第一篇：醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)資料總結(jié)doc（精選）

醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)資料小結(jié)

1、質(zhì)?！羌?xì)菌細(xì)胞內(nèi)攜帶的染色體外的DNA分子，是共價閉合的環(huán)狀DNA分子，能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制。質(zhì)粒只有在宿主細(xì)胞內(nèi)才能夠完成自己的復(fù)制。

2、基因——指貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列及表達(dá)這些信息所需的全部核苷酸序列，是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位。

3、癌基因——是細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長和分化的基因，具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的特性，它的結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常，可以引起細(xì)胞癌變。

4、基因克隆——是指把一個生物體的遺傳信息（基因片段）轉(zhuǎn)入另一個生物體內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，得到一群完全相同的基因片段，又稱DNA克隆。

5、抑癌基因——是指存在于正常細(xì)胞內(nèi)的一大類可抑制細(xì)胞生長并具有潛在抑癌作用的基因，當(dāng)這類基因在發(fā)生突變、缺失或失活時可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

6、基因診斷——是以DNA和RNA為診斷材料，通過檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。

7、管家基因——是在生命過程都是必需的，是在一個生物個體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的基因，它較少受環(huán)境因素的影響，其表達(dá)方式為組成性基因表達(dá)。

8、klenow片段——亦稱DNA聚合酶1大片段，為DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶裂解后產(chǎn)生的大片段，它除了保留5′→3′聚合酶活性及3′→5′外切酶活性外，失去了5′→3′外切酶活性，它具有的3′→5′外切酶活性能保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性，把DNA合成過程中錯誤配對的堿基去除，再把正確的核苷酸接上去。

9、核蛋白體——系tRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合生成的一種復(fù)合體，是蛋白質(zhì)生物合成的場所。

10、限制性內(nèi)切核酸酶——能識別DNA的特異序列，并在識別位點(diǎn)或其附近切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切核酸酶，是基因克隆中最重要的工具酶，通常所說的限制酶是指2型酶。主要從原核細(xì)胞中提取，大多數(shù)限制性內(nèi)切酶是錯位切割雙鏈DNA，產(chǎn)生粘性末端，部分酶則沿對稱軸切割DNA而產(chǎn)生平端。

11、Tm值——DNA變性是在一個相當(dāng)窄的溫度范圍內(nèi)完成的，在這一范圍內(nèi)，紫外吸收值達(dá)到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度（Tm），其大小與G+C含量成正比?；?雙鏈DNA變性一半所需要的溫度叫DNA的融解溫度.12、DNA的甲基化——是指DNA的一級結(jié)構(gòu)中，有一些堿基可以通過加上一個甲基而被修飾，其作用是對自身DNA產(chǎn)生保護(hù)作用。

13、原位雜交——是核酸保持在細(xì)胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理細(xì)胞或組織后，將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交的方法。

14、DNA微陳列——系直接將大量DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面所組成的微陳列（基因芯片）稱為DNA微陳列。.15、順序作用元件——是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)，能被基因調(diào)控蛋白異性識別和結(jié)合的DNA序列,抱括啟動子.上游啟動子元件.增強(qiáng)子.加尾信號和一些反應(yīng)元件。

16．轉(zhuǎn)位因子—是指能夠在一個DNA分子內(nèi)或2個DNA分子之間移動的DNA片段。

17、基因治療--是指通過在特定靶細(xì)胞中表達(dá)該細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，或采用特定方式關(guān)閉和抑制異常表達(dá)基因，達(dá)到治療疾病目的的治療方法。

二、綜合內(nèi)容

1、DNA的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及特點(diǎn)

①一級結(jié)構(gòu)是指DNA分子中核苷酸的排列順序，二級結(jié)構(gòu)是指兩條DNA單鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)、三股螺旋結(jié)構(gòu)和四股螺旋結(jié)構(gòu)；三級結(jié)構(gòu)是指雙鏈DNA進(jìn)一步扭曲盤旋形成的超螺旋結(jié)構(gòu)。②DNA一級結(jié)構(gòu)的基本特點(diǎn)：4種脫氧核糖核苷酸以3′，5′—磷酸二酯鍵相連，形成長鏈，鏈中的脫氧核糖和磷酸都是相同的。組成DNA的堿基有腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。③DNA是由兩條單鏈結(jié)合在一起形成的雙鏈分子，兩條單鏈都是由A、T、G、C以千變?nèi)f化的排列組合而形成的。大多數(shù)生物的遺傳信息都是儲存在DNA分子中。④DNA分子主要攜帶兩類遺傳信息，即有功能活性的DNA序列所攜帶的信息和調(diào)控信息。⑤DNA二級結(jié)構(gòu)是指DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，其特點(diǎn)為：脫氧核糖與磷酸交替排列構(gòu)成了DNA主鏈；兩條脫氧核苷酸鏈?zhǔn)欠聪蚱叫信帕?，一條是5′→3′方向，另一條為3′→5′方向；以右手方向盤繞成雙螺旋構(gòu)型；A配T，G配C。⑥生物體的閉環(huán)DNA都以超螺旋形式存在，如細(xì)菌質(zhì)粒、一些病毒、線粒體的DNA等。

2、RNA的結(jié)構(gòu)、功能、特點(diǎn)

①由4種基本的核苷酸以3′，5′-磷酸二酯鍵連接而成的長鏈，堿基中沒有T，而為尿嘧啶（U）。②分為mRNA（信使RNA），tRNA（轉(zhuǎn)RNA，轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸）和核蛋白體RNA（rRNA）。mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：不穩(wěn)定、代謝活躍，更新迅速，壽命短。原核生物mRNA具有操縱子結(jié)構(gòu)，主要是多順反子，mRNA5′端無帽子結(jié)構(gòu)，3′端一般無多聚A尾巴，沒有修飾堿基；真核mRNA5′端有帽子結(jié)構(gòu)、3′端大多有多聚腺苷酸尾巴、分子中可能有修飾堿基，主要有甲基化、有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。tRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及作用：作用：在蛋白質(zhì)合成過程轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸，參與蛋白質(zhì)的翻譯。一級結(jié)構(gòu)含有稀有堿基如DHU，3′端為3個同樣的核苷酸序列（CCA）序列，此序列是tRNA結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)安基酸而生成氨酰tRNA所必需的。5′端為G、具有TΨC；二級結(jié)構(gòu)為三葉草形，三級結(jié)構(gòu)為倒L形； C、rRNA即核蛋白體RNA：為細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的RNA，約占細(xì)胞總RNA的80%以上,參與組成核蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場所。原核生物核糖體的沉降系數(shù)為70S，由50S和30S兩個大小亞基組成，30S小亞基含16SrRNA和21種蛋白質(zhì),50S大亞基含23S和5SrRNA以及34種蛋白質(zhì)；真核生物細(xì)胞核糖體的沉降系數(shù)為80S，由大小亞基組成，40S小亞基含18SrRNA及30多種蛋白質(zhì)，60S大亞基含3種rRNA(28S.5.8S.5S)以及大約45種蛋白質(zhì)。④hnRNA即核內(nèi)不均-RNA，為真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA前體。⑤SnRNA即小分子核內(nèi)RNA，不單獨(dú)存在，常與多種特異的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，形成小分子核內(nèi)核蛋白顆粒，在mRNA的剪接中起重要作用。⑥反義RNA，又稱調(diào)節(jié)RNA，主要封閉RNA。

3、參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸在特異的氨基酰tRNA合成酶催化下，與其相應(yīng)的tRNA結(jié)合成氨基酰—tRNA。真核生物起始tRNA結(jié)合的氨基酸為蛋氨酸，結(jié)合形成Met-tRNAimet，翻譯起始時首先與40S核糖體小亞基結(jié)合形成復(fù)合物。原核生物的起始氨基酸為甲?；鞍彼幔Y(jié)合形成fMet-tRNAffmet。導(dǎo)致DNA變性的常用方法有熱變性、堿變性和化學(xué)試劑變性。DNA變性的結(jié)果：粘性降低，密度增加，A260紫外吸收值增加。

4、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能特點(diǎn)

①蛋白質(zhì)又稱為“功能分子”，根據(jù)功能分為結(jié)構(gòu)蛋白、活性蛋白和信息蛋白。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸排列的順序。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可以使蛋白質(zhì)的功能發(fā)生改變，嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。②因基因突變而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)改變后表現(xiàn)出生理功能的異常，使機(jī)體出現(xiàn)病態(tài)現(xiàn)象，稱為分子病。③蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)單元（形式）有a-螺旋、β-折疊、-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲。④一級結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵是肽鍵及二硫鍵；二級結(jié)構(gòu)主要化學(xué)鍵為氫鍵；三級結(jié)構(gòu)的主要靠疏水作用、離子鍵、氫鍵和范得華力等；四級結(jié)構(gòu)的結(jié)合力主要是疏水作用、氫鍵和離子鍵。

5、端粒的主要特點(diǎn)和功能：特點(diǎn)為：位于真核生物染色體末端、端粒酶催化端粒DNA延長、在決定細(xì)胞壽命中起重要作用、含短的高度重復(fù)序列。其主要功能有：保護(hù)線性DNA的完整復(fù)制、保護(hù)染色體末端、決定細(xì) 2 胞的壽命。

6、DNA聚合酶（DNApol）

①作用是催化DNA合成，其活性需要Mg2+的存在。大腸桿菌DNA聚合酶有I-II、II3種（即原核生物DNA聚合酶）。②DNApolI的功能有：a、聚合作用，使DNA鏈沿5′→3′方向延伸，b、3′→5′外切酶活性，即能從DNA鏈3′端開始沿3′→5′進(jìn)行水解反應(yīng)，產(chǎn)生5′單核苷酸，糾正復(fù)制過程中的錯誤，保證DNA復(fù)制的正確性，因而具有校對功能；C、5′→3′外切酶活性，參與RNA生物的切除、填補(bǔ)岡崎片段間的空隙以及DNA損傷的修復(fù)。③DNApolII：具有5′→3′DNA聚合酶活性及3′→5′外切核酸酶活性，可能參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。④DNApolII：α亞基具有催化合成DNA的功能；ε亞基具有3′→5′外切酶活性及編輯和校對功能，θ則為裝配所必需，是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。DNA聚合酶的共同性質(zhì)是：需要DNA模板；RNA或DNA作為引物；ATP與Mg2+的參與；以dNTP作底物；DNA合成的方向是5′→3′。反應(yīng)特點(diǎn)：新生鏈的延伸方向?yàn)?'→3'；半保留方式合成子代DNA雙鏈；反應(yīng)需要DNA引物。共同具有的酶活性：5'→3'聚合酶活性；3'→5'核酸外切酶活性。

7、RNA聚合酶

①RNA聚合酶也稱依賴DNA的RNA聚合酶，能以DNA為模板，四種核苷三磷酸為底物，按照堿基配對原則，從5′→3′方向延長RNA鏈。②原核生物的RNA聚合酶只有一種，是由四種亞基α2ββ'σ組成的五聚體蛋白質(zhì)，稱為全酶。去掉σ亞基后，剩下的α2ββ’稱為核心酶。活細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄起始，需要全酶；而核心酶負(fù)責(zé)催化RNA鏈的延伸。③真核生物RNA聚合酶有三種，即RNA聚合酶I、II、III。RNA聚合酶I定位在核仁，主要轉(zhuǎn)錄5.8S、18S、28S-rRNA基因；酶II定位在核漿，主要轉(zhuǎn)錄編碼蛋白質(zhì)的基因，即主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA；酶III定位在核漿，主要轉(zhuǎn)錄tRNA和5S-rRNA基因。④RNA聚合酶催化聚合反應(yīng)時需要有Mg或Mn的存在，無3’→5’外切酶海性，無校對功能。

8、密碼子分為起始密碼和終止密碼，起始密碼為AUG，終止密碼為UAA、UAG和UGA，共有64種不同的密碼?？勺鳛樵松锲鹗济艽a的是：AUG.GUG.UUG。

9、遺傳密碼具有以下特點(diǎn)：

A、連續(xù)性：兩個密碼子之間沒有任何核苷酸加以分隔，即密碼是無標(biāo)點(diǎn)的。B、方向性：mRNA中密碼子的排列是有方向性的，即起始密碼子總是位于編碼區(qū)5’末端，而終止密碼子位于3’末端。每個密碼子的三個核苷酸也是5’→3’方向閱讀，不能倒讀。C、簡并性：是指遺傳密碼中除色氨酸和甲硫氨酸僅有一個密碼子外，其余氨基酸有2～6個密碼子為其編碼。D、通用性：從最簡單的病毒、原核生物、直至人類，都使用同一套遺傳密碼。E、擺動性：翻譯過程中，氨基酸的正確加入，要靠mRNA上的密碼子與tRNA上的反密碼子相辯認(rèn)。密碼子與反密碼子配對辯認(rèn)時，有時不完全遵守堿基互補(bǔ)規(guī)律，即使不嚴(yán)格互補(bǔ)也能辯認(rèn)配對，這種現(xiàn)象稱為擺動。

10、轉(zhuǎn)錄的過程及特點(diǎn)

①轉(zhuǎn)錄是以DNA為模板，以4種NTP為原料，依堿基配對規(guī)律，在DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶催化下合成RNA的過程，其過程包括：起始、延長和終止三個階段。②轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)：A、對于一個基因組來說，轉(zhuǎn)錄只發(fā)生在一部分基因，而且每個基因的轉(zhuǎn)錄都受到相對獨(dú)立的控制。B、轉(zhuǎn)錄是不對稱的。C、轉(zhuǎn)錄時不需要引物，而且RNA鏈的合成是連續(xù)的。D、轉(zhuǎn)錄的單向性，即RNA生物合成時，只能向一個方向進(jìn)行聚合，所依賴的模板DNA鏈的方向?yàn)?’→5’，而RNA鏈的合成方向?yàn)?’→3’。E、有特定的起始和終止位點(diǎn)。參與轉(zhuǎn)錄終止的因素為ρ因子或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'端發(fā)夾結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn):AATAAA+GT序列。

11、原核生物DNA復(fù)制的過程及特點(diǎn)

①復(fù)制過程包括：起始（復(fù)制起始位點(diǎn)識別、解螺旋酶解開DNA雙鏈，引發(fā)體合成RNA引物）延伸（DNA聚合2+

2+ 3 酶催化聚合反應(yīng)，連續(xù)合成前導(dǎo)鏈，不連續(xù)合成隨從鏈）。終止（RNA引物去除、岡崎片段連接、在特殊的終止結(jié)構(gòu)區(qū)域停止）。②復(fù)制的共同特點(diǎn)為：半保留復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制、聚合反應(yīng)都需要模板、底物、DNA聚合酶及其它酶和蛋白質(zhì)。

12、真核生物染色體DNA復(fù)制的特點(diǎn)：（原核相反）

①復(fù)制起始點(diǎn)為多個；②復(fù)制叉移動速度慢；③復(fù)制方向大多數(shù)為雙向；④RNA引物短；⑤岡崎片段短，⑥不可連續(xù)復(fù)制

13、翻譯的主要過程及特點(diǎn)

①起始：形成翻譯起始復(fù)合物②延長：指每加一個氨基酸經(jīng)過進(jìn)位、成肽和轉(zhuǎn)位，使肽鏈從N端向C端延長。③終止（當(dāng)mRNA分子中的終止密碼子出現(xiàn)后，多肽鏈合成停止，肽鏈從肽酰-tRNA中釋出，mRNA、核蛋白體等分離）。蛋白制合成是一個耗能過程，每生成一個肽鍵，要消耗2個高能磷酸鍵，氨基酸活化要消耗2個高能磷酸鍵，整個過程可能多于4個高能磷酸鍵。

14、原核生物mRNA的加工：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA分子不需加工。tRNA結(jié)構(gòu)基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要加工，才能成為具有生物功能的成熟分子。tRNA前體的加工包括剪切作用（切除多余核苷酸）、添加和修復(fù)3'端CCA序列，某些堿基的化學(xué)修飾（成熟tRNA分子中有稀有堿基）。

15、翻譯后的加工修飾：

①加工包括：A、去掉N-甲?；-蛋氨酸或N端序列。B、個別氨基酸的修飾（羥化、磷酸化形成-S-S-等）。C、多蛋白水解修飾，D、分子伴侶，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，肽-脯氨酰順反異構(gòu)酶輔助折疊成空間構(gòu)象。E、亞基聚合，F(xiàn)、輔基的結(jié)合（糖基化等）。其中A、B、C屬一級結(jié)構(gòu)修飾，D、E、F屬空間結(jié)構(gòu)修飾。②多肽鏈形成后，氨基酸殘基可進(jìn)行多種共價修飾，包括；磷酸化，羥基化，ADP-核糖基化，形成胱氨酸及乙酰化。③翻譯過程涉及多種分子之間的相互作用，可以歸納為：RNA-蛋白質(zhì)相互作用，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及RNA-RNA相互作用。④參與翻譯終止的蛋白質(zhì)因子包括：RF、PR、IF。⑤廣義的核蛋白體循環(huán)包括：翻譯起始，進(jìn)位，成肽，轉(zhuǎn)位和翻譯終止。

16、真核生物mRNA的加工包括：

①5′端加帽（由加帽酶催化5′端加入7-甲苷烏苷酸，形成帽子結(jié)構(gòu)mGpppmNP-）。②3′端加入Poly(A)尾（A、組蛋白的成熟mRNA無需加polyA尾；B、加尾信號包括AAUAAA和富含GU的序列；C、加尾不需模板；D剪切過程需要多種蛋白質(zhì)因子的輔助）。③mRNA前體的剪接（剪接加工以除去內(nèi)含子序列，并將外顯子序列連接成為成熟的有功能的mRNA分子。內(nèi)含子兩端的結(jié)構(gòu)通常是5′-GU??AG-3′。選擇性剪接的作用機(jī)制包括；A使用不同的剪接位點(diǎn)，B選擇使用外顯子，C、反式剪接，D、使用不同的啟動子，E、使用不同的多腺苷酸化位點(diǎn)）。④RNA的編輯（發(fā)生于轉(zhuǎn)錄后水平，改編mRNA序列，C→U或A→G，增加遺傳信息容量）。

17、基因表達(dá)是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過程，合成特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過程。但并非所有基因表達(dá)過程都產(chǎn)生蛋白質(zhì)，tRNA、rRNA編碼基因轉(zhuǎn)錄生成RNA的過程也屬于基因表達(dá)?；虮磉_(dá)受到多級水平的調(diào)控，具有階段特異性（時間特異性）和組織特異性（空間特異性）?；虮磉_(dá)分為幾個階段：基因活化、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工等、產(chǎn)物是RNA和有功能的蛋白質(zhì)。

