱讀相關(guān)內(nèi)容，進(jìn)一步了解現(xiàn)代教育技術(shù)

2、以“課程整合”、“教育資源庫(kù)”、“ 中小學(xué)教師教育技術(shù)能力建設(shè)”為關(guān)鍵詞，檢索并閱讀相關(guān)內(nèi)容

3、檢索并閱讀《中小學(xué)教師教育技術(shù)能力標(biāo)準(zhǔn)（試行）》，下載。

4、檢索并閱讀《江蘇省縣（市、區(qū)）教育現(xiàn)代化建設(shè)主要指標(biāo)》，了解現(xiàn)代教育技術(shù)在實(shí)現(xiàn)教育信息化、教育現(xiàn)代化中的作用

5、在檢索并閱讀上述材料基礎(chǔ)上，填寫教材單元一的活動(dòng)

一、活動(dòng)

二、活動(dòng)三的“討論與思考”

6、下載教學(xué)媒體的圖片，傳到網(wǎng)絡(luò)存儲(chǔ)上。

第五篇：實(shí)驗(yàn)一

實(shí)驗(yàn)一

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆誛IN7的操作和系統(tǒng)設(shè)置 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

1、在資源管理器中打開(kāi)“本地磁盤（C：）”，設(shè)置所有文件及文件夾的視圖方式為“中等圖標(biāo)”，并“顯示預(yù)覽窗格”。

操作提示：右擊開(kāi)始－打開(kāi)資源管理器－打開(kāi)音樂(lè)庫(kù) 組織—布局—顯示預(yù)覽窗格

2、為“附件”菜單中的“截圖工具”創(chuàng)建桌面快捷方式

操作提示：開(kāi)始－所有程序－附件－截圖工具右擊－發(fā)送到桌面快捷方式；

3、為“開(kāi)始”→“所有程序”→“Microsoft Office”子菜單中的“Microsoft Outlook 2010”創(chuàng)建桌面快捷方式，并鎖定到任務(wù)欄中。/附到“開(kāi)始”菜單中。

4、在控制面板中將桌面背景更改為圖片文件第1單元素材DATA2tupian1-6.jpg。

5、在控制面板中將桌面“計(jì)算機(jī)”的圖標(biāo)更改為“第1單元素材DATA2tubiao1-10.ico”的樣式。

6、在控制面板中設(shè)置桌面上僅顯示“計(jì)算機(jī)”和“回收站”的圖標(biāo)。

7、在控制面板中將系統(tǒng)的“日期和時(shí)間”更改為“2010年10月1日 10:50:30”。在控制面板中將系統(tǒng)當(dāng)前“時(shí)區(qū)”更改為“（UCT+08:00）臺(tái)北”。

8、在語(yǔ)言欄中添加“微軟拼音-簡(jiǎn)捷2010”輸入法。在語(yǔ)言欄中刪除“微軟拼音-新體驗(yàn)2010”輸入法。

在語(yǔ)言欄中設(shè)置計(jì)算機(jī)啟動(dòng)時(shí)默認(rèn)的輸入語(yǔ)言為“微軟拼音－簡(jiǎn)捷2010”輸入法。

9安裝字體第1單元素材DATA2Ziti1-7.ttf。在控制面板中隱藏“微軟雅黑”字體。

在控制面板中預(yù)覽“華文新魏 常規(guī)”字體。在控制面板中刪除“華文細(xì)黑 常規(guī)”字體。

10、在控制面板中向桌面添加小工具“CPU儀表盤”，并設(shè)置其始終“前端顯示”。

在控制面板中向桌面添加小工具“日歷”，并設(shè)置顯示較大尺寸。在控制面板中卸載桌面小工具“時(shí)鐘”。

在控制面板中向桌面上添加“幻燈片放映”小工具，設(shè)置每張圖片顯示的時(shí)間為“10秒”，圖片轉(zhuǎn)換方式為“旋轉(zhuǎn)”。

11、在控制面板中設(shè)置隱藏桌面上所有的圖標(biāo)。

結(jié)論分析：

通過(guò)這次實(shí)驗(yàn)學(xué)會(huì)了WIN7操作系統(tǒng)的基本操作及操作系統(tǒng)的設(shè)置與優(yōu)化