第一篇：生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器使用方法與保養(yǎng)

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器使用方法與保養(yǎng) 點(diǎn)擊次數(shù)：786 發(fā)布時(shí)間：2009-9-10 分子生物學(xué)操作中會(huì)涉及一系列儀器，使用不當(dāng)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗、減少儀器使用壽命或損壞儀器。因此在進(jìn)行操作前細(xì)致地了解各種儀器的使用方法及注意事項(xiàng)，是使后繼實(shí)驗(yàn)事半功倍的一個(gè)必要準(zhǔn)備。

一、冷凍離心機(jī)

低溫分離技術(shù)是分子生物學(xué)研究中必不可少的手段。基因片段的分離、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實(shí)驗(yàn)中，都離不開低溫離心技術(shù)，因此低溫冷凍離心機(jī)已成為分子生物學(xué)研究中必需的重要工具。

使用方法：

1.離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的地板或平臺(tái)上，并力求使機(jī)器處于水平位置以免離心時(shí)造成機(jī)器震動(dòng)。

2.打開電源開關(guān)，按要求裝上所需的轉(zhuǎn)頭，將預(yù)先以托盤天平平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上(離心筒須與樣品同時(shí)平衡)，關(guān)閉機(jī)蓋。

3.按功能選擇鍵，設(shè)置各項(xiàng)要求：溫度、速度、時(shí)間、加速度及減速度，帶電腦控制的機(jī)器還需按儲(chǔ)存鍵，以便記憶輸入的各項(xiàng)信息。

4.按啟動(dòng)鍵，離心機(jī)將執(zhí)行上述參數(shù)進(jìn)行運(yùn)作，到預(yù)定時(shí)間自動(dòng)關(guān)機(jī)。

5.待離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動(dòng)后打開機(jī)蓋，取出離心樣品，用柔軟干凈的布擦凈轉(zhuǎn)頭和機(jī)腔內(nèi)壁，待離心機(jī)腔內(nèi)溫度與室溫平衡后方可蓋上機(jī)蓋。

注意事項(xiàng)：

1.機(jī)體應(yīng)始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線。

2.開機(jī)前應(yīng)檢查轉(zhuǎn)頭安裝是否牢固，機(jī)腔有無異物掉入。

3.樣品應(yīng)預(yù)先平衡，使用離心筒離心時(shí)離心筒與樣品應(yīng)同時(shí)平衡。

4.揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏，以免腐蝕機(jī)腔或造成事故。

5.擦拭離心機(jī)腔時(shí)動(dòng)作要輕，以免損壞機(jī)腔內(nèi)溫度感應(yīng)器。

6.每次操作完畢應(yīng)作好使用情況記錄，并定期對(duì)機(jī)器各項(xiàng)性能進(jìn)行檢修。

7.離心過程中若發(fā)現(xiàn)異常現(xiàn)象，應(yīng)立即關(guān)閉電源，報(bào)請有關(guān)技術(shù)人員檢修。

附：相對(duì)離心力與每分鐘轉(zhuǎn)速的換算

離心機(jī)的轉(zhuǎn)速，在以前實(shí)驗(yàn)資料中一般以每分鐘多少轉(zhuǎn)來表示。由于離心力不僅為轉(zhuǎn)速函數(shù)，亦為離心半徑的函數(shù)，即轉(zhuǎn)速相同時(shí)，離心半徑越長，產(chǎn)生的離心力越大。因此僅以轉(zhuǎn)速表達(dá)離心力是不夠科學(xué)的，近年來主張用相對(duì)離心力(RCF)來表示比較合理?，F(xiàn)在國際資料中，已改用相對(duì)離心力來表示。

二、PCR擴(kuò)增儀

目前各公司提供的PCR儀操作方法各有不同，按其操作說明進(jìn)行操作。

值得提出的是，在使用一定時(shí)期后，樣品孔的實(shí)際溫度與儀器顯示溫度有時(shí)會(huì)有較大差異，應(yīng)當(dāng)請廠商的技術(shù)支持人員校對(duì)儀器的各項(xiàng)性能。

三、數(shù)字式酸度計(jì)

【一】、準(zhǔn)備工作

1.儀器應(yīng)平放在符合使用環(huán)境的工作臺(tái)上，依視覺角度支起支架。

2.pH值的定位測量法：

(一)二點(diǎn)定位法(高精度測量方法)(1)連接好電極線路，將參比電極及活化滿24h以上清潔的PH電極移入第一標(biāo)準(zhǔn)緩沖液pH1中(例pH1=4.00)，待儀器響應(yīng)穩(wěn)定后，調(diào)節(jié)定位旋鈕至儀器顯示為“0.00”；

(2)將電級(jí)系統(tǒng)從第1種標(biāo)準(zhǔn)液中取出，用去離子水沖洗干凈后以濾紙吸干電級(jí)表面水份，移入第2種標(biāo)準(zhǔn)液(例pH2=9.18)中，儀器響應(yīng)穩(wěn)定后，調(diào)節(jié)斜率旋鈕，使儀器顯示為(△pH=pH1-pH2=9.18-4.00=5.18)此后斜率旋鈕不可再動(dòng)，除非更換電極系統(tǒng)；

(3)斜率調(diào)節(jié)完成后，重新調(diào)節(jié)定位旋鈕，使儀器顯示第2種標(biāo)準(zhǔn)液的實(shí)際pH值(9.18)，至此2點(diǎn)定位結(jié)束；

(4)將電極從第2種標(biāo)準(zhǔn)液中取出沖洗、吸干后移入待測溶液中，儀器響應(yīng)穩(wěn)定后顯示的數(shù)值即為待測溶液的pH值。

(二)一點(diǎn)定位法(粗略測量法)

(1)將溫度補(bǔ)償旋鈕調(diào)至溶液溫度值；

(2)向左將斜率補(bǔ)償旋鈕旋轉(zhuǎn)至頭；

(3)將電級(jí)系統(tǒng)移入標(biāo)準(zhǔn)液中(一點(diǎn)法僅用一種標(biāo)準(zhǔn)液，如pH=4.00時(shí))，調(diào)節(jié)定位旋鈕使儀器顯示“4.00”；

(4)取出電級(jí)沖洗吸干水分后移至待測溶液中，儀器響應(yīng)穩(wěn)定后顯示的數(shù)值即為待測溶液的pH值。

(三)溫度的測量

1.將功能選擇撥至溫度檔。

2.將溫度探頭插入插孔，并將溫度探頭置于環(huán)境條件或溶液中，儀器響應(yīng)穩(wěn)定后儀器顯示值即為環(huán)境條件或溶液溫度值。

(四)注意事項(xiàng)

1.認(rèn)真做好儀器使用前準(zhǔn)備工作。

2.儀器通電后或測量過程中出現(xiàn)顯示不穩(wěn)或亂跳現(xiàn)象，應(yīng)切斷電源進(jìn)行檢查，如電壓、預(yù)熱時(shí)間及電極系統(tǒng)等是否正常。

3.使用不同電極應(yīng)注意排除離子的干擾，選擇好鹽橋，必要時(shí)應(yīng)使用離子強(qiáng)度固定劑。

4.電極系統(tǒng)從第1種溶液取出移入第2種溶液之前，須用去離子水或雙蒸水清洗干凈，再用濾紙吸干表面水分，以免影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

5.儀器應(yīng)存放于干燥、清潔無腐蝕的場所，每次測量結(jié)束后應(yīng)關(guān)閉電源，退出電極及溫度探頭妥善保存。玻璃電極清洗后可浸于去離子水待用(注意水面不得低于玻璃球泡)，甘汞電極清潔后套上橡皮帽置于配套盒中保存，當(dāng)甘汞電極內(nèi)充液泄漏或不飽和及鹽橋中斷時(shí)，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充飽和內(nèi)充液。