18、原核生物基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)，主要在轉(zhuǎn)錄水平，其次是翻譯水平。原核生物基因多以操縱子的形式存在，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控涉及到啟動子、σ因子（能與RNA聚合酶結(jié)合）、阻遏蛋白(負(fù)調(diào)控)、正調(diào)控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰減子等多種因素。而翻譯水平的調(diào)控涉及到SD序列（位于AUG前）、mRNA的穩(wěn)定性（不穩(wěn)定，其5′端和3′端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可保護(hù)其不被酶水解，mRNA的5′端與核糖體結(jié)合，可明顯提高其穩(wěn)定性）、翻譯產(chǎn)物及小分子RNA的調(diào)控作用。4

19、真核生物基因表達(dá)的調(diào)控環(huán)節(jié)較多，在DNA水平可通過染色體丟失，基因擴(kuò)增、基因重排、DNA甲基化以及染色體結(jié)構(gòu)改變影響基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平則主要通過反式作用因子的作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與TATA盒的結(jié)合、RNA聚合酶與轉(zhuǎn)錄因子-DNA復(fù)合物的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成；在轉(zhuǎn)錄后水平主要通過RNA修飾、剪接及mRNA運(yùn)輸?shù)目刂苼碛绊懟虮磉_(dá)；影響翻譯水平的因素有影響起始翻譯的阻遏蛋白、5′AUG、5′端非編碼區(qū)的長度、mRNA的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)及小分子RNA等。真核基因調(diào)控中最重要的環(huán)節(jié)是基因轉(zhuǎn)錄，真核生物基因表達(dá)需要轉(zhuǎn)錄因子、啟動子、沉默子和增強(qiáng)子。

20、反式作用因子：指能直接或間接辨認(rèn)和結(jié)合轉(zhuǎn)錄上游區(qū)段DNA的蛋白質(zhì)，其主要特點(diǎn)包括三個功能結(jié)構(gòu)域（DNA識別結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄活性域、結(jié)合其它蛋白的結(jié)合域）、能識別并結(jié)合上游調(diào)控區(qū)的順式作用元件、對基因表達(dá)有正性和負(fù)性調(diào)控作用。其活性調(diào)節(jié)方式：表達(dá)式調(diào)節(jié)，共價修飾，配體結(jié)合及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。作用方式:成環(huán)、扭曲、滑動、Oozing。DNA結(jié)構(gòu)域包括：鋅指、螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋、亮氨酸拉鏈和螺旋—環(huán)—螺旋。轉(zhuǎn)錄激活域富含：酸性氨基酸、脯氨酸和谷氨酰胺。

21、參與DNA復(fù)制（合成）的物質(zhì)包括：

①模板（解開成單鏈的DNA母鏈）。②引物（提供3’—OH未端使dNTP可以依次聚合）。③底物（dATP，dGTP，dCTP和dTTP）。④聚合酶（依賴DNA的DNA聚合酶（DNA—pol））。⑤其它的酶和蛋白質(zhì)因子。DNA復(fù)制的基本過程包括：①DNA雙鏈解開，②RNA引物的合成，③DNA鏈的延長，④切除引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰DNA片段，⑤切除和修復(fù)錯配堿基。

22、結(jié)構(gòu)基因突變的類型包括點(diǎn)突變、缺失、插入和倒位四類，遺傳密碼的改變分為錯義突變、無義突變、同義突變和移碼突變。

23、癌基因惡性激活的機(jī)制包括：①原癌基因點(diǎn)突變，②原癌基因獲得外源啟動子而激活，③原癌基因因甲基化程度降低而激活，④基因易位或重排使原癌基因激活。

24、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是基因治療中最常用的載體。造血肝細(xì)胞是基因治療中最重要的靶細(xì)胞，禁用生殖細(xì)胞?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)(基因治療技術(shù))包括生物學(xué)方法和非生物學(xué)方法:生物學(xué)方法有:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體.腺病毒載體.腺相關(guān)病毒載體.單純皰疹病毒載體;非生物學(xué)方法有：脂質(zhì)體、直接注射、受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)、DNA—磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、顯微注射、顆粒轟擊。

25、DNA甲基化的一個特點(diǎn)是它們經(jīng)過細(xì)胞許多代分裂之后仍保持穩(wěn)定。在真核生物DNA中，幾乎所有甲基化均發(fā)生于二核苷酸序列5’—mCG—3’上。

26、一個基因所包括的序列有：編碼蛋白質(zhì)肽鏈或RNA的核酸序列、保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列、位于編碼區(qū)5’端上游的非編碼序列、內(nèi)含子、位于編碼區(qū)3'端下游的非編碼序列。

27、啟動子是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列,啟動子具有方向性，真核生物的啟動子必須與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，才能被DNA聚合酶識別和結(jié)合，真核生物的啟動子元件是TATA蓋,TATA盒的核心序列是TATA(A/T)A(A/T)，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游—25bp處,啟動子決定轉(zhuǎn)錄方向.模板鏈及轉(zhuǎn)錄效率。上游啟動子元件包括：CAAT盒，CACA盒和GC盒。

28、逆轉(zhuǎn)錄：是指以RNA為模板，利用宿主細(xì)胞中4種dNTP為原料，在引物的3'端以5'→3'方向合成與RNA互補(bǔ)的DNA鏈的過程，此過程與中心法則方向相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄。

29、原癌基因產(chǎn)物的類型及細(xì)胞定位

①生長因子及其類似物，由細(xì)胞分泌，如C-sis家族（sis編碼血小板源生長因子，表達(dá)產(chǎn)物與PDGF鏈結(jié)構(gòu)同源）。②跨膜生長因子受體型的酪氨酸蛋白激酶，如erb-B,表皮細(xì)胞生長因子（EGF）受體；fims,巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體；定位于質(zhì)膜。③細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子，定位于胞夜,包括A、低分子量G蛋白，如H-ras等 5 基因表達(dá)產(chǎn)物；B、胞內(nèi)蛋白激酶（包括與膜結(jié)合的蛋白酪氨酸激酶和胞漿絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶），如src、abl。④核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子：如myc、fos等，定位于細(xì)胞核內(nèi)。⑤胞漿調(diào)節(jié)蛋白，如crk的產(chǎn)物是存在于胞漿中的調(diào)節(jié)蛋白，定位于胞漿。⑥可溶性蛋白酪氨酸激酶受體和非蛋白激酶受。30、細(xì)胞周期的主要調(diào)控點(diǎn)

細(xì)胞周期的運(yùn)行受多種因素所調(diào)控，有2個主要調(diào)控點(diǎn)，亦稱為檢測點(diǎn)。①G1/S期檢測點(diǎn)：在酵母中稱起點(diǎn)，在哺乳細(xì)胞中稱限制點(diǎn),是控制細(xì)胞進(jìn)入S期檢測點(diǎn)（G1期檢測點(diǎn)）,cyclinB與CDK4和CDK6結(jié)合，cyclinE與CDK2，CDK3結(jié)合，通過磷酸化使它們活化。cyclin-CDK復(fù)合物可使Rb蛋白磷酸化，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)DNA復(fù)制相關(guān)基因的表達(dá)。CDK2也可和cyclinA、cyclinA1結(jié)合，促進(jìn)早S期DNA合成的起始。②G2/M期檢測點(diǎn)：是控制細(xì)胞進(jìn)入M期檢測點(diǎn)（G2期檢測點(diǎn)），促有絲分裂因子（MPF）由cyclinB和CDK1組成，是啟動有絲分裂的關(guān)鍵因子。細(xì)胞何時進(jìn)入M期取決于Cdc2的磷酸化狀態(tài)。

31、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的基本方法：

①磷酸鈣沉淀法。②電穿孔法。③脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因?qū)敕?。④DEAE-葡聚糖法。⑤顯微注射法。

32、DNA損傷的主要類型

①堿基和糖基破壞②錯配③DNA鏈斷裂：電離輻射致DNA損傷的主要形式④DNA變聯(lián)。上述DNA損傷可導(dǎo)致DNA模板發(fā)生堿基的置換、插入、缺失、鏈的斷裂，并可影響到染色體的高級結(jié)構(gòu)。DNA鏈中一種嘌呤被另一種嘌呤取代，或嘧啶被另一種嘧啶所取代，稱為轉(zhuǎn)換；嘌呤被嘧呤取代，或反之，稱為顛換；轉(zhuǎn)換和顛換在DNA復(fù)制時可引起堿基錯配，導(dǎo)致基因突變；堿基的插入和缺失可引起移碼突變。

33、DNA修復(fù)機(jī)制的主要類型

①光修復(fù)；②切除修復(fù)；③重組修復(fù)；④SOS修復(fù)；⑤錯配修復(fù)。

34、基因文庫篩選的主要方法及原理

(1)根據(jù)抗藥性標(biāo)志篩選：對于帶有某種抗藥性標(biāo)志基因，只有轉(zhuǎn)化成功的受體菌才可能在含該抗生素的培養(yǎng)基中生存并形成菌落；而沒有轉(zhuǎn)化成功的受體菌，不能在培養(yǎng)基中生長，以此可選擇陽性菌。(2)根據(jù)菌落的呈色反應(yīng)篩選（互補(bǔ)、藍(lán)-白篩選）：根椐菌落的顏色并結(jié)合插入片段的序列測定篩選。(3)營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記法:(4)核酸分子雜交法：即采用與目的基因部分互補(bǔ)的DNA片段作為探針，與含有重組體的細(xì)菌菌落進(jìn)行雜交，以確定重組體中帶目的基因。包括原位雜交和southern印跡雜交。（5）遺傳互補(bǔ)法：載體上的營養(yǎng)代謝標(biāo)記可以對宿主細(xì)胞的營養(yǎng)代謝缺陷進(jìn)行互補(bǔ)，以此作為篩選重組體的標(biāo)記。（6）免疫學(xué)方法：如果克隆基因的產(chǎn)物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表達(dá)，因而可以用相應(yīng)的抗血清或單克隆抗體，通過放射免疫、化學(xué)發(fā)光或顯色反應(yīng)進(jìn)行篩選。

35、PCR的主要步驟及引物設(shè)計的基本要求

①PCR的主要步驟：PCR又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是在體外進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)過程。其基本過程包括：A、雙鏈DNA模板加熱變性成單鏈(變性),溫度95度左右。B、在低溫下引物與單鏈DNA互補(bǔ)配對(退火),85-90度。C、延伸：在四種DNTP底物及Mg存在條件下，TaqDNA聚合酶在最適作用溫度（70~75℃）下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，從特異結(jié)合到DNA模板上的引物3′-OH端開始摻入單核苷酸，合成新的DNA分子。②引物設(shè)計的基本要求：A、引物長度一般為15~30個核苷酸。B、引物中的堿基組成盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象，尤其在3′端避免連續(xù)3個G或C。C、引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物自身存在的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過3bp。D、兩個引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊。E、引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列。F、引物與模板結(jié)合時，引物的5′端可以修飾。2+ 6

36、乳糖操縱子的正、負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制

乳糖操縱子包含3個結(jié)構(gòu)基因Z.Y.A（編碼β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷通透酶和轉(zhuǎn)乙?；福?、3個調(diào)控元件（啟動子、操縱基因和CAP結(jié)合位點(diǎn)）和1個調(diào)節(jié)基因（編碼阻遏蛋白）。乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄起始是由CAP和阻遏蛋白兩種調(diào)控因子來調(diào)控的。（1）阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控：無乳糖時，阻遏蛋白結(jié)合操縱基因，妨礙RNA聚合酶結(jié)合啟動子，從而抑制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。有乳糖時，生成半乳糖（誘導(dǎo)劑）結(jié)合阻遏蛋白，使阻遏蛋白構(gòu)象改變，變構(gòu)的阻遏蛋白不能與操縱序列結(jié)合，阻遏機(jī)制解除，結(jié)構(gòu)基因可以轉(zhuǎn)錄，基因得以表達(dá)。③cAMP-CAP復(fù)合物的正調(diào)控:無葡萄糖時，cAMP濃度高，形成的cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合于CAP結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)下游基因得以表達(dá)；有葡萄糖時，cAMP濃度低，cAMP-CAP復(fù)合物形成受阻，影響轉(zhuǎn)錄活性。④正、負(fù)調(diào)控機(jī)制相輔相成：cAMP-CAP復(fù)合物是轉(zhuǎn)錄必需的，同時阻遏蛋白進(jìn)一步控制轉(zhuǎn)錄啟動。綜上，乳糖操縱子最強(qiáng)的表達(dá)條件是有乳糖而無葡萄糖。

37、雙脫氧末端終止法DNA測序的主要步驟：雙脫氧末端終止法是以單鏈或雙鏈DNA為模板，采用DNA引物引導(dǎo)新生DNA的合成，又稱為引物合成法，或酶促引物合成法。其主要步驟為：①制備單鏈模板。②模板與測序引物結(jié)合。③摻入法標(biāo)記反應(yīng)。④延伸-終止反應(yīng)。⑤變性膠電泳。⑥放射自顯影。⑦閱讀測序結(jié)果。

38、常用的分子生物學(xué)技術(shù)的原理、過程及特點(diǎn)

①核酸分子雜交技術(shù)：基本原理是：具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，重新形成雙鏈；在這一過程中，核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化，以及復(fù)性過程中各分子間鍵的形成和斷裂等。特點(diǎn)：直接檢測血清中病毒基因組，無須擴(kuò)增，靈敏度較PCR低。在雜交體系中已知的核酸序列稱作探針。②聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：PCR的原理是根據(jù)待測DNA片段兩端的核苷酸序列，設(shè)計并人工合成兩個分別與DNA片段兩端互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物，在有過量的引物、過量的底物（4種dNTP）、DNA聚合酶以及模板（待擴(kuò)增片段的DNA分子）的反應(yīng)體系中，經(jīng)過高溫變性（使DNA鏈解開）、低溫退火（使引物與模板結(jié)合）和適溫延伸（新合成的DNA片段）三個階段的循環(huán)周期，對DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增。特點(diǎn):極強(qiáng)的擴(kuò)增能力,度高靈敏性,高度特異性，只需微量模板,只需數(shù)小時,擴(kuò)增產(chǎn)物量大,變性.復(fù)性.延伸三個步聚循環(huán)進(jìn)行,操作簡便，適用廣泛，但可出現(xiàn)假陽性.③DNA序列測定：DNA序列測定是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的，包括Sanger雙脫氧鏈末端終止法和化學(xué)降解法。Sanger法的基本原理是：雙脫氧核苷酸（ddNTP）在DNA合成過程中代替相應(yīng)的脫氧核苷酸（dNTP）作為底物，不能形成3′，5′-磷酸二酯鍵而導(dǎo)致鏈延伸終止?；瘜W(xué)降解法：是采用化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的DNA單鏈片段，造成堿基特異性切割，由此產(chǎn)生一組具有不同長度的DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳按分子大小分離和放射自顯影，直接讀出待測DNA的核苷酸順序。

④DNA芯片技術(shù)：DNA芯片技術(shù)是一種大規(guī)模集成的固相核酸分子雜交，以大量已知堿基序列的寡核苷酸片段為探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補(bǔ)，然后通過定性、定量分析得出待測樣品的基因序列及表達(dá)的信息。DNA芯片的主要技術(shù)流程包括：芯片的設(shè)計與制備、靶基因的標(biāo)記（常用熒光色素.生物素或放射性核素標(biāo)記dNTP）、芯片雜交與雜交信號檢測。特點(diǎn)：高通量.鑒別診斷。酶：DNA聚合酶。所需探針：合成的寡核苷酸片段，cDNA，已克隆的基因片段，雙鏈或單鏈DNA或RNA，肽核酸。

⑤基因克隆技術(shù)（重組DNA技術(shù)）：基因克隆是指某種目的基因的擴(kuò)增與分離過程，具體是從基因組或DNA大片段中分離并獲得某一特定的基因或DNA片段，再通過DNA序列擴(kuò)增形成由眾多拷貝組成的DNA拷貝群體的過程。其基本過程為：A-目的基因的制備；栽體的選擇與制備；B-DNA分子的體外連接；C-將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞；D-目的基因的篩選與鑒定；E-DNA重組體的擴(kuò)增與表達(dá)

39、原核生物與真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控的特點(diǎn)比較：

①兩者均涉及RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（啟動子等）的相互作用。②真核需要多種轉(zhuǎn)錄因子輔助、原核不需要。③真核以正調(diào)控為主，原核以負(fù)調(diào)控為主。④真核3種RNA聚合酶負(fù)責(zé)不同種類基因的轉(zhuǎn)錄，原核只有1種RNA聚合酶。

40、原核生物和真核生基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)的比較。

①相同點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)②不同點(diǎn)：A、原核基因表達(dá)調(diào)控主要包括轉(zhuǎn)錄和翻譯水平；真核基因表達(dá)調(diào)控主要包括染色質(zhì)活化、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工多個層次。B、原核基因表達(dá)調(diào)控主要為負(fù)調(diào)節(jié)，真核主要為正調(diào)節(jié)。C、原核轉(zhuǎn)錄起始不需要轉(zhuǎn)錄因子，RNA聚合酶直接結(jié)合啟動子，由σ因子決定基因表達(dá)的特異性；真核轉(zhuǎn)錄起始需要基礎(chǔ)、特異兩類轉(zhuǎn)錄因子，依賴DNA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活。D、原核基因表達(dá)調(diào)控主要采用操縱子模型，轉(zhuǎn)錄出多順反子RNA，實(shí)現(xiàn)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)；真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子RNA，功能相關(guān)蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)表達(dá)機(jī)制更為復(fù)雜。

41、質(zhì)粒的特征：

①原核細(xì)胞中染色體外的共價閉合的環(huán)狀DNA分子。②能獨(dú)立于細(xì)胞的染色體而進(jìn)行復(fù)制，并依賴于宿主細(xì)胞。③在同一宿主中具有不相容性，即具有相同復(fù)制起始位點(diǎn)和分配區(qū)的兩種質(zhì)粒不能共存于一個宿主菌。④具有嚴(yán)格的遺傳控制系統(tǒng)（復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)，分配系統(tǒng)，細(xì)胞分裂控制系統(tǒng)，位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)）。⑤其所攜帶的遺傳信息能賦予宿主細(xì)胞特定的遺傳性狀。⑥是DNA重組技術(shù)中所使用的主要載體。作為克隆載體的質(zhì)粒具有的特點(diǎn)：分子量較小，能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)；具有一個以上的遺傳標(biāo)志；具有多個限制酶的單一切點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)，便于外源基因的插入。

