第一篇：實驗2 土壤中稀有放線菌的分離--土壤樣品采集

實驗2 土壤中稀有放線菌的分離--土壤樣品采集 1 目的

1.1 了解微生物分離和純化的原理 1.2 掌握常用的分離純化微生物的方法 2 原理

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。本實驗將采用不同的培養(yǎng)基從土壤中分離不同類型的微生物。3 材料 3.1 培養(yǎng)基

淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏I號培養(yǎng)基)，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基，查氏瓊脂培養(yǎng)基。3.2 儀器或其它用具 取樣鏟、塑料袋、記號筆、1．布點：按照土壤類型和作物種植品種分布，按土壤肥力高、中、低分別采樣。一般150-300畝（不同地區(qū)可根據(jù)情況確定）采取一個耕層混合樣，采樣點以鋸齒型或蛇型分布，要做到盡量均勻和隨機。應(yīng)用土壤底圖確定采樣地塊和采樣點，并在圖上標(biāo)出，確定調(diào)查采樣路線和方案。

2．采樣部位和深度：用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5～25cm處的土樣0.5-1kg，在采樣過程中，采取的混合樣一般都大于該重量，所以要去掉部分樣品，將所有采樣點的樣品攤在塑料布上，除去動植物殘體、石礫等雜質(zhì)，將大塊的樣品整碎，混勻，攤成園形，中間劃十字分成四份，然后對角線去掉兩份，若樣品還多，將樣品再混合均勻，再反復(fù)進行四分法，直至樣品最終重量要求0.5-1公斤（試驗用的樣品2公斤）為止。如下示意圖。一用取土器或鋤頭直接挖入耕層取樣。每個點切取的土塊寬度、厚度應(yīng)基本一致。裝入事先準(zhǔn)備好的塑料袋內(nèi)扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm處取樣。

3．采樣方法、數(shù)量：1)面積小，地勢平坦，肥力均勻的田塊，采用對角采樣法。2)面積中等，地勢平整，有些肥力差異的田塊采用棋盤式采樣法。3)面積大，地勢又不平坦，肥力不勻的田塊采用蛇型線采樣法。土樣由20個樣點組成。樣點分布范圍不少于3畝（各地可根據(jù)情況確定）。每個點的取土深度及重量應(yīng)均勻一致，土樣上層和下層的比例也要相同。采樣器應(yīng)垂直于地面，入土至規(guī)定的深度。采樣使用不銹鋼、木、竹或塑料器具。樣品處理、儲存等過程不要接觸金屬器具和橡膠制品，以防污染。每個混合樣品一般取1kg左右，如果采集樣品太多，可用“四分法”棄去多余土壤。

4．樣品編號和檔案紀(jì)錄：做好采樣記錄：土樣編號、采樣地點及經(jīng)緯度、土壤名稱、采樣深度、采樣日期、采樣人等。

第二篇：實驗二_____土壤中放線菌的分離

實驗講義5 土壤中枯草芽孢桿菌分離方法

取土樣時最好選取如花壇等地方的土樣，去掉表層5~10cm的土壤后取樣。

放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常壓加熱至水沸騰后維持20min，取出，置28-37攝氏度培養(yǎng)24-48h，液面則產(chǎn)生黃白色皮膜。用接種環(huán)取皮膜適量于無菌水中分散，稀釋涂布于蔗糖豆芽汁瓊脂平皿，置28-37攝氏度培養(yǎng)24-48h，挑取典型菌落。

實驗6

土壤中放線菌的分離（實訓(xùn)）

實驗?zāi)康模?掌握配制合成培養(yǎng)基的一般方法。

2掌握稀釋倒平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。3掌握平板劃線法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。4掌握涂布平板法從土壤中分離放線菌的基本原理和基本操作技術(shù)。

實驗材料：

藥品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O、瓊脂。其他：高壓蒸汽滅菌鍋、扭力天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、試管、牛皮紙、硫酸紙、線繩、無菌培養(yǎng)皿、鐵鍬、小鏟、酒精棉球、鑷子、玻璃鉛筆。

實驗原理：

高氏一號合成培養(yǎng)基是培養(yǎng)放線菌的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基是采用化學(xué)成分完全了解的純試劑配制而成的培養(yǎng)基，高氏一號培養(yǎng)基：碳源為可溶性淀粉、氮源為KNO3、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O 作為無機鹽，F(xiàn)eSO4?7H2O作為微生物的微量元素，提供鐵離子等組成。

放線菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，主要分布在土壤中，其數(shù)量僅次于細菌，一般在中性偏堿性、有機質(zhì)豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由于土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來，從而獲得某一菌株的純培養(yǎng)。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據(jù)放線菌的營養(yǎng)、酸堿度等條件要求，常選用合成培養(yǎng)基或有機氮培養(yǎng)基。如果培養(yǎng)基成分改變，或土壤預(yù)先處理（120℃熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數(shù)滴10%酚等），都可以使細菌，霉菌出現(xiàn)的數(shù)量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培養(yǎng)基上形成單獨菌落，并可得到純菌株。

實驗步驟：

1.高氏一號合成培養(yǎng)基的制備

高氏一號瓊脂培養(yǎng)基（培養(yǎng)放線菌用）

可溶性淀粉20g，硝酸鉀1g,氯化鈉0.5g，K2HPO4 ?3H2O 0.5g，MgSO4?7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.01g，瓊脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。

配制時，先用冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入煮沸的水中，在火上加熱，邊攪拌邊加入其他成分，溶化后，補足水分至1000ml。112℃滅菌20分鐘。

2.土壤中放線菌的分離（1）待測樣液的制備

選定取樣點（最好是有機質(zhì)含量高的菜地），按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。盛土的容器應(yīng)是無菌的。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等，土樣取回后應(yīng)盡快投入實驗。

稱土樣1g于盛有99mL無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10～20min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-2濃度的菌懸液，靜置30s。另取裝有9ml無菌水的試管3支，編號10-

3、10-

4、10-5。用無菌吸管無菌操作取10-2濃度的土壤懸液1ml并加入編號10-3的無菌試管中，并吹吸吸管2~3次，使與9ml水混勻，即為10-3濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-5的試管中（每個稀釋度換1支無菌吸管）。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進行。（2）稀釋倒平板法分離土壤中放線菌

-5-4-5-4取2支1毫升移液管分別從10、10菌懸液中吸取1毫升菌懸液，分別注入編號10、10的培養(yǎng)皿內(nèi)。將溫度為45～50℃的高氏一號培養(yǎng)基倒入上述各培養(yǎng)皿內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)使菌懸液充分混合均勻，凝固后，將培養(yǎng)皿倒扣放置在溫暖處（28℃左右），每天觀察培養(yǎng)基表面有無微生物菌落。（3）涂布平板法分離土壤中放線菌