6.該類儀器均采用大規(guī)模集成電路，輸入阻值較高，在對(duì)儀器內(nèi)部進(jìn)行任何零部件修理焊接時(shí)，應(yīng)使用45W以下有良好地線的烙鐵，無接地線烙鐵應(yīng)撥下電源插頭焊接?！径?、pH(酸堿度)測量

1.將功能選擇撥至“pH”檔，調(diào)節(jié)定位旋扭，斜率補(bǔ)償旋鈕及溫度補(bǔ)償旋鈕顯示值應(yīng)有相應(yīng)變化。

2.通過儀器溫度檔測定標(biāo)準(zhǔn)液及待測樣品液溫度(要求兩種液體溫度保持一致，以減少測定誤差)，并用溫度補(bǔ)償旋鈕調(diào)節(jié)至溶液實(shí)際溫度值。

四、分光光度計(jì)

不同物質(zhì)對(duì)不同波長入射光的吸收程度各不相同，從而形成特征性的吸收光譜。分光光度法不僅適應(yīng)于可見光區(qū)，同時(shí)還可擴(kuò)展至紫外光區(qū)及紅外光區(qū)，因此給科研實(shí)驗(yàn)帶來了極大方便。下面重點(diǎn)介紹分光光度計(jì)的使用及注意事項(xiàng)。

使用規(guī)則：

1.接通穩(wěn)壓器電源，待穩(wěn)壓器輸出電壓穩(wěn)定至200V后打開光度計(jì)電源，儀器自動(dòng)進(jìn)入初始化。

2.初始化約需時(shí)10 min，內(nèi)容包括：①尋找零級(jí)光；②建立基線；③最后當(dāng)顯示器指示××nm時(shí)，表明儀器完成初始化程序，可進(jìn)入檢測狀態(tài)。

3.按要求輸入各項(xiàng)參數(shù)，選擇相應(yīng)比色杯(玻璃或石英)，將空白管、標(biāo)準(zhǔn)管及待測管依次放入比色皿架內(nèi)，關(guān)上比色池蓋。

4.以空白管自動(dòng)調(diào)零。

5.試樣槽依次移至樣品位置，待數(shù)據(jù)顯示穩(wěn)定后按“START/STOP”鍵，打印機(jī)自動(dòng)打印所測數(shù)據(jù)，重復(fù)上述步驟，直到所有樣品檢測完畢。

6.檢測結(jié)束后應(yīng)及時(shí)取出比色杯，并清洗干凈放回原處，同時(shí)關(guān)上儀器電源開關(guān)及穩(wěn)壓器電源開關(guān)，做好使用情況登記。

注意事項(xiàng)：

1.儀器初次使用或使用較長時(shí)間(一般為一年)，需檢查波長準(zhǔn)確度，以確保檢測結(jié)果的可靠性。

2.由于長途運(yùn)輸或室內(nèi)搬運(yùn)可能造成光源位置偏移，導(dǎo)致亮電流漂移增大。此時(shí)對(duì)光源位置進(jìn)行調(diào)整，直至達(dá)到有關(guān)技術(shù)指標(biāo)為止。若經(jīng)調(diào)整校正后波長準(zhǔn)確度、暗電源漂移及亮電流漂移三項(xiàng)關(guān)鍵指標(biāo)仍未符合要求，則應(yīng)停止使用，并及時(shí)通知有關(guān)技術(shù)人員檢修。

3.每次檢測結(jié)束后應(yīng)檢查比色池內(nèi)有否溶液溢出，若有溢出應(yīng)隨時(shí)用濾紙吸干，以免引起測量誤差或影響儀器使用壽命。

4.儀器每次使用完畢，應(yīng)于燈室內(nèi)放置數(shù)袋硅膠(或其它干燥劑)，以免反射鏡受潮霉變或沾污，影響儀器使用，同時(shí)蓋好防塵罩。

5.儀器室應(yīng)通常保持潔凈干燥，室溫以5-35℃為宜，相對(duì)溫度不得超過85%。有條件者應(yīng)于室內(nèi)配備空調(diào)機(jī)及除濕機(jī)，以確保儀器性能穩(wěn)定。

6.儀器室不得存放酸、堿、揮發(fā)性或腐蝕性等物質(zhì)，以免損壞儀器。

7.儀器長時(shí)間不用時(shí)，應(yīng)定時(shí)通電預(yù)熱，每周1次，每次30min，以保證儀器處于良好使用狀態(tài)。

五、電泳儀

電泳技術(shù)是分子生物學(xué)研究不可缺少的重要分析手段。電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳兩大類，自由界面電泳不需支持物，如等電聚焦電泳、等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等，這類電泳目前已很少使用。而區(qū)帶電泳則需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，常用的支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠-G薄層等，分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的是瓊脂糖凝膠電泳。所謂電泳，是指帶電粒子在電場中的運(yùn)動(dòng)，不同物質(zhì)由于所帶電荷及分子量的不同，因此在電場中運(yùn)動(dòng)速度不同，根據(jù)這一特征，應(yīng)用電泳法便可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析，或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M(jìn)行組份分析或單個(gè)組份提取制備，這在臨床檢驗(yàn)或?qū)嶒?yàn)研究中具有極其重要的意義。電泳儀正是基于上述原理設(shè)計(jì)制造的。下面簡單介紹其使用方法及注意事項(xiàng)。

使用方法：

1.首先用導(dǎo)線將電泳槽的兩個(gè)電極與電泳儀的直流輸出端聯(lián)接，注意極性不要接反。

2.電泳儀電源開關(guān)調(diào)至關(guān)的位置，電壓旋鈕轉(zhuǎn)到最小，根據(jù)工作需要選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電流范圍。

3.接通電源，緩緩旋轉(zhuǎn)電壓調(diào)節(jié)鈕直到達(dá)到的所需電壓為止，設(shè)定電泳終止時(shí)間，此時(shí)電泳即開始進(jìn)行。

4.工作完畢后，應(yīng)將各旋鈕、開關(guān)旋至零位或關(guān)閉狀態(tài)，并撥出電泳插頭。

注意事項(xiàng)：

1.電泳儀通電進(jìn)入工作狀態(tài)后，禁止人體接觸電極、電泳物及其它可能帶電部分，也不能到電泳槽內(nèi)取放東西，如需要應(yīng)先斷電，以免觸電。同時(shí)要求儀器必須有良好接地端，以防漏電。

2.儀器通電后，不要臨時(shí)增加或撥除輸出導(dǎo)線插頭，以防短路現(xiàn)象發(fā)生，雖然儀器內(nèi)部附設(shè)有保險(xiǎn)絲，但短路現(xiàn)象仍有可能導(dǎo)致儀器損壞。

3.由于不同介質(zhì)支持物的電阻值不同，電泳時(shí)所通過的電流量也不同，其泳動(dòng)速度及泳至終點(diǎn)所需時(shí)間也不同，故不同介質(zhì)支持物的電泳不要同時(shí)在同一電泳儀上進(jìn)行。

4.在總電流不超過儀器額定電流時(shí)(最大電流范圍)，可以多槽關(guān)聯(lián)使用，但要注意不能超載，否則容易影響儀器壽命。

5.某些特殊情況下需檢查儀器電泳輸入情況時(shí)，允許在穩(wěn)壓狀態(tài)下空載開機(jī)，但在穩(wěn)流狀態(tài)下必須先接好負(fù)載再開機(jī)，否則電壓表指針將大幅度跳動(dòng)，容易造成不必要的人為機(jī)器損壞。

6.使用過程中發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象，如較大噪音、放電或異常氣味，須立即切斷電源，進(jìn)行檢修，以免發(fā)生意外事故。

六、分析天平

分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方法，是獲得可靠分析結(jié)果的保證。分析天平的種類很多，有普通分析天平、半自動(dòng)/全自動(dòng)加碼電光投影阻尼分析天平及電子分析天平等。下面就電子分析天平的使用方法及注意事項(xiàng)做一介紹。