42、真核生物基因組結(jié)構(gòu)與功能的特點(diǎn)。

①每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目，體細(xì)胞一般為雙倍體。②真核基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，具有許多復(fù)制起點(diǎn)。③真核基因組由一個結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子，即一分子mRNA只能翻譯一種蛋白質(zhì)。④真核生物分子含有大量重復(fù)順序。⑤真核生物基因組內(nèi)非編碼的順序占90%以上。⑥真核基因是斷裂基因。⑦功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族。⑧真核生物基因組中也存在一些可移動的遺傳因素。

43、蛋白質(zhì)生物合成后的靶向輸送過程及特點(diǎn)：

蛋白質(zhì)合成后，定向地被輸送到最終發(fā)揮生物學(xué)功能的部位稱為靶向輸送。靶向輸送的蛋白質(zhì)的N端往往有一些特異的氨基酸序列，稱為信號序列，是決定蛋白質(zhì)靶向輸送特性的重要元件，通過信號序列引導(dǎo)蛋白質(zhì)從胞漿進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng).線粒體.葉綠體和核內(nèi)，靶向不同的蛋白質(zhì)各有特異的信號序列。分泌型蛋白合成后進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，經(jīng)加工，包裝成分泌小泡，再轉(zhuǎn)移.融合到靶部位或分泌出細(xì)胞，其靶向輸送主要靠信號肽與胞漿中的信號肽識別粒子（SRP）識別并特異結(jié)合，然后再通過SRP與膜上的對接蛋白（DP）識別并結(jié)合后，將所攜帶的蛋白質(zhì)送出細(xì)胞；線粒體蛋白的靶向輸送靠導(dǎo)肽與多種蛋白復(fù)合體介導(dǎo)進(jìn)入基質(zhì)和膜間腔，然后自發(fā)的或在分子伴侶HSP70幫助下折疊形成有功能的蛋白質(zhì)；而細(xì)胞核蛋白的靶向輸送則通過核定位信號與核輸入受體結(jié)合形成核蛋白-受體復(fù)合物，被導(dǎo)出核孔，再與核孔復(fù)合體結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核。

44、核酸分子雜交的基本方法包括：Southern印跡雜交（鑒別DNA靶分子的雜交、待測核酸是DNA片段）、Northern印跡雜交（鑒別RNA靶分子、待測核酸是RNA）、斑點(diǎn)雜交、原位雜交和液相雜交。

45、DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的異同。

相同點(diǎn)：①模板是DNA②遵守堿基互補(bǔ)規(guī)律③新鏈合成方向?yàn)?'→3'④催化核苷酸以磷酸二酯鏈連接⑤合成部位在細(xì)胞核。

不同點(diǎn)：①復(fù)制的原材料是dNTP，轉(zhuǎn)錄的原料是NTP②復(fù)制的主要酶類是DNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄酶是RNA聚合酶③復(fù) 8 制需要RNA引物，轉(zhuǎn)錄不需要引物④復(fù)制的產(chǎn)物是雙鏈DNA，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是單鏈RNA⑤復(fù)制的模板是DNA雙鏈（半保留復(fù)制），轉(zhuǎn)錄的模板是DNA單鏈（不對稱轉(zhuǎn)錄）⑥復(fù)制的功能是傳遞遺傳信息給子代 ,轉(zhuǎn)錄是表達(dá)信息所需步聚.46、雙脫氧核苷酸末端終止法DNA序列測定中所需要的順序試劑：M13載體、dNTP、DNA聚合酶I的klenow片段，逆轉(zhuǎn)錄酶，TqaDNA聚合酶（耐熱DNA聚合酶），經(jīng)過修飾的T7噬菌菌體DNA聚合酶，測序酶2.0版，雙脫氧核苷三磷酸（即2',3'-ddNTP）、dNTP類似物，放射性標(biāo)記的[aP]dNTP。

47、PCR體系的主要成分。

引物、TaqDNA聚合酶、dNTP、模板核酸、緩沖液。

48、DNA聚合酶I的作用特點(diǎn)：

①模板為DNA，②底物為4種脫氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），③Mg參與，④DNA合成方向?yàn)?'→3'，⑤具有DNA聚合酶活性，3'→5'及5'→3'核酸外切酶活性，其5'→3'核酸外切酶活性，用于缺口平移法標(biāo)記DNA探針。

基因治療的方法有兩種：體內(nèi)直接轉(zhuǎn)基因，稱為體內(nèi)法；細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療，稱為回體法?；驕缁罴夹g(shù)有：反義核酸技術(shù)，核酶技術(shù)，三鏈技術(shù)，干擾RNA技術(shù)。人的DNA端粒含有TTAGGG重復(fù)序列。

49.信號肽的特點(diǎn):能與細(xì)胞質(zhì)中的信號識別顆粒結(jié)合,SRP受體是蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所必需的,N端一小段富含蔬水氨基酸的序列,翻譯的同時引導(dǎo)新生多肽鏈穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng).基因組文庫—采用限制酶將基因組DNA切成片段，每一DNA片段都與一個載體分子拼接成重組DNA，將全部DNA分子都引入宿主細(xì)胞并擴(kuò)增所得到的分子克隆混合體叫基因組文庫。

50.基因重組是指DNA之間的共價連接.在分子克隆中的克隆是指無性繁殖DNA。基因工程中目的基因的來源可以是:化學(xué)合成.PCR合成.細(xì)胞DNA.組織DNA.cDNA文庫。

分子生物學(xué)需要掌握的重點(diǎn)：

DNA、RNA、蛋白質(zhì)、質(zhì)粒、基因、端粒、聚合酶、密碼子、突變、變性的概念或結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及特點(diǎn)；

復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工修飾、靶向輸送的主要過程及特點(diǎn)；

癌基因的概念、原癌基因產(chǎn)物的類型及細(xì)胞定位、癌基因活化致癌的主要機(jī)制；

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理、主要步驟、酶學(xué)及特點(diǎn)；

基因表及其調(diào)控的原理、主要過程或步驟，乳糖操縱子的正、負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制；

常用的基因診斷及基因治療技術(shù)；

基因克隆、基因診斷、基因治療、管家基因、抑癌基因、Klenow片段、核蛋白體、限制性內(nèi)切核酸酶、人類基因組計劃、原位雜交的概念；

雙脫氧末端終止法DNA測序、重組DNA技術(shù)的主要步驟；

結(jié)構(gòu)基因、順式作用元件、啟動子、遺傳密碼、反式作用因子、氨基酰-tRNA、基因組文庫、DNA多態(tài)性、轉(zhuǎn)位因子、探針、Tm值、DNA微陣列、DNA甲基化的概念、性質(zhì)；

核酸分子雜交的主要類型、PCR的主要步驟及引物設(shè)計； DNA、RNA及多肽鏈的合成方向；

真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的基本方法；

細(xì)胞周期的主要調(diào)控點(diǎn)；

DNA損傷及修復(fù)的主要類型和機(jī)制；

基因文庫篩選的主要方法及原理。

《醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)》主要內(nèi)容

2+

321、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)：醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)是分子生物學(xué)的一個重要分支，是從分子水平研究人體在正常和疾病狀態(tài)下生命活動及其規(guī)律的一門科學(xué)。

2、基因的概念、功能

基因：是貯存遺傳信息的核酸（DNA或RNA）片段，包括編碼RNA和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列兩部分。

基因的功能：

1、利用4種堿基的不同排列荷載遺傳信息；

2、通過復(fù)制將所有的遺傳信息穩(wěn)定、忠實(shí)地遺傳個子代細(xì)胞；

3、作為基因表達(dá)的模版。

3、DNA、RNA的結(jié)構(gòu)和功能

功能：DNA:DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個體生命活動的信息基礎(chǔ)。

RNA:

1、mRNA：攜帶蛋白質(zhì)的序列信息，在翻譯過程作為模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成

2、tRNA:在蛋白質(zhì)生物合成時運(yùn)輸氨基酸

3、核蛋白體：介導(dǎo)rRNA與mRNA的結(jié)合 rRNA與核蛋白體蛋白的結(jié)合 rRNA與tRNA的相互識別和相互作用

4、小分子RNA：參與mRNA的剪接、加工

U3與rRNA加工有關(guān)

4、不同生物基因的基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

原核生物：5’-啟動子-結(jié)構(gòu)基因-轉(zhuǎn)錄終止子-3’

真核生物：由1個結(jié)構(gòu)基因+轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列組成，mRNA多是單順反子，rRNA基因結(jié)構(gòu)是多順反子 病毒：與真核基因相比很小，一般沒有內(nèi)含子，調(diào)控序列較少，有不規(guī)則基因

5、原核、真核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列有哪些

（1）原核生物：啟動子、終止子、操縱原件、正調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)；

① 啟動子：提供轉(zhuǎn)錄起始信號，其本身不出現(xiàn)于RNA產(chǎn)物中。其中有著“TATAAT”的共有特征序列，稱為普里布諾盒。

② 終止子：提供RNA合成終止信號。其含有GC富集區(qū)組成的回文特征序列。③ 操縱元件：被阻遏蛋白識別與結(jié)合。與啟動子通常有部分重疊。④ 正調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)：加強(qiáng)下游結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。

（2）真核生物：啟動子、上游啟動子元件、增強(qiáng)子、加尾信號和一些反應(yīng)元件等。

① 啟動子：提供轉(zhuǎn)錄起始信號，啟動子本身通常不被轉(zhuǎn)錄，除了編碼tRNA基因的啟動子。分為三類：I類啟動子富含GC堿基對，編碼rRNA的基因，除了5SrRNA。II類啟動子具有TATA盒特征結(jié)構(gòu),編碼蛋白質(zhì)（mRNA）的基因和一些小RNA基因。III類啟動子包括A盒、B盒、C盒，編碼5SrRNA、tRNA、U6snRNA。

② 增強(qiáng)子：順式作用元件，增強(qiáng)鄰近基因的轉(zhuǎn)錄。③ 沉默子：負(fù)性調(diào)控元件，可抑制基因轉(zhuǎn)錄的特定序列。

6、操縱子、啟動子、增強(qiáng)子、斷裂基因、內(nèi)含子和外顯子的概念

操縱子：功能上相關(guān)聯(lián)的數(shù)個結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，由一套轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列控制其轉(zhuǎn)錄，構(gòu)成的基因表達(dá)單位。

啟動子：指結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的一段DNA序列，它結(jié)合RNA聚合酶（真核生物還需要結(jié)合其他蛋白質(zhì)因子）后能夠開放基因轉(zhuǎn)錄。

增強(qiáng)子：是可以增強(qiáng)真核生物基因啟動子的工作效率的順式作用元件。斷裂基因：真核生物的結(jié)構(gòu)基因中，編碼區(qū)與非編碼區(qū)間隔排列。

內(nèi)含子：指在真核生物的斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中出現(xiàn)，但在成熟RNA中被剪接除去的核酸序列。

外顯子：指在真核生物的斷裂基因及其成熟RNA中都存在的核酸序列。

7、基因組的定義和功能

定義：細(xì)胞或生物體中，一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。

功能：儲存和表達(dá)遺傳信息

8、真核生物基因組的特點(diǎn)

真核生物的基因組龐大，出了結(jié)構(gòu)基因的結(jié)構(gòu)與原核生物大不相同以外，還存在大量的非結(jié)構(gòu)基因區(qū)域。真核細(xì)胞基因組具有結(jié)構(gòu)基因呈斷裂基因形式、以單順反子轉(zhuǎn)錄、結(jié)構(gòu)基因在基因組中所占比例小于非編碼區(qū)域的特點(diǎn)。真核細(xì)胞基因組存在大量重復(fù)序列，可以分為高度重復(fù)序列、中毒重復(fù)序列和單拷貝或低度重復(fù)序列等3種。真核基因組的另一特點(diǎn)是存在多基因家族。

9、原核生物基因組的特點(diǎn)

原核生物的基因組主要是染色體DNA。

特點(diǎn)：

1、基因組中很少有重復(fù)序列；

2、編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因多為單拷貝基因，但編碼rRNA的基因仍然是多拷貝基因；

3、結(jié)構(gòu)基因在基因組中所占的比 例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于真核基因組，但小于病毒基因組；

4、許多結(jié)構(gòu)基因在基因組中以操縱子為單位排列。

10、質(zhì)粒、基因重疊、基因組、假基因、核酶

質(zhì)粒：細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的、染色體外的DNA分子，是共價閉合的環(huán)狀DNA分子，能夠獨(dú)立于細(xì)胞的染色質(zhì)DNA而進(jìn)行復(fù)制。

基因重疊：同一DNA片段可以是2種甚至3種蛋白質(zhì)分子的部分編碼區(qū)?；蚪M：細(xì)胞或生物體中，一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。假基因：與有功能的基因同源，但不能產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物的基因。核酶：指具有催化活性的RNA，其作用底物是RNA，主要參與RNA的加工成熟。

11、DNA復(fù)制過程的共同特點(diǎn)

1、半保留復(fù)制方式保證了遺傳信息的忠實(shí)傳遞；

2、基因組DNA都有固定的復(fù)制起始點(diǎn)；

3、復(fù)制子是基本復(fù)制單位；

4、雙向復(fù)制形成復(fù)制泡和復(fù)制叉；

5、半不連續(xù)復(fù)制方式克服了DNA空間結(jié)構(gòu)對DNA新鏈合成的制約。

12、DNA復(fù)制保真性的機(jī)制

1、DNA聚合酶對堿基配對的選擇作用，保證嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；

2、DNA聚合酶對模板的識別作用；

3、DNA聚合酶3’→5’外切活性的校正作用，復(fù)制出錯時有即時的糾錯功能。

13、真核生物DNA復(fù)制的基本過程

1、DNA復(fù)制的起始；

2、DNA鏈的延伸。DNA鏈的延伸主要由DNA聚合酶完成。DNA聚合酶催化的反應(yīng)是以親代DNA為模板、4種脫氧核糖核苷三磷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP為原料底物，一句堿基配對原則，在RNA引物鏈的3’-OH上開始逐個添加dNTP，從而延伸為子代DNA鏈；

3、復(fù)制的終止。復(fù)制的終止過程包括去除RNA引物、岡崎片段的連接等反應(yīng)，最終形成兩個完整的子代DNA雙鏈。

14、端粒、端粒酶

端粒：是位于真核生物染色體末端的、由DNA和蛋白質(zhì)組成的一膨出結(jié)構(gòu)。端粒DNA由短的高度重復(fù)序列組成，不同生物的重復(fù)序列不同。

端粒酶：是反轉(zhuǎn)錄酶，由蛋白質(zhì)和RNA共同組成能以自身的RNA為模板反復(fù)延伸端粒的重復(fù)序列。

15、DNA損傷的因素、類型

DNA損傷的因素包括：電離輻射、紫外線、堿基類似物、堿基修飾劑、某些化學(xué)染料和自由基。DNA損傷的類型有堿基和糖基破壞、錯配、DNA鏈斷裂、DNA交聯(lián)等。

16、DNA損傷的修復(fù)方式

DNA損傷的修復(fù)方式：直接修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)和損傷跨越。

17、切除修復(fù)、重組修復(fù)

切除修復(fù)：在多種酶作用下，先將損傷區(qū)域切除，然后利用互補(bǔ)鏈為模板，合成一段正確配對的堿 11 基順序來修補(bǔ)。

重組修復(fù)：重組酶系將未受損傷的DNA片段移到損傷部位，提供正確的模板，進(jìn)行修復(fù)。

18、基因表達(dá)的概念

基因表達(dá)：指基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程，基因表達(dá)的最終產(chǎn)物是蛋白質(zhì)或者rRNA、tRNA等。管家基因是組成性表達(dá)，而可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)具有時空特異性。

19、何為轉(zhuǎn)錄？轉(zhuǎn)錄的體系？復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別有哪些？ 轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板合成RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。

轉(zhuǎn)錄體系：

1、模板：DNA；

2、原料：ATP、GTP、CTP、UTP；

3、RNA聚合酶：原核細(xì)胞：全酶α2ββ'σ；真核細(xì)胞：RNA聚合酶I、II、III 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的不同點(diǎn)：1)復(fù)制的模板是DNA雙鏈（半保留復(fù)制），轉(zhuǎn)錄的模板是DNA單鏈（不對稱轉(zhuǎn)錄）。2）復(fù)制的原料是dNTP，轉(zhuǎn)錄的原料是NTP。3)復(fù)制的主要酶類是DNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄酶是RNA聚合酶。4)復(fù)制需要RNA引物（由引物酶合成），轉(zhuǎn)錄不需要引物。5)復(fù)制的產(chǎn)物是雙鏈DNA，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是單鏈RNA。6）復(fù)制的功能是傳遞遺傳信息給子代，轉(zhuǎn)錄是表達(dá)遺傳信息所需步驟。20、原核、真核生物RNA轉(zhuǎn)錄的基本過程

轉(zhuǎn)錄起始：轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體在啟動子部位形成（形成開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體）① 原核生物：RNA聚合酶與啟動子相互作用。② 真核生物: RNA聚合酶、反式作用因子與順式作用元件相互作用。轉(zhuǎn)錄延長：RNA鏈隨著轉(zhuǎn)錄泡的移動得以延長 ①原核生物：核心酶催化(α2β'βω)② 真核生物：磷酸化的RNA聚合酶催化，核小體解聚。

轉(zhuǎn)錄終止：轉(zhuǎn)錄終止受DNA模板上終止信號的控制 ① 原核生物：a.依賴ρ因子：ρ因子與RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，結(jié)合后ρ因子和RNA聚合酶發(fā)生構(gòu)象變化，使RNA聚合酶停頓，轉(zhuǎn)錄停止。b.非依賴ρ因子：DNA模板上靠近終止處有些特殊堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。② 真核生物：轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)處切離并加尾。

21、蛋白質(zhì)合成體系

蛋白質(zhì)合成體系：

1、模板：mRNA；

2、氨基酸運(yùn)輸：tRNA;