取2套無菌平皿，在皿底貼上標(biāo)簽，注明土壤稀釋液的稀釋度（10-

4、10-5）、組別、姓名、操作日期等。每個稀釋度做一個培養(yǎng)皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一號培養(yǎng)基15~20ml左右，待冷凝成平板。

用無菌吸管從濃度最小稀釋液開始，每次吸取0.1ml加到一組相應(yīng)編號（10-5）的高氏一號平板上（每次吸取前，吸管要在液體內(nèi)吹吸幾次），再依次將10-4的土壤稀釋液加到相應(yīng)平板上。用無菌刮棒（從濃度小的稀釋液開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個平板表面涂勻。（4）平板劃線法分離土壤中放線菌

取一培養(yǎng)皿置于實驗臺上，左手將培養(yǎng)皿打開稍許，向培養(yǎng)皿內(nèi)注入熔化的營養(yǎng)固體培養(yǎng)基10～12毫升，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使其中的培養(yǎng)基分布均勻，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蠟筆劃分A、B、C、D幾個區(qū)。每組兩個平板培養(yǎng)基。

將培養(yǎng)皿底部用姆指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許10-2濃度的土壤稀釋液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 6～7條，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。（5）培養(yǎng)

接種完畢，將平皿放入28℃恒溫箱培養(yǎng)7天，觀察平皿上放線菌（主要是鏈霉菌）菌落。（6）挑菌落

待三種方法的平板長出菌落后，鑒定微生物類群，并根據(jù)鏡檢結(jié)果，判斷是否已分離到了純菌種。如果菌種很純，則可轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)基上進一步培養(yǎng)。轉(zhuǎn)種至斜面，菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。

準(zhǔn)備實驗內(nèi)容：

問曾老師借 無菌刮棒 打火機 酒精燈

無菌報紙包（1個）

99mL水/三角瓶（玻璃珠）

5支移液管 3支9mL水的試管

培養(yǎng)皿6套 槍頭（1mL/0.1mL）

高氏一號培養(yǎng)基500mL（150mL三角瓶2個，200mL試管）思考題：

1.檢查接種后培養(yǎng)物的生長情況和染菌情況。

2.觀察與記錄以下內(nèi)容。

大小

形狀

邊緣顏色

表面代謝物

種類 3.如何區(qū)分放線菌和真菌、細菌？

放線菌菌落小而緊密、干燥、不透明、難以挑取，當(dāng)大量孢子覆蓋于菌落表面時，就形成表面為粉末狀或顆粒狀的典型放線菌菌落，由于基內(nèi)菌絲和孢子常有顏色，使得菌落的正反面呈現(xiàn)出不同的色澤。霉菌菌落的話應(yīng)該是比較大的，可能是大而疏松也可能大而緊密，其他一些跟放線菌都差不多，比如都是顏色多種多樣，與培養(yǎng)基緊密結(jié)合難于挑取。但在氣味上有很大差別，放線菌具有泥腥味，而霉菌具有霉味。還有一點就是放線菌菌落周圍瓊脂平面會有變形的現(xiàn)象。若稀釋平板的稀釋度不夠，放線菌會被抑制了或者菌落太小，而其他細菌的菌落又太多，不容易找到。

第三篇：土壤中放線菌的采集、分離、培養(yǎng)、發(fā)酵及提取實驗報告

土壤中放線菌的采集、分離、培養(yǎng)、發(fā)酵及提取

實驗?zāi)康模?/p>

1、從土壤中分離產(chǎn)抗生素的放線菌

2、放線菌的培養(yǎng)

3、放線菌的發(fā)酵產(chǎn)生活性物質(zhì)

4、放線菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)提取。實驗原理：

放線菌是一類呈菌絲狀生長，主要以孢子繁殖。放線菌與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切，目前廣泛應(yīng)用的抗生素約80%是各種放線菌所產(chǎn)生的。

許多臨床應(yīng)用的抗生素均由土壤中分離的放線菌產(chǎn)生。采用選擇培養(yǎng)基可分離土壤中的放線菌。產(chǎn)抗生素的放線菌經(jīng)液體培養(yǎng)后，其分泌的抗生素存在于離心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌試驗進行檢測，從而篩選到所需的抗生素產(chǎn)生菌，并對其進一步培養(yǎng)，繁殖，發(fā)酵，最終提取我們所需的抗生素。實驗器材：

1、土壤

2、培養(yǎng)基：高氏一號培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基

3、其他：重鉻酸鉀、培養(yǎng)皿、牛津杯、接種環(huán)、酒精燈，無菌涂棒、三角錐瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、試管、牛皮紙、線繩等。實驗步驟：

一、土壤放線菌株的采集

采集樣品：選定取樣點（最好是有機質(zhì)含量高的菜地），按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等。

樣品（土壤）處理：室溫風(fēng)干

二、土壤中放線菌的分離、培養(yǎng)

1、配制淀粉培養(yǎng)基

淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏培養(yǎng)基）

可溶性淀粉2g；硝酸鉀0.1g；磷酸氫二鉀0.05g；氯化鈉0.05g；硫酸鎂0.05g；硫酸亞鐵0.001g；瓊脂2g；水100ml.先把淀粉放在燒杯里，用5ml水調(diào)成糊狀后，倒入95ml水，攪勻后加入其他藥品，使它溶解。加熱到煮沸時加入瓊脂，不停攪拌，待瓊脂完全溶解后，補足失水。調(diào)整PH到7.2-7.4，分裝后滅菌，備用。

2、土壤懸液梯度稀釋

① 將5.0g土壤加入到50ml滅菌的生理鹽水中，震蕩10min制備土壤懸液。

② 用無菌吸管吸取1ml土壤懸液，加入到9ml滅菌的生理鹽水中10倍稀釋。

③ 按1：:1稀釋至10-

3、10-

4、10-5，將3塊滅菌平板分別標(biāo)記10-

3、10-

4、10-5，稀釋過程應(yīng)在無菌條件下進行。

3、將高氏一號培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55-60℃時，加入3%的重鉻酸鉀數(shù)滴（大約100ml加0.3ml），混合均勻。分別吸取0.1ml稀釋液于滅菌平皿中，再加入10-15ml恒溫于55℃的含有重鉻酸鉀的淀粉瓊脂培養(yǎng)基中，輕輕旋轉(zhuǎn)混合均勻。