操作方法：

1.檢查并調(diào)整天平至水平位置。

2.事先檢查電源電壓是否匹配(必要時(shí)配置穩(wěn)壓器)，按儀器要求通電預(yù)熱至所需時(shí)間。

3.預(yù)熱足夠時(shí)間后打開天平開關(guān)，天平則自動(dòng)進(jìn)行靈敏度及零點(diǎn)調(diào)節(jié)。待穩(wěn)定標(biāo)志顯示后，可進(jìn)行正式稱量。

4.稱量時(shí)將潔凈稱量瓶或稱量紙置于稱盤上，關(guān)上側(cè)門，輕按一下去皮鍵，天平將自動(dòng)校對(duì)零點(diǎn)，然后逐漸加入待稱物質(zhì)，直到所需重量為止。

5.被稱物質(zhì)的重量是顯示屏左下角出現(xiàn)“→”標(biāo)志時(shí)，顯示屏所顯示的實(shí)際數(shù)值。

6.稱量結(jié)束應(yīng)及時(shí)除去稱量瓶(紙)，關(guān)上側(cè)門，切斷電源，并做好使用情況登記。

注意事項(xiàng)：

1.天平應(yīng)放置在牢固平穩(wěn)水泥臺(tái)或木臺(tái)上，室內(nèi)要求清潔、干燥及較恒定的溫度，同時(shí)應(yīng)避免光線直接照射到天平上。

2.稱量時(shí)應(yīng)從側(cè)門取放物質(zhì)，讀數(shù)時(shí)應(yīng)關(guān)閉箱門以免空氣流動(dòng)引起天平擺動(dòng)。前門僅在檢修或清除殘留物質(zhì)時(shí)使用。

3.電子分析天平若長時(shí)間不使用，則應(yīng)定時(shí)通電預(yù)熱，每周一次，每次預(yù)熱2h，以確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。

4.天平箱內(nèi)應(yīng)放置吸潮劑(如硅膠)，當(dāng)吸潮劑吸水變色，應(yīng)立即高溫烘烤更換，以確保吸濕性能。

5.揮發(fā)性、腐蝕性、強(qiáng)酸強(qiáng)堿類物質(zhì)應(yīng)盛于帶蓋稱量瓶內(nèi)稱量，防止腐蝕天平。

6.通電前應(yīng)按工作電源要求檢查電壓是否符合要求，若電源波動(dòng)太大，應(yīng)經(jīng)交流穩(wěn)壓后再送接儀器。

7.電源應(yīng)用良好接線，以消除外界干擾，使用攪拌器時(shí)，務(wù)必使攪拌器外殼與儀器接地端相連。

8.接通儀器電源，經(jīng)10min預(yù)熱后，可進(jìn)行測量工作。

第二篇：常用實(shí)驗(yàn)室儀器使用方法

常用實(shí)驗(yàn)室器材使用方法

包括加熱裝置，攪拌器，壓縮氣體鋼瓶，玻璃儀器，玻璃儀器的干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，氣壓計(jì)，真空泵等實(shí)驗(yàn)室常用器材的介紹及使用方法，注意事項(xiàng)等。

加熱

為了加速化學(xué)反應(yīng)，以及將產(chǎn)物蒸餾、分餾等，往往需要加熱。但是考慮到大多數(shù)有機(jī)化合物包括有機(jī)溶劑都是易燃易爆物，所以在實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)則中就規(guī)定禁止用明火直接加熱（特殊需要除外）。

為了保證加熱均勻，一般使用熱浴進(jìn)行間接加熱。作為傳熱的介質(zhì)有空氣、水、有機(jī)液體、熔融的鹽和金屬等，根據(jù)加熱溫度、升溫的速度等需要，常用下列手段：

(1)水浴和蒸汽浴

當(dāng)加熱的溫度不超過100℃時(shí)，最好使用水浴加熱較為方便。但是必須指出（強(qiáng)調(diào)）：當(dāng)用到金屬鉀、鈉的操作以及無水操作時(shí)，決不能在水浴上進(jìn)行，否則會(huì)引起火災(zāi)或使實(shí)驗(yàn)失敗，使用水浴時(shí)勿使容器觸及水浴器壁及其底部。由于水浴的不斷蒸發(fā)，適當(dāng)時(shí)要添加熱水，使水浴中的水面經(jīng)常保持稍高于容器內(nèi)的液面。電熱多孔恒溫水浴，使用起來較為方便。

(2)油浴

當(dāng)加熱溫度在100～200℃時(shí)，宜使用油浴，優(yōu)點(diǎn)是使反應(yīng)物受熱均勻，反應(yīng)物的溫度一般低于油浴溫度20℃左右。常用的油浴有：

1）甘油 可以加熱到140-150℃，溫度過高時(shí)則會(huì)炭化。

2）植物油 如菜油、花生油等，可以加熱到220℃，常加入1%的對(duì)苯二酚等抗氧化劑，便于久用。若溫度過高時(shí)分解，達(dá)到閃點(diǎn)時(shí)可能燃燒起來，所以使用時(shí)要小心。

3）石蠟油 可以加熱到200℃左右，溫度稍高并不分解，但較易燃燒。

4）硅油 硅油在250℃時(shí)仍較穩(wěn)定，透明度好，安全，是目前實(shí)驗(yàn)室里較為常用的油浴之 一，但其價(jià)格較貴。

使用油浴加熱時(shí)要特別小心，防止著火，當(dāng)油浴受熱冒煙時(shí)，應(yīng)立即停止加熱，油浴中應(yīng)掛一溫度計(jì)，可以觀察油浴的溫度和有無過熱現(xiàn)象，同時(shí)便于調(diào)節(jié)控制溫度，溫度不能過高，否則受熱后有溢出的危險(xiǎn)。使用油浴時(shí)要竭力防止產(chǎn)生可能引起油浴燃燒的因素。加熱完畢取出反應(yīng)容器時(shí)，仍用鐵夾夾住反應(yīng)器離開油浴液面懸置片刻，待容器壁上附著的油滴完后，再用紙片或干布檫干器壁。

攪拌器

攪拌器也是有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)必不可少的儀器之一，它可使反應(yīng)混合物混合得更加均勻，反應(yīng)體系的溫度更加均勻，從而有利于化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行特別是非均相反應(yīng)。攪拌的方法有三種：人工攪拌、磁力攪拌、機(jī)械攪拌。人工攪拌一般借助于玻棒 就可以進(jìn)行，磁力攪拌是利用磁力攪拌器，機(jī)械攪拌則是利用機(jī)械攪拌器。

磁力攪拌器由于磁力攪拌器容易安裝，因此，它可以用來進(jìn)行連續(xù)攪拌尤其當(dāng)反應(yīng)量比較少或在反應(yīng)是在密閉條件下進(jìn)行，磁力攪拌器的使用更為方便。但缺點(diǎn)是對(duì)于一些粘

稠液或是有大量固體參加或生成的反應(yīng)，磁力攪拌器無法順利使用，這時(shí)就應(yīng)選用機(jī)械攪拌器作為攪拌動(dòng)力。磁力攪拌器是利用磁場的轉(zhuǎn)動(dòng)來帶動(dòng)磁子的轉(zhuǎn)動(dòng)。磁子是在一小塊金屬用一層惰性材料（如聚四氟乙烯等）包裹著的，也可以自制：用一截10# 鐵鉛絲放入細(xì)玻管或塑料管中，兩端封口。磁子的大小大約有10mm、20mm、30mm長，還有更長的磁子，磁子的形狀有圓柱形、橢圓形和圓形等，如圖2.5，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的規(guī)模來選用。

機(jī)械攪拌器機(jī)械攪拌器主要包括三部分：電動(dòng)機(jī)、攪拌棒和攪拌密封裝置。

電動(dòng)機(jī)是動(dòng)力部分，固定在支架上，由調(diào)速器調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)動(dòng)快慢。攪拌棒與電動(dòng)機(jī)相連，當(dāng)接通電源后，電動(dòng)機(jī)就帶動(dòng)攪拌棒轉(zhuǎn)動(dòng)而進(jìn)行攪拌，攪拌密封裝置是攪拌棒與反應(yīng)器連接的裝置，它可以使反應(yīng)在密封體系中進(jìn)行。攪拌的效率在很大程度上取決于攪拌棒的結(jié)構(gòu)，圖2.6介紹的老式攪拌棒是用粗玻璃棒制成的。根據(jù)反應(yīng)器的大小、形狀、瓶口的大小及反應(yīng)條件的要求，選擇較為合適的攪拌棒。

