第一篇：土壤微生物的分離培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

重慶大學(xué)研究生專業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)

實(shí)驗(yàn)報(bào)告書

實(shí)驗(yàn)課程名稱： 實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師： 學(xué)

院： 專業(yè)及類別： 學(xué)

號(hào)： 姓

名： 實(shí)驗(yàn)日期： 成績(jī)：

重慶大學(xué)研究生院制

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、了解分離與純化微生物的基本原理及方法；

2、了解倒平板配制土豆培養(yǎng)基的方法與平板劃線分離的基本操作技術(shù)；；

3、學(xué)習(xí)習(xí)近平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法，并掌握其基本技能；

4、初步觀察來(lái)自土壤中的幾類微生物的菌落形態(tài)特征，并能判斷菌的類型。

二、實(shí)驗(yàn)原理

1、培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒別、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。一般的培養(yǎng)基應(yīng)包含適合微生物生長(zhǎng)的6大營(yíng)養(yǎng)素即水分、碳源、氮源、能源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)基的種類很多，根據(jù)培養(yǎng)成分的不同可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基與半合成培養(yǎng)基；根據(jù)物理狀態(tài)的不同又可分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。微生物的分離、純化、記數(shù)等方面的研究常常使用的就是固體培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)就是使用的固體培養(yǎng)基。

已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，如來(lái)不及滅菌，應(yīng)暫存冰箱，以防止其中微生物生長(zhǎng)繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)基酸堿度所帶來(lái)不利影響。

培養(yǎng)基的原材料來(lái)源十分廣泛，本實(shí)驗(yàn)采用的原材料為土豆。

2、接種方法與無(wú)菌接種

將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱之為接種。接種是微生物實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無(wú)菌操作。微生物的接種方法很多，劃線接種、三點(diǎn)接種、穿刺接種、混澆接種與涂布接種是幾種常用的接種方法。

劃線接種是最常用的接種方法，即在固體培養(yǎng)基表面作來(lái)回直線形的移動(dòng)，就可以達(dá)到接種的目的。常用的接種工具為接種環(huán)、針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。三點(diǎn)接種是把少量的微生物接種在平板表面，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來(lái)觀察研究它們的形態(tài)。研究霉菌形態(tài)時(shí)就常用此法。

穿刺接種是用針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺。該法常用于厭氧菌種的保藏或微生物的動(dòng)力研究。

混澆接種是先將待接的微生物放入培養(yǎng)皿中再倒入冷卻至45℃左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就被稀釋了。待平板凝固后，置于適宜溫度下培養(yǎng)，就可以長(zhǎng)出單個(gè)菌落的微生物。

涂布接種是將菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作來(lái)回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可以長(zhǎng)出單個(gè)菌落的微生物。

本實(shí)驗(yàn)采用的是劃線接種。為了防止接種時(shí)引入其它微生物，整個(gè)操作過(guò)程均需在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行，還需對(duì)操作員的雙手進(jìn)行酒精消毒，每次劃線前都需灼燒接種環(huán)，接種時(shí)才打開培養(yǎng)皿且不能全部打開，接種完馬上關(guān)上。

三、實(shí)驗(yàn)器材

1、儀器

培養(yǎng)皿、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、酒精燈、玻璃棒、接種環(huán)、15ml離心管、試管架、鑷子、電磁爐、鍋、恒溫培養(yǎng)箱、高溫滅菌鍋、無(wú)菌操作臺(tái)、酒精燈、天平、濾紙等。

2、材料

土豆、瓊脂、蒸餾水、酒精、土壤樣品

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、土壤稀釋液的配制

① 在菜地用九點(diǎn)取樣法取適量土壤樣品，具體操作為：在菜地選取九個(gè)取樣點(diǎn)，在每個(gè)取樣點(diǎn)取相同量的表層土壤（10cm左右），然后將其混合均勻；

② 稱取1g土壤樣品與99ml蒸餾水，將其配制成100ml的土壤溶液； ③ 用移液管取9ml蒸餾水于15ml離心管中，再用移液槍取1ml前一步已配制的土壤溶液于離心管中，搖勻，即為10-3的土壤溶液；

④ 重復(fù)前一步，將土壤溶液稀釋為10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-8一系列稀釋液。

2、土豆培養(yǎng)基的制備

① 用天平稱取200g土豆，清洗干凈后去皮切丁；

② 用量筒量取1000ml蒸餾水與電磁爐鍋中，再加入已準(zhǔn)備好的土豆，將其煮爛；

③ 從鍋中取出已煮爛的土豆，用紗布過(guò)濾，濾液待用； ④ 稱取20g瓊脂與濾液中，再用蒸餾水定容至1000ml；

⑤ 在制備好的濾液中加入0.1ml菌液，然后放入高溫滅菌鍋中，在121℃下滅菌20min；

⑥ 取出已滅菌的土豆培養(yǎng)基，待其熔化后冷卻至60℃，倒入每付平板約15-20ml，待其凝固后便可使用。

3、微生物的接種與分離

① 將接種需要的所有器材均放置于無(wú)菌操作臺(tái)上；

② 用浸泡在酒精里棉花給雙手滅菌，點(diǎn)燃酒精燈，右手拿接種環(huán)，左手拿培養(yǎng)基；

③ 將接種環(huán)放在火焰上燒灼，待其冷卻后在10-6土壤稀釋液中蘸取少量液體，打開培養(yǎng)基的一部分，采用劃線接種，使之形成單菌落，一共劃線3-4次，每劃線一次就需在火焰上燒灼一次；

④ 重復(fù)上步，接種10-

7、10-8的土壤稀釋液的微生物；

⑤ 接種完的培養(yǎng)基放在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h，取出觀察。

五、結(jié)果與思考

1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，采用劃線接種土壤微生物的培養(yǎng)皿里有單菌落出現(xiàn)，這說(shuō)明劃線接種能達(dá)到分離培養(yǎng)的目的。

學(xué)習(xí)過(guò)微生物這門課程的同學(xué)都知道，真菌的菌落較大且疏松，菌絲細(xì)長(zhǎng)，呈絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀、棉絮狀，無(wú)固定大小，多有光澤，不易挑，孢子會(huì)呈現(xiàn)紅色、褐色、綠色、黑色、黃色等不同的顏色；細(xì)菌的菌落較小，形狀表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多為白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有細(xì)菌。

2、思考題

⑴在平板劃線法中，為什么每次都需要將接種環(huán)上的剩余物燒掉？

答：這么做的主要目的是殺死上次劃線后接種環(huán)上殘留的菌種，以使下次劃線的菌種直接來(lái)自于上次劃線的末端，使每次劃線菌種數(shù)目減少，從而達(dá)到分離菌株的目的。

⑵為什么要把培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？

答：①操作時(shí)培養(yǎng)皿蓋上可能粘有水珠或者細(xì)菌，倒著培養(yǎng)可以避免培養(yǎng)皿蓋上的水珠或者微生物落在培養(yǎng)皿上；