4、平皿倒置于培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)一周左右。

5、將平皿上的放線菌菌落跳去在淀粉瓊脂平皿上四區(qū)劃線進行分離純化，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右，觀察放線菌菌落特征。

6、將純化好的菌落轉(zhuǎn)入到斜面，4℃條件下進行保存。

三、抗菌譜的測定

1、挑取一個放線菌的菌落接種到含有250ml淀粉液體培養(yǎng)基的三角瓶，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右。

2、將2ml培養(yǎng)8h的大腸桿菌分別加到200ml滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中混合均勻，每培養(yǎng)皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培養(yǎng)皿中均勻放入4個牛津杯，每個牛津杯中加入1ml放線菌發(fā)酵培養(yǎng)液。培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)12h。

4、測量抑菌圈的大小。

四、發(fā)酵

1、配制種子培養(yǎng)基

蔗糖22.5g，黃豆粉12.5g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000ml，PH值7.2,121℃滅菌20min。

2、配制發(fā)酵培養(yǎng)基

蔗糖45g，黃豆粉25g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣3g，蒸餾水1000ml，PH7.2。121℃滅菌20min。

3、種子液的制備

將試管斜面菌種轉(zhuǎn)管活化，28℃培養(yǎng)7天后，以接種取一環(huán)孢子轉(zhuǎn)入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-1 培養(yǎng)4天。

4、發(fā)酵培養(yǎng)

以6%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接入裝有50ml初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-

1培養(yǎng)4天。

5、活性檢測

發(fā)酵液經(jīng)4000r/ min-1 離心15min，取上清，杯碟法測定抗菌活性（同三）。

五、提取

1、發(fā)酵液經(jīng)4000r/ min-1 離心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例進行萃取。

2、活性檢測

將萃取液濃縮，杯碟法測定抗菌活性（同三）。

第四篇：土壤中放線菌的分離和純化實驗

土壤中放線菌的分離和純化實驗

一、實驗?zāi)康?/p>

1、制作MS培養(yǎng)基的方法，掌握母液的保存方法。

2、掌握培養(yǎng)基的滅菌方法。

掌握外植體的消毒和超凈工作臺的使用。

4、掌握放線菌的分離純化及染色的基本流程；

5、掌握高氏一號培養(yǎng)基的配制方法；

6、復(fù)習(xí)分離純化放線菌的基本操作技術(shù)、培養(yǎng)方學(xué)會使用高壓蒸汽滅菌鍋。

7、培養(yǎng)微生物實驗的設(shè)計思路和動手能力。

二、實驗材料

高壓蒸汽鍋、培養(yǎng)瓶、石斛的愈傷組織、超凈工作臺，酒精燈、酒精棉球、鑷子、電子天平、稱量紙、燒杯、量筒、顯微鏡、三角錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、分析天平；接種環(huán)、載玻片、蓋玻片、玻璃珠、移液槍、剪刀

三、實驗原理

植物組織培養(yǎng)即植物無菌培養(yǎng)技術(shù)，又稱離體培養(yǎng)，是根據(jù)植物細胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官(如根、莖、葉、莖尖、花、果實等）、組織（如形成層、表皮、皮層、髓部細胞、胚乳等）

第 1 頁 或細胞（如大孢子、小孢子、體細胞等）以及原生質(zhì)體,在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及溫度等人工條件下，能誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的學(xué)科。

四、實驗步驟

1、配制MS培養(yǎng)基8L，稱取馬鈴薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、瓊脂80g、配制 母液。

2、配制培養(yǎng)液時應(yīng)注意：

①在使用提前配制的母液時，應(yīng)在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應(yīng)立即淘汰這種母液，重新進行配制；為防止母液被微生物污染，有機母液放在冰箱里4℃保存；

②用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次；

③量取母液時，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳希咳?種，劃掉1種，以免出錯。溶化瓊脂 用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750 mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然后再將配好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中，最后加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻。

需要注意的是，在加熱瓊脂，制備培養(yǎng)基的過程中，操作者千萬不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，第 2 頁 否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。調(diào)pH 用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用pH試紙測培養(yǎng)基的pH，一直調(diào)到培養(yǎng)基的pH為6（5.8~6.5）左右為止。培養(yǎng)基的分裝 溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。分裝時，先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入錐形瓶（50 mL或100 mL）中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培養(yǎng)基，可分裝25～30瓶。培養(yǎng)基分裝完畢后，應(yīng)及時封蓋瓶口。用2塊硫酸紙（每塊大小約為9 cm×9 cm）中間夾1層薄牛皮紙封蓋瓶口，并用線繩捆扎。最后在錐形瓶外壁貼上標(biāo)簽。

3、高壓滅菌 培養(yǎng)基的高壓滅菌包括以下幾個步驟。

第一，碼放錐形瓶。將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶直立于金屬小筐中，再放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)。如果沒有金屬小筐，可以在兩層錐形瓶之間放一塊玻璃板隔開。

第二，放置其他需要滅菌的物品。將其他需要滅菌的物品也放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)，如裝有蒸餾水的錐形瓶、帶螺口蓋的玻璃瓶、燒杯、廣口瓶（以上物品都要用牛皮紙封口），用報紙包裹的培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、濾紙、鉛筆等。

第三，滅菌。待需要滅菌的物品碼放完畢，蓋上鍋蓋。在98 kPa、121 ℃下，滅菌20 min。滅菌后取出錐形瓶，讓其中的培養(yǎng)基自然冷卻凝固后再使用。

第 3 頁 4,、再在操凈工上進行消毒，先用紫外線照射30MIN，然后送風(fēng)，關(guān)閉紫外燈，改 用日光燈，對手用酒精進行消毒，對培養(yǎng)基表面也要用酒精進行消毒。準(zhǔn)備工作好了，就進行接種。并且要在酒精燈旁邊進行操作，避免污染。鑷子要在雙孔滅菌器上進行滅菌。

4、接種完成后要整理工作臺，并且把培養(yǎng)瓶拿到培養(yǎng)架上進行日光培養(yǎng)。

五、放線菌的提取步驟

5、（1）稱取土樣2.00g，在火焰旁加到一個盛有48ml無菌水并裝有玻璃珠的100ml錐形瓶中。振蕩20-30min，使樣品的菌體、芽孢或孢子均勻分散。靜止20-30s，標(biāo)記為編號1。