氣壓計(jì)

氣壓計(jì)的作用是指示系統(tǒng)內(nèi)的壓力，通常采用水銀氣壓計(jì)。在厚玻璃管內(nèi)盛水銀，管背后裝有移動(dòng)標(biāo)尺，移動(dòng)標(biāo)尺將零度調(diào)整在接盡活塞一邊玻璃管B中的水銀平面處，當(dāng)減壓泵工作時(shí)，A管汞柱下降，B管汞柱上升，兩者之差，表明系統(tǒng)的壓力。使用時(shí)必須注意勿使水或贓物侵入測壓計(jì)內(nèi)，水銀柱中也不得有氣泡存在，否則將影響測定壓力的準(zhǔn)確性。封閉式水銀測壓計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是輕巧方便，但如有殘留空氣或引入了水或雜質(zhì)時(shí)，則準(zhǔn)確度受到影響。這種測壓計(jì)裝入水銀時(shí)要嚴(yán)格控制不讓空氣進(jìn)入，方法是先將純凈汞放入小圓底燒瓶，然后與測壓計(jì)相連的高效油泵抽氣至13033Pa(10-1mmHg)以下，并輕拍小燒瓶，使泵內(nèi)的氣泡逸出，用電吹風(fēng)微熱玻璃管使氣體抽出，然后把水銀注入U(xiǎn)形管停止抽氣放入大氣即成。開口式水銀測壓計(jì)裝汞比較方便，比較準(zhǔn)確，所用玻璃管的比度要超過760mm。U形管兩臂汞柱的高度之差即為公共壓力與系統(tǒng)中壓力之差。

真空泵

根據(jù)使用的范圍和抽氣效能可將真空泵分為三類：

(1)一般水泵，壓強(qiáng)可達(dá)到1.333~ 100kPa(10~760mmHg)為“粗”真空。

(2)油泵，壓強(qiáng)可達(dá)0.133~133.3 Pa(0.001~1mmHg)為“次高”真空。

(3)擴(kuò)散泵，壓強(qiáng)可達(dá)0.133 Pa以下，(10-3 mmHg)為“高”真空。

在有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室里常用的減壓泵有水泵和油泵兩種，若不要求很低的壓力時(shí)，可用水泵，如果水泵的構(gòu)造好且水壓又高，抽空效率可達(dá)1067~3333 Pa(8~25mmHg)。水泵所能抽到的最低壓力理論上相當(dāng)于當(dāng)時(shí)水溫下的水蒸氣壓力。例如，水溫25℃、20℃、10℃時(shí)，水蒸氣的壓力分別為3192、2394、1197Pa(8-25mmHg)。用水泵抽氣時(shí)，應(yīng)在水泵前裝上安全瓶，以防水壓下降，水流倒吸；停止抽氣前，應(yīng)先放氣，然后關(guān)水泵。

若要較低的壓力，那就要用到油泵了，好的油泵能抽到133.3Pa（1mmHg）以下。油泵的好壞決定于其機(jī)械結(jié)構(gòu)和油的質(zhì)量，使用油泵時(shí)必須把它保護(hù)好。如果蒸餾揮發(fā)性較大的有機(jī)溶劑時(shí)，有機(jī)溶劑會(huì)被油吸收結(jié)果增加了蒸氣壓，從而降低了抽空效能，如果是酸性氣體，那就會(huì)腐蝕油泵，如果是水蒸氣就會(huì)使油成乳濁液而抽壞真空泵。因此使用油泵時(shí)

必須注意下列幾點(diǎn)：

在蒸餾系統(tǒng)和油泵之間，必須裝有吸收裝置。

蒸餾前必須用水泵徹底抽去系統(tǒng)中有機(jī)溶劑的蒸氣。

如能用水泵抽氣的，則盡量用水泵，如蒸餾物質(zhì)中含有揮發(fā)性物質(zhì)，可先用水泵減壓抽降，然后改用油泵。

減壓系統(tǒng)必須保持密不漏氣，所有的橡皮塞的大小和孔道要合適，橡皮管要用真空用的橡皮管。磨口玻璃涂上真空油脂。

抽真空步驟及注意事項(xiàng)

首先檢查真空容器所處狀態(tài)，處于真空下或者處于大氣中。決定了兩種啟動(dòng)真空設(shè)備的程序：第一種，真空下操作程序。第二種，大氣狀態(tài)下操作程序。注意：第一次啟動(dòng)要先打開ESP—A總控電源，總控電源上面三個(gè)燈表示三相電，三燈全亮表示正常。

1、如果容器處于低真空狀態(tài)下，不能立即打開閘板閥以免引起真空油的回流。正確的操作步驟是先打開水龍頭，然后打開機(jī)械泵(注：按下機(jī)械泵的啟動(dòng)鍵)，同時(shí)打開ZDF—IV真空計(jì)電源，觀察真空計(jì)讀數(shù)到達(dá)30Pa左右時(shí)，再打開分子泵(注：先按下FDK—600K總電源，然后按下啟動(dòng)鍵)，看到分子泵的工作頻率達(dá)到50Hz左右時(shí)方可打開閘板閥。

2、如果容器處于大氣下，首先要做的是檢查大漏，即關(guān)閉容器大門和放氣閥。然后打開水龍頭，閘板閥，機(jī)械泵，ZDF—IV真空計(jì)電源，觀察真空計(jì)讀數(shù)到達(dá)30Pa左右時(shí)，再打開分子泵(注：先按下FDK—600K總電源，然后按下啟動(dòng)鍵)。

3、等到分子泵正常工作后(工作頻率穩(wěn)定在450Hz)，按下真空計(jì)中電離計(jì)單元的啟動(dòng)鍵對(duì)真空度進(jìn)行觀測。

4、在真空達(dá)到Pa時(shí)可以打開離子泵，此時(shí)先關(guān)閉分子泵處的閘板閥，但不要關(guān)閉分子泵，等到離子泵的電壓達(dá)到4000V時(shí)(離子泵穩(wěn)定工作后)再關(guān)掉5410~10??

分子泵，機(jī)械泵。

5、如果不需要維持真空時(shí)，先關(guān)掉真空計(jì)電源，后只需要把離子泵的閘板閥關(guān)閉即可，不關(guān)閉離子泵，而是讓離子泵處于工作狀態(tài)保持其內(nèi)部環(huán)境。(注意：烘烤與離子泵不能同時(shí)打開，烘烤的目的是為了讓離子泵更好的工作，需要時(shí)可先烘烤，關(guān)閉烘烤后在打開離子泵開關(guān)。一般不需要打開烘烤。)

壓縮氣體鋼瓶

在有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)會(huì)用到氣體來作為反應(yīng)物。如氫氣、氧氣等，也會(huì)用到氣體作為保護(hù)氣，例如氮?dú)?、氬氣等，有的氣體用來作為燃料，例如煤氣、液化氣等。所有這些氣體都需要裝在特制的容器中。一般都是用的壓縮氣體鋼瓶。將氣體以較高壓力貯存在鋼瓶中，既便于運(yùn)輸又可以在一般實(shí)驗(yàn)室里隨時(shí)用到非常純凈的氣體。由于鋼瓶里裝的高壓的壓縮氣體，因此在使用時(shí)必須嚴(yán)格注意安全，否則將會(huì)十分危險(xiǎn)。