②培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)菌在代謝繁殖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些有害于細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的代謝物，釋放熱量及有水排出，如果不倒著培養(yǎng)會(huì)有水珠滴落到培養(yǎng)基中，影響菌落的生長(zhǎng);③如果培養(yǎng)目標(biāo)是收集細(xì)菌代謝物，而且代謝物易溶于水，倒著培養(yǎng)可能會(huì)方便收集。

六、實(shí)驗(yàn)總結(jié) 我本科所學(xué)專業(yè)是材料科學(xué)與工程，本次實(shí)驗(yàn)是我高中后第一次接觸微生物方面的知識(shí)。在本次實(shí)驗(yàn)課里，段老師先給我們?cè)敿?xì)講解了微生物分離培養(yǎng)方面的許多理論知識(shí)，然后才進(jìn)入了理論環(huán)節(jié)。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中段老師一直在我們旁邊觀察我們的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程，一旦出現(xiàn)錯(cuò)誤，會(huì)立即指出并耐心的給我們講解應(yīng)該怎么做，我擔(dān)心自己從來(lái)沒(méi)做過(guò)微生物培養(yǎng)方面的實(shí)驗(yàn)會(huì)做不好，段老師還一直在旁邊鼓勵(lì)我，并給我講解了許多微生物分離培養(yǎng)方面的知識(shí)，最后我獨(dú)立完成了本次實(shí)驗(yàn)。此次實(shí)驗(yàn)課，我真的是受益匪淺，學(xué)到了許多微生物分離培養(yǎng)方面的知識(shí)，十分感謝段老師。

圖2 如圖2所示，本次微生物分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，有些培養(yǎng)皿里菌落很少，只有一個(gè)，有的甚至沒(méi)有。我認(rèn)為出現(xiàn)這種情況原因可能是：劃線接種時(shí)，未等接種環(huán)冷卻就開始接種，微生物可能被高溫殺死；在接種時(shí)，酒精燈火焰太大，進(jìn)行接種操作的全過(guò)程又離酒精燈火焰很近，這也可能將微生物殺死。

第二篇：微生物分離實(shí)驗(yàn)報(bào)告（定稿）

微生物分離實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)儀器及材料

土樣：18號(hào)土樣 試劑及培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：果膠酶篩選培養(yǎng)基；幾丁質(zhì)酶真菌篩選培養(yǎng)基；果膠酶劃線分

離培養(yǎng)基；幾丁質(zhì)酶劃線培養(yǎng)基；細(xì)菌半固體培養(yǎng)基；淀粉培養(yǎng)基；葡萄糖酵解培養(yǎng)基；乳糖酵解培養(yǎng)基；蛋白胨水培養(yǎng)基

a)試劑：草酸銨結(jié)晶紫染液、番紅復(fù)染液等各種染料以及盧戈氏碘液、95%

乙醇、5%孔雀綠水溶液、無(wú)菌水等

儀器

錐形瓶（500mL×2；300mL×2；100mL×3）、培養(yǎng)皿（20套）、試管（20支）、移液管（3支）、燒杯、玻璃棒、載玻片、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡、涂布棒、U型管、德漢氏小管、酒精燈、漏斗、接種環(huán)、濾紙、棉塞、牛皮紙、無(wú)菌操作臺(tái)、滅菌鍋、紗布等

細(xì)菌的篩選，分離純化及鑒定 細(xì)菌的篩選

土樣處理

配制生理鹽水：在燒杯中配置200ml0.85％的生理鹽水，用移液管各移取9ml于五支潔凈試管，再移取90ml配置好的生理鹽水于三角燒瓶，并放入少許玻璃珠，包好滅菌；

加土樣：冷卻后準(zhǔn)確稱取10g土樣放入盛有90ml無(wú)菌生理鹽水并帶有少許玻璃珠的三角燒瓶中，充分震蕩搖勻，然后放在30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min。

果膠酶菌種篩選

梯度稀釋：用一支無(wú)菌吸管吸取1ml土壤懸液加入到盛有9ml無(wú)菌水的試管中充分混勻，此為10-1稀釋液，以此類推制成10-

2、10-3兩種稀釋度的土壤溶液（如下圖）；

涂布：配制果膠酶篩選培養(yǎng)基，110度滅菌20-30分鐘，冷卻后倒平板在培養(yǎng)皿蓋周邊用記號(hào)筆做好標(biāo)記，分別寫上10-

1、10-3兩種稀釋度字樣，每稀釋度標(biāo)記三皿，然后用無(wú)菌吸管分別由10-

3、10-1兩管土壤稀釋液中吸取適量對(duì)好放入已寫好稀釋度的平板中央位置，每皿準(zhǔn)確放入0.2ml，用無(wú)菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，其方法是將菌液先沿一條直線輕輕地來(lái)回推動(dòng)，使之均勻分布，然后改變方向90度沿另一垂直線來(lái)回推動(dòng)，平板內(nèi)邊緣處改變方向用涂布棒再涂布幾次；

培養(yǎng)：將平板倒置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)1-2天；

果膠酶透明圈平板檢測(cè)：取10-1涂布平皿，用0.5％的剛果紅染色15-20min后，倒掉剛果紅，用1mol/L的NaCl脫色幾分鐘至觀察到透明圈，則說(shuō)明水解圈內(nèi)的菌有水解果膠的能力；

菌落描述：取此菌進(jìn)行菌落形態(tài)描述，就菌落的大小（大、中，小），顏色（白，黃，粉紅等），干濕（干、濕），邊緣（整齊，不整齊），表面（光滑，粗糙，有無(wú)突起等）分別進(jìn)行闡述并詳細(xì)記錄； 細(xì)菌的分離純化

劃線分離：制備果膠酶劃線培養(yǎng)基，滅菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌種，第一次劃線分離培養(yǎng)1-2天后取分離所得單菌落再進(jìn)行第二次劃線分離，劃線分離的具體方法是：先在平皿上劃定區(qū)域，然后將接種針在火焰上進(jìn)行滅菌操作，取含菌種的培養(yǎng)皿，在火焰上方（注意：不

圖 細(xì)菌的劃線分離示意圖

能離火焰太近）打開培養(yǎng)皿蓋，先拿接種針在上蓋處劃線以降溫，然后用接種針輕挑所選菌落一到兩下，將平皿蓋上放好，再取剛剛冷卻了的干凈平皿在1區(qū)進(jìn)行劃線接種操作。操作完畢后對(duì)接種針進(jìn)行滅菌操作，完成后在火焰上方打開平皿蓋，將接種針冷卻后從1區(qū)引線到2區(qū)，再如圖所示劃線，劃完后引線到3區(qū)，同上進(jìn)行劃線，劃線完畢后蓋蓋平放；