3、肽鏈合成場所：核糖體；

4、蛋白質(zhì)因子：起始、延長、終止因子；

5、原料：20種有遺傳密碼的氨基酸

22、原核、真核生物翻譯的基本過程：

1、起始：形成翻譯起始復(fù)合物；2延長：只每加一個氨基酸經(jīng)過進(jìn)位、成肽和轉(zhuǎn)位；

3、終止：原核細(xì)胞：RF1，RF2識別終止密碼，RF3激活轉(zhuǎn)肽酶釋放肽鏈；真核細(xì)胞：eRF同時具有上述功能。

23、基因表達(dá)調(diào)控的基本規(guī)律（包括基因表達(dá)的特點(diǎn)、方式等）

1、基因表達(dá)具有時空特異性；

2、誘導(dǎo)表達(dá)和阻遏表達(dá)時基因表達(dá)調(diào)控的最普遍方式；

3、基因表達(dá)受順式作用元件和反式作用元件因子共同調(diào)節(jié)；

4、蛋白質(zhì)-DNA以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用是基因表達(dá)調(diào)控的分子基礎(chǔ)；

5、基因表達(dá)調(diào)控是多層次的復(fù)雜調(diào)節(jié)。

24、RNA編輯、核蛋白體循環(huán)、分子伴侶

RNA編輯：指細(xì)胞核中初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物hnRNA的序列改變，使C變?yōu)閁或者A變?yōu)镚，結(jié)果一個基因表達(dá)產(chǎn)生不止一種蛋白質(zhì)，增加了遺傳信息容量。

核蛋白體循環(huán)：是指氨基酸活化后，在核蛋白體上縮合形成多肽鏈的過程，該過程包括肽鏈合成的起始，肽鏈的延長，肽鏈合成的終止和釋放。

分子伴侶：幫助新生多肽鏈折疊成天然空間構(gòu)象的一類保守蛋白質(zhì)（如熱休克蛋白），在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中廣泛存在。

25、乳糖操縱子作用機(jī)制

(1)乳糖操縱子包含3個結(jié)構(gòu)基因（編碼β－半乳糖苷酶、β－半乳糖苷通透酶和轉(zhuǎn)乙?；福?、3個調(diào)控元件（啟動子、操縱基因和CAP結(jié)合位點(diǎn)）和1個調(diào)節(jié)基因（編碼阻遏蛋白）。(2)阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控：無乳糖時，阻遏蛋白結(jié)合操縱基因，妨礙RNA聚合酶結(jié)合啟動子，抑制結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄。有乳糖時，生成別位乳糖（誘導(dǎo)劑）結(jié)合阻遏蛋白，不能封閉操縱基因，結(jié)構(gòu)基因可以轉(zhuǎn)錄。(3)cAMP-CAP 12 復(fù)合物的正調(diào)控：無葡萄糖時，cAMP濃度高，形成的cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合于CAP結(jié)合位點(diǎn)，增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄活性。有葡萄糖時，cAMP濃度低，cAMP-CAP復(fù)合物形成受阻，影響轉(zhuǎn)錄活性。(4)正、負(fù)調(diào)控機(jī)制相輔相成。cAMP-CAP復(fù)合物是轉(zhuǎn)錄必需的，同時阻遏蛋白進(jìn)一步控制轉(zhuǎn)錄啟動。綜上，乳糖操縱子最強(qiáng)的表達(dá)條件是有乳糖而無葡萄糖。

26、試述原核生物和真核生物基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)的異同(1)相同點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄起始是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

(2)不同點(diǎn) 1)原核基因表達(dá)調(diào)控主要包括轉(zhuǎn)錄和翻譯水平；真核基因表達(dá)調(diào)控包括染色質(zhì)活化、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工多個層次。2)原核基因表達(dá)調(diào)控主要為負(fù)調(diào)節(jié)；真核基因表達(dá)調(diào)控主要為正調(diào)節(jié)。3)原核轉(zhuǎn)錄起始不需要轉(zhuǎn)錄因子，RNA聚合酶直接結(jié)合啟動子，由σ因子決定基因表達(dá)的特異性；真核轉(zhuǎn)錄起始需要基礎(chǔ)、特異兩類轉(zhuǎn)錄因子，依賴DNA－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活。4)原核基因表達(dá)調(diào)控主要采用操縱子模型，轉(zhuǎn)錄出多順反子RNA，實(shí)現(xiàn)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)；真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子RNA，功能相關(guān)蛋白質(zhì)的協(xié)調(diào)表達(dá)機(jī)制更為復(fù)雜。

27、細(xì)胞通訊、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的概念

細(xì)胞通訊：生物體內(nèi)各種細(xì)胞在功能上的協(xié)調(diào)統(tǒng)一是通過細(xì)胞間相互識別和相互作用的機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的，這種機(jī)制稱為細(xì)胞通訊。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)：是通過多種分子相互作用的一系列有序反應(yīng)、將來自細(xì)胞外的信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)各種效應(yīng)分子的過程。

28、化學(xué)信號分子的分類

化學(xué)信號分子可根據(jù)物理性質(zhì)分為脂溶性化學(xué)信號和水溶性化學(xué)信號兩大類。從其作用距離考慮則可分為激素、神經(jīng)遞質(zhì)和屬于旁分泌系統(tǒng)的細(xì)胞因子、生長因子等三大類。

29、受體的概念、分類、作用和特點(diǎn)

（1）概念：受體位于細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)，能特異識別生物活性分子，可與之相互結(jié)合，進(jìn)而引起生物學(xué)效應(yīng)的蛋白質(zhì)，以及個別糖脂。（2）分類： 膜受體和胞內(nèi)受體 1)膜受體分類：

① 離子通道型受體 與此類受體結(jié)合的主要是神經(jīng)遞質(zhì)，介導(dǎo)離子通道的打開和關(guān)閉，改變膜通透性，能迅速、準(zhǔn)確地傳遞神經(jīng)沖動，作用時間很短。

② G蛋白偶聯(lián)受體 又名七次跨膜受體，胞漿面的第三個環(huán)能與鳥苷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)，通過不同的G蛋白影響腺苷酸環(huán)化酶或磷脂酶C改變細(xì)胞內(nèi)第二信使?jié)舛龋詫?shí)現(xiàn)跨膜信號傳遞。

③ 單次α螺旋跨膜受體 結(jié)構(gòu)上具有一個跨膜α螺旋，包括受體型酪氨酸蛋白激酶和非酪氨酸蛋白激酶型受體。

2)胞內(nèi)受體：多為反式作用因子，當(dāng)其與相應(yīng)配體（例如 類固醇激素、甲狀腺素等），能與DNA的順式作用元件結(jié)合，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。

（3）受體作用的特點(diǎn)： 高度專一性、高度親和力、可飽和性、可逆性、特定的作用模式。30、何為生物體內(nèi)第二信使？主要包括哪些？

第二信使：配體與受體結(jié)合后，靶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)膜外激素信號的某些小分子化合物，在信息傳遞過程中產(chǎn)生放大的作用，稱為第二信使。

主要包括：環(huán)腺苷酸（cAMP）、環(huán)鳥甘酸（cGMP）、甘油二酯（DAG）、三磷酸肌醇（IP3）、Ca2+。

31、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子下游傳遞信號的方式

（一）通過改變小分子的濃度和細(xì)胞內(nèi)定而傳遞信號

1、酶促反應(yīng)生成小分子信使

2、調(diào)控離子通道可改變小分子的濃度或細(xì)胞內(nèi)的定位分布

（二）上游分子通過邊溝激活下游分子而傳遞信號

1、配體結(jié)合并激活受體

2、酶分子通過共價修飾變構(gòu)激活下游轉(zhuǎn)導(dǎo)分子

3、小分子信使結(jié)合并激活下游分子

4、上游蛋白質(zhì)結(jié)合激活下游蛋白質(zhì)分子

32、列舉膜受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 1)cAMP-PKA途徑。

2)Ca2+-依賴性蛋白激酶途徑 Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶途徑和Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶途徑（Ca2+-CaM激酶途徑）。3)cGMP-PKG 途徑。

4)酪氨酸蛋白激酶途徑 受體型TPK-Ras-MAPK途徑和JAKs-STAT 途徑。5)核因子κB途徑 6)TGF-β/Smad途徑

33、核酸分子雜交

在DNA變性后的復(fù)性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系，在適宜的條件下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈。這種雜化雙鏈可以再不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成，這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。

34、重組DNA技術(shù)的基本原理

35、目的基因獲取的方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、反轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）、文庫篩選和人工合成等

36、基因載體的概念，常用載體有哪些，載體選擇標(biāo)準(zhǔn)

載體是指能夠攜帶目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增或表達(dá)的DNA分子。常用的載體包括：質(zhì)粒載體、病毒載體和人工染色體載體

載體選擇應(yīng)具備的條件：(1)有復(fù)制子。(2)有單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。(3)有篩選標(biāo)志。(4)表達(dá)型載體具備完整的轉(zhuǎn)錄單位。

37、基因克隆的基本步驟

基因克隆的基本步驟是：

1、用限制性內(nèi)切酶笑話目的基因和載體DNA，使其具備能連接的末端序列特征；

2、用DNA連接酶將目的基因和載體DNA連接起來構(gòu)成重組DNA分子；

3、將連接起產(chǎn)物導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，使重組DNA分子得以復(fù)制擴(kuò)增；

4、篩選及克隆化，從而獲得重組克隆載體及克隆的基因。

38、cDNA文庫、基因組文庫

cDNA文庫：指含有某種組織細(xì)胞全部mRNA信息的重組DNA克隆群體。以細(xì)胞總mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的cDNA第一鏈，進(jìn)而形成cDNA雙鏈，與合適載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，由此建立cDNA文庫。

基因組文庫：指含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體。即將原核或真核細(xì)胞染色體DNA提純，用機(jī)械法或限制性內(nèi)切酶將染色體DNA切割成大小不等的片段，插入適當(dāng)?shù)目寺≥d體中，繼而轉(zhuǎn)入受體菌擴(kuò)增，由此獲得含有眾多克隆的基因組DNA文庫。

39、PCR、RT-PCR、Southern印跡、Northern印跡、RNA干擾

PCR：是根據(jù)DNA半保留復(fù)制和DNA聚合酶的特性建立起來的體外復(fù)制擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。

RT-PCR：以mRNA為模板，先進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,再進(jìn)行的PCR反應(yīng)。

Southern印跡：是DNA定性及定量分析的方法之一，過程為

提取細(xì)胞中的總DNA，用限制性內(nèi)切酶水解后進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用DNA探針與結(jié)合在膜上的DNA分子退火形成雙鏈，檢測靶DNA的含量。

Northern印跡：是RNA定性及定量分析的方法之一，過程為

將細(xì)胞中的總RNA分子進(jìn)行電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用DNA探針與結(jié)合在膜上的RNA分子退火形成雙鏈，檢測靶RNA的含量。

RNA干擾：由短雙鏈RNA誘導(dǎo)同源RNA降解的過程，是一種特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，可以認(rèn)為是生物體在核酸水平的免疫反應(yīng)。40、何謂藥物發(fā)現(xiàn)

藥物發(fā)現(xiàn)：廣義定義是藥物研究和開發(fā)過程，包括：某種疾病和治療靶點(diǎn)確定的基礎(chǔ)研究和可行性分析；先導(dǎo)化合物體外檢測的生物模型和方法學(xué)的建立；藥理學(xué)、藥物代謝動力學(xué)和安全性研究；制劑學(xué)；專利申請以及人體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床研究和上市銷售。狹義上指藥物設(shè)計，即基礎(chǔ)研究和可行性分析設(shè)計的先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)過程。

41、傳統(tǒng)和現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)模式

傳統(tǒng)藥物發(fā)現(xiàn)模式：

1、隨機(jī)發(fā)現(xiàn)，包括治療作用的隨機(jī)發(fā)現(xiàn)和藥物來源地隨機(jī)發(fā)現(xiàn)；

2、定向篩選發(fā)現(xiàn)，也包括對治療特定疾病藥物的篩選和特定藥物來源物質(zhì)的篩選。

現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)模式：1.合理藥物設(shè)計：發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物是藥物發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵一步。

2.逆向藥理學(xué)

42、何謂藥物靶點(diǎn)

藥物靶點(diǎn)：是生物體細(xì)胞膜上火細(xì)胞內(nèi)的一種特異性大分子結(jié)構(gòu)。藥物和信息分子能與有關(guān)受體大分子的關(guān)鍵部位特異性結(jié)合，生成可逆性復(fù)合物，并進(jìn)一步啟動功能性變化，汝開啟細(xì)胞膜上的離子通道，火激活特殊的酶，從而導(dǎo)致生理藥理變化。

第二篇：醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)

1.簡述動物組織蛋白質(zhì)，DNA ,RNA提取的大致過程及原理。

答：共同的第一步都是取動物組織進(jìn)行清洗剪碎，然后用高速組織搗碎機(jī)破碎。

DNA的提?。?/p>

通過勻漿、離心得到細(xì)胞核組分，然后用SDS（十二烷基硫酸鈉，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，釋放出DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，再加入高濃度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—異戊醇混合液，振蕩、乳化，使蛋白質(zhì)變性，DNP復(fù)合物解離，離心后，DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)沉淀夾在水相和有機(jī)相之間得以除去，最后用有機(jī)溶劑沉淀出DNA。

RNA的提取:

取組織，剪成小塊，在乳缽種研碎，加20mLSDS-緩沖鹽溶液（見試劑1.）使成均漿，倒入磨口具塞錐形瓶內(nèi)，再加同樣體積的含水酚液，室溫下劇烈振蕩10分鐘。置冰浴中分層，在0-4℃下，以4000rpmn離心15分鐘。吸出上清液，加等體積氯仿－異戊醇，室溫下劇烈振蕩10分鐘，以4000rpm離心5分鐘，或在室溫下放置10分鐘使分層。吸出上清液（若有必要，該操作可反復(fù)多次），加2倍體積2%乙酸鉀的乙醇溶液，在冰浴中放置1小時使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱內(nèi)較長期存放。若要得到干燥制品，可將沉淀液以4000rpm離心10分鐘，傾去上清液。沉淀用少許75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇各洗1次，同上法離心，傾去乙醇后，空氣干燥。

蛋白質(zhì)的提取:

1.組織稱重，切小塊放入管中。

2.配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑（1ml抽提試劑中加入5 μl蛋白酶抑制劑混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。

3.加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑（250mg組織中加入1ml抽提試劑）。

4.用勻漿器每次30秒低速勻漿，每次勻漿間隔冰浴1分鐘，至組織完全裂解。

5.裂解液于預(yù)冷的離心機(jī)中14，000xg離心15分鐘。上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。

原理：在細(xì)胞核內(nèi)，核酸通常是與某些組織蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，因此在提取和制備DNA或RNA時，首先必須設(shè)法將這兩類核蛋白分開。在不同濃度的鹽溶液中，RNP與DNP的溶解度有很大的差別。在低濃度的NaCl溶液中，DNP的溶解度隨著NaCl濃度的增加而逐漸下降，當(dāng)NaCl 濃度為0.14mol/L時，DNP的溶解度僅為其在純水中溶解度的1%，而當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)增加時，DNP的溶解度又漸次增大，當(dāng)NaCl濃度增至0.5 mol/L時，DNP的溶解度約與其在純水中的溶解度近似，當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)增加至1.0 mol/L時，DNP的溶解度約為其在純水中的溶解度的兩倍，且隨著鹽濃度的上升，其溶解度仍繼續(xù)呈增大的趨勢。但RNP則與之不同，在0.14 mol/L的鹽溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相當(dāng)大，因此，通常采用0.14 mol/L的鹽溶液來除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用濃鹽溶液（1.7 mol/L濃度以上的NaCl）來提取DNP。

提取出DNA或RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體（DNP）后，在將其中的蛋白質(zhì)除去

2.簡述基因工程的原理及過程。

答：基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。

所謂基因工程（genetic engineering）是在分子水平上對基因進(jìn)行操作的復(fù)雜技術(shù)。是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細(xì)胞中，以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙。一般步驟：1克隆重組：提取供體生物目的基因，酶解，連接到另一個DNA分子（克隆載體）上形成重組DNA；2轉(zhuǎn)化：將重組子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并在其中復(fù)制保存；3篩選鑒定：已吸收重組子的細(xì)胞；4大量培養(yǎng)監(jiān)測外源性基因是否表達(dá)。

3.比較原核生物與真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

答：

原核生物基因表達(dá)調(diào)控 真核生物基因表達(dá)調(diào)控

啟動因子：σ因子決定RNA聚合酶識別的特異性TF2D決定RNA聚合酶識別的特異性

轉(zhuǎn)錄激活：操縱子 調(diào)節(jié)蛋白順式作用元件轉(zhuǎn)錄因子

主要機(jī)制：操縱子模型具有普遍性順式作用元件具有普遍性

主要為負(fù)性調(diào)節(jié)（阻遏調(diào)節(jié)）主要為正性調(diào)節(jié)

特有機(jī)制：轉(zhuǎn)錄衰減染色體結(jié)構(gòu)變化

共同點(diǎn)： 1.基因表達(dá)都有時間特異性和空間特異性2.基因調(diào)控的多層次性和復(fù)雜性3轉(zhuǎn)錄起始部分是基因表達(dá)的基本調(diào)控點(diǎn)

4.簡述 PCR的原理及其應(yīng)用，引物設(shè)計的原則。

答：PCR的原理：以擴(kuò)增的DNA分子為模板，以1對與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，依半保留機(jī)制沿模板鏈延伸直至完成2條新鏈合成。通過變性，退火和延伸重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。反應(yīng)體系基本成分有模板DNA，特異引物，耐熱性DNA聚合酶，dNTP和含有 Mg2+的緩沖液。

PCR的主要用途：1目的基因的克?。?.基因的體外突變3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列測定5.基因突變分析

PCRD的衍生技術(shù)：1錨定PCR(anchored PCR)2..不對稱PCR(asymmetric PCR)3.反向PCR(inverse PCR)4.多重PCR(multiplex PCR)5.逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)

引物設(shè)計的基本原則

①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。②引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。③引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。④兩個引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。⑤引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。⑥引物3?端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，最佳選擇是G和C。⑦引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

5.簡southern blot的原理及其應(yīng)用。

答：原理： 將待檢測的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。可用于檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。

主要應(yīng)用于1.遺傳病診斷 2.DNA圖譜分析 3.PCR產(chǎn)物分析。例如在研究轉(zhuǎn)基因的時候，可用于檢測外源基因的插入和整合情況。

第三篇：暨南大學(xué)分子生物學(xué)資料

暨南大學(xué) 2005 分子生物學(xué)復(fù)習(xí)題參考解答

2005生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)