有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室里常用的壓縮氣體壓強(qiáng)一般接近200個(gè)大氣壓。整個(gè)鋼瓶的瓶體是非常堅(jiān)實(shí)的，而最易損壞的，應(yīng)是安裝在鋼瓶出氣口的排氣閥，一旦排氣閥被損壞，后果則不堪設(shè)想，因此為安全起見，都要在排氣閥上裝一個(gè)罩子。除此之外，這些壓縮氣體鋼瓶應(yīng)遠(yuǎn)離火源和有腐蝕性的物質(zhì)，如酸、堿等。

實(shí)驗(yàn)室里用的壓縮氣體鋼瓶，一般高度約160cm，毛重約70到80公斤。對(duì)于如此龐大的物體，如果不加以固定，一旦倒下來肯定會(huì)砸壞東西或砸傷人，且不說還會(huì)有高壓氣體本身帶來的危險(xiǎn)。因此，也是從安全考慮，應(yīng)當(dāng)將鋼瓶固定在某個(gè)地方，如固定在桌邊

或墻角等。

為了轉(zhuǎn)移方便，一般選用特制的推車。如何正確識(shí)別鋼瓶所裝的氣體種類，也是一件相當(dāng)重要的事情。雖然，所有的氣體鋼瓶外面都會(huì)貼有標(biāo)簽來說明瓶內(nèi)所裝氣體的種類及純度，但是這些標(biāo)簽往往會(huì)被損壞或腐爛。為保險(xiǎn)起見，所有的壓縮氣體鋼瓶都會(huì)依據(jù)一定的標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)所裝的氣體被涂成不同的顏色。氫氣瓶為綠色，氧氣瓶為天藍(lán)色，氮?dú)馄繛楹谏８邏簹馄康钠針?biāo)志

氧氣瓶顏色為淡酞藍(lán)（天藍(lán)），字樣“氧”，字顏色為黑色，當(dāng)壓力為２０Ｍｐａ，為白色環(huán)一道，當(dāng)壓力為３０Ｍｐａ，為白色環(huán)二道；

氫氣瓶顏色為淡綠色，字樣“氫”，字顏色為大紅，當(dāng)壓力為２０Ｍｐａ，為淡黃色環(huán)一道，當(dāng)壓力為３０Ｍｐａ，為淡黃色環(huán)二道；

氨氣瓶顏色為淡黃，字樣“液氨”，字顏色為黑色； 空氣瓶顏色為黑色，字樣“氧”，字顏色為白色，當(dāng)壓力為２０Ｍｐａ，為白色環(huán)一道，當(dāng)壓力為３０Ｍｐａ，為白色環(huán)二道；

氮?dú)馄款伾珵楹谏?，字樣“氮”，字顏色為淡黃，當(dāng)壓力為２０Ｍｐａ，為白色環(huán)一道，當(dāng)壓力為３０Ｍｐａ，為白色環(huán)二道；

氯氣瓶顏色為深綠，字樣“液氯”，字顏色為白色；

溶解乙炔氣瓶顏色為白色，字樣“乙炔不可近火”，字顏色為大紅； 二

氧化碳?xì)馄款伾珵殇X白，字樣“液化二氧化碳”，字顏色為黑色，當(dāng)壓力為２０Ｍｐａ，為黑色環(huán)一道；

液化石油氣氣瓶顏色為銀灰，字樣“液化石油氣”，字顏色為大紅

玻璃儀器

化學(xué)實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器可分為普通玻璃儀器和磨口玻璃儀器。

標(biāo)準(zhǔn)接口玻璃儀器是具有標(biāo)準(zhǔn)化磨口或磨塞的玻璃儀器。由于儀器口塞尺寸的標(biāo)準(zhǔn)化、系統(tǒng)化、磨砂密合，凡屬于同類規(guī)格的接口，均可任意連接，各部件能組裝成各種配套儀器。與不同類型規(guī)格的部件無法直接組裝時(shí)，可使用轉(zhuǎn)換接頭連接。使用標(biāo)準(zhǔn)接口玻璃儀器，既可免去配塞子的麻煩手續(xù)，又能避免反應(yīng)物或產(chǎn)物被塞子玷污的危險(xiǎn)，口塞磨砂性能良好，使密合性可達(dá)較高真空度，對(duì)蒸餾尤其減壓蒸餾有利，對(duì)于毒物或揮發(fā)性液體的實(shí)驗(yàn)較為安全。

標(biāo)準(zhǔn)接口玻璃儀器，均按國際通用的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)制造，當(dāng)某個(gè)部件損壞時(shí)，可以選購。標(biāo)準(zhǔn)接口儀器的每個(gè)部件在其口塞的上或下顯著部位均具有烤印的白色標(biāo)志，表明規(guī)格。常用的有10，12，14，16，19，24，29，34，40等。

有的標(biāo)準(zhǔn)接口玻璃儀器有兩個(gè)數(shù)字，如10/30，10表示磨口大端的直徑為10mm，30表示磨口的高度為30mm。

使用標(biāo)準(zhǔn)接口玻璃儀器應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）磨口塞應(yīng)經(jīng)常保持清潔，使用前宜用軟布揩拭干凈，但不能附上棉絮。（2）使用前在磨砂口塞表面涂以少量凡士林或真空油脂，以增強(qiáng)磨砂口的密合性，避免磨面的相互磨損，同時(shí)也便于接口的裝拆。（3）裝配時(shí)，把磨口和磨塞輕輕地對(duì)旋連接，不宜用力過猛。但不能裝得太緊，只要達(dá)到潤滑密閉要求即可。（4）用后應(yīng)立即拆卸洗凈。否則，對(duì)接處常會(huì)粘牢，以致拆卸困難。（5）裝拆時(shí)應(yīng)注意相對(duì)的角度，不能在角度偏差時(shí)進(jìn)行硬性裝拆，否則極易造成破損。磨口套管和磨塞應(yīng)該是由同種玻璃制成的。

玻璃儀器的干燥

有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常需要使用干燥的玻璃儀器，故要養(yǎng)成在每次實(shí)驗(yàn)后馬上把玻璃儀器洗凈和倒置使之晾干的習(xí)慣，以便下次實(shí)驗(yàn)時(shí)使用。干燥玻璃儀器的方法有下列幾種：

(1)自然風(fēng)干是指把已洗凈的玻璃儀器在干燥架上自然風(fēng)干，這是常用而簡單的方法。但必須注意，若玻璃儀器洗得不夠干凈時(shí)，水珠不易流下，干燥較為緩慢。

(2)烘干是指把已洗凈的玻璃儀器由上層到下層放入烘箱中烘干。放入烘箱中干燥的玻璃儀器，一般要求不帶水珠，器皿口側(cè)放。帶有磨砂口玻璃塞的儀器，必須取出活塞才能烘干，玻璃儀器上附帶的橡膠制品在放入烘箱前也應(yīng)取下，烘箱內(nèi)的溫度保持105℃左右，約0.5h，待烘箱內(nèi)的溫度降至室溫時(shí)才能取出。切不可把很熱的玻璃儀器取出，以免驟冷使之破裂，當(dāng)烘箱已工作時(shí)，不能往上層放入濕的器皿，以免水滴下落，使熱的器皿驟冷使之破裂。

(3)吹干有時(shí)儀器洗滌后需要立即使用，可使用吹干，即用氣流干燥器或電吹風(fēng)把儀器吹干。首先將水盡量晾干后，加入少量丙酮或乙醇搖洗并傾出，先通入冷吹風(fēng)1-2min，待大部分溶劑揮發(fā)后，再吹入熱風(fēng)至完全干燥為止，最后吹入冷風(fēng)使儀器逐漸冷卻