6、（2）按照一定的梯度進行稀釋（該實驗采用10倍梯度）

①取3個各裝有9.5ml無菌水的25ml錐形瓶，分別按照順序標(biāo)記好2、3、4.②在超凈工作臺上，用微量移液器從1號錐形瓶中移取0.5ml土壤懸液加到2號錐形瓶中，搖勻后，再用微量移液器從2號錐形瓶中移取0.5ml土壤懸液加到3號錐形瓶中，依此類推，7、分別將土壤懸液制成10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-

8、10-

9、10-10的土壤稀釋液。

六、稀釋涂布法分離土壤中放線菌

8、（1）倒平板

9、將配制好并且滅菌的高氏一號培養(yǎng)基加熱融化，待冷卻至55—60℃時，往高氏1號培養(yǎng)基中加入1ml的0.5%重鉻酸鉀, 然后分別倒平板。方法是在超凈工作臺，右手持盛培養(yǎng)基的三角燒瓶，置火焰旁

第 4 頁 邊，左手拿平皿并松動瓶塞，用手掌邊緣和小指、無名指夾住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上滅菌，左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)液約15ml，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制備6個平板（一個稀釋度做3個平行樣品）。

10、（3）涂布平板

11、用1ml無菌吸管分別精確地吸取10-

4、10-

5、10-6的稀釋菌液1ml，對號放入編好號的無菌培養(yǎng)皿中，每一濃度對應(yīng)兩個平板。用無菌涂布棒（從濃度小液開始）將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個平板表面涂勻，涂完一個平板用酒精燈滅菌。

12、（4）倒置平板

13、將培養(yǎng)基平板倒置（防皿蓋的冷凝水下滴），置于28度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d14、15、5、放線菌的純化

16、（1）倒平板

同上

17、（2）平板劃線

18、將蘸有菌種的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上做以Z字行劃線，每劃完一次要充分燃燒接種環(huán)燒掉殘余微生物，再從上一次劃線處末點開始下一次劃線。劃線完畢后蓋上培養(yǎng)皿蓋，倒置與恒溫箱中培養(yǎng)。

6、放線菌的觀察玻璃紙法

19、將玻璃紙剪成培養(yǎng)皿大小，用舊報紙隔層疊好后滅菌。

第 5 頁 20、將高氏一號瓊脂培養(yǎng)基熔化后在火焰旁倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿倒15ml左右，待培養(yǎng)基凝固后，在無菌操作下用鑷子將無菌玻璃紙履蓋在瓊脂平板上即制成玻璃紙瓊脂平板培養(yǎng)基。

21、（3）用接種環(huán)挑取純化后的放線菌，在玻璃紙上劃線接種。

22、（4）將接種的玻璃紙瓊脂平板置28—30℃下培養(yǎng)。

23、（5）在培養(yǎng)至3天，5天，7天時，從溫室中取出平皿。在超凈工作臺上，打開培養(yǎng)皿，用無菌鑷子將玻璃紙與培養(yǎng)基分離，用無菌剪刀取小片玻璃紙置于載玻片上用顯微鏡觀察。

7、放線菌保藏

斜面低溫保藏法

長后，棉塞部分用油紙包扎好，移至 2—8 ℃的冰箱中保藏，保存 2—4 個月，移種一次。

將純化培養(yǎng)后的放線菌接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生

第 6 頁

第五篇：土壤肥料教案-實驗一

實驗一 土壤樣品的采集與制備

一、實驗?zāi)康?/p>

土壤樣品的采集與制備是搞好土壤分析工作的一個重要環(huán)節(jié)，它關(guān)系到分析結(jié)果是否具有應(yīng)用價值、是否準(zhǔn)確以及由此得出的結(jié)論是否正確、可靠。

二、采集土壤樣品的要求

1、樣品具有代表性 避免特殊的采樣部位，采樣點分布要均勻、多點和隨機，可采用蛇形采樣法、對角線采樣法和棋盤式采樣法（P111 圖實-1）。

2、采樣深度 根據(jù)化驗?zāi)康臎Q定采樣深度，一般采集耕層0~20CM的土樣。

3、采樣時間 根據(jù)化驗?zāi)康臎Q定采樣時間。如果調(diào)查隨時出現(xiàn)的問題，可隨時采樣；為了制定施肥計劃而測土，必須在收獲后、施基肥前進行采樣。

4、采土工具 可用土鉆或小鏟進行采土，土鉆垂直入土20CM處；用小鏟采土，要先挖成一鏟寬、20CM深的小土坑，然后從垂直面鏟取一鏟寬、1CM厚的土壤即可（P112圖實—2）。

5、樣品數(shù)量 可反復(fù)用四分法去掉過多的土樣，最后減少至0.5~1KG（P112圖—3）。

三、儀器用具

取土鏟、塑料布、土壤袋、土壤篩、圓木滾、廣口瓶、盛土盤、標(biāo)簽、鉛筆。

四、實驗步驟

采樣——物理分析——化學(xué)分析

五、注意事項

1、有些土壤成分需用新鮮土樣，不能風(fēng)干。

2、在過篩時，可借助研缽進行磨細。

3、如果要測定微量元素，在采樣和處理過程中不能接觸金屬器具。

實驗二 土壤質(zhì)地的判別

一、實驗?zāi)康?/p>

通過土壤質(zhì)地可以了解土壤肥力狀況，為提高土壤肥力和因土種植作物提供參考。生產(chǎn)上，土壤質(zhì)地可以通過手測法進行測定。本實驗?zāi)康囊笳莆帐譁y法測定土壤質(zhì)地。

二、實驗原理

土壤中的土粒有砂粒、粉粒和黏粒，土粒的大小、硬度、光澤、黏性等各不相同，根據(jù)手的感覺，可以大體上區(qū)分各級土粒的多少，進而判別出土壤質(zhì)地類型。

三、儀器用具

木板、圓木棍等。

四、實驗步驟

1、干測法

2、濕測法

五、注意事項

1、手測法主要用于田間快速判別土壤質(zhì)地類型。

2、對于大批樣品的測定，至少應(yīng)選取10%的土樣量于室內(nèi)采用比重計法（黏度分布儀法）測定，以校正手測法較大的誤差。

實驗三 土壤含水量的測定

一、實驗?zāi)康?/p>

土壤水分是土壤的重要組成部分，也是土壤的重要肥力因素。測定土壤含水量可作為播種、排灌、耕作、施肥的依據(jù)，對指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重大的意義。本實驗?zāi)康氖且笳莆账譁y定方法。