暨南大學(xué) 2005 分子生物學(xué)復(fù)習(xí)題參考解答

1.舉例解釋蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)（MOTIF）、三級結(jié)構(gòu)、DOMAIN和四級結(jié)構(gòu)？

二級結(jié)構(gòu):一條多肽鏈主鏈原子局部的空間排列

超二級結(jié)構(gòu):由若干個相鄰的二級結(jié)構(gòu)元件組合在一起,彼此相互作用形成的有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)的組合體.ＤＯＭＡＩＮ（結(jié)構(gòu)域）:多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)或超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上形成的三級結(jié)構(gòu)的局部折疊區(qū),是相對獨(dú)立的緊密球狀實(shí)體.三級結(jié)構(gòu):一條肽鏈的所有原子的空間排列.MOTIF:就是在許多轉(zhuǎn)錄因子的序列中,存在的負(fù)責(zé)與DNA結(jié)合的共同基序.這些基序通常都很短,僅含一小部分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),還通過與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的蛋白質(zhì)之間的相互作用激活轉(zhuǎn)錄.如鋅指基序,亮氨酸拉鏈等都是MOTIF.四級結(jié)構(gòu):幾個亞基在三級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上相互作用所形成的空間結(jié)構(gòu)．

2.定義chaperone，并解釋其功能？

Chaperone:即分子伴侶，為一類與其他蛋白不穩(wěn)定構(gòu)像相結(jié)合并使之穩(wěn)定的蛋白，他們通過控制結(jié)合和釋放來幫助被結(jié)合多肽在體內(nèi)的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)或降解等。分子伴侶在蛋白質(zhì)的折疊和組裝中起非常重要的作用，它是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊和組裝的重要調(diào)節(jié)者。

分子伴侶的功能：分子伴侶是一類蛋白家族，可以在細(xì)胞內(nèi)幫助蛋白折疊 ? 在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中，保持蛋白質(zhì)的去折疊狀態(tài) ? 在受脅迫的細(xì)胞內(nèi)幫助蛋白進(jìn)行正確的折疊 ? 阻止形成錯誤的折疊，抑制聚沉 ? 為執(zhí)行校驗(yàn)功能進(jìn)行再折疊

? 為了防止降解使蛋白去折疊，或選擇蛋白使其降解

3.分析你所認(rèn)識的RNA分子二級結(jié)構(gòu)？

核酸分子的二級結(jié)構(gòu)，對RNA而言，是指單鏈RNA分子通過自身堿基的配對，折疊而成的螺旋，突環(huán)相間排列的結(jié)構(gòu)。如廣泛存在的tRNA的三葉草形二級結(jié)構(gòu)是由于小片斷互補(bǔ)堿基配對而形成。它包括四條根據(jù)結(jié)構(gòu)或已知功能命名的手臂即受體臂，D臂，反密碼臂和TψC臂。另外還有一條易變的多余臂。無法配對的堿基形成套索狀結(jié)構(gòu)。

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4.解釋DNA聚合酶I的三種酶活性？

DNA聚合酶I 其活性主要有：①5＇→3＇聚合酶活性，即使脫氧核糖核苷酸逐個加到3＇－OH末端的核苷酸鏈上，使DNA鏈沿5＇→3＇方向延長，其聚合活性只能在已有的核苷酸鏈上延長DNA而不能從無到有開始DNA鏈的合成；②3＇→5＇核酸外切酶活性，只作用于單鏈DNA,此活性對DNA復(fù)制的忠實(shí)性極為重要，在極少情況下，聚合酶在3＇－OH末端加上1個與模板鏈上堿基不配對的堿基，此時聚合酶I即可發(fā)現(xiàn)并切除這個錯配堿基，從而避免復(fù)制過程中的錯誤；③5＇→3＇核酸外切酶活性，它只作用于雙鏈DNA的堿基配對部分，從5＇末端水解下核苷酸，此活性在切除由紫外線照射而形成的胸腺嘧啶二聚體中起重要作用，在DNA復(fù)制中岡崎片段5＇端RNA引物的切除也靠此酶。

5.解釋DNA聚合酶III各亞基的功能？

DNA聚合酶III是多亞基組成的蛋白質(zhì),它在細(xì)胞中含量很少,在每個細(xì)胞中只有10～20個拷貝的全酶，Pol III全酶由α,β,γ,δ,ε,θ,τ,δ',χ,ψ10種不同的亞基組成

核心酶由α, ε，θ組成。

α亞基具有5'→3'方向合成DNA的催化活性,每秒可以合成8個核苷酸。

ε亞基具有3'→5'外切核酸酶的校對功能,在體內(nèi)其基本功能是控制復(fù)制的忠實(shí)性,ε亞基常與α亞基形成一個緊密的1:l復(fù)合物,協(xié)同發(fā)揮功能.θ亞基使核心酶相互連接

τ亞基使核心酶形成二聚體，與模板連接，具有ATP活性。

β亞基是以二聚體的形式存在的.在復(fù)制過程中β二聚體環(huán)繞著DNA,并能在DNA上自由滑動,構(gòu)成一個滑動鉗.滑動鉗可把全酶束縛在模板DNA上,從而保證高度的進(jìn)行性和聚合反應(yīng)速度。

γ復(fù)合物是β滑動鉗的載體,可幫助β滑動鉗結(jié)合到DNA上.γ復(fù)合物含有5個不同的亞基,形成一種化學(xué)計量為γ2δ1δ'1χ1ψ1的結(jié)構(gòu).β二聚體自己并不能組裝到DNA 上 ,它是通過γ復(fù)合物與ATP協(xié)同作用催化ATP的水解而組裝到DNA上的.6.生物如何控制一個世代只復(fù)制一次？

原核生物與真核生物控制自身DNA復(fù)制次數(shù)的機(jī)理是不一樣的現(xiàn)分別以大腸桿菌和酵母為例加以闡明：

在大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)存在一些被Dam甲基化酶甲基化的位點(diǎn)，包括那些DnaA特異的13bp結(jié)合位點(diǎn)，復(fù)制起時候再復(fù)制周期后將保持甲基化狀態(tài)，并處予隔離狀態(tài)約10分

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鐘，在這一時期他與膜相連，而復(fù)制的再次起始會被抑制直到復(fù)制起點(diǎn)完全甲基化時與膜連接的DnaA取代抹上的抑制劑時DNA才開始下一次的復(fù)制

細(xì)胞分裂后，真核生物細(xì)胞和含有執(zhí)照因子，它是復(fù)制起時所需的，在酵母中執(zhí)照因子在復(fù)制起始后被破壞，這就能阻止再次復(fù)制周期的發(fā)生，執(zhí)照因子不能從細(xì)胞只運(yùn)送到細(xì)胞核中，只能在有絲分裂過程中和崩裂時才能進(jìn)入核內(nèi)

7.闡明Rolling Circle Replication？

滾環(huán)式復(fù)制(rolling circle replication)是噬菌體中常見的DNA復(fù)制方式。滾環(huán)式復(fù)制的一個特點(diǎn)是以一條環(huán)狀單鏈DNA為模板，進(jìn)行新的DNA環(huán)狀分子合成。噬菌體的雙鏈DNA環(huán)狀分子先在一條單鏈的復(fù)制起點(diǎn)上產(chǎn)生一個切口，然后以另一條單鏈為模板不斷地合成新的單鏈。釋放出的新合成的單鏈或是先復(fù)制成雙鏈DNA，被酶切割成單位長度后，再形成環(huán)狀雙鏈DNA分子；或是釋放出的新合成的單鏈DNA，先被酶切割成單位長度形成單鏈環(huán)狀DNA分子后再復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA分子。

質(zhì)粒的滾環(huán)式復(fù)制有2個步驟：第一步是前導(dǎo)鏈的合成。質(zhì)粒編碼的復(fù)制蛋白（Rep）起始子與超螺旋DNA的正起點(diǎn)結(jié)合，并提供鏈特異性及位點(diǎn)特異性缺口。隨著缺口的母鏈被替換，隨著宿主編碼的產(chǎn)的參入，前導(dǎo)鏈的合成不斷進(jìn)行著，當(dāng)復(fù)制復(fù)合體到達(dá)重構(gòu)的起點(diǎn)，同一個或另一個Rep分子在質(zhì)粒DNA上引入一個新的缺口，使替換鏈從ssDNA形式解放；第二步是隨后鏈的合成。這一過程從不同的質(zhì)粒區(qū)域即單鏈起點(diǎn)起始。由于前導(dǎo)鏈和隨后鏈的解偶聯(lián)，復(fù)制是不對稱的。ssDNA的產(chǎn)生是RC質(zhì)粒的標(biāo)志。宿主譜廣可能是RC質(zhì)粒的特征。

8.闡述端粒的結(jié)構(gòu)和端粒酶功能？

端粒的結(jié)構(gòu)：

端粒是真核細(xì)胞染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，是由端粒DNA和與端粒DNA特異結(jié)合的端粒結(jié)合蛋白組成的核糖核酸的蛋白質(zhì)復(fù)合物，在真核生物包括原蟲、真菌、纖毛蟲、植物和哺乳動物中都存在．端粒DNA 由非編碼的重復(fù)序列組成，不同物種的DNA 重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)不同，如人與其他脊椎動物約為2 000 個，擬南芥是53 個拷貝．不同的真核細(xì)胞端粒存在類似的DNA 序列與結(jié)構(gòu)，且高度保守。其共同的特征是富含G，而且富含G的鏈(5′→3′)比富含C的鏈(3′→5′)突出12~16個核苷酸。

盡管端粒DNA 是染色體末端的一個結(jié)構(gòu)，但在染色體的中間也發(fā)現(xiàn)了同樣的重復(fù)序列．與端粒DNA 相鄰的是一“端粒下區(qū)”(subtelomericregion)，它由一些退化的端粒DNA 片斷獨(dú)特的重復(fù)片斷組成。

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端粒除簡單的核苷酸重復(fù)外，還包含有特殊的非核小體蛋白端粒結(jié)合蛋白．端粒結(jié)合蛋白依據(jù)結(jié)合特性分為兩大類

(1)雙鏈TBPs(double-strand TBPs)：這是一類可特異地與雙鏈端粒重復(fù)序列結(jié)合的蛋白質(zhì)，它在端粒長度的維持中具有重要作用，而且對端粒具有保護(hù)和調(diào)節(jié)功能。

(2)單鏈TBPs(single-strand TBPs)：可結(jié)合于3′單鏈突出的末端，對于染色體末端的“戴帽”，以及端粒酶活性的調(diào)節(jié)具重要作用。

端粒酶的功能：

端粒酶的主要作用是維持端粒的長度。端粒酶不但可以維持已經(jīng)存在的端粒DNA，同時端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶能夠識別斷裂染色體的末端，重新將端粒重復(fù)序列加到染色體的斷裂末端或非端粒DNA上。端粒酶能利用端粒3′端單鏈為引物，自身的RNA 為模板合成端粒重復(fù)序列添加到染色體末端，從而延長端粒的長度。人的生殖細(xì)胞、造血干細(xì)胞及T，B 淋巴細(xì)胞中端粒酶有不同程度的表達(dá)，而在正常的體細(xì)胞中，端粒酶處于失活狀態(tài)，因此體細(xì)胞隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加端粒逐漸縮短。端粒的長度與有絲分裂次數(shù)相關(guān)，所以端粒又有細(xì)胞的“有絲分裂鐘”之稱。

9.描述The Nucleotide Excision Repair pathway。

當(dāng)DNA鏈上相應(yīng)位臵的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無法形成氫鍵，則需要以核苷酸切除修復(fù)(nucleotide-excision repair)方式進(jìn)行修復(fù)。

1）．切除損傷部位。一種專門的核酸切割酶識別并在已損傷的核苷酸5’和3’位分別切開磷酸糖苷鍵，產(chǎn)生一個由12～13個核苷酸（原核生物）或27～29個核苷酸（人類或其他高等真核生物）的小片段。

2）．DNA解鏈酶把切除的小片段核苷酸移去。

3）．DNA聚合酶I（原核）或DNA聚合酶E以完整的互補(bǔ)鏈為模板，按5’—3’方向DNA鏈，填補(bǔ)已切除的空隙。

4）．DNA連接酶封口，修復(fù)完成。

10.解釋recA, recB, recC，recD，RuvA，RuvB，RuvC genes 所編碼蛋白和Chi sites 在重組中的作用。

RceA蛋白具有鏈交換，ATP酶及蛋白酶活性。它能結(jié)合到ssDNA上，促使DNA分子間的鏈交換，我們將RecA催化單、雙鏈DNA的反應(yīng)分為三個階段： 1RecA結(jié)合到單鏈DNA上。

2單鏈DNA與其互補(bǔ)物在雙鏈上快速配對反應(yīng)，產(chǎn)生異性雙鏈連接

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3單鏈從雙鏈中轉(zhuǎn)移，取代了雙鏈中的一條鏈。

RecBCD是由recB，recC，recD三個基因編碼的三個亞單位組成的酶，具有：核酸外切酶V活性；解旋酶；核酸內(nèi)切酶；ATP酶；ssDNA外切酶活性。它能結(jié)合到雙鏈的上并使雙鏈解旋并分開，當(dāng)遇到Chi位點(diǎn)時，RecBCD就切開一條單鏈，并失去RecD亞單位，RecBC繼續(xù)解開雙鏈。這樣就得到了鏈交換和重組的位點(diǎn)。Chi是一個被recBCD基因編碼的酶的作用目標(biāo)。

RuvA辨認(rèn)Holliday連合處的結(jié)構(gòu)，RuvB是一個解旋酶，并以六聚體形式結(jié)合于雙鏈DNA上，解開雙鏈螺旋。

ruvC，編碼了一個末端核酸酶，它能確精地辨認(rèn)出Holliday結(jié)合處，結(jié)合到Holliday中間產(chǎn)物上，將這樣的結(jié)合處分開。

11.原核生物啟動子所組成的保守序列和終止子特異序列是什么？

原核生物中絕大部分的啟動子都存在位于-10bp處的TATAAT區(qū)和-35bp處的TTGACA區(qū)。這兩個區(qū)是相當(dāng)保守的序列，是RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合位點(diǎn)，能與?因子相互識別而具有很高的親和力。在-35區(qū)和-10區(qū)之間的距離17±1bp。保持啟動子這二段的序列以及它們之間的距離是很重要的，否則會改變它所控制的基因的表達(dá)水平。UP 元件，位于啟動子上游-57 和-47 富含A/T。(5'-AAAATTATTTT-3').不依賴于rho因子的終止子：終止位點(diǎn)上游一般都存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)。在終止位點(diǎn)前面有一段由6-8個A組成的序列，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3`端為寡聚U，這種結(jié)構(gòu)特征的存在決定了轉(zhuǎn)錄的終止。

依賴于rho因子的終止子：依賴rho因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)DNA序列缺乏共性。Rho因子是一個相對分子量為2.0×105的六聚體蛋白，是一種NTP酶，通過催化NTP的水解促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。RNA合成起始以后，rho因子即吸附在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿5`→3`方向朝RNA聚合酶移動，到達(dá)RNA的3`-OH端后取代了暫停在終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，使之從模板DNA上釋放mRNA，完成轉(zhuǎn)錄過程

12.RNA聚合酶I識別的啟動子包含有哪兩個部分？分別有什么蛋白因子識別？

RNA聚合酶Ⅰ只轉(zhuǎn)錄編碼核糖體RNA的基因，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)切割和加工后生成各種成熟rRNA RNA 聚合酶I 的轉(zhuǎn)錄單位有兩段起始調(diào)控序列，核心啟動子(Core promoter)和與之

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相距70bp 處的上游啟動元件upstream promoter element(UPE)（舊稱上游控制元件(Upstream control element，UCE)）

核心啟動子(Core promoter)位于起始位點(diǎn)周圍，從-45 延伸到+20，它本身就足以起始轉(zhuǎn)錄。但是，其效率可被位于-180 到-107 的上游啟動元件（UPE)顯著提高。與一般啟動子相比，這兩個區(qū)域都有不尋常的組成，富含G·C堿基對，而且它們約有85%是一致的。

RNA 聚合酶Ⅰ需要UBF1和SL1兩個輔助因子。UBF1 是一個單鏈多肽，它先后與UPE和核心啟動子上富含G·C 區(qū)結(jié)合。SL1 因子是一個四聚體蛋白，其作用類似于細(xì)菌，本身對于啟動子沒有特異性，但一旦UBF1 結(jié)合，SL1 就可以協(xié)同UPE結(jié)合到此覆蓋的DNA 延伸區(qū)域，可能其主要功能是使RNA 聚合酶正確的定位在起始位點(diǎn)。

發(fā)生在兩個部位的結(jié)合因子之間相互作用的詳細(xì)情況尚不清楚。兩個因子都結(jié)合后，RNA 聚合酶Ⅰ就與核心啟動子結(jié)合起始轉(zhuǎn)錄。

簡單答案：（RNA聚合酶I識別的啟動子包含-40~+50的近啟動子和-165~-40的遠(yuǎn)啟動子兩部分。近啟動子功能決定了轉(zhuǎn)錄起始的精確位臵，遠(yuǎn)啟動子的功能是影響轉(zhuǎn)錄的頻率。近啟動子有輔助因子UBFl識別，遠(yuǎn)啟動子有SL1識別。）

13.RNA聚合酶III識別的啟動子有哪幾類？其定位因子是什么？

RNA聚合酶Ⅲ的啟動子分成兩大類,由不同的因子采用不同方式識別。

5SrRNA和tRNA基因的啟動子是內(nèi)部（internal）啟動子，它們位于起點(diǎn)下游（Downstream）。

snRNA（核小RNA）基因的啟動子與其它啟動子相似，位于起始位點(diǎn)上游（Upstream）。在這兩種情況中，啟動子的功能元件都是由可被轉(zhuǎn)錄因子識別的序列組成，但它反過來指導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合。

5SrRN轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的啟動子位于基因+55和+80之間。

RNA聚合酶Ⅲ有三種類型啟動子包括兩種類型的內(nèi)部啟動子，每個都含有兩個分開的結(jié)構(gòu)，其中兩個短序列元件被一個多變的序列分開。類型Ⅰ（5SrRN）同boxA 序列和一個隔開的boxC組成，類型Ⅱ（tRNA）由boxA和一個隔開的boxB序列組成。類型Ⅱ啟動子上的A盒和B盒之間的距離可以變化很大，但兩盒不能過近，太近會失去其功能。