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，主要用于在減壓條件下連續(xù)蒸餾大量易揮發(fā)性溶劑。尤其對(duì)萃取液的濃縮和色譜分離時(shí)的接收液的蒸餾，可以分離和純化反應(yīng)產(chǎn)物。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的基本原理就是減壓蒸餾，也就是在減壓情況下，當(dāng)溶劑蒸餾時(shí)，蒸餾燒瓶在連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)。結(jié)構(gòu):蒸餾燒瓶可是一個(gè)帶有標(biāo)準(zhǔn)磨口接口的梨形或圓底燒瓶，通過一高度回流蛇形冷凝管與減壓泵相連，回流冷凝管另一開口與帶有磨口的接收燒瓶相連，用于接收被蒸發(fā)的有機(jī)溶劑。在冷凝管與減壓泵之間有一三通活塞，當(dāng)體系與大氣相通時(shí)，可以將蒸餾燒瓶，接液燒瓶取下，轉(zhuǎn)移溶劑，當(dāng)體系與減壓泵相通時(shí)，則體系應(yīng)處于減壓狀態(tài)。使用時(shí)，應(yīng)先減壓，再開動(dòng)電動(dòng)機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)蒸餾燒瓶，結(jié)束時(shí)，應(yīng)先停機(jī)，再通大氣，以防蒸餾燒瓶在轉(zhuǎn)動(dòng)中脫落。作為蒸餾的熱源，常配有相應(yīng)的恒溫水槽。

第三篇：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器及使用方法

實(shí)驗(yàn)一

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器及使用

事實(shí)證明，在科學(xué)飛速發(fā)展的今天，無論從事哪個(gè)領(lǐng)域的研究，要想突破，除了有良好的理論基礎(chǔ)外，更重要的是依賴于先進(jìn)的技術(shù)和優(yōu)良的儀器設(shè)備以及良好的研究環(huán)境。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室除了具有一般生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器設(shè)備外，還具有一些特殊用途的儀器，這些儀器一般較精密，價(jià)格昂貴。下面介紹這些儀器的使用方法和注意事項(xiàng)。

一、冷凍離心機(jī)

低溫分離技術(shù)是分子生物學(xué)研究中必不可少的手段。基因片段的分離、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實(shí)驗(yàn)中都離不開低溫離心技術(shù)，心機(jī)成為分子生物學(xué)研究中必備的重要儀器。室的高速冷凍離心機(jī)為GL-20G-Ⅱ型（上海安亭）×10ml和12×1.5ml。極限轉(zhuǎn)速20000rpm。

1.安裝與調(diào)試

離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的地面上，應(yīng)至少距離中，周圍空氣應(yīng)呈中性，且無導(dǎo)電性灰塵、易燃?xì)怏w和腐蝕性氣體，環(huán)境溫度應(yīng)在之間，相對(duì)濕度小于80%。試轉(zhuǎn)前應(yīng)先打開蓋門，用手盤動(dòng)轉(zhuǎn)軸，輕巧靈活，無異?，F(xiàn)象方可上所用的轉(zhuǎn)頭。轉(zhuǎn)子準(zhǔn)確到位后打開電源開關(guān)，然后用手按住門開關(guān)，動(dòng)后立即停止，并觀察轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)向，若逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)即為正確，機(jī)器可投入使用。2.操作程序

（1）插上電源，待機(jī)指示燈亮；打開電源開關(guān)，調(diào)速與定時(shí)系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示的閃爍數(shù)字為機(jī)器工作轉(zhuǎn)速的出廠設(shè)定，溫控系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示此時(shí)離心腔的溫度。

（2）設(shè)定機(jī)器的工作參數(shù)，如工作溫度，運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間，工作轉(zhuǎn)速等。

（3）將預(yù)先平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上，關(guān)閉機(jī)蓋。

（4）按控制面板的運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，離心機(jī)開始運(yùn)轉(zhuǎn)。預(yù)先設(shè)定的值。

（5）在預(yù)先設(shè)定的運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間內(nèi)（不包括減速時(shí)間）定的減速時(shí)間內(nèi)降至零。

（6）按控制面板上的停止鍵，數(shù)碼管顯示機(jī)器已準(zhǔn)備好下一次工作。

3.注意事項(xiàng)

（1）離心機(jī)應(yīng)始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線，機(jī)器不使用，要拔掉電源插頭。

（2）開機(jī)前應(yīng)檢查轉(zhuǎn)頭安裝是否牢固，機(jī)腔中有無異物掉入。

（3）樣品應(yīng)預(yù)先平衡，使用離心筒離心時(shí)離心筒與樣品應(yīng)同時(shí)平衡。

（4）揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機(jī)腔或造成事故。

在國內(nèi)，有多個(gè)廠家生產(chǎn)冷凍離心機(jī)，落地式。配有角式轉(zhuǎn)頭：10cm在預(yù)先設(shè)定的加速時(shí)間內(nèi)，其運(yùn)速升，離心機(jī)開始減速，其轉(zhuǎn)速在預(yù)先設(shè)dedT，數(shù)秒鐘后即顯示閃爍的轉(zhuǎn)速值，這時(shí)1

本實(shí)驗(yàn)6×50ml、120～30℃

至 因此低溫冷凍離 以上且具有良好的通風(fēng)環(huán)境再按運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，轉(zhuǎn)

（5）除工作溫度、運(yùn)轉(zhuǎn)速度和運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間外，不要隨意更改機(jī)器的工作參數(shù)，以免影響機(jī)器性能。轉(zhuǎn)速設(shè)定不得超過最高轉(zhuǎn)速，以確保機(jī)器安全運(yùn)轉(zhuǎn)。

（6）使用中如出現(xiàn)0.00或其它數(shù)字，機(jī)器不運(yùn)轉(zhuǎn)，應(yīng)關(guān)機(jī)斷電，10秒鐘后重新開機(jī)，待所設(shè)轉(zhuǎn)速顯示后，再按運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，機(jī)器將照常運(yùn)轉(zhuǎn)。

（7）不得在機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)過程中或轉(zhuǎn)子未停穩(wěn)的情況下打開蓋門，以免發(fā)生事故。

（8）每次操作完畢應(yīng)做好使用情況記錄，并定期對(duì)機(jī)器各項(xiàng)性能進(jìn)行檢修。

二、電泳儀

電泳技術(shù)是分子生物學(xué)研究不可缺少的重要手段。帶電泳大類，自由界面電泳不需支持物，泳目前已很少使用。區(qū)帶電泳需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，纖維薄膜、非凝膠性支持物、是瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用電泳法可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析，組份分析或單個(gè)組份提取制備。下面以為例介紹其使用方法。

1.使用方法

（1）按電源開關(guān)，顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用同時(shí)系統(tǒng)初始化，蜂鳴

U:

0V

U＝

I:

0mA

I ＝

P:

0W

P＝

T:

00:00

T＝

其中:左側(cè)大寫Mode(模式)：STD(標(biāo)準(zhǔn)

（2）設(shè)置工作程序。用鍵盤輸入新的工作程序。例如，要求工作電壓I限制在200mA以內(nèi)，功率動(dòng)關(guān)掉輸出。則操作步驟如下：

①按“模式”鍵，將工作模式由標(biāo)準(zhǔn)（凝膠性支持物及硅膠―4聲，設(shè)置常設(shè)置。屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設(shè)置狀態(tài)，見圖一：

100V

50mA

｜

50W

｜ 01:00

｜U: I: P: T:)；TIME(定時(shí)W限制在 電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)如等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等，這類電G薄層等，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）DYY-12型電腦三恒多用電泳儀?”等字樣后，Mode：

STD

中間部分顯示程序的常設(shè)值)；VH（伏時(shí)）；STEP（分步）100W以內(nèi)，時(shí)間T為3STD）轉(zhuǎn)為定時(shí)（TIME）2

醋酸或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M(jìn)行（預(yù)置值）。U＝1000V，電流20分，并且到時(shí)間自常用的支持物有濾紙、｜

為電泳時(shí)實(shí)際值； 小時(shí) 模式。每按一下模式鍵，其工作方式按下列順序改變：

STD?TIME?VH?STEP?STD。

②先設(shè)置電壓U，按“選擇”鍵，先將其反顯，然后輸入數(shù)字鍵即可設(shè)置該參數(shù)的數(shù)值。按數(shù)字1000,則電壓即設(shè)置完成。