純種保藏：再配制一份普通細(xì)菌培養(yǎng)基，分裝試管后滅菌，制得斜面，將純種劃線接種在斜面上培養(yǎng)保存并進(jìn)行下一步的鑒定。

a)純種果膠酶水解能力的測(cè)定

配制果膠酶篩選培養(yǎng)基，110度滅菌20-30分鐘，冷卻后倒平板在培養(yǎng)皿蓋周邊用記號(hào)筆做好標(biāo)記，將分離純化的細(xì)菌點(diǎn)種于平板上（注意：點(diǎn)種的量不宜過(guò)多，以3～4個(gè)為宜），在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，取培養(yǎng)后的平皿用0.5％的剛果紅染色15-20min后，倒掉剛果紅，用1mol/L的NaCl脫色幾分鐘至觀察到透明圈，測(cè)量并記錄透明圈的大小

b)簡(jiǎn)單染色步驟 i.涂片 取一塊載玻片，在上邊用膠頭滴管加半滴無(wú)菌水，用接種環(huán)無(wú)菌操作將沾有菌的接種環(huán)置于載玻片上的無(wú)菌水種涂抹，待看到微弱的渾濁即可；（注意取菌不要太多）

ii.干燥與固定

涂菌面朝上，通過(guò)火焰以干燥并固定菌物，固定過(guò)程應(yīng)使載玻片通過(guò)火焰2-3次，注意溫度的控制，過(guò)熱的溫度會(huì)將細(xì)菌殺死，溫度以手背感覺微微發(fā)燙為標(biāo)準(zhǔn)；

iii.染色

將載玻片平放于載波片支架上，滴加結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位即可，染色1.5min iv.水洗

傾去染液，將載玻片的涂菌面朝下，自來(lái)水沖洗，水流不宜太急、太大，至洗出水無(wú)色為止；

v.干燥

用吸水紙吸去多余水分后自然干燥； vi.鏡檢

將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)。

c)革蘭氏染色步驟 i.涂片

先在載玻片一側(cè)用記號(hào)筆標(biāo)記間隔的四個(gè)區(qū)域，在另一側(cè)四個(gè)區(qū)域的位置分別滴加半滴無(wú)菌水。分別取四種活躍生長(zhǎng)期菌種（大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌和一種自選菌）按常規(guī)方法涂片（不宜過(guò)厚），用酒精燈按照簡(jiǎn)單染色中所述干燥和固定的方法對(duì)四種菌進(jìn)行干燥和固定。

ii.初染

滴加草酸銨結(jié)晶紫染液使之覆蓋涂菌部位，染色1.5min后水洗； iii.媒染

先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min后水洗； iv.脫色

先用乙醇沖去水跡，然后用95%乙醇覆蓋脫去色素，脫色約30s，立即用水沖洗；

v.復(fù)染

先用番紅洗去水跡，然后滴加番紅復(fù)染1.5min后水洗； vi.鏡檢

將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細(xì)菌。分別以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌所染顏色作為對(duì)照，來(lái)判斷枯草桿菌以及另一種自選菌的染色結(jié)果。

d)芽孢染色步驟 i.涂片，加熱干燥及固定

在潔凈蓋玻片接近中部?jī)商幏謩e滴一滴無(wú)菌水，分別接種枯草芽孢桿菌及梭狀芽孢桿菌。然后按照常規(guī)方法加熱干燥及固定；

ii.孔雀綠加熱染色

用木夾夾住載玻片，向載玻片上滴加5%孔雀綠水溶液使之完全覆蓋涂菌部位，然后在酒精燈上微微加熱（孔雀綠著色能力強(qiáng)，加熱可使較難染色的芽孢染成綠色，且再難洗脫）至染液冒蒸汽開始計(jì)時(shí)并維持5min，注意加熱時(shí)應(yīng)以有蒸汽微微冒出為宜，過(guò)熱或加熱不足均會(huì)影響觀察效果，且加熱時(shí)在載玻片上隨時(shí)補(bǔ)加染液，切勿讓涂片干涸；

iii.水洗

水洗一定要等載玻片冷卻后進(jìn)行，否則可能導(dǎo)致載玻片的破裂。具體水洗按常規(guī)方法進(jìn)行； iv.復(fù)染

用0.5%番紅水溶液復(fù)染2min； v.水洗并干燥

按常規(guī)方法水洗后自然干燥； vi.鏡檢

先在低倍鏡下尋找視野范圍，然后換用高倍鏡調(diào)焦，最后加香柏油在油鏡下仔細(xì)尋找兩種細(xì)菌以及其周圍或內(nèi)部染成綠色的芽孢。

e)半固體穿刺法觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性 i.配制培養(yǎng)基

配制半固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分裝于4支試管內(nèi)，110度滅菌20-30分鐘，正立于燒杯中冷卻至室溫；

ii.在無(wú)菌操作臺(tái)上右手握接種針,以針挑取菌苔.垂直刺入半固體瓊脂培養(yǎng)的中心直至接近(但勿觸及)試管底,然后循原路退出。如圖所示：

iii.接種完成后在30℃條件下培養(yǎng)兩天觀察并判斷其運(yùn)動(dòng)性。

第三篇：微生物的分離與培養(yǎng)

病原物的分離與培養(yǎng)

病原物的分離與培養(yǎng)在植物病害的研究中具有重要意義，分離、培養(yǎng)病原菌的方法是植物病理學(xué)研究工作中最常應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。一方面，在一個(gè)新的病害研究中，通過(guò)分離與培養(yǎng)獲得病原物的純培養(yǎng)，完成柯氏法則，以明確該病病原；研究病原物的生物學(xué)特性和病害循環(huán)（侵染、病程等等）。所謂病原物的分離，即把該病原菌從發(fā)病組織上與其他微生物分開；所謂病原物的培養(yǎng)，即將分離的病原菌移到可以讓這種病原菌正常生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)即培養(yǎng)基上，從而獲得其純培養(yǎng)。病原物的分離與培養(yǎng)，需經(jīng)以以幾個(gè)步驟: 1.有關(guān)器皿的滅菌和消毒； 2.制作培養(yǎng)基； 3.病原菌的分離 4.病原菌的培養(yǎng)。－、滅菌與消毒

滅菌與消毒是兩個(gè)不同的概念。滅菌則是指殺死一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體和孢子。消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營(yíng)養(yǎng)體，在植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場(chǎng)所都要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒和滅菌。消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過(guò)濾、輻射和使用化學(xué)藥品等方法。

(一)熱力滅菌

熱力滅菌分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。

1．干熱滅菌

干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)疑固性與其本身的含水量有關(guān)。在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高(160～170℃)，時(shí)間長(zhǎng)1～2 h。但干熱滅菌溫度不能超過(guò)180 ℃，否則包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的儀器是烘箱。

干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種?；鹧鏌茰缇m用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，無(wú)菌操作時(shí)酌試管口和瓶口也在火焰上作短暫燒灼滅菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后進(jìn)行灼燒滅菌。通常所說(shuō)的干熱滅菌是在烘箱內(nèi)利用高溫干燥空氣(160～170℃)進(jìn)行滅菌。此法適用于玻璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等的滅菌。