RNA聚合酶Ⅲ的第Ⅲ類啟動子有三個上游元件。負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄snRNA的基因，其元件主要包括：Oct-PSE-TATA(PSE：近端序列元件，提高轉(zhuǎn)錄效率)

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有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子包括TFⅢA、TFⅢB、TFⅢC, 在Ⅰ類啟動子的轉(zhuǎn)錄起始過程中，首先TFⅢA結(jié)合于內(nèi)部部啟動子的boxA，然后TFⅢC結(jié)合于boxC然后招募真正的起始因子TFⅢB，TFⅢB最后招募RNA聚合酶Ⅲ。

在Ⅱ類啟動子的轉(zhuǎn)錄起始過程中，首先TFⅢC結(jié)合于平boxA和boxB，然后招募真正的起始因子TFⅢB，后者招募RNA聚合酶Ⅲ。

（TFⅢB含TBP是真正的轉(zhuǎn)錄因子，A、C可被高鹽除掉，是裝配因子）

14.RNA聚合酶II識別的啟動子含有多種順式作用因子，請舉4例。

eg1: TATA box通常位于起始位點(diǎn)上游約25bp處，它組成唯一的上游啟動子元件，此元件距起始位點(diǎn)有相對固定的位臵。它可以在所有真核生物中找到。TATA盒傾向于被富含G*C對的序列環(huán)繞，可能是TATA盒起作用的一個因子。具有選擇定位轉(zhuǎn)錄點(diǎn)的功能，作為定位因子起作用的

eg2: GC box通常在起始位點(diǎn)上游40-70處，但在每一個啟動子中，GC盒前后的情況是不一樣的。功能是加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄，兩個方向都有效。

eg3: CAAT box決定了轉(zhuǎn)錄的效率，兩個方向都有效。eg4: 八聚體（8bp元件）能增強(qiáng)真核生物啟動子的轉(zhuǎn)錄功能。

15.列出能在真核生物細(xì)胞中表達(dá)載體的構(gòu)件名稱，并作出解釋？

真核表達(dá)系統(tǒng)中根據(jù)受體細(xì)胞的不同，其所應(yīng)用的載體和表達(dá)策略各有不同，據(jù)此可將真核生物表達(dá)系統(tǒng)分為三類：1酵母表達(dá)系統(tǒng)，2哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)，3昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，這三類的組成元件分述如下。

1.酵母表達(dá)系統(tǒng)的組成元件包括

1〉 遺傳標(biāo)記：利于重組子的篩選、鑒定 2〉 調(diào)控序列

a.ARS：酵母自主復(fù)制序列，相當(dāng)于復(fù)制起點(diǎn)，可啟動基因在酵母中的復(fù)制 b.2μ質(zhì)粒，酵母細(xì)胞中存在削奪不同類型的內(nèi)源性質(zhì)粒，其中一種稱為2μ質(zhì)粒，它以高拷貝數(shù)存在于細(xì)胞核外，為小球狀DNA，長約2μm，可以獨(dú)立復(fù)制轉(zhuǎn)錄

c.酵母啟動子：在小母表達(dá)載體中必需含有酵母啟動子，以啟動外源基因在酵母中的表達(dá)

d.酵母著絲粒區(qū)段：增加轉(zhuǎn)化的的穩(wěn)定性 2.哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的主要組成元件 1〉啟動子

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2〉增強(qiáng)子，3〉篩選標(biāo)記，4〉終止信號和多聚腺苷酸化信號：維系轉(zhuǎn)錄后能有效切割和多聚腺苷酸化，在真核表達(dá)載體中須含有轉(zhuǎn)錄終止信號和多聚腺苷酸化信號，5〉剪切信號，并非所有的cDNA都需要剪切信號但一般來說內(nèi)含子不會降低而是提高表達(dá)的效率，6〉復(fù)制元件：可提高外源基因的表達(dá)水平，7〉為了能方便化的大量重組DNA，哺乳動物表達(dá)載體通常含有一段原核系列。-3.昆蟲桿狀病毒載體——轉(zhuǎn)移載體的基本元件

1〉原核系列：包括復(fù)制起始點(diǎn)、抗性基因及多克隆位點(diǎn)。2〉桿狀病毒啟動子：常用的有P10啟動子

3〉桿狀病毒復(fù)制非必需區(qū)：多采用多角體蛋白側(cè)翼序列，提供轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒細(xì)胞內(nèi)同源重組的位點(diǎn)

昆蟲細(xì)胞加尾信號

16.請闡述ALTERNATIVE SPLICING的生理學(xué)意義。

選擇性剪接（ALTERNATIVE SPLICING）是指同一基因轉(zhuǎn)錄形成的初級RNA經(jīng)過不同的剪切和連接方式形成不同的RNA的過程。真核生物含有限數(shù)目的基因，但是當(dāng)嚴(yán)格需要時，真核生物通過一系列精確的工具來加工 mRNA,產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄類型。選擇性剪接屬于復(fù)雜性剪接，也就是說，一個基因的初始轉(zhuǎn)錄物能夠加工產(chǎn)生出不同的 mRNA,從而產(chǎn)生不止一種蛋白質(zhì)。一個選擇性剪接的例子就是SV40,當(dāng)它感染細(xì)胞時，引導(dǎo)2種蛋白質(zhì)的合成：大T抗原和小T抗原。這兩種蛋白質(zhì)表達(dá)自同一種前體mRNA，通過2個5'剪切位點(diǎn)及一個共同的3'剪切位點(diǎn)的不同加工過程，表達(dá)出2種不同的抗原。一般地，真核生物一個基因的外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目及所在位臵是固定的。但也可能出現(xiàn)外顯子和內(nèi)含子數(shù)目及所在位臵不固定的情況，選擇性剪接的直接后果是一個基因產(chǎn)生多個不同功能的蛋白質(zhì)。mRNA 選擇性剪接涉及生命現(xiàn)象的很多方面，如細(xì)胞分化，個體發(fā)育，免疫機(jī)理，某些遺傳病的發(fā)生等等。選擇性剪接在器官發(fā)育中具有重要意義，同樣的基因產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)，使得不同的組織，不同的器官各自分工，形成真核生物復(fù)雜的生命體。同時可以節(jié)省大量的遺傳信息。選擇性剪接使真核生物在蛋白質(zhì)組水平上表現(xiàn)出極高的復(fù)雜性，這就是人類的基因數(shù)目只有3 萬多個，卻有比其他生物高得多的進(jìn)化程度的一個重要原因。

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17.請闡述RIBOZYME的應(yīng)用？

（由于17、18題目相對開放靈活，沒有大篇幅詳細(xì)解答。請各位同學(xué)結(jié)合自己研究方向?qū)Ω信d趣的某一方面進(jìn)行詳細(xì)闡述，這里只起拋磚引玉作用。）

核酶(ribozyme)是一類具有催化活性的RNA 分子,可通過堿基配對特異地與相應(yīng)的RNA 底物結(jié)合,并在特定的位點(diǎn)切割底物RNA 分子。自美國科學(xué)家Cech 和Altman 等發(fā)現(xiàn)核酶至今的20多年來,人們利用核酶可以特異性地切割靶RNA序列的特點(diǎn),通過設(shè)計合適的核酶阻斷特定基因的表達(dá),已相繼對獲得性免疫缺陷綜合征、腫瘤、生殖系統(tǒng)疾病、病毒性肝炎、白血病、移植排斥反應(yīng)等進(jìn)行了廣泛深入的研究。核酶的種類很多，從結(jié)構(gòu)上看主要有發(fā)夾狀核酶(hairpin ribozyme)和錘頭狀核酶(hammerhead ribozyme)。

從目前來看，核酶的應(yīng)用主要在基因治療上。即將核酶基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出相應(yīng)的核酶，從而對mRNA進(jìn)行切割，在翻譯水平阻止某些基因的異常表達(dá)，達(dá)到治療疾病的目的。

核酶的應(yīng)用舉例：

1．核酶在腫瘤治療中的應(yīng)用 主要集中在以下幾個方面

①核酶與癌基因：核酶獨(dú)特的切割目的基因的方式有可能阻斷癌基因的表達(dá), 從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖, 并誘導(dǎo)其分化和凋亡。

②核酶與多藥耐藥性：多藥耐藥性(Multidrug resistance, MDR)是腫瘤化療失敗的主要原因。設(shè)計核酶抑制耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，使耐藥的腫瘤細(xì)胞重新獲得對化療藥物的敏感性。

③核酶和端粒酶：在高等生物細(xì)胞中, 除了精原細(xì)胞和少數(shù)造血細(xì)胞存在端粒酶活性外, 其余體細(xì)胞的端粒酶均處于失活狀態(tài)。而當(dāng)細(xì)胞惡變時, 端粒酶則被激活, 使端粒酶長度不隨細(xì)胞分裂而丟失, 從而使細(xì)胞逃避老化死亡, 保持無限復(fù)制與增殖?，F(xiàn)在, 人們已經(jīng)開始應(yīng)用核酶技術(shù)通過抑制端粒酶活性, 從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

2．核酶在抗病毒中的應(yīng)用

①抗艾滋病病毒HIV：HIV的長末端重復(fù)序列(LTR)參與病毒蛋白生成的調(diào)節(jié)，起著類似“開關(guān)”的作用。HIV感染人體后，病毒的RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成DNA，然后整合到細(xì)胞染色體上，可長期潛伏。只有某些特定的激活因子作用于已整合人細(xì)胞基因的 HIV 前病毒LTR時，才能啟動表達(dá)，或使表達(dá)從低水平轉(zhuǎn)入高水平。利用特異性核酶在細(xì)胞內(nèi)抑制HIV-1的LTR mRNA表達(dá)，能明顯降低細(xì)胞HIV-1病毒蛋白的表達(dá)水平，從而

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達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用。

②抗乙肝病毒HBV：核酶能特異地切割HBV前基因組RNA , 使其喪失模板 活性, 如針對HBcAg mRNA 設(shè)計的核酶, 可有限的剪切HBV mRNA;針對HBV 前C/C區(qū)基因設(shè)計的錘頭狀核酶, 經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后可定點(diǎn)切割靶RNA等。從而起到抗病毒的作用。

盡管核酶已經(jīng)開始應(yīng)用于人體內(nèi)治療,但尚有許多問題有待解決。例如:如何獲得高效、無毒的特異性核酶,如何選擇靶序列中最佳切割位點(diǎn),如何提高核酶進(jìn)入靶細(xì)胞的效率并穩(wěn)定發(fā)揮作用等。

18.請闡述RNA分子功能的研究進(jìn)展？

RNA是由4種核糖核苷酸組成的多核苷酸分子，在細(xì)胞內(nèi)的RNA按結(jié)構(gòu)與功能可分為若干類，最基礎(chǔ)的是mRNA、rRNA、tRNA。此外還有一些小RNA分子。

RNA是生物體內(nèi)最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，它與DNA和蛋白質(zhì)一起構(gòu)成生命的框架。但長久以來，RNA分子一直被認(rèn)為是小角色。它從DNA那兒獲得自己的順序，然后將遺傳信息轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)。然而，一系列發(fā)現(xiàn)表明，RNA事實(shí)上操縱著許多細(xì)胞功能。它可透過互補(bǔ)序列的結(jié)合反作用于DNA，從而關(guān)閉或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。甚至某些小分子RNA可以透過指導(dǎo)基因的開關(guān)來調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育時鐘。

近年來對RNA分子功能的研究主要集中在以下幾個方面 1．小干涉RNA(small interfering RNA, siRNA)雙股RNA(dsRNA)對基因表達(dá)的阻斷作用被稱為RNA干擾(RNA interference，RNAi)。雙股RNA(dsRNA)經(jīng)酶切后會形成很多小片段，如siRNA。siRNA一旦與信使RNA(mRNA)中的同源序列互補(bǔ)合，會導(dǎo)致mRNA失去功能，即不能轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，也就是使基因“沉默化”了。

2．小RNA(microRNA, miRNA)最近幾年來，科學(xué)家在線蟲(C.elegans)中相繼發(fā)現(xiàn)了能時序性調(diào)控發(fā)育的基因lin-4和let-7，將這類基因編碼的能時序調(diào)控發(fā)育進(jìn)程，長度約為22個核苷酸的小分子RNA稱為small temporal RNA(stRNA)。后來，科學(xué)家又相繼在線蟲、果蠅、鼠、人等生物中發(fā)現(xiàn)了許多類似的基因，把它統(tǒng)稱作miRNA(microRNA)。miRNA的主要功能是調(diào)節(jié)內(nèi)源基因的表達(dá)，參與細(xì)胞周期的調(diào)控及個體發(fā)育過程，同時它與在siRNA具有很大的相關(guān)性，可能對基因功能研究、人類疾病防治及生物進(jìn)化探索有重要的意義。

此外，2004年Tomoko Kuwabara和他的同事們發(fā)現(xiàn)一種小dsRNA能夠作用于神經(jīng)

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基因的表達(dá)，并且能在轉(zhuǎn)錄水平上直接誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化.這種RNA在基因轉(zhuǎn)錄水平上直接參與調(diào)控，它被命名為smRNA。

19.請闡述Aminoacyl tRNA synthetases 在蛋白質(zhì)翻譯中的作用。

在蛋白質(zhì)翻譯中，每種tRNA分子在它到達(dá)核糖體之前都需與相應(yīng)的氨基酸結(jié)合，這種結(jié)合是在一系列被稱為氨酰-tRNA合成酶作用下完成的。大多數(shù)細(xì)胞可產(chǎn)生二十種不同的氨酰-tRNA合成酶，每一種酶既識別tRNA，又能識別氨基酸，對兩者都具有高度專一性。它們各不相同，各負(fù)其責(zé)，使一種氨基酸與其相應(yīng)的一套tRNA分子結(jié)合。這些酶可以將正確的氨基酸裝載到相應(yīng)的tRNA分子上，于是，tRNA就可以執(zhí)行它從DNA的脫氧核糖核苷酸序列信息到蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息的翻譯功能，保證了蛋白質(zhì)翻譯的真實(shí)性。

20.闡述IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF的功能。

起始因子

IF-1：無特異功能，僅具有加強(qiáng)IF2和IF3的活性作用，尤其在70S起始復(fù)合物生成后促進(jìn)IF-2的釋放。

IF-2：對于30S起始符合物與50S亞基的連接是必需的。

IF-3：形成三元復(fù)合物；使70S核糖體顆粒解離為30S和50S亞基。延長因子

EF-Tu：與氨基酰-tRNA及GTP結(jié)合形成三元復(fù)合體。

EF-Ts：結(jié)合EF-Tu，臵換出GDP，再被GTP取代，使失活的EF-Tu·GDP變成有活性的EF-Tu·GTP。

EF-G：介導(dǎo)GTP水解，為核糖體的移動提供必需的能量。

終止因子：終止因子用以識別這些密碼子，并在A位點(diǎn)上與終止密碼子相結(jié)合，從而阻止肽鏈的繼續(xù)延伸。

RF1：識別UAG和UAA RF2：識別UGA和UAA RF3：具體作用還不肯定，可能與核糖體的解體有關(guān)。

21.原核生物如何Rescuing synthesis on “broken“ mRNA from ribosome。

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細(xì)菌mRNA壽命較短而且通常很快就被降解，所以其3’端很容易丟失。3’端丟失，一般此序列就沒有終止子了，這段系列就遭到嚴(yán)重的破壞。沒有終止子的mRNA，缺少了促使核糖體從其上面脫落的標(biāo)志。如果核糖體結(jié)合了這樣一個mRNA，那么它將在到達(dá)有缺陷的地方后就停止，并且無法有效的脫落。這對細(xì)胞是有害的。

E.coli有一種由ssrA基因編碼小分子RNA，其前體形式有457個核苷酸，成熟形式有363個核苷酸。這種RNA又稱為tmRNA 或 10SaRNA，它同時具有tRNA, mRNA兩者的性質(zhì)。它在蛋白質(zhì)合成過程中用來拯救被困在失去終止序列的缺陷RNA上的核糖體。tmRNA有若干重要的特性： 它的二級別結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)類似于tRNA.2 它受丙氨酸的調(diào)控。它能做為mRNA使用，用來知道合成一段10個氨基酸的寡肽ANDENYALAA。E.coli中的SsrB蛋白有一個丙氨酸末端，能夠結(jié)合tmRNA。后者將tmRNA帶到受困的核糖體的A位點(diǎn)。隨即肽基轉(zhuǎn)移酶把新生肽，也即是原先無法繼續(xù)合成的肽鏈的C端連接到SsrB蛋白的丙氨酸末端上。此時tmRNA也取代了原先的缺陷RNA，以自身為模板行使其mRNA功能，再合成10個氨基酸加到新生肽上。

最后加上的兩個氨基酸均為丙氨酸，它們是作為水解酶ClpAP和 ClpXP識別標(biāo)志而加上去了的。這樣，因?yàn)楹颂求w受困而合成不完全的肽鏈能夠即使的被水解。從而消除由于synthesis on “broken” mRNA from ribosome帶來的潛在危害。

22.真核生物翻譯scanning模型

Scanning模型是闡述核糖體在帶有5′帽子結(jié)構(gòu)的真核生物mRNA上翻譯的起始作用。

該模型認(rèn)為40s亞基首先識別5′端帽子，然后沿mRNA移動進(jìn)行掃描。從5′端的掃描是一個線性過程。當(dāng)40s亞基掃描先導(dǎo)序列時，可能遇到發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)，其穩(wěn)定性應(yīng)小于-30kcal，因?yàn)楦€(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)會阻止亞基的移動。

當(dāng)40s亞基遇到AUG起始密碼子時即停止移動。通常（不是所有情況下），第一個AUG三聯(lián)體密碼子為起始密碼子，AUG本身并不能阻止亞基移動，并且只有在合適的位臵上它才會被高效地識別。該位臵含有序列GCCAGCCAUGG，在AUG前三個堿基位臵上的嘌呤（A或G）和隨后的G非常重要，它們以10倍的關(guān)系影響翻譯效率，而其余的堿基對翻譯效率影響較低。當(dāng)前導(dǎo)序列很長時，第一個亞基還未離開起始位點(diǎn)，5′端又會被新的亞基識別，從而在前導(dǎo)序列和起始位點(diǎn)之間形成一串亞基。

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當(dāng)40s亞基定位于AUG上，即停止掃描，60s亞基加入，形成完整的80s起復(fù)合物。