二、儀器用具與試劑

天平（感量0.01g、0.001g）、烘箱、干燥箱、稱樣皿、鋁盒、小刀、量筒、滴管、無水酒精等。

三、實驗方法

(一)烘干法

1、方法原理

2、操作步驟

⑴取有蓋鋁盒，洗凈、烘干，在天平上稱重（W1）。注意底、蓋編號配套。⑵按要求用土鉆取不同深度的土樣，放入鋁盒，取樣量以約占鋁盒體積的1/3為宜。立即將鋁盒蓋上，帶回實驗室稱重（W2）。

⑶將鋁盒蓋打開后，放入烘箱中，在——溫度下烘6h左右。

⑷關(guān)閉烘箱，蓋上鋁盒，放進干燥器中（干燥器內(nèi)的干燥劑要經(jīng)常更換或處理），待冷卻至室溫后稱重。

⑸打開鋁盒蓋，放入烘箱中再烘2h，冷卻，稱重至恒重（W3）。

3、結(jié)果計算

（二）酒精燃燒測定法

1、方法原理

2、操作步驟

⑴用1/100天平稱鋁盒（帶蓋）質(zhì)量（A）。

⑵用鋁盒稱土樣5g左右，注意取樣均勻，稱重（B）。

⑶用量筒加酒精5ML于鋁盒中，稍加振蕩至均勻濕潤，使土面平整。⑷點燃酒精（注意勿使火柴掉入土樣中），使其自行燃燒，火焰燒盡前不宜翻撥，以免將土壤毛細管堵塞，反而降低蒸發(fā)速度。

⑸火焰熄滅后，再加入酒精2~3Ml繼續(xù)燃燒，通常燃燒2~3次即可，燒至恒重為止。合蓋冷卻稱重（C）。土樣呈單粒松散即已干燥。

3、結(jié)果計算

四、注意事項

1、烘干法測含水量使用感量0.001g的分析天平稱量。烘干溫度不得超過——，溫度過高易造成土壤有機質(zhì)的碳化損失。

2、酒精燃燒法不能測有機質(zhì)含量高的土壤樣品，操作室要防止土樣損失。

實驗四 土壤容重的測定

一、實驗?zāi)康?/p>

土壤容重能表明土壤松緊及孔隙狀況，又可用來計算土壤孔隙度及單位面積一定深度的土壤質(zhì)量，為計算土壤水分、養(yǎng)分、有機質(zhì)等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通過實習(xí)使學(xué)生掌握測定土壤容重和計算孔隙度的基本方法。

二、實驗原理 土壤容重是單位體積原狀土壤（包括孔隙）的干土質(zhì)量。因此，用已知體積的取土器“環(huán)刀”取土，烘干稱重，即可計算出土壤容重。

三、儀器用具

土鏟、小刀、天平（感量0.01g）、鋁盒、酒精或烘箱、環(huán)刀。

四、實驗步驟

1.取環(huán)在天平上稱重。

2.選定待測地塊，將環(huán)刀垂直壓入待測土層中。環(huán)刀進入土層時不要左右搖動，以保持自然狀態(tài)。3.用土鏟挖開環(huán)刀周圍土壤，并取出裝滿土的環(huán)刀，用小刀小心削平環(huán)刀上下端突出的土，使與環(huán)刀口相齊，并擦凈環(huán)刀外面的土，帶回室內(nèi)。

4.把裝滿土的環(huán)刀在室內(nèi)稱總質(zhì)量。減掉環(huán)刀本身質(zhì)量即為濕土質(zhì)量。5.用鋁盒取土5~10g，放入烘箱烘干，或用酒精燃燒法測定含水量。

五、結(jié)果計算

六、注意事項

1.土壤容重測定也可將裝滿土壤的環(huán)刀直接于105℃±2℃的烘箱烘干。2.用小刀削平土面時，應(yīng)防止切割過分或不足。

實驗五 土壤含水量的測定

一、實驗?zāi)康?/p>

通過實驗，熟悉各種地形、地貌特征及其分布規(guī)律；初步掌握土壤剖面設(shè)置、挖掘和觀察記載技術(shù)，并能對土壤生產(chǎn)特性進行初步評價。

二、實驗原理

“地”是地表各種自然因素相互聯(lián)系的一個整體。田間認(rèn)地就是了解當(dāng)?shù)赝寥?、地形、地貌、地下水、地表水、植被和利用狀況等?！巴痢笔寝r(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)。田間識土就是通過對土壤各種性狀、利用狀況、周邊的環(huán)境條件、灌溉設(shè)施及有關(guān)的農(nóng)業(yè)措施等的觀察、記錄和分析，制訂土壤利用、改良和培肥的規(guī)劃及措施。

三、實驗用具與試劑

鐵鍬、土鏟、土盒、鋼卷尺、剖面刀、放大鏡、布口袋（或塑料袋）、標(biāo)簽、鉛筆、土壤剖面記載表、土壤硬度計、土壤標(biāo)準(zhǔn)比色卡、標(biāo)本盒、10%稀鹽酸溶液、水。

四、實驗步驟

(一)田間認(rèn)地

從山頂往下直到河邊，可以觀察到各種各樣的“地”，如山坡地、崗坡地、交接洼地、四平地等。由于成因不同和發(fā)育時間不一，不同地理位置上，地形地貌、成土母質(zhì)、水土流失、植被等情況有很大的差異。

(二)田間識土

1、土壤質(zhì)地的手測法測定

2、記錄土壤利用情況

3、灌溉設(shè)施和條件。

4、周邊環(huán)境條件。

5、土壤剖面的挖掘、觀察、記錄和樣品的采集等及對土壤性狀的綜合評價。(三)土壤剖面的觀察記載

1、剖面點的選擇和挖掘

土壤剖面點的設(shè)置一定要有代表性。剖面要設(shè)置在地形、母質(zhì)、植被等因素一致的地段，一般選在地塊的中央，要避免田邊、地角、路旁、溝渠附近及糞堆上，應(yīng)能夠代表整個地塊的情況。剖面坑的大小，一般為寬0.8~1.0m，長1.5~2m，寬1.0~1.5m。土層厚度不足1m則挖至母質(zhì)層；地下水位高時，挖至地下水面或到達地下水位。

挖掘剖面時應(yīng)注意：①剖面觀察面要垂直向陽；②挖出的表土與底土要分別堆在土坑兩側(cè)，避免回填時打亂土層；③觀察面的上方不得堆土和站人，保持觀察面的自然狀態(tài)；④坑的后方呈階梯形，便于上下工作，并節(jié)省挖土量。