進(jìn)行干熱滅菌要注意以下問(wèn)題：物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通；滅菌物品不要接觸烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火；在升溫過(guò)程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內(nèi)停止加溫；電烘箱內(nèi)溫度未降到70℃以前，切勿自行打開箱門以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。濕熱滅菌

(1)高壓蒸汽滅菌 此法是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，0.1MPa，121℃保持15～30 min進(jìn)行滅菌。時(shí)間的長(zhǎng)短可根據(jù)滅菌物品種類和數(shù)量的不同而有所變化，以達(dá)到徹底滅菌。這種滅菌適用于培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的滅菌。

(2)常壓蒸汽滅菌 在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下：常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌法。對(duì)于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法可用阿諾氏流動(dòng)蒸汽滅菌器進(jìn)行，也可用普通蒸籠進(jìn)行滅菌。由于常壓，其溫度不超過(guò)100℃，僅能使大多數(shù)微生物被殺死，而芽孢細(xì)菌卻不能在短時(shí)間內(nèi)殺死，因此可采用間歇滅菌以殺死芽孢細(xì)菌，達(dá)到徹底滅菌的目的。

常壓間歇滅菌是將滅菌培養(yǎng)基放人滅菌器內(nèi)，每天加熱100℃，30 min，連續(xù)3 d，第一天加熱后，其中的營(yíng)養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物取出放室溫下18～24 h，使其中的芽孢發(fā)育成營(yíng)養(yǎng)體，第二天再加熱100℃，30 min，發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)體又被殺死，但可能仍留有芽孢，故再重復(fù)一次，使徹底滅菌。

(二)過(guò)濾除菌

許多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加熱消毒滅菌方法，—均會(huì)被熱破壞，因此采用過(guò)濾除菌的方法。應(yīng)用最廣泛的過(guò)濾器有：

(1)蔡氏過(guò)濾器 該過(guò)濾器是由石棉制成的圓形濾板和一個(gè)特制的金屬（銀或鋁）漏斗組成，分上、下兩節(jié)。過(guò)濾時(shí)，用螺旋把石棉板緊緊夾在上、下兩節(jié)濾器之間，然后將溶液臵于濾器中抽濾。每次過(guò)濾必須用一張新濾板。根據(jù)其孔徑大小，濾板分為3種型號(hào)：K型最大，作一般澄清用；EK濾孔較小，用來(lái)除去一般細(xì)菌；EK-S濾孔最小，可阻止大病毒通過(guò)。使用時(shí)可根據(jù)需要選用。

(2)微孔濾膜過(guò)濾器 這是一種新型濾器，其濾膜是用醋酸纖維酯和硝酸纖維酯的混合物制成的薄膜。微孔濾膜過(guò)濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝臵的塑料蓋盒組成。出口處可連接針頭，入口處可連接針筒。使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達(dá)到除菌的目的。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過(guò)濾除菌。實(shí)驗(yàn)室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm，但若要將病毒除掉，則需更小孔徑的微孔濾膜。微孔濾膜過(guò)濾除菌的主要操作步驟為：

① 組裝、滅菌 將0.22μm孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊。壓平，包裝滅菌后待用(0.1MPa、121.5℃滅菌：20 min)。連接。將滅菌濾器的入口在無(wú)菌條件下，以無(wú)菌操作方式連接于裝有待濾溶液注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無(wú)菌試管中。

② 壓濾 將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠壓過(guò)濾到無(wú)菌試管中。濾畢，將針頭撥出。壓濾時(shí)，用力要適當(dāng)，不可太猛太快，以免細(xì)菌被擠壓通過(guò)濾膜。

提示: 整個(gè)過(guò)程應(yīng)在無(wú)菌條件下嚴(yán)格無(wú)菌操作以防污染，過(guò)濾時(shí)應(yīng)避免各連接處出現(xiàn)滲透現(xiàn)象。

(三)輻射滅菌 紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的。波長(zhǎng)為200～300 nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260 nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長(zhǎng)一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線殺菌機(jī)理主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成過(guò)氧化氫(H2O2)。O3和H2O2有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以只適用于無(wú)菌室、接種箱的空氣及物體表面的滅菌。

注意事項(xiàng): 紫外線對(duì)眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用，對(duì)皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光，更不能在紫外線燈光下工作。紫外線燈距照射物以不超過(guò)1.2 m為宜。

此外，采用60Co-γ射線滅菌，也已廣泛用于不能進(jìn)行加熱滅菌的紙、塑料薄膜，各種積層材料制作的容器以及醫(yī)用生物敷料皮等的滅菌。γ射線滅菌的最大優(yōu)點(diǎn)是穿透力強(qiáng)，可在厚包裝完好條件下滅菌。

(四)化學(xué)藥品滅菌

化學(xué)藥品消毒滅菌法是應(yīng)用能抑制或殺死微生物的化學(xué)制劑進(jìn)行消毒滅菌的方法。能破壞細(xì)菌代謝機(jī)能并有致死作用的化學(xué)藥劑為殺菌劑，如重金屬離子等；只是阻抑細(xì)菌代謝機(jī)能，使細(xì)菌不能增殖的化學(xué)藥劑為抑菌劑，如磺胺類及大多數(shù)抗生素等。化學(xué)藥品對(duì)微生物的作用是抑菌還是殺菌以及作用效果還與化學(xué)藥品濃度的高低、處理微生物的時(shí)間長(zhǎng)短、微生物的種類以及微生物所處的環(huán)境等有關(guān)。

植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用的化學(xué)藥品有2％煤酚皂溶液(來(lái)蘇爾)、0.25％新潔爾滅、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。

消毒與滅菌不僅是從事植物病理學(xué)和整個(gè)生命科學(xué)研究必不可少的重要環(huán)節(jié)和實(shí)用技術(shù)，而且在醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、食品、生物制品等各方面均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)不同的使用要求和條件選用合適的消毒滅菌的方法。

二、培養(yǎng)基的制作

1、目的要求

了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握培養(yǎng)基的制備方法。

2、基本原理

在植物病理學(xué)研究工作中經(jīng)常要使用各種不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是按照生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)，用人工方法配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。其中含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素以及水分等。微生物在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖還必須在最適pH范圍內(nèi)才能生長(zhǎng)得更好，因此，對(duì)不同種類的微生物應(yīng)將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到一定的pH范圍。－般而言，真菌調(diào)節(jié)到微酸，細(xì)菌調(diào)節(jié)到微堿。

培養(yǎng)基的種類很多，不同的微生物所需要的培養(yǎng)基不同。依物理性狀可分為液體的、固體的和半固體的三種。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入1.5 %～2 %的瓊脂，半固體培養(yǎng)基是加入0.2 %～0.5 %的瓊脂。瓊脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。