23.解釋大腸桿菌乳糖操縱子的正負(fù)調(diào)控機(jī)制。

大腸桿菌乳糖操縱子包括三個結(jié)構(gòu)基因：Z，Y和A，以及啟動子，控制子和阻遏子等。轉(zhuǎn)錄時，RNA聚合酶首先與啟動區(qū)結(jié)合，通過操縱區(qū)向右轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄從啟動區(qū)開始，按Z-》Y-》A方向進(jìn)行，每次轉(zhuǎn)錄出來的一條mRNA上都帶有這三個基因。轉(zhuǎn)錄的調(diào)空是在啟動區(qū)和操縱區(qū)進(jìn)行的。

正調(diào)空機(jī)制：

cAMP-CAP復(fù)合物與 DNA結(jié)合改變了這一區(qū)段 DNA次級結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了RNA聚合酶結(jié)合區(qū)的解鏈。這可能是cAMP-CAP通過與RNA聚合酶結(jié)合，再與DNA結(jié)合，因而促進(jìn)了RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合，從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄。cAMP-CAP復(fù)合物的形成取決于細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，當(dāng)以葡萄糖為能源時，由于其抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性，ATP不能轉(zhuǎn)化為cAMP，細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度降低，形不成CAP-cAMP復(fù)合物，因而乳糖結(jié)構(gòu)基因不被轉(zhuǎn)錄。

負(fù)調(diào)空機(jī)制：

具有活性的阻遏物只要結(jié)合在操縱基因上，就可以阻擾RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活動，這是由于P和O位點(diǎn)有一定的重疊序列，O被阻遏物占據(jù)后，RNA聚合酶便不能結(jié)合到P位點(diǎn)上。阻遏物有無活性又受乳糖這種小分子誘導(dǎo)物的影響。阻遏物與乳糖結(jié)合后，由于發(fā)生構(gòu)象變化而失活，不再能同操縱基因結(jié)合，于是RNA聚合酶便能結(jié)合于啟動子，起動基因的表達(dá)，使乳糖利用的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA，進(jìn)而再翻譯出蛋白質(zhì)。在酶誘導(dǎo)合成的這個調(diào)節(jié)系統(tǒng)中，阻遏蛋白是主要的作用因子，而誘導(dǎo)物可以影響阻遏蛋白的活性，只有阻遏物被誘導(dǎo)失活，結(jié)構(gòu)基因才得以表達(dá)。

24.解釋大腸桿菌半乳糖操縱子的兩啟動子調(diào)控機(jī)制。

大腸桿菌半乳糖操縱子(galactose operon)包括3個結(jié)構(gòu)基因galE galT galk 分別編碼3種酶。這3個酶的作用是使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸。GalR與galE、T、K及操縱區(qū)O等離得很遠(yuǎn)，而galR產(chǎn)物對galO的作用與lacI-lacO的作用相同。

分析gal操縱子P-O區(qū)的DNA序列發(fā)現(xiàn)，該操縱子存在兩個相距僅5bp的啟動子，可以分別起始mRNA的合成。每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)S1和S2。

從S1起始的轉(zhuǎn)錄只有在培養(yǎng)基中無葡萄糖時，才能順利進(jìn)行，RNA聚合酶與S1的結(jié)合需要半乳糖、CAP和較高濃度的cAMP。從S2起始的轉(zhuǎn)錄則完全依賴于葡萄糖，高水平的cAMP-CAP能抑制由這個啟動子起始的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)有cAMP-CAP時，轉(zhuǎn)錄從S1開始，第13頁 暨南大學(xué) 2005 分子生物學(xué)復(fù)習(xí)題參考解答

2005生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)

當(dāng)無cAMP-CAP時，轉(zhuǎn)錄從S2開始。

為什么gal操縱子需要兩個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)？

半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細(xì)胞生長，而且與之相關(guān)的物質(zhì)--尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大腸桿菌細(xì)胞壁合成的前體。在沒有外源半乳糖的情況下，UDP-gal是通過半乳糖差向異構(gòu)酶的作用由UDP-葡萄糖合成的，該酶是galE基因的產(chǎn)物。生長過程中的所有時間里細(xì)胞必須能夠合成差向異構(gòu)酶?，F(xiàn)在設(shè)想只有S1一個啟動子，那么由于這個啟動子的活性依賴于cAMP-CRP，當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時就有能合成異構(gòu)酶。假如唯一的啟動子是S2，那么，即使在葡萄糖存在的情況下，半乳糖也將使操縱子處于充分誘導(dǎo)狀態(tài)，這無疑是一種浪費(fèi)。無論從必要性或經(jīng)濟(jì)性考慮，都需要一個不依賴于cAMP-CAP的啟動子（S1）對高水平合成進(jìn)行調(diào)節(jié)。

25.解釋大腸桿菌阿拉伯糖操縱子的C蛋白正負(fù)調(diào)控機(jī)制。

在大腸桿菌中阿拉伯糖的降解需要3個基因：araB、araA和araD，分別編碼3個酶。與araBAD相鄰的是一個復(fù)合的啟動子區(qū)域和一個調(diào)節(jié)基因araC，這個AraC蛋白同時顯示正、負(fù)調(diào)節(jié)因子的功能。AraBAD和araC基因的轉(zhuǎn)錄是分別在兩條鏈上以相反的方向進(jìn)行的。araBAD基因簇從啟動子PBAD開始向左進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，而araC基因則是從Pc向右轉(zhuǎn)錄

AraC蛋白作為PBAD活性正、負(fù)調(diào)節(jié)因子的雙重功能是通過該蛋白的兩種異構(gòu)體來實(shí)現(xiàn)的。Pr是起阻遏作用的形式，可以與現(xiàn)在尚未鑒定的類操縱區(qū)位點(diǎn)相結(jié)合，而Pi是起誘導(dǎo)作用的形式，它通過與PBAD啟動子結(jié)合進(jìn)行調(diào)節(jié)。在沒有阿拉伯糖時，Pr形式占優(yōu)勢；一旦有阿拉伯糖存在，它就能夠與AraC蛋白結(jié)合，使平衡趨向于Pi形式。這樣，阿拉伯糖的誘導(dǎo)作用就可以解釋為阿拉伯糖與Pr的結(jié)合，使Pr離開它的結(jié)合位點(diǎn)，然后，產(chǎn)生大量的Pi，并與啟動子結(jié)合。

26．解釋大腸桿菌衰減子（Attenuator）調(diào)控機(jī)制。

在阻遏型操縱子中第一個結(jié)構(gòu)基因之前常有一段能減弱轉(zhuǎn)錄的序列,稱為衰減子.當(dāng)操縱子被阻遏,RNA合成別終止,起終止轉(zhuǎn)錄信號做用的那一段核苷酸稱為衰減子.在色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)基因中的一個區(qū)域,此區(qū)域以形成不同二級結(jié)構(gòu)的方式,利用原核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯的偶聯(lián)對轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)節(jié).在衰減子調(diào)控方式中,起信號作用的是有特殊負(fù)載的氨基酰-tRNA的濃度.在MRNA水平上,該序列有4個調(diào)節(jié)區(qū),分別是1,2,3,4區(qū),其中1-2,2-3,3-4可自行配對形成RNA特有的發(fā)夾結(jié)構(gòu),但只有3-4配對才能形成莖部富含G-C,3’端有7個連續(xù)U的典型內(nèi)在終止子結(jié)構(gòu).此外,該序列還編碼含有14個氨基酸殘基的前導(dǎo)肽.前導(dǎo)肽編碼區(qū)3’端與1區(qū)部分重疊.在Trp操縱子中,該重疊序列含有兩個連續(xù)的第14頁 暨南大學(xué) 2005 分子生物學(xué)復(fù)習(xí)題參考解答

2005生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)

Trp密碼子,其他氨基酸操縱子相應(yīng)地也有類似特點(diǎn).以大腸桿菌色氨酸操縱子為例說明衰減子調(diào)控機(jī)制.細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄和翻譯幾乎同步進(jìn)行,RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)序列時,核糖體和相應(yīng)的tRNA緊隨其后翻譯前導(dǎo)肽.當(dāng)介質(zhì)中Trp濃度很低時,tRNA-trp相應(yīng)短缺,核糖體移至重疊區(qū)兩個Trp密碼子時因缺少相應(yīng)tRNA-trp而停滯不前,使1區(qū)不能和2區(qū)配對,所以2區(qū)和3區(qū)配對,結(jié)果不能形成3-4區(qū)配對的終止子結(jié)構(gòu),因此RNA聚合酶能繼續(xù)轉(zhuǎn)錄下去,操縱子得以表達(dá).當(dāng)介質(zhì)中Trp濃度高時,核糖體與足量的tRNA-trp緊隨聚合酶后迅速合成前導(dǎo)肽,并在位于1區(qū)和2區(qū)之間的終止密碼子處停止,不影響1區(qū)和2區(qū)的配對,所以3區(qū)可以和4區(qū)配對,形成終止子結(jié)構(gòu),使RNA聚合酶在此終止,從而阻止操縱子酶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯.第15頁

第四篇：分子生物學(xué)總結(jié)

SectionA 1 三個域：真細(xì)菌，古細(xì)菌，真核生物 2 組裝中的主要作用力：非共價健作用力

SectionB 1 蛋白質(zhì)純化的分析方法

正電荷：天冬氨酸 谷氨酸

負(fù)電荷：賴氨酸 精氨酸

組氨酸

極性：天冬酰胺 谷氨酰胺

蘇氨酸 絲氨酸 半胱氨酸

非極性：脂肪族 甘氨酸 丙氨酸 纈氨酸 亮氨酸

異亮氨酸 甲硫氨酸 脯氨酸

芳香族 苯丙氨酸

酪氨酸 色氨酸 Cys 二硫鍵 Gly 無手性 Pro 亞氨基酸

芳香族氨基酸最大吸收峰280mm 3 蛋白質(zhì)的一級(決定蛋白折疊及其最后的形狀的最重要的因素)：氨基酸脫水縮合形成肽鏈 N端到C端

共價鍵

二級：多肽鏈中空間結(jié)構(gòu)鄰近的肽鏈骨架通過氫鍵形成的特殊結(jié)構(gòu)。

α轉(zhuǎn)角

β螺旋 氫鍵為主要作用力

三級： 多肽鏈中的所有二級結(jié)構(gòu)和其他松散肽鏈區(qū)域（散環(huán)結(jié)構(gòu)）通過各種分子間作用力（非共價鍵為主），彎曲、折疊成具有特定走向的緊密球狀構(gòu)象。

非共價鍵

四級： 許多蛋白分子由多條多肽鏈（亞基，subunits）構(gòu)成。組成蛋白的各亞基以各種非共價鍵作用力為主，結(jié)合形成的立體空間結(jié)構(gòu)即為四級結(jié)構(gòu)。非共價鍵 偶極：電子云在極性共價鍵的兩原子間不均勻分布，使共價鍵兩端的原子分別呈現(xiàn)不同的電性

兼性離子：具有正電荷（堿性），又具有負(fù)電荷（酸性）的分子 雙極性分子：

Section C 1核酸的光學(xué)特性：

增色性：一種化合物隨著結(jié)構(gòu)的改變對光的吸收能力增加的現(xiàn)象 減色性：一種化合物隨著結(jié)構(gòu)的改變對光的吸收能力減少的現(xiàn)象 Reason: 堿基環(huán)暴露在環(huán)境中的越多，對紫外的吸收力越強(qiáng) Absorbance（吸收值）：Nucleotide > ssDNA/RNA > dsDNA 核酸的最大吸收峰260mm(堿基有芳香環(huán))芳香族氨基酸最大吸收峰280mm A260/A280:

純的 dsDNA：1.8 純的 RNA：2.0 純的 Protein：0.5 2 Tm 值（熔解溫度）：熱變性時，使得DNA雙鏈解開一半所需要的溫度。

Tm=2x(A+T)+ 4x(G+C)

Tm值與DNA分子的長度，及GC的含量成正比

Annealing（退火）:熱變性的DNA經(jīng)過緩慢冷卻后復(fù)性

快速冷卻： Stay as ssDNA

緩慢冷卻: 復(fù)性成dsDNA 3 脫氧核糖核酸與核糖核苷酸得到畫法 支持雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩個實(shí)驗(yàn)：查戈夫規(guī)則

X射線晶體衍射 5 雙螺旋的內(nèi)容：

雙鏈之間的關(guān)系：DNA分子由兩條鏈組成

雙鏈反向平行(5’?3’ 方向)

兩鏈的堿基通過氫鍵互補(bǔ)配對，A:T;G:C。

雙鏈序列反向互補(bǔ)

各基團(tuán)排列方式：糖-磷酸骨架DNA分子排列在外;

堿基對平面相互平行，排列在DNA分子的內(nèi)部?？臻g結(jié)構(gòu)為：右手雙螺旋結(jié)構(gòu)

每轉(zhuǎn)一圈~10個堿基對，每一圈長度33.2A

雙鏈螺旋中形成大溝，小溝。堿對DNA的影響：高pH值對DNA的影響比低pH值的要小。

高 pH 值(pH>11)會改變堿基構(gòu)象，使DNA變性（雙鏈解旋，成單鏈）

RNA的影響：高pH值，2’羥基會攻擊磷酸二酯鍵，使其斷裂，形成2’，3’-環(huán)式磷酸二酯鍵，從而使RNA分子斷裂 共價閉合環(huán)狀DNA(convalently closed circular DNA, cccDNA）。即通過共價鍵結(jié)合形成的封閉環(huán)狀DNA分子。超螺旋DNA（Supercoil DNA）:松弛型雙鏈DNA進(jìn)一步旋轉(zhuǎn)后，再形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)時，就會形成DNA超螺旋結(jié)構(gòu)

L=T+W 判斷是否為超螺旋 正負(fù)超螺旋 拓?fù)洚悩?gòu)酶：暫時斷裂DNA分子中一條或兩條單鏈上的磷酸二酯鍵，改變DNA分子的連接數(shù)及拓?fù)錉顟B(tài)。

功能：消除DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過程產(chǎn)生的超螺旋。

細(xì)胞中，Ⅰ型酶與Ⅱ型酶的活性保持一種平衡狀態(tài)。Ⅱ型酶的“使DNA超螺旋化” 與Ⅰ型酶“使DNA松馳化” 相抗衡，從而使DNA保持適當(dāng)?shù)某菪芏?。EB: 嵌入DNA配對堿基之間，使DNA分子在嵌入處局部解旋，增加ccDNA其它部位的正超螺旋 Type II RE

二型限制性內(nèi)切酶:識別位點(diǎn)一般為４～8個堿基對的回文序列

如：EcoRI

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5

Section D 1 染色體的折疊：串珠結(jié)構(gòu) ：核心組蛋白:H2A, H2B, H3 and H4.連接組蛋白 H1

核小體

30nm纖絲

高級環(huán)狀結(jié)構(gòu)（染色質(zhì)的最高結(jié)構(gòu)）

緊密纏繞結(jié)構(gòu) 著絲粒：兩側(cè)是大量的名叫衛(wèi)星DNA的重復(fù)序列

端粒：上百個短的重復(fù)序列

作用：端粒DNA 形成特殊的環(huán)狀二級結(jié)構(gòu)，保護(hù)染色體末端不被核酸外切酶降解。

抵消DNA復(fù)制時每一輪復(fù)制都導(dǎo)致兩末端形成的后隨鏈比母鏈要短一截的現(xiàn)象對染色體的影響 異染色質(zhì)：高度濃縮，無轉(zhuǎn)錄活性

常染色質(zhì)：結(jié)構(gòu)松散，有轉(zhuǎn)錄活性

DNaseI 敏感區(qū)域：對區(qū)域內(nèi)DNA的轉(zhuǎn)錄活躍

串珠結(jié)構(gòu)

DNaseI 超敏感區(qū)域：轉(zhuǎn)錄活躍的基因的調(diào)控區(qū)域

DNA裸露 4 原核染色體結(jié)構(gòu)：非特異性DNA結(jié)合蛋白：類組蛋白

位點(diǎn)特異性DNA結(jié)合蛋白：與特殊的DNA序列結(jié)合

有其他特殊的生理功能：RNA polymerases

對結(jié)構(gòu)域的形成也很重要

復(fù)性動力曲線：

Low C0t: 高重復(fù) 衛(wèi)星DNA Moderate C0t : 中重復(fù) 串聯(lián)基因簇

反轉(zhuǎn)座子 High C0t :單拷貝或低重復(fù)

大腸桿菌基因組 染色體結(jié)構(gòu)對基因轉(zhuǎn)錄的影響

CpG 抑制→CpG位點(diǎn)中的胞嘧啶的C-5常發(fā)生甲基化(CpG甲基化），CpG 甲基化可能可以DNA轉(zhuǎn)錄被限制→哺乳動物基因組中，有些區(qū)域含有很多未甲基化的CpG 位點(diǎn)，被稱為CpG 孤島。

甲基化—轉(zhuǎn)錄抑制

去甲基化—恢復(fù)轉(zhuǎn)錄

組蛋白的乙?；汉诵慕M蛋白N-端的Lys被乙?；?，DNA與核心組蛋白體解聚。Gene 表達(dá)被激活

去乙?；阂种?gene表達(dá)

組蛋白的磷酸化:對組蛋白 H1 磷酸化，抑制基因表達(dá) 其他組蛋白中心法則

Section E 1 DNA復(fù)制：細(xì)胞中，一條雙鏈DNA分子通過堿基配對，形成兩條與其序列相同的DNA雙鏈分子的過程。2

確定DNA半保留復(fù)制

半不連續(xù)復(fù)制 3 復(fù)制的基本步驟 復(fù)制為雙向

大腸桿菌的復(fù)制：

起始AT含量高的區(qū)域

參與蛋白：DnaA（復(fù)制起始因子)：識別并結(jié)合于重復(fù)序列上，驅(qū)使富含AT的重復(fù)序列解鏈，需負(fù)超螺旋，及ATP

DnaB(DNA解旋酶):DNA雙鏈解旋，形成復(fù)制叉

SSB:(單鏈結(jié)合蛋白):保持解旋部分的單鏈狀態(tài)