③設(shè)置電流I，按“選擇”鍵，先使I反顯，然后輸入數(shù)字200。

④設(shè)置功率P，按“選擇”鍵，先使P反顯，然后輸入數(shù)字100。

⑤設(shè)置時(shí)間以按“清除”鍵，再重新輸入。

⑥確認(rèn)各參數(shù)無誤后，按“啟動(dòng)”鍵，啟動(dòng)電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯示Start!并蜂鳴至設(shè)置值。同時(shí)在狀態(tài)欄中顯示“壓輸出。在狀態(tài)欄最下方，顯示實(shí)際的工作時(shí)間（精確到秒）

⑦每次啟動(dòng)輸出時(shí)，儀器自動(dòng)將此時(shí)的設(shè)置數(shù)值存入“要調(diào)用時(shí)可以按“讀取”鍵，再按“出執(zhí)行。

⑧電泳結(jié)束，儀器顯示：

2.注意事項(xiàng)

(1)U、I、P三個(gè)參數(shù)的有效輸入范圍是：

(2)一般情況下，當(dāng)?shù)牡胤剑梢杂萌f用表的歐姆檔逐段測量。

(3)如果輸出端接多個(gè)電泳槽，則儀器顯示的電流數(shù)值為各槽電流之和，此時(shí)應(yīng)選擇穩(wěn)壓輸出，以減小各槽的相互影響。

(4)注意保持儀器的清潔，不要遮擋儀器后方進(jìn)風(fēng)通道。嚴(yán)禁將電泳槽放在儀器頂部，避免緩沖液灑進(jìn)儀器內(nèi)部。

(5)本儀器輸出電壓較高，使用中應(yīng)不避免接觸輸出回路及電泳槽內(nèi)部，以免發(fā)生危險(xiǎn)。

(6）長期不用儀器，應(yīng)放置在干燥通風(fēng)的清潔環(huán)境中保存。

三、分析天平

分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方 T，按“選擇”鍵，先使 4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，“No Load！時(shí)，首先應(yīng)關(guān)機(jī)檢查電極導(dǎo)線與電泳槽之間是否有接觸不良

T反顯，然后輸入數(shù)字Run”，并有兩個(gè)不斷閃爍的高壓符號(hào)，表示端口已有電0”鍵，按“確定”鍵，即可將上次設(shè)置的工作程序取END”，并連續(xù)蜂鳴提醒。此時(shí)按任一鍵可止鳴。U：5 3

注意安全。3000V；I：320。如果輸入錯(cuò)誤，可之后逐漸將輸出電壓加 MO”號(hào)存儲(chǔ)單元。以后需4～400mA P：4～400W.?！?； 法，是獲得可靠分析結(jié)果的保證。分析天平的種類很多，有普通分析天平、半自動(dòng)/全自動(dòng)電光分析天平及電子分析天平等。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)備用的是自動(dòng)化程度較高的電子分析天平。下面介紹電子分析天平PL203/01型和AL104/01型(METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。PL203/01型精密電子天平：最大稱量210g；實(shí)際分度值0.001g；AL104/01型高分辨率電子分析天平：最大稱量110g；實(shí)際分度值0.0001g

1.使用方法

（1）檢查并調(diào)整天平至水平位置。檢查電源電壓是否匹配（使用配置的穩(wěn)壓器），按天平儀器要求通電預(yù)熱至所需時(shí)間

（2）打開天平開關(guān)“短時(shí)點(diǎn)亮，天平回零時(shí)，可進(jìn)行正式稱量。

（3）稱量時(shí)將潔凈稱量瓶或稱量紙置于稱盤上，關(guān)上側(cè)門，天平將顯示該重量，點(diǎn)擊“?O/T?”鍵自動(dòng)校對(duì)零，然后逐漸加入待稱物質(zhì)，直至所需重量為止。

（4）稱量結(jié)束應(yīng)及時(shí)除去稱量瓶（紙）

2.注意事項(xiàng)

（1）天平應(yīng)放置在牢固平穩(wěn)水泥臺(tái)或木臺(tái)上，室內(nèi)要求清潔、干燥，同時(shí)應(yīng)避免光線直接照射到天平上。

（2）稱量時(shí)應(yīng)從側(cè)門取放物質(zhì)，讀數(shù)時(shí)應(yīng)關(guān)閉箱門以免空氣流動(dòng)引起天平擺動(dòng)。

（3）揮發(fā)性、腐蝕性、強(qiáng)酸強(qiáng)堿類物質(zhì)應(yīng)盛于帶蓋稱量瓶內(nèi)稱量，防止腐蝕天平。

（4）電子分析天平若長時(shí)間不使用，則應(yīng)定時(shí)通電預(yù)熱，每周一次，每次預(yù)熱確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。

四、分光光度計(jì)

不同物質(zhì)對(duì)不同波長入射的吸收程度各不相同，從而形成各具特征的吸收光譜原理，應(yīng)用比色法可以對(duì)某些有色物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。而且精度低，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足高精度微量分析的要求。不斷地更新?lián)Q代，人們引進(jìn)了分光光度法的概念，單色器、吸收池、接受器、顯示屏幕所組成，它不僅適應(yīng)于可見光區(qū)，同時(shí)還擴(kuò)展至紫外光區(qū)及紅外光區(qū)。光密度（而測定某一溶液對(duì)該單色光的吸收值。液定量和純度的初步判斷。下面介紹紫外可見光分光光度計(jì)的使用方法。該儀器除了能檢測核酸樣品濃度外，的測定，能檢測低至幾微升樣品（30min。on”，天平則自動(dòng)進(jìn)行靈敏度及零點(diǎn)調(diào)節(jié)。待顯示屏上所有字段，關(guān)上側(cè)門，切斷電源，并做好使用情況登記。

隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，分光光度計(jì)隨之應(yīng)用。OD）是許多溶液中的溶質(zhì)定量的指標(biāo)之一，通過所產(chǎn)生的單色光分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸溶還可進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度以及細(xì)胞培養(yǎng)液濃度70μl和5～7μl），樣品無需稀釋，測量后還可全部回收。4

分光光度計(jì)由光源、GeneQantTM Pro

2h，以。根據(jù)這一分析儀器也Amersham）

但由于比色法僅限于可見光區(qū)，（使用方法

(1）打開電源開關(guān)（ON），等待數(shù)秒鐘，顯示屏上顯示一系列數(shù)據(jù)，如本機(jī)型號(hào)、當(dāng)前日期等，這些數(shù)據(jù)可以重新設(shè)置，當(dāng)出現(xiàn)“instrument Ready”即可進(jìn)入下一程序。

(2）在儀器面板上有許多功能鍵，其中包括檢測base sep、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲檢測DNA，按DNA鍵，即進(jìn)入DNA檢測程序。在顯示屏上：

以上為儀器預(yù)設(shè)置的參考數(shù)據(jù)，若按“新設(shè)定。

(3）取石英樣品杯后放入儀器上的樣品槽中，放入時(shí)注意樣品杯的光學(xué)面朝前方。

(4)按“set ref”鍵，進(jìn)行空白測試。顯示屏上出現(xiàn)一系列數(shù)據(jù)均““Insert sample 中進(jìn)行測定。

(5）一個(gè)樣品測定完畢，按“

(6）取出樣品杯，吸出樣品，然后用高純水洗幾次，自然晾干。由于樣品杯十分昂貴，使用時(shí)要小心操作。以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過

五、數(shù)字式酸度計(jì)

酸度計(jì)是實(shí)驗(yàn)室配置溶液必備的儀器。本實(shí)驗(yàn)室的酸度計(jì)為臺(tái)式微電腦酸堿度計(jì)和溫度計(jì)（Hanna

1.使用方法

（1）將pH

70μl或5。將樣品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同樣吸入待測樣品，放入樣品槽 ,測量pH范圍為