根據(jù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源的不同，培養(yǎng)基可分為天然、半合成和合成培養(yǎng)基三類。天然培養(yǎng)基是以自然界原有的有機(jī)物為材料經(jīng)滅菌后制成，如馬鈴薯、胡蘿卜、水果、大麥粒、高粱粒等。半合成培養(yǎng)基中既有一些天然的有機(jī)物質(zhì)，又有一些成分簡(jiǎn)單或明確的化合物。如常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、肉汁胨培養(yǎng)基(NA)等。合成培養(yǎng)基是由一些成分明確的化合物配制而成的，無(wú)任何成分不明確的物質(zhì)，常用于研究微生物的生理生化性狀，如查氏(Czapek)培養(yǎng)基等。

根據(jù)培養(yǎng)基用途不同，可分為生長(zhǎng)繁殖培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基、貯存培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基等。在植物病理學(xué)研究中，最常用培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，主要用于分離培養(yǎng)病原真菌。

在培養(yǎng)基配制完之后，必須經(jīng)過(guò)滅菌，以便徹底殺死其中原有的一切微生物。

3、材料、試劑與儀器 材料 馬鈴薯。

試劑 葡萄糖、瓊脂等。

儀器與用品 高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(或酸度計(jì))、試管、鋁鍋、攪拌棒、三角瓶、燒杯、漏斗、量筒、紗布、棉花、天平等。

4、操作步驟

PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20g、蒸餾水1000 ml，自然pH。

在PDA培養(yǎng)基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，這樣配制的培養(yǎng)基也稱為PSA培養(yǎng)基。(1)稱量 稱量去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g。提示：瓊脂加入的量取決于瓊脂的質(zhì)量，質(zhì)量好的15 g就夠了，質(zhì)量差的應(yīng)適當(dāng)增加。另外，在夏天氣溫較高時(shí)，適當(dāng)增加用量。

(2)將馬鈴薯切成小塊，放入鍋中，加水1000 ml，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)?/p>

(3)將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂，加熱熔化。

提示：在瓊脂熔化的過(guò)程中，需要用玻璃棒不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入適量的水以補(bǔ)充加熱過(guò)程中損失的水分，定容至1000 ml。

提示：通常在制作培養(yǎng)基的鍋內(nèi)用紅藍(lán)鉛筆標(biāo)記出不同體積的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容時(shí)直接將水加至已標(biāo)記的刻度即可。

(5)分裝 根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模蓪⑴渲频呐囵B(yǎng)基分裝于試管內(nèi)或三角瓶?jī)?nèi)。分裝試管，其量為管高的1／5，滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的容量以不超過(guò)三角瓶容積之一半為宜。

(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脫脂的經(jīng)彈松的棉花，棉塞可過(guò)濾空氣，防止雜菌侵入并可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，故在植物病理學(xué)研究工作中普遍使用。

正確的棉塞是形狀、劃、、松緊與管口或瓶口完全適合，過(guò)緊時(shí)妨礙空氣流通，操作不便；過(guò)松則達(dá)不到濾菌的目的，且棉塞過(guò)小往往容易掉進(jìn)試管內(nèi)。正確的棉塞頭較大，約有1／3在外，2／3在試管內(nèi)。分裝過(guò)程中注意不要使培養(yǎng)基沾染在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起污染。

(7)包扎 加塞后，將試管用線繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道線繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、組別、制作人等。

(8)滅菌 將上述培養(yǎng)基以0.1MPa，121℃，高壓蒸氣滅菌20 min。

(9)擱臵斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基豎臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱臵的斜面長(zhǎng)度以不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半為宜。

培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37℃溫箱培養(yǎng)24h，無(wú)菌生長(zhǎng)者方可使用。

PDA培養(yǎng)基一般不需要調(diào)pH。對(duì)于要調(diào)節(jié)pH的培養(yǎng)基，一般用pH試紙測(cè)定其pH。如果培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿破壞培養(yǎng)基成分。

三、病原菌的分離培養(yǎng)和純化

1、目的要求

(1)了解分離與純化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和組織分離、稀釋分離、平板劃線分離的基本操作技術(shù)。

(3)掌握在平板、斜面及液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原菌及觀察其培養(yǎng)性狀的方法。

2、基本方法

植物病原真菌的分離方法主要有組織分離法和稀釋分離法兩種。最常用的方法是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產(chǎn)生大量孢子的病原真菌的分離。病原細(xì)菌的分離方法以劃線分離法為最常用，在有些情況下也采用稀釋分離法。

為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須要進(jìn)行分離菌的純化，純化的方法類似于分離工作中采用的稀釋分離法或劃線分離法。

3、材料、儀器與用具 3.1 材料

(1)稻瘟?。ㄈ~、病節(jié)、病穗頸）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）。(3)黃瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉病（果）(Botrytis cinerea)。

(5)黃瓜菌核?。ü?Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黃瓜細(xì)菌性角斑?。ㄈ~）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。

(7)水稻白葉枯?。ㄈ~）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜軟腐?。ㄈ~）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。

3.2．培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；肉膏蛋白脈培養(yǎng)基；加寄主組織煎汁的培養(yǎng)基等。

3.3．儀器與用品 超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、吸管、吸水紙、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、鑷子、接種鏟(針)、接種環(huán)(鉺)、70％酒精、0.1％升汞、酒精燈、火柴、記號(hào)筆、橡皮筋套、可調(diào)式電爐、不銹鋼鍋等。

4、實(shí)驗(yàn)操作

(一)病原真菌的分離

1．組織分離法 其步驟為：

(1)取滅菌培養(yǎng)皿一個(gè)，臵于濕紗布上，在皿蓋上用玻璃鉛筆注明分離日期、材料和分離人的姓名。提示：無(wú)菌操作應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：工作前將所需的物品都放在超凈工作臺(tái)內(nèi)；操作前用肥皂洗手，操作時(shí)還需用70 ％酒精擦拭雙手；無(wú)菌操作時(shí)，呼吸要輕，不要說(shuō)話。

（2）用無(wú)菌操作法向培養(yǎng)皿中加入25％乳酸1～2滴(可減少細(xì)菌污染)，然后將融化而冷至60℃左右的PDA培養(yǎng)基倒人培養(yǎng)皿中，每皿倒10～15 ml，輕輕搖動(dòng)使之成平面。凝固后即成平板培養(yǎng)基。

提示：加入25％乳酸1～2滴，可減少平板上出現(xiàn)污染細(xì)菌菌落。除乳酸外，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)目咕匾种萍?xì)菌的生長(zhǎng)，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 細(xì)菌生長(zhǎng)；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-細(xì)菌生長(zhǎng)；加鏈霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分細(xì)菌的生長(zhǎng)。除了氯霉素可在滅菌前加入外，其他抗菌素都應(yīng)在滅菌后并冷卻到45℃左右(以手背觸三角瓶感到燙，但尚可以忍耐為宜)時(shí)加入。倒平板過(guò)程中只要遵循“穩(wěn)、輕、快”要領(lǐng)，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌葉斑病的新鮮病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個(gè)病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣(病健交界處，)切取小塊(每邊長(zhǎng)3～4 mm)病組織數(shù)塊。

提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機(jī)會(huì)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點(diǎn)病害應(yīng)在臨近健組織的部分分離。