2、剖面的觀察記載

（1）剖面層次的劃分。耕作土壤大體分為耕作層、犁底層、心土層和底土層；水稻土劃分為淹育層、滲育層、潴育層和潛育層。記載每個層次的厚度。

（2）土壤顏色。土壤顏色的命名采用復(fù)名法，有主次之分。描述時主色在后，副色在前，如灰棕色，即棕色為主，灰色為副。還可加上淺灰棕色。

（3）土壤質(zhì)地。在野外鑒定土壤質(zhì)地可用手測法。

（4）土壤結(jié)構(gòu)。在各層分別掘出較大土塊，于1m處落下，然后觀察其結(jié)構(gòu)體的外形、大小、硬度、顏色，并確定其結(jié)構(gòu)名稱。可分為粒狀、團粒狀、核狀、塊狀、柱狀、片狀等。

（5）土壤緊實度。野外鑒定時可根據(jù)土鉆（或竹筷）入土的難易進行大致劃分。不如或稍加壓力土鉆即可入土，為疏；加壓力時土鉆能順利入土，為松；土鉆要用力才能入土，取出稍困難，為緊；需用大力土鉆才能入土，取出很困難，為極緊。

（6）土壤干濕度。土壤干濕度是指土壤剖面中各土層的自然含水狀況。土壤呈干土塊或干土面，手試無涼意，用嘴吹時有塵土揚起，為干；手試有涼意，用嘴吹時無塵土揚起，為潤；手試有明顯潮濕感覺，可握成土團，但落地即散開，放在紙上能使紙變濕，為濕潤；土樣放在手中可使手濕潤，能握成土團，但無水流出，為潮濕；土壤水分過飽和，用手握土塊時有水分流出，為濕。

（7）新生體和侵入體。新生體是土壤形成過程中產(chǎn)生的物質(zhì)，它不但反映出土壤形成過程的特點，而且對土壤的生產(chǎn)性能有很大的影響。土壤新生體常見的有砂姜、假菌絲體、銹紋銹斑、鐵錳結(jié)核等。侵入體是指外界混入土壤中的物體，如石塊、貝殼、磚瓦片、鐵木屑、爐渣等，它反映了人為因素的影響適度。

（8）石灰性反應(yīng)。用10%稀鹽酸直接滴在土壤上，觀察泡沫反應(yīng)的有無、強弱。（9）酸堿度。用混合指示劑比色法測定。

（10）植物根系。土層中根系交織，4條／c㎡以上，為多量；根系適中，2~4條／c㎡，為中量；根系稀疏，只有1~2條／c㎡，為少量；沒有根系，則為無。

五、注意事項

1、在野外工作一定要做好充分的物質(zhì)準(zhǔn)備。

2、挖掘面時盡可能減少對農(nóng)作物的影響。

3、對于生產(chǎn)中的問題，要注重向當(dāng)?shù)氐姆N植戶請教

實驗六 土壤有機質(zhì)含量的測定

一、實驗?zāi)康?/p>

土壤有機質(zhì)是土壤的組分，是植物養(yǎng)分的重要來源，對改善土壤理化、生物性質(zhì)起重要作用。因此測定土壤有機質(zhì)含量是判斷土壤肥力高低、培肥土壤的重要指標(biāo)。

二、實驗原理

在加熱條件下，用過量的重鉻酸鉀—硫酸溶液氧化土壤有機碳，多余的重鉻酸鉀用硫酸亞鐵按標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以樣品和空白消耗重鉻酸鉀的差值計算出有機碳量。

三、實驗用具

油浴鍋（高20~26cm，內(nèi)裝工業(yè)用固體石蠟）、硬質(zhì)試管（18~25cm×200mm）、鐵絲籠（與油浴鍋配套，內(nèi)有若干小格，每格可插入一支試管）、滴定管（10.00mL、25.00 mL）、溫度計（300℃）、電爐1000W）。

四、試劑配置

1、重鉻酸鉀—硫酸溶液

2、重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液3、0.2mol/L硫酸亞鐵按標(biāo)準(zhǔn)溶液

4、鄰菲啰啉

五、實驗步驟

稱取通過0.25mm孔徑篩的風(fēng)干土樣0.05～0.5g（精確到0.00 01g，稱樣量根據(jù)有機質(zhì)含量范圍而定），放入硬質(zhì)試管中，然后從滴定管準(zhǔn)確加入10.00mL0.4mOl／L重鉻酸鉀—硫酸溶液，搖勻并在每個試管口插入一玻璃漏斗。將試管插入鐵絲籠中，再將鐵絲籠深入已在電爐上加熱至185～190℃的油浴鍋內(nèi)，使管中的液面低于油面，要求放入后油浴溫度下降至170～180℃，待試管中的溶液沸騰時開始計時，5min±0.5 min后將鐵絲籠從油浴鍋中提出（如果有試管夾預(yù)先住試管，鐵絲籠沒必要提出），冷卻片刻，擦去試管外的油液。把試管內(nèi)的消煮液及土壤殘渣無損地轉(zhuǎn)入250mL三角瓶中，用蒸餾水沖洗試管及小漏斗，洗液并入三角瓶中，使三角瓶內(nèi)溶液的總體積控制在50～60mL。加3滴鄰菲啰啉指示劑，用硫酸亞銨標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定剩余的，溶液的變色過程是橙色—藍色—棕紅。

同時做空白實驗，取大約0.2g灼燒過后浮石粉或土壤代替土樣，其他步驟與土樣測定相同。

六、結(jié)果計算

七、注意事項

1、測定土壤有機質(zhì)必須采用風(fēng)干樣品。

2、如樣品中含Cl較多，可加一定量（0.1g）的硫酸銀消除部分干擾。

3、消煮時間對分析結(jié)果有較大影響，應(yīng)盡量準(zhǔn)確。

4、油浴鍋應(yīng)根據(jù)材質(zhì)不同定期強制更換，以防止石蠟滲漏引發(fā)火災(zāi)。

5、消煮好的溶液顏色，一般影視橙黃色或黃中稍帶綠色。

6、土壤樣品處理過程中，應(yīng)注意用靜電吸附等方法跳出植物根、葉等有機殘體。

7、在計算結(jié)果時，采用的是風(fēng)干土樣的質(zhì)量。

實驗七 土壤酸堿度的測定

一、實驗?zāi)康?/p>

土壤酸堿度（pH）是土壤的基本性質(zhì)，對植物生長及土壤理化、生物性質(zhì)有很大影響。了解土壤酸堿反應(yīng)，可以因土種植和進行土壤改良與培肥。