DnaG(引發(fā)酶/引物酶):RNA引物合成，引發(fā)復(fù)制 延伸

參與蛋白：DNA Pol III全酶：負(fù)責(zé)新鏈的合成:前導(dǎo)鏈，岡崎片段

DNA pol

I：復(fù)制中除去引物，填補(bǔ)引物處空缺

終止： 真核生物的復(fù)制：

一個細(xì)胞周期內(nèi)，一個DNA分子只能復(fù)制一次

Section F 1 復(fù)制忠實(shí)性的機(jī)制：

DNA復(fù)制的高精度：模板連和進(jìn)入核苷酸在DNA聚合酶的作用位點(diǎn)正確配對

3’到5’外切核酸酶對錯誤堿基的校正

錯配修復(fù) 2 holiday模型 3

Section K 編碼鏈 模板鏈 2 大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄

RNAP酶：核心酶：a 亞基：aNTD對核心酶的組裝很重要。

aCTD在識別啟動子、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平中起著非常重要的作用。

b 亞基：RNAP的催化中心。

與模板DNA、RNA產(chǎn)物、及底物核糖核苷酸緊密結(jié)合。

抗生素利福平結(jié)合在在b 亞基上，可以抑制RNAP的轉(zhuǎn)錄活性。

利福平只抑制轉(zhuǎn)錄的起始。

利迪鏈菌素只抑制延伸而不抑制轉(zhuǎn)錄起始

b’ 亞基：可能與RNAP的催化有關(guān)。

肝素與b’亞基結(jié)合后，能干擾RNAP與DNA的結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄。

w 亞基：可能與RNAP的組裝及維持RNAP結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)

s factor(s因子)：s factor 在啟動子特異性識別過程中至關(guān)重要 移動慢的原因：可以保持與翻譯同步。

與有些基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。

有利于轉(zhuǎn)錄終止

RNAP沒有3’ →5’外切酶活性，不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄校正。其錯配率達(dá)10-4。RNAP倒退暴露新合成的錯配堿基，可以有利于其他輔助核酸酶將錯配堿基切除，增加轉(zhuǎn)錄的忠實(shí)性。s70基礎(chǔ)啟動子的一般結(jié)構(gòu)

-10 序列：它對轉(zhuǎn)錄起始時，RNAP打開DNA雙鏈的過程非常重要。-

10序列到TSS位點(diǎn)的距離對轉(zhuǎn)錄效率也有很大的影響-35 序列：增強(qiáng)RNAP s factor 的識別能力及與DNA的結(jié)合能力 4 影響啟動子效率的DNA序列：

核心啟動子的序列：與保守序列越像，效率越高。

TSS周圍序列：影響起始效率。

轉(zhuǎn)錄單位的前30個核苷酸的堿基序列：影響RNAP從啟動子處移動出去（啟動子區(qū)清空）的速率。

核心啟動子附近的調(diào)控元件。轉(zhuǎn)錄的起始：開放復(fù)合物 閉合復(fù)合物 無效起始

延伸：啟動子的清空，鏈的延伸轉(zhuǎn)錄泡，s因子的循環(huán)利用

終止：依賴性 不依賴性

反復(fù)重復(fù)序列

Section L 1.順式作用元件（cis-acting elements）：一般為DNA上較為保守的、有著特異性序列或結(jié)構(gòu)的特定區(qū)域。它們只能影響與其在同一條染色體上的基因的活動。如：啟動子，轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點(diǎn)等。

反式作用基因/調(diào)節(jié)基因（trans-acting genes，regulator genes）

可以影響與他們不在同一條染色體上的基因的表達(dá)水平的DNA元件。2 乳糖操縱子 色氨酸操縱子 正負(fù)調(diào)控都可以有誘導(dǎo)和阻遏兩種調(diào)控方式。

正控誘導(dǎo)：誘導(dǎo)因子活化激活因子，使其可以增加基因的表達(dá)。（Lac operon，CRP調(diào)控）正控阻遏：共阻遏物使激活因子失活，減少基因的表達(dá)。負(fù)控誘導(dǎo)：誘導(dǎo)因子使阻遏蛋白失活，增加基因的表達(dá)。（Lac operon，lac repressor）負(fù)控阻遏:共阻遏物活化阻遏蛋白，使其可以降低基因的表達(dá)。（Trp operon，trp repressor）

Section M 增強(qiáng)子 沉默子 TFIID：可與多種核心啟動子元件或特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動二類轉(zhuǎn)錄預(yù)起始復(fù)合物組裝的通用轉(zhuǎn)錄因子。

TBP(TATA-box binding protein):可識別并結(jié)合TATA-box TAFII（TBP-associated factor II）：TBP關(guān)聯(lián)蛋白，TFIID中與TBP形成復(fù)合體的所有蛋白，～13個。

TFII H的結(jié)構(gòu)與功能：蛋白激酶(4 個亞基)：催化蛋白磷酸化。將NTP（一般為ATP）的g-磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白上。

磷酸化 RNA pol II 中的CTD 結(jié)構(gòu)域。TFIIE 刺激TFIIH介導(dǎo)的磷酸化反應(yīng)。DNA 解旋酶/ATPase(5 亞基)：

水解ATP，利用其能量打開DNA的雙鏈 TBP(TATA-binding protein): 確保 RNA Pol I能正確定位到轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域上。

SP1 為組成性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在所有的細(xì)胞中都存在，與基因本底表達(dá)水平有關(guān) SL1，選擇因子,RNA Pol I起始轉(zhuǎn)錄所必需的因子 CTD:羧基末端結(jié)構(gòu)域，的磷酸化狀態(tài)與轉(zhuǎn)錄進(jìn)程有關(guān)

轉(zhuǎn)錄起始時期，CTD結(jié)構(gòu)域一般處于去磷酸化形式，與結(jié)合啟動子有關(guān)。

轉(zhuǎn)錄延伸時期，CTD結(jié)構(gòu)域常處于磷酸化形式，與mRNA的加工有關(guān)。

Section N 1 DNA-binding domains（DBD）:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域

螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)（域）

鋅指結(jié)構(gòu)（域）

堿性結(jié)構(gòu)（域）

Dimerization domains：二聚體化結(jié)構(gòu)域

亮氨酸拉鏈 螺旋 散環(huán) 螺旋 DBD+DM 激活結(jié)構(gòu)域 酸性激活結(jié)構(gòu)域 富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域 富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域 LBD

Section O 真核生物中mRNA 加工的一般過程 5’加帽: CTD作用：轉(zhuǎn)錄起始時，參與加帽反應(yīng)的三種酶結(jié)合在RNA Pol II的CTD結(jié)構(gòu)域上。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物剛開始合成時，即對其5’端進(jìn)行加帽反應(yīng)。

作用：防止降解：核糖核酸酶一般不能降解帽結(jié)構(gòu)中的三磷酸鍵

幫助轉(zhuǎn)運(yùn)mRNA到細(xì)胞質(zhì)中

增強(qiáng)翻譯水平：mRNA需要帽結(jié)合蛋白的幫助才能更好的與核糖體結(jié)合 幫助去除pre-mRNA中的第一個內(nèi)含子。3’加Poly(A)尾：

作用：防止被核酸酶降解：增加mRNA的穩(wěn)定性

有助于mRNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)

參與pre-mRNA的最后一個內(nèi)含子的剪接。

增強(qiáng)mRNA的翻譯水平，增加基因的表達(dá) 剪接 甲基化 2 核酶有：有催化功能的RNA即為核酶

U2 U6 RNAP 3 RNA的多樣性：可變加工，反式剪接，RNA編輯 原核生物核糖體

真核生物核糖體 原核rRNA 加工的大致過程：形成多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與蛋白結(jié)合形成RNP，核苷酸修飾，逐級切割

真核rRNA 加工的大致過程：甲基化，切割。內(nèi)含子剪接 原核tRNA 加工的大致過程:將多順反子前體切割，分離出單順反子前體

單順反子前體進(jìn)一步被切割，形成與成熟tRNA長度一致分子（RNases D, E, F，P

.堿基修飾，形成成熟tRNA 真核tRNA 加工的大致過程：5’-末端成熟，3’-末端成熟（添加5’-CCA-3’）去除內(nèi)含子 7 miRNA and siRNA的調(diào)控機(jī)制：mRNA降解，抑制翻譯，抑制轉(zhuǎn)錄

Section P 1 遺傳密碼的特性:

蛋白的編碼信息由三聯(lián)體密碼子組成。

密碼子為連續(xù)的，之間無間隔、無重疊。

除三個終止密碼子之外，每個密碼子對應(yīng)一種氨基酸

有密碼簡并現(xiàn)象。即：多個密碼子對應(yīng)同一種氨基酸。

標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼子在各類生物中基本通用，不過少數(shù)生物體或細(xì)胞器中，有一些密碼子對應(yīng)的氨基酸與標(biāo)準(zhǔn)的不同。

生物對同義密碼子的使用經(jīng)常有偏好性。不同生物的密碼子偏好性不同。

基因一般不重疊。一段核酸分子一般只有一個開放閱讀框（open reading frame, ORF/可讀框），被翻譯成一個蛋白。

有些物種也有重疊基因的現(xiàn)象。開放閱讀框:ORF 從起始密碼子ATG 到終止密碼子

TGA,TAA or TAG 之間的連續(xù)的蛋白編碼序列

CDS 編碼序列 當(dāng)ORF可以預(yù)測一個蛋白時 3 tRNA 二級結(jié)構(gòu):三葉草結(jié)構(gòu) 4 tRNA的特異性加載：（翻譯的高保真性）

氨酰-tRNA合成酶對相應(yīng)tRNA分子有很強(qiáng)的專一性：第二密碼子：

氨酰-tRNA合成酶接受相應(yīng)氨基酸時有很強(qiáng)的忠實(shí)性：校正：雙篩選機(jī)制—酶的活性中心，酶中的編輯位點(diǎn) 氨酰-tRNA（AA-tRNA）： 3’-end加載了一個氨基酸的tRNA分子。是在蛋白質(zhì)合成中，將密碼子轉(zhuǎn)換氨基酸的適配器。

Section Q 1 密碼子與反密碼子的反向互補(bǔ)配對 一個tRNA可識別的密碼子數(shù)由反密碼子的第一位堿基決定

擺動學(xué)說：第三位密碼子與第一位反密碼子的配對可以擺動

反密碼子第一位為A或C時，配對無搖擺現(xiàn)象。3 核糖體的E，P，A位點(diǎn) A位：接受AA-tRNA部位.除了起始氨酰-tRNA，其他所有AA-tRNA都只能進(jìn)A位點(diǎn)。P位：肽?；?tRNA結(jié)合部位。起始氨酰-tRNA也進(jìn)入此位點(diǎn)。E位：空載tRNA離開核糖體的位點(diǎn)。4 核糖體各亞基的功能

核糖體小亞基功能：結(jié)合mRNA

促進(jìn)密碼子與反密碼子的正確結(jié)合 mRNA移位

大亞基的功能A位、P位、肽酰轉(zhuǎn)移酶（轉(zhuǎn)肽酶）中心等在大亞基上。

負(fù)責(zé)攜帶AA-tRNA、肽鍵/肽鏈的形成 5 翻譯的基本內(nèi)容 核糖體與mRNA結(jié)合

氨酰tRNA逐個進(jìn)入核糖體

氨酰tRNA通過反密碼子與mRNA互補(bǔ)配對 氨酰tRNA分子的氨基酸之間形成肽鍵。空載tRNA的釋放 肽鏈的釋放

第五篇：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科班分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)試卷

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本班《分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)》試卷

一.選擇題（在備選答案中選擇一個最佳答案,每題2分,共20分）:

1.在核酸提取時,常需要使用氯化鈉,醋酸鈉等鹽溶液,真正的目的是（）

A.中和核酸的負(fù)離子,使其易于沉淀B.調(diào)節(jié)PH值

C.保持核算的完整性D.提高核酸的濃度

E.無特定目的2.在一個DNA分子中,如G所占摩爾比為17.2%,則A所占摩爾比為（）

A.82.8%B.32.8%C.17.2%D.65.6%E.無法計算

3.下列那項(xiàng)不是擴(kuò)增反應(yīng)所必需的?（）

A.引物和模板B.dNTPC.Mg++D.DNaseE.緩沖液

4.下列那項(xiàng)是分子生物學(xué)技術(shù)形成的理論基礎(chǔ)?（）

A.基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系B.基因結(jié)構(gòu)變異與疾病的關(guān)系

C.病原微生物的基因結(jié)構(gòu)特征D.基因的表達(dá).調(diào)控與疾病的關(guān)系E.以上皆是

5.分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)主要包括那些技術(shù)?（）

A.核酸分子雜交技術(shù)B.DNA測序技術(shù)

C.PCR技術(shù)D.DNA重組技術(shù)

E.以上全是

6.下列哪項(xiàng)檢測需應(yīng)用分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)?（）

A.肝功能檢測B.乙肝兩對半檢測

C.乙肝病毒DNA(HBV-DNA)檢測D.腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)

E.病原微生物培養(yǎng)

7.在核酸的分離純化過程中,為保證其一級結(jié)構(gòu)的完整性,應(yīng)采?。ǎ?/p>

A.盡量簡化分離步驟,縮短提取時間B.適當(dāng)延長提取時間

C.在37攝氏度條件下進(jìn)行D.加入Mg++,Ca++等二價金屬離子E.以上全是

8.有一核酸樣品,測得A260/A280=2.0,請問該樣品屬于哪類核酸樣品?（A.DNAB.RNA）

C.是DNA,但有蛋白質(zhì)污染D.是RNA,但有蛋白質(zhì)污染

E.DNA和RNA

9.在RNA提取和純化過程中,為避免Rnase污染而導(dǎo)致RNA的降解,應(yīng)采?。ǎ?/p>

A.在潔凈的實(shí)驗(yàn)室里操作B.帶手套和口罩

C.所用器材高壓消毒或DEPC處理D.冰浴下操作

E.以上皆是

10.隨機(jī)引物標(biāo)記法全程標(biāo)記DNA時,需選用下列哪種酶?（）

A.DNA多聚酶I的Kelnow片段B.TaqDNA聚合酶

C.限制性內(nèi)切酶D.DNA連接酶

E.末端轉(zhuǎn)移酶

二.判斷題：(你認(rèn)為下列敘述正確的請?jiān)陬}后括號內(nèi)打√,錯誤的打×，每題2分,共6分)

1.雙脫氧核酸鏈終止法是最常用的DNA測序技術(shù)（）

2.TapDNA聚合酶的作用是催化DNA合成，但由于缺乏3’→5’外切酶活性，無校正功能，所以在復(fù)制合成新鏈過程中可能會發(fā)生堿基錯配，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的錯誤（）

3.采用加熱煮沸法可使RNase完全失活（）

三：填空題(每空格2分,共24分):

1.在選擇核酸的分離純化方法，應(yīng)遵循的總原則是：一是保證核酸（一級結(jié)構(gòu)的完整性）；二是盡可能（排除其他分子的污染，保證核酸樣品的純度）。

2.在PCR反應(yīng)中，Mg++是個至關(guān)重要的因素，濃度（過低）會降低酶的活性，濃度（過高）又會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

3.用于核酸雜交的普通硝酸纖維素膜最大的優(yōu)點(diǎn)是（本底低），因而最容易檢測雜交信號，缺點(diǎn)是（脆性大）易破裂，且隊(duì)＜５００bp的核酸結(jié)合力低。

4． 整個核酸雜交反應(yīng)主要由（預(yù)雜交）、（雜交）和（洗脫）三個步驟組成。

5.轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上的核酸，其與濾膜的結(jié)合是松散的，需做進(jìn)一步的固定，常用的固定方法是（烘烤）、（紫外線固定）和（堿固定）。

三.名詞解釋：(每題4分,共20分):

1.融點(diǎn)曲線分析技術(shù)：是根據(jù)野生型序列和突變序列因不同Tm而產(chǎn)生不同的融點(diǎn)曲線而設(shè)計的。

2.探針:指所有能與特定的靶分子發(fā)生特異性的相互作用，并可以被檢測的分子。

3.Tm值： DNA熔解溫度，指把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半時的溫度。

4.轉(zhuǎn)染:將外源DNA直接導(dǎo)入真核生物細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)染。

5.轉(zhuǎn)化:將重組的DNA分子導(dǎo)入細(xì)菌，使其在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增及表達(dá)的過程稱為轉(zhuǎn)化。

四.問答題:（每題10分，共30分）

1.簡述限制性內(nèi)切酶的定義、命名原則和分類。

答：定義：限制性內(nèi)切酶是能識別和水解雙鏈DNA分子內(nèi)特異序列的核酸水解酶類。

命名：通常由3個斜體字母表示，第1個大寫字母為來源微生物的屬名第1個字母，第2、第3個小寫子母取微生物種名的頭兩個字母。

分類：根據(jù)酶分子組成及裂解方式的不同，將限制性內(nèi)切酶分3類，Ⅰ類和Ⅲ類限制性內(nèi)切酶在同一酶分子中兼有修飾（甲基化）作用和依賴于ATP的限制水解活性，Ⅱ類限制性內(nèi)切酶能識別并水解特異性的核苷酸序列是DNA重組技術(shù)中最重要的工具。

2.PCR引物的設(shè)計應(yīng)遵循哪些原則。

答：1.用于PCR反應(yīng)的引物需要兩條，分別設(shè)在被擴(kuò)增目的的片段的兩端，并分別與模版正負(fù)鏈序列互補(bǔ)。

2.引物的長度一般以18-25個核苷酸為宜，引物過長容易產(chǎn)生寡核苷酸的鏈內(nèi)互補(bǔ)，形成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，影響引物和模板之間的互補(bǔ)。

3.兩條引物之間尤其在3’端的序列不能有互補(bǔ)，以免形成引物二聚體。

4.引物的堿基組成應(yīng)平衡，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積。

5.PCR擴(kuò)增中的退火溫度是根據(jù)引物的Tm值而決定的，兩條引物的Tm值不能差太大。

6.根據(jù)需要，可在合成引物時于其5’端加修飾成分。

3.試述實(shí)時熒光PCR水解探針法的實(shí)驗(yàn)原理？

答：原理：PCR反應(yīng)體系中除有兩條引物外還需要一條熒光素標(biāo)記的探針。探針的5’端和3’端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)R和熒光淬滅基團(tuán)Q，當(dāng)探針完整時R基團(tuán)與Q基團(tuán)分別位于探針的兩端，Q基團(tuán)抑制R基團(tuán)使其不能發(fā)射熒光。PCR過程中，TaqDNA聚合酶沿著模板移動各成新鏈，當(dāng)移動到模板互補(bǔ)的探針處時，TaqDNA聚合酶同時還發(fā)揮其5’-3’外切核酸酶活性，將探針的脫氧核苷三磷酸逐個水解，R基團(tuán)與Q基團(tuán)隨子分離。此時R基團(tuán)不再受Q基團(tuán)的抑制而發(fā)射熒光，儀器的檢測系統(tǒng)便可測得熒光信號。