（4）將病組織放入70％酒精中浸3～5s后，按無(wú)菌操作法將病組織移入0.1％升汞液中分別表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒劑)，如植物組織柔嫩，則表面消毒時(shí)間宜短；反之則可長(zhǎng)些。然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留的消毒劑。

提示：先用70％的酒精浸2～3 s是為了消除寄主表面的氣泡，減少表面張力，70％的酒精亦用于表面消毒，處理的時(shí)間較短(一般數(shù)秒至l min)升汞溶液消毒的時(shí)間因材料而異，可自30s至30min不等，一般情況下，需時(shí)間3～5 min。

(5)用無(wú)菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放4～6塊。

提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無(wú)菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染。

(6)將培養(yǎng)皿倒臵放入25℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般3～4 d后觀察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果。

(7)若病組織小塊上均長(zhǎng)出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。在無(wú)菌條件下，用接種針(鏟)自菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上，在25 ℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，如無(wú)雜菌生長(zhǎng)即得該分離病菌純菌種，便可臵于冰箱中保存。

提示：除根據(jù)菌落的一致性初步確定長(zhǎng)出的菌落是否目標(biāo)菌外，還要在顯微鏡下檢查，進(jìn)一步確定。如果是對(duì)未知病原菌的組織分離，則要將長(zhǎng)出的菌落分別轉(zhuǎn)出，通過(guò)進(jìn)一步的接種實(shí)驗(yàn)明確哪一種為其病原菌。

在組織分離工作中，如果植物材料體積較大且較軟(如患灰霉病的番茄果實(shí))，在分離過(guò)程中可直接挖取內(nèi)部患病組織移入平板培養(yǎng)基上，完成分離工作。

2.稀釋分離法

(1)取滅菌培養(yǎng)皿三個(gè)，平放在濕紗布上，編號(hào)，并注明日期、分離材料及分離人姓名。

(2)用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一皿中分別注入0.5～1.0 ml。(3)用移植環(huán)蘸一滴孢子懸浮液，與第一個(gè)培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，再?gòu)牡谝粋€(gè)培養(yǎng)皿移三環(huán)到第二個(gè)培養(yǎng)皿中，混合后再移三環(huán)到第三個(gè)培養(yǎng)皿中。

(4)將熔化并冷卻到45～50℃的培養(yǎng)基，分別倒在三個(gè)培養(yǎng)皿中(為防止細(xì)菌污染，也可以向每個(gè)培養(yǎng)皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，搖勻，凝固，要使培養(yǎng)基與稀釋的菌液充分混勻。

提示： 倒平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度一定要掌握好，過(guò)熱易將病原菌燙死而使分離失敗，過(guò)冷則倒入培養(yǎng)皿中后難以形成平板，不利于分離。

(5)將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)后臵恒溫箱(25℃)中培養(yǎng)，數(shù)日后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

(6)挑菌 將培養(yǎng)后長(zhǎng)出較為整齊一致的單個(gè)菌落分別挑取，接種到斜面培養(yǎng)基上，臵25℃左右培養(yǎng)。待菌長(zhǎng)出后，檢查菌是否單純，若有其他菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離純化，直到獲得純培養(yǎng)。

(二)病原細(xì)菌的分離

病原細(xì)菌的分離方法以稀釋分離法和劃線分離法為最常用。在進(jìn)行分離之前，首先應(yīng)對(duì)病組織材料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)初步診斷，即經(jīng)過(guò)鏡檢確認(rèn)有噴菌現(xiàn)象以后，才對(duì)該病組織作分離工作。稀釋分離法是最經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)分離法，方法同上述真菌分離。

除去上述稀釋分離法以外，較為方便的是劃線分離法：(1)預(yù)先把熔化好的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝成平板后，翻轉(zhuǎn)放在30℃恒溫箱中2～4 h，使表面無(wú)水滴凝結(jié)。也可凝成平板后直接使用。(2)將病組織先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用無(wú)菌水換洗3次后，放在滅菌培養(yǎng)皿中的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并讓組織碎塊在水中浸泡20～60 min，讓細(xì)菌釋放到滅菌水中。

(3)用滅菌的接種鉺，(接種環(huán))；蘸取浸泡液在干燥的培養(yǎng)基平板表面劃線，盡量不要把平板表面劃破。劃過(guò)第一批線后的接種環(huán)應(yīng)放在火焰上燒灼，冷卻后直接在第一批劃線的末端向另一方向劃線。滅菌后再劃第三次線。

提示：劃過(guò)第一批線后接種鉺放在火焰上燒過(guò)這一步驟非常重要，這樣做可以使第一批線和第二批線上的細(xì)菌數(shù)量相差很大。

(4)用玻璃鉛筆在培養(yǎng)皿上寫上分離材料、日期和分離者姓名后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，放在26～28℃恒溫箱中培養(yǎng)。1～3 d后觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，在哪些地方有單菌落生長(zhǎng)出來(lái)?其中的優(yōu)勢(shì)單菌落應(yīng)為待分離菌形成的。

(5)仔細(xì)挑取病原菌的單菌落，并移植到斜面培養(yǎng)基上。同時(shí)，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮液作第二次劃線分離，經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時(shí)，即表明已獲得純培養(yǎng)。最好要經(jīng)過(guò)連續(xù)三次單菌落的分離，才能確保純化。

(三)真菌、細(xì)菌培養(yǎng)性狀

1．真菌培養(yǎng)性狀觀察 取已分離，純化的某種真菌菌種；按前述稀釋分離法中(1)～(5)步驟進(jìn)行，待某培養(yǎng)皿中形成單個(gè)菌落后觀察。記載以下內(nèi)容：菌落顏色、菌叢密集及繁茂程度、是否有色素分泌出來(lái)而滲透到培養(yǎng)基中、菌落生長(zhǎng)速度快慢等。同時(shí)要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

2．細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察

(1)仿照上述真菌菌落形成步驟，觀察記載以下內(nèi)容：菌落顏色、菌落邊緣形狀、菌落表面是光亮還是粗糙或有皺折、、菌落隆起情況、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中，菌落生長(zhǎng)速度快慢，是否有特殊氣味形成等。同時(shí)要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

(2)用接種鉺(環(huán))蘸細(xì)菌菌種后，通過(guò)無(wú)菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培養(yǎng)基表面從下向上劃一直線，過(guò)2～3 d后長(zhǎng)出的細(xì)菌群體稱為菌苔，可仿照觀察記載細(xì)菌菌落的記載內(nèi)容，記載菌苔顏色、邊緣形狀、表面是光亮還是粗糙有皺折、隆起情況、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中，是否有特殊氣味生成，生長(zhǎng)速度快慢等。也要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

(3)用接種鉺(環(huán))蘸取細(xì)菌菌種后，通過(guò)無(wú)菌操作，將其接種在某種液體培養(yǎng)基中，數(shù)日后觀察記載培養(yǎng)基中是否變混濁、是否有色素、氣體、沉淀生成，培養(yǎng)液表面是否可生成菌膜等。也要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