二、實驗原理

采用電位法測定土壤pH，是將pH玻璃電極和甘汞電極（或復(fù)合電極）插入土壤懸液或浸出液中構(gòu)成一原電池，測定其電動勢值，再換算成pH。在酸度計上測定，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)溶液定值后可直接讀取pH。水土比例對pH影響較大，尤其對于石灰性土壤稀釋效應(yīng)土壤除測定水浸土壤pH外，還應(yīng)測定鹽浸pH，即以1mOl／LKC1溶液浸取土壤H+后用電位法測定。本慶方法適用于各類土壤pH的測定。

三、實驗用具

酸度計（精確到0.01pH單位,有溫度補償功能）、pH玻璃電極、飽和甘汞電極（或復(fù)合電極）、攪拌器。

四、試劑配制

1、去除CO2的蒸餾水 煮沸10min后加蓋冷卻，立即使用。

2、氧化鉀溶液 稱取74.6gKC1溶于800mL蒸餾水中,用稀氫氧化鉀和稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH為5.5～6.0，稀釋至1L。

3、pH4.01（25℃）標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液 稱取徑110～120℃烘干2～3h的鄰苯二甲酸氫鉀10.21g溶于蒸餾水，移入1L容量瓶中，用蒸餾水定容，貯于聚乙烯瓶。

4、pH6.87（25℃）標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液 稱取經(jīng)110～130℃烘干2～3h的磷酸氫二鈉3.533g和磷酸二氫鉀3.388g溶于蒸餾水，移入1L容量瓶中，用蒸餾水定容，貯于聚乙烯瓶。

5、pH6.87（25℃）標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液 稱取經(jīng)平衡處理的硼砂3.800g溶于無CO2的蒸餾水中，移入1L容量瓶中，用蒸餾水定容，貯于聚乙烯瓶。、硼砂的平衡處理是將硼砂放在盛有蔗糖和食鹽飽和水溶液的干燥器內(nèi)平衡兩晝夜。

五、實驗步驟

1、儀器校準(zhǔn)

各種pH計和電位計的作用方法不盡一致,電極的處理和儀器的使用按儀器說明書進行。將待測液與標(biāo)準(zhǔn)沖溶液調(diào)到同一溫度，并將溫度補償器調(diào)到該溫度值。用標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校正儀器時，先將電極插入與所測試樣pH相差不超過2個pH單位的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液，啟動讀數(shù)開關(guān)，調(diào)節(jié)定位器使讀數(shù)剛好為標(biāo)準(zhǔn)液的pH，反復(fù)幾次至讀數(shù)穩(wěn)定。取出電極洗凈，用濾紙條吸干水分，再插入第二個標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液中，兩標(biāo)準(zhǔn)液之間允許偏差0.1個pH單位，如超過則應(yīng)檢查儀器電極或標(biāo)準(zhǔn)液是否有問題。儀器校準(zhǔn)無誤后，方可用于樣品測定。

2、土壤水浸液pH的測定 稱取通過2mm孔徑篩的風(fēng)干土壤樣品10.0g于50mL高型燒杯中，加25mL去CO2蒸餾水，以攪拌器攪拌1min，使土粒充分分散，放置30min后進行測定。將電極插入待測液中（注意玻璃電極球泡下部位于土液界面處，甘汞電極插入上部清液），輕輕搖動燒杯以除去電極上的水膜，促使其快速平衡，靜置片刻，按下讀數(shù)開關(guān)，待讀數(shù)穩(wěn)定（在5s內(nèi)pH變化不超過0.02）時記下pH。放開讀數(shù)開關(guān)，取出電極，以水洗滌，用濾紙條吸干水分后即可進行第二個樣品的測定。每測5～6個樣品后需用標(biāo)準(zhǔn)液檢查定位。

3、土壤氯化鉀鹽浸提液pH的測定 當(dāng)土壤水浸Ph〈7時，應(yīng)測定土壤鹽浸提液pH。測定方法除用1mOl／LKC1溶液代替去CO2蒸餾水以外，其他測定步驟與水浸pH測定相同。

六、注意事項

1、長時間存放不用的玻璃電極需要在蒸餾水中浸泡24h，使之活化后才能進行正常使用。暫時不用的可浸泡在蒸餾水中，長期不用時應(yīng)干燥保存。甘汞電極腔內(nèi)要充滿飽和氯化鉀溶液。玻璃電極的內(nèi)電極與球泡之間、甘汞電極內(nèi)電極和陶瓷芯之間不得有氣泡。

2、標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液在室溫下一般可保存1～2個月，在4℃冰箱中可延長保存期限。用過的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液不要倒回原液中混存，發(fā)現(xiàn)渾濁、沉淀就不能再使用。

3、溫度影響電極電位和水的電離平衡，溫度補償器、標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液、待測液溫度要一致。標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液pH隨溫度稍有變化。

4、依照儀器使用說明書，至少使用兩種pH標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液進行pH計的校正。

5、測定批量樣品時，最好按土壤類型將pH相差大的樣品分開測定，可避免因電極響應(yīng)遲鈍而造成的測定誤差。

6、如果復(fù)合電極質(zhì)量不穩(wěn)定，會導(dǎo)致讀數(shù)穩(wěn)定時間延長，因此，測試期間應(yīng)經(jīng)常檢查復(fù)合電極是否正常。

7、測量時土壤懸浮液的溫度與標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液的溫度之差不應(yīng)超過1℃。

實驗八 土壤堿解氮的測定

一、實驗?zāi)康?/p>

土壤堿解氮也成為土壤有效氮，它包括無機銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和土壤含氮有機物中交易分解的部分。土壤堿解氮含量可以反應(yīng)近期內(nèi)土壤氮素的供應(yīng)狀況，了解土壤肥力高低，作為指導(dǎo)合理施用氮肥的依據(jù)。

二、實驗原理

旱地土壤由于硝態(tài)氮含量叫高，需加還原劑還原，再用1.8mol/L氫氧化鈉溶液處理土樣，在擴散皿中，土樣于堿性條件下水解，使易水解氮經(jīng)堿解轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮，由硼酸溶液吸收，以標(biāo)準(zhǔn)酸滴定，計算有效氮含量。對于水稻土和經(jīng)常淹水的土壤，由于硝態(tài)氮含量甚微，不需加還原劑，因此氫氧化鈉溶液濃度采用1.2mol/L。本方法適用于各類土壤。