第四篇：土壤中放線菌的采集、分離、培養(yǎng)、發(fā)酵及提取實(shí)驗(yàn)報(bào)告

土壤中放線菌的采集、分離、培養(yǎng)、發(fā)酵及提取

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、從土壤中分離產(chǎn)抗生素的放線菌

2、放線菌的培養(yǎng)

3、放線菌的發(fā)酵產(chǎn)生活性物質(zhì)

4、放線菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)提取。實(shí)驗(yàn)原理：

放線菌是一類呈菌絲狀生長(zhǎng)，主要以孢子繁殖。放線菌與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切，目前廣泛應(yīng)用的抗生素約80%是各種放線菌所產(chǎn)生的。

許多臨床應(yīng)用的抗生素均由土壤中分離的放線菌產(chǎn)生。采用選擇培養(yǎng)基可分離土壤中的放線菌。產(chǎn)抗生素的放線菌經(jīng)液體培養(yǎng)后，其分泌的抗生素存在于離心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，從而篩選到所需的抗生素產(chǎn)生菌，并對(duì)其進(jìn)一步培養(yǎng)，繁殖，發(fā)酵，最終提取我們所需的抗生素。實(shí)驗(yàn)器材：

1、土壤

2、培養(yǎng)基：高氏一號(hào)培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基

3、其他：重鉻酸鉀、培養(yǎng)皿、牛津杯、接種環(huán)、酒精燈，無(wú)菌涂棒、三角錐瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、試管、牛皮紙、線繩等。實(shí)驗(yàn)步驟：

一、土壤放線菌株的采集

采集樣品：選定取樣點(diǎn)（最好是有機(jī)質(zhì)含量高的菜地），按對(duì)角交叉（五點(diǎn)法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數(shù)次，然后取2～10cm處的土壤。將5點(diǎn)樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等。

樣品（土壤）處理：室溫風(fēng)干

二、土壤中放線菌的分離、培養(yǎng)

1、配制淀粉培養(yǎng)基

淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏培養(yǎng)基）

可溶性淀粉2g；硝酸鉀0.1g；磷酸氫二鉀0.05g；氯化鈉0.05g；硫酸鎂0.05g；硫酸亞鐵0.001g；瓊脂2g；水100ml.先把淀粉放在燒杯里，用5ml水調(diào)成糊狀后，倒入95ml水，攪勻后加入其他藥品，使它溶解。加熱到煮沸時(shí)加入瓊脂，不停攪拌，待瓊脂完全溶解后，補(bǔ)足失水。調(diào)整PH到7.2-7.4，分裝后滅菌，備用。

2、土壤懸液梯度稀釋

① 將5.0g土壤加入到50ml滅菌的生理鹽水中，震蕩10min制備土壤懸液。

② 用無(wú)菌吸管吸取1ml土壤懸液，加入到9ml滅菌的生理鹽水中10倍稀釋。

③ 按1：:1稀釋至10-

3、10-

4、10-5，將3塊滅菌平板分別標(biāo)記10-

3、10-

4、10-5，稀釋過(guò)程應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

3、將高氏一號(hào)培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55-60℃時(shí)，加入3%的重鉻酸鉀數(shù)滴（大約100ml加0.3ml），混合均勻。分別吸取0.1ml稀釋液于滅菌平皿中，再加入10-15ml恒溫于55℃的含有重鉻酸鉀的淀粉瓊脂培養(yǎng)基中，輕輕旋轉(zhuǎn)混合均勻。

4、平皿倒置于培養(yǎng)箱28℃恒溫培養(yǎng)一周左右。

5、將平皿上的放線菌菌落跳去在淀粉瓊脂平皿上四區(qū)劃線進(jìn)行分離純化，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右，觀察放線菌菌落特征。

6、將純化好的菌落轉(zhuǎn)入到斜面，4℃條件下進(jìn)行保存。

三、抗菌譜的測(cè)定

1、挑取一個(gè)放線菌的菌落接種到含有250ml淀粉液體培養(yǎng)基的三角瓶，28℃恒溫培養(yǎng)一周左右。

2、將2ml培養(yǎng)8h的大腸桿菌分別加到200ml滅菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中混合均勻，每培養(yǎng)皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培養(yǎng)皿中均勻放入4個(gè)牛津杯，每個(gè)牛津杯中加入1ml放線菌發(fā)酵培養(yǎng)液。培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)12h。

4、測(cè)量抑菌圈的大小。

四、發(fā)酵

1、配制種子培養(yǎng)基

蔗糖22.5g，黃豆粉12.5g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000ml，PH值7.2,121℃滅菌20min。

2、配制發(fā)酵培養(yǎng)基

蔗糖45g，黃豆粉25g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣3g，蒸餾水1000ml，PH7.2。121℃滅菌20min。

3、種子液的制備

將試管斜面菌種轉(zhuǎn)管活化，28℃培養(yǎng)7天后，以接種取一環(huán)孢子轉(zhuǎn)入裝有50ml種子培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-1 培養(yǎng)4天。

4、發(fā)酵培養(yǎng)

以6%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接入裝有50ml初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-

1培養(yǎng)4天。

5、活性檢測(cè)

發(fā)酵液經(jīng)4000r/ min-1 離心15min，取上清，杯碟法測(cè)定抗菌活性（同三）。

五、提取

1、發(fā)酵液經(jīng)4000r/ min-1 離心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例進(jìn)行萃取。

2、活性檢測(cè)

將萃取液濃縮，杯碟法測(cè)定抗菌活性（同三）。

第五篇：微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告

微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告

姓名：阿曼古麗

學(xué)號(hào)：09070401042

班級(jí)：生物科學(xué)08-班

微生物實(shí)驗(yàn)課程已經(jīng)接近尾聲，同時(shí)訓(xùn)練我們實(shí)際動(dòng)手能力的實(shí)驗(yàn)課程也已經(jīng)全部結(jié)束，通過(guò)自己切身動(dòng)手設(shè)計(jì)，操作實(shí)驗(yàn)，感到收獲頗多。

我覺得最重要的就是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作實(shí)驗(yàn)的重要性。實(shí)驗(yàn)操作可以說(shuō)是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵部分，可是馬虎不得。對(duì)于需要團(tuán)隊(duì)合作的實(shí)驗(yàn)，個(gè)人認(rèn)為要有強(qiáng)勢(shì)的人員搭檔，不說(shuō)是精通實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程，最少也得知道實(shí)驗(yàn)的基本操作，掌握要做實(shí)驗(yàn)的基本放法，這對(duì)于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)無(wú)疑是有決定性作用的。對(duì)于個(gè)人的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰ΓP(guān)鍵還是要看平時(shí)的實(shí)驗(yàn)積累，有些實(shí)驗(yàn)操作繁瑣復(fù)雜，需要極大的耐心，這些都應(yīng)該是逐漸培養(yǎng)起來(lái)的。

在這里我以學(xué)過(guò)的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)為例，簡(jiǎn)單談一下自己的心得體會(huì)。

（一）環(huán)境因素對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

溫度對(duì)微生物學(xué)報(bào)的大分子（蛋白質(zhì)、核酸等）穩(wěn)定性、酶的活性、細(xì)胞膜的流動(dòng)性和完整性等方面有重要的影響。過(guò)高溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)（酶）及核酸變性失活，細(xì)胞膜破壞等，而過(guò)低溫度會(huì)使酶活性受抑制，細(xì)胞新陳代謝活動(dòng)減弱

pH值過(guò)高或過(guò)低會(huì)使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶電荷發(fā)生變化，影響其生物活性，甚至導(dǎo)致變性失活，還可以引起細(xì)胞膜電荷變化，影響學(xué)報(bào)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時(shí)還會(huì)改變環(huán)境中物質(zhì)的可給性及有害物質(zhì)的毒性。紫外線誘導(dǎo)形成胸腺嘧啶二聚體和DNA交聯(lián)，從而抑制DNA的復(fù)制。此外，細(xì)菌具有光復(fù)合效應(yīng)。紫外線穿透力弱，加一張蠟光紙即可阻止其穿過(guò)。

在自然界中普遍存在微生物間的拮抗現(xiàn)象，許多微生物可以產(chǎn)生抗生素，能選擇性地抑制或殺死其他微生物。

常用化學(xué)消毒劑包括有機(jī)溶劑（酚、醇、醛等）、重金屬、鹵素元素及其化合物、染料和表面活性劑。有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)（酶）和核酸變性失活，破壞細(xì)胞膜；重金屬鹽也可使使蛋白質(zhì)（酶）和核酸變性失活，或與細(xì)胞代謝產(chǎn)物螯合使之變成無(wú)效化合物；碘與蛋白質(zhì)酪氨酸殘基不可逆結(jié)合而使蛋白質(zhì)失活；低濃度染料可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，革蘭氏陽(yáng)性菌比革蘭氏陰性菌對(duì)染料更加敏感。

影響微生物生長(zhǎng)的外界因素很多，其一是前面討論過(guò)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其二是許多物理、化學(xué)因素。當(dāng)環(huán)境條件的改變，在一定限度內(nèi)，可引起微生物形態(tài)、生理、生長(zhǎng)、繁殖等特征的改變；當(dāng)環(huán)境條件的變化超過(guò)一定極限時(shí)，則導(dǎo)致微生物的死亡。研究環(huán)境條件與微生物之間的相互關(guān)系，有助于了解微生物在自然界的分布與作用，也可指導(dǎo)人們?cè)谑称芳庸ぶ杏行У乜刂莆⑸锏纳顒?dòng)，保證食品的安全性，延長(zhǎng)食品的貨架期。

（二）革

蘭

氏

染

色

通過(guò)結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細(xì)胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時(shí)，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會(huì)出現(xiàn)縫隙，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

革蘭氏陰性菌，以[大腸桿菌]為代表。大腸桿菌為兼氣性菌種，一般生存於腸道中及厭氧的還境中。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的特徵為有一層out member 與陽(yáng)性菌種不同。目前對(duì)大腸桿菌的研究很多，除了它是一般食物中是否有被污染的指標(biāo)外，很多分子生物學(xué)方面的研究皆需要使用到大腸桿菌當(dāng)作實(shí)驗(yàn)宿主。

臨床應(yīng)用：用于革蘭氏細(xì)菌分類形態(tài)觀察前的染色。主要應(yīng)用于細(xì)菌分類和鑒定，革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。

適用范圍：適宜石蠟切片、涂片等染色。

（三）活菌計(jì)數(shù)

菌計(jì)數(shù)法

此法又稱活菌計(jì)數(shù)法，其原理是每個(gè)活細(xì)菌在適宜的培養(yǎng)基和良好的生長(zhǎng)條件下可以通過(guò)生長(zhǎng)形成菌落。將待測(cè)樣品經(jīng)一系列 10 倍稀釋，然后選擇三個(gè)稀釋度的菌液，分別取 0.2ml 放入無(wú)菌平皿，再倒入適量的已熔化并冷至 45 ℃ 左右的培養(yǎng)基，與菌液混勻，冷卻、待凝固后，放入適宜溫度的培養(yǎng)箱或溫室培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后，計(jì)數(shù)，按下面公式計(jì)算出原菌液的含菌數(shù)：

每毫升原菌液活菌數(shù)＝同一稀釋度三個(gè)以上重復(fù)平皿

菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)× 5

此法還可以將稀釋的菌液取 0.2m 1 加到已制備好的平板上，然后用無(wú)菌涂棒將菌液涂布整個(gè)平板表面，放入適宜溫度下培養(yǎng)，計(jì)算菌落數(shù)，再按上公式計(jì)算出每毫升原菌液的所含活菌總數(shù)。此法可因操作不熟練造成污染，或因培養(yǎng)基溫度過(guò)高損傷細(xì)胞等原因造成結(jié)果不穩(wěn)定。盡管如此，由于該方法能測(cè)出樣品中微量的菌數(shù)，仍是教學(xué)、科研和生產(chǎn)上常用的一種測(cè)定細(xì)菌數(shù)的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細(xì)菌、酵母、芽抱與抱子等的數(shù)量均可用此法測(cè)定。但不適于測(cè)定樣品中絲狀體微生物，例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍(lán)細(xì)菌等的營(yíng)養(yǎng)體等。

隨著微生態(tài)學(xué)的發(fā)展，微生態(tài)療法通過(guò)調(diào)整腸道菌群作為部分疾病的輔助治療已應(yīng)用于臨床。糞便標(biāo)本腸道菌群的定量檢測(cè)方法——平板活菌計(jì)數(shù)法能夠較好地判定其療效以及腸道菌群是否存在失調(diào)和失調(diào)的程度。此種方法計(jì)數(shù)的線性范圍大，能較好的反映菌落的疏密程度。重復(fù)性、平行性好，但操作較繁瑣，且測(cè)定值常受各種因素的影響，需要操作者有熟練的技術(shù)。

在同學(xué)們的相互配合和老師的耐心指導(dǎo)下，這門實(shí)驗(yàn)課也接近了尾聲，在這一學(xué)的這門實(shí)驗(yàn)課中我也學(xué)到了很多的實(shí)驗(yàn)室知識(shí)。為了保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程高質(zhì)高量完成，除了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備及實(shí)驗(yàn)過(guò)程外，還要求實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員必須具備相應(yīng)的素質(zhì)，實(shí)驗(yàn)操作人員必須具備較扎實(shí)的專業(yè)基礎(chǔ)、熟練的實(shí)驗(yàn)技能及高度的責(zé)任心，在工作中要善于總結(jié)，同時(shí)一定要和老師積極溝通，不懂得地方及時(shí)向他請(qǐng)教，在以后的學(xué)習(xí)和工作中，我會(huì)繼續(xù)保持這種態(tài)度，認(rèn)真完成老師交給的各項(xiàng)任務(wù)。