三、實驗用具

恒溫培養(yǎng)箱、擴散皿、半微量滴定管。

四、試劑配置

1、氫氧化鈉溶液 稱取72.0g氫氧化鈉溶解于水，稀釋至1L。

2、氫氧化鈉溶液 稱取48.0g氫氧化鈉溶解于水，稀釋至1L。

3、鋅—硫酸亞鐵還原劑 稱取50.0g磨細并通過0.25mm孔徑篩的硫酸亞鐵及10.0鋅粉混勻，保存于棕色瓶中。

4、堿性膠液。

5、鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

6、定氮混合指示劑。

7、硼酸溶液。

五、實驗步驟

稱取通過2mm孔徑篩的風(fēng)干土樣2g和1g鋅—硫酸亞鐵還原劑，均勻平鋪于擴散皿外室內(nèi)。在擴散皿內(nèi)室加入2mL 20g/L 硼酸溶液。在皿的外室邊緣圖上堿性膠液，蓋上毛玻璃，旋轉(zhuǎn)數(shù)次，使毛玻璃與皿邊完全黏合，在慢慢轉(zhuǎn)開毛玻璃的一邊，使擴散皿外室露出一條狹縫，迅速加入10mL 1.8mol/L氫氧化鈉溶液于擴散皿外室，立即將毛玻璃蓋嚴(yán)。

水平地輕輕轉(zhuǎn)動擴散皿，使氫氧化鈉溶液與土樣充分混合，然后小心地用橡皮筋兩根交叉成十字形圈緊，使毛玻璃固定。放在恒溫培養(yǎng)箱中于40℃保溫24h±0.5h。將擴散皿取出，用0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定內(nèi)室硼酸中吸收的氨量，顏色由藍色剛變紫紅色即達終點。滴定時應(yīng)用細玻璃棒攪動內(nèi)室溶液，不宜搖動擴散皿，以免溢出。

六、七、結(jié)果計算 注意事項

1、由于堿性膠液的堿性很強，在涂膠液和恒溫擴散時，必須特別細心，謹(jǐn)慎污染內(nèi)室。

2、據(jù)最新研究表明，土壤有效氮素含量指標(biāo)與植物實際需要的相關(guān)性并不是很強。

實驗九 土壤速效磷的測定

一、實驗?zāi)康?/p>

土壤速效磷含量是判斷近期內(nèi)土壤磷素供應(yīng)能力的一項重要指標(biāo)，可作為合理分配和施用磷肥的依據(jù)之一。

二、實驗原理

碳酸氫鈉溶液除可提取水溶性磷外，也可以抑制鈣離子Ca2+的活性，使一定量活性較大的Ca-P鹽類中的磷被浸出，也可使一定量的活性Fe-P和Al-P鹽類中的磷通過水解作用而浸出。由于浸出液中Ca、Fe、Al濃度較低，不會產(chǎn)生磷的再沉淀。浸提取液中的磷，在一定酸度下用鉬銻抗還原顯色成磷鉬藍，藍色的深淺在一定濃度范圍內(nèi)與磷的濃度成正比，故可用比色法測定。土壤浸出的磷量與土液比、液溫、振蕩時間及方式有關(guān)。本方法嚴(yán)格規(guī)定土液比為1：20，浸提液溫度為25℃±1℃，振蕩提取時間為30min。

本方法適用于石灰性土壤；中性土壤及睡到土也可參照使用。

三、實驗用具 恒溫往復(fù)式振蕩機或普通振蕩機及恒溫室、分光光度計或紫外——可見分光光度計、塑料瓶、無磷濾紙。

四、試劑配置

1、無磷活性碳粉

2、氫氧化鈉溶液

3、碳酸氫鈉浸提劑

4、酒石酸銻鉀溶液

5、鉬銻貯備液

6、鉬銻抗顯色劑

7、磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液

8、磷標(biāo)準(zhǔn)溶液

五、實驗步驟

稱取通過2mm孔徑篩的風(fēng)干土樣2.5g，置于200mL塑料瓶中，加入約1g無磷活性碳粉，加入25℃±1℃的碳酸氫鈉浸提劑50.0.mL，搖勻，在25℃±1℃溫度下，于振蕩器上用180r/min±20r/min的頻率振蕩30min±1min，立即用無磷濾紙過濾于干燥的150ml三角瓶中。

吸取濾液10.0ml于25ml比色管中，加入顯色劑5.0mL,慢慢搖動，排出CO2后加蒸餾水定容至刻度，充分搖勻。在室溫高于20℃處放置30min，用空白溶液為參比，用1cm光徑比色皿在波長700mm處比色，測量吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

六、七、結(jié)果計算 注意事項

1、測定時也可采用波長880mm比色，浸提時可不加活性炭退色。

2、如果土壤速效磷含量高時，應(yīng)減少浸提液的吸樣量，并加浸提劑補足至10.0mL后顯色，以保持顯色時溶液的酸度，計算時按所取浸提液的分取倍數(shù)計算。

3、用NaHCO3溶液浸提速效磷時，溫度影響較大，應(yīng)嚴(yán)格控制浸提溫度。

4、土樣風(fēng)干和貯存后，測定的速效磷含量可能有所改變，單一般無大影響。

5、對于酸性土壤，一般采用Bray法。

實驗十 土壤速效鉀的測定

一、實驗?zāi)康?/p>

土壤速效鉀包括土壤溶液中的鉀和土壤膠體吸附的鉀，是判斷近期內(nèi)土壤鉀素供應(yīng)能力的一項重要指標(biāo)，作為指導(dǎo)合理施用鉀肥的依據(jù)之一。

二、實驗原理

以中性1mol/L已算銨溶液為浸提劑時，NH4+與土壤膠體表面的K+進行交換，連同水溶性鉀一起進入溶液。浸出液中的鉀直接用火焰光度計或院子吸收分光光度計測定。本方法適用于各類土壤速效鉀含量的測定。

三、實驗用具

往復(fù)式或旋轉(zhuǎn)式振蕩機、火焰光度計或原子吸收分光光度計、塑料瓶。

四、試劑配置

1、乙酸銨溶液

2、鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液

五、實驗步驟

稱取通過2mm孔徑篩的風(fēng)干土樣5.00g,，置于200mL塑料瓶中，加入50.0mL乙酸銨溶液（土液比為1：10），蓋緊瓶塞，搖勻，在15~25攝氏度下，150~180r/min振蕩30min,干過濾。濾液直接在光焰光度計上測定或經(jīng)適當(dāng)稀釋后用原子吸收分光光度計測定。同時做空白實驗。

六、注意事項

1、含乙酸銨的鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液不能久放，以免長霉影響測定結(jié)果。

2、若樣品含量過高需要稀釋時，應(yīng)采用乙酸銨浸劑稀釋定容，以消除基體效應(yīng)。