Pathlengh

10mm

Units

μg/μl

Use 320nm

NO

Dilution Faotor 1

Insert reference，enter”鍵，和“select”鍵可以將以上的參數(shù)進(jìn)行重7μl，容量大小根據(jù)需要。先用吸管吸高純水入樣品杯中，然 0.000”并提示插入樣品stop”鍵，返回“Instrument Ready”?？捎脺厮蛳←}酸，乙醇15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。0.00～14.00pH；溫度為0.0～100.0℃；

～”不能用手指拿樣品杯的光學(xué)面，用后要及時(shí)洗滌，）電極和溫度探頭與主機(jī)連接，主機(jī)與電源連接。

（2）取出電極保護(hù)套，如果有結(jié)晶鹽出現(xiàn)，這是電極常見現(xiàn)象，浸入水后就會(huì)消逝。如果薄膜玻璃或透析膜發(fā)干，可在HI170300電極保存液中浸泡1小時(shí)。

（3）pH校準(zhǔn)。將pH電極和溫度探棒浸泡在所選的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液內(nèi)4cm（建議用pH6.86、7.01），緩沖液值可通過“D℃”或“?℃”鍵來調(diào)節(jié)。按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號(hào)及“7.01”數(shù)據(jù)。當(dāng)讀數(shù)不穩(wěn)定時(shí)，屏幕會(huì)顯示“NOTREADY”；當(dāng)讀數(shù)穩(wěn)定時(shí)，屏幕會(huì)顯示“READY”和“CFM”，按“CFM”鍵確認(rèn)校準(zhǔn)值。確認(rèn)第一校準(zhǔn)點(diǎn)后，將pH電極與溫度探棒浸泡在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液內(nèi)4cm（建議用pH4.01、9.18、10.01）；再按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號(hào)及“4.01”數(shù)據(jù)。按“CFM”鍵確認(rèn)校正值。

（4）pH測量。校準(zhǔn)完畢后，儀器自動(dòng)進(jìn)入溶液約4cm，停幾分鐘讓電極讀數(shù)穩(wěn)定。

2.注意事項(xiàng)

（1）由于pH211酸度計(jì)內(nèi)裝有可充電電池，在剛購買或長時(shí)間放置后，再使用時(shí)，通電校正測量完畢后，可將電源繼續(xù)還插入電源插座，只需關(guān)閉開關(guān)，這樣可以保證電池充電，是校正值得以儲(chǔ)存，下次測量時(shí)無須校正即可進(jìn)入精確測量。

（2）不可用蒸餾水、去離子水和純水浸泡電極。如果讀數(shù)偏差太大（±沒有校正或電極變干。為避免電極受損，在關(guān)機(jī)前要將狀態(tài)時(shí)，在電極浸入電極保存液前，電極要與機(jī)器分開。

（3）如儀器已測過幾種不同的樣品溶液，請用自來水清洗，樣品清洗電極。

（4）溫度會(huì)影響pH的讀數(shù)，為測量準(zhǔn)確的補(bǔ)償，用HI7669/2W溫度探棒浸入樣品中，緊靠電極并停幾分鐘，如果被測溶液的溫度已知或測量是在相同溫度下進(jìn)行，只需動(dòng)手補(bǔ)償，示溫度讀數(shù)伴有℃信號(hào)閃爍。溫度可通過“

六、PCR儀

PCR儀，也稱DNA熱循環(huán)儀、基因擴(kuò)增儀，它是使一對(duì)寡核苷酸引物結(jié)合到正負(fù)上的靶序列兩側(cè)，從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬倍的靶序列三種不同溫度進(jìn)行DNA變性、引物復(fù)性、PCR儀主要應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等許多領(lǐng)域，如基因分析、序列分析、進(jìn)化分析、臨床診斷、法醫(yī)學(xué)等等。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，因此了解PCR儀的性能，熟練掌握儀器的正確使用方法及使用過程中的注意事項(xiàng)，將是十分必要的。

現(xiàn)介紹PCR 擴(kuò)增儀（Tl Thermocycler）的使用方法和注意事項(xiàng)。

pH測量狀態(tài)，將電極與溫度探棒浸泡在待測

pH電極從溶液中拿出。當(dāng)處于關(guān)機(jī) 或在插入樣品溶液前，用待測pH值，溫度要在適合的范圍內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)溫度那么此時(shí)溫度探棒是不用連接，?℃”或“D℃”來調(diào)節(jié)。DNA片段，它的每一循環(huán)包括在DNA聚合酶催化的延伸反應(yīng)的三個(gè)過程。PCR擴(kuò)增技術(shù)也得到普及推廣應(yīng)用，6

1pH），則是由于屏幕上會(huì)顯DNA鏈 1.使用方法

(1）接通電源開關(guān)，儀器進(jìn)入準(zhǔn)備狀態(tài)；在顯示屏上記錄了當(dāng)前儀器的溫度和蓋子（Lid）的溫度。若儀器正在運(yùn)行時(shí)，須按“

B ”鍵（start/stop），才能退出運(yùn)行并返回準(zhǔn)備狀態(tài)。

(2）編寫程序段。在準(zhǔn)備狀態(tài)下按“

C ”鍵(programs)進(jìn)入編程狀態(tài)，選定一程序號(hào)，然后按“enter”鍵，進(jìn)入下一程序；按 “A”(list)鍵后，選一文件號(hào)（empty program）；再按“enter”鍵，進(jìn)入下一程序；按“ABC”鍵，進(jìn)入下一程序，用上下左右鍵號(hào)選擇一個(gè)字母（A、B、C、D、?），然后按“enter”鍵，進(jìn)入下一程序；按“name ok”鍵，完成文件命名。

(3）設(shè)定蓋子的溫度。性溫度是95℃，那么蓋子的溫度就要設(shè)定為程序。

(4）設(shè)定變性溫度、變性時(shí)間、延伸溫度、延伸時(shí)間、退火溫度、退火時(shí)間及循環(huán)總數(shù)等參數(shù)。從第一步依次按“間，全部參數(shù)設(shè)置完后，按“

(5）運(yùn)行程序。檢查設(shè)定是否正確，屏上可觀察到系統(tǒng)運(yùn)行的情況，按“

七、凝膠成像系統(tǒng)

本系統(tǒng)屬全自動(dòng)電腦控制影像分析系統(tǒng)，主要拍攝核酸的acrylamide電泳膠片。在與確定量，是分子生物學(xué)及生化蛋白試驗(yàn)的重要檢測工具。像頭，變焦鏡，電腦以及專業(yè)凝膠圖象采集及分析斑點(diǎn)測量、PCR密度的定量分析等。此外，還提供圖像采集、標(biāo)注、打印、數(shù)據(jù)和圖像發(fā)送到Word、Excel、圖像處理等功能。

1.使用方法

(1)打開電腦，啟動(dòng)凝膠分析軟件，進(jìn)入用戶界面。

（2）打開采集凝膠圖像的暗箱裝置電源開關(guān)，放入凝膠，打開紫外光源或白光光源，將采集裝置與電腦上采集卡相連，然后選擇“文件”菜單中的“圖像采集”或工具欄的“圖像采集”按鈕，出現(xiàn)圖像窗口：晰，可以調(diào)節(jié)暗箱上的變焦鏡，使之清晰?？芍苯訉D像保存起來，也可通過“圖像處理”對(duì)圖像進(jìn)行旋轉(zhuǎn)、裁剪、濾波、調(diào)節(jié)對(duì)比度??方面的處理。

(3)對(duì)讀入的電泳凝膠圖像，可以啟動(dòng)電泳凝膠分析系統(tǒng)。在“功能選擇”菜單中選擇“電泳凝膠”或在工具欄上的“電泳凝膠”工具，將出現(xiàn)泳道分析工具欄，并在“圖像顯示”子窗口中出現(xiàn)一個(gè)紅色的矩形框。還可進(jìn)入“條帶分析”系統(tǒng)，對(duì)條帶 lid temp：

℃”enter”鍵進(jìn)入，用四個(gè)移位鍵移動(dòng)設(shè)定位置。先設(shè)定溫度，后設(shè)定時(shí)pgm ok”鍵，所設(shè)定的程序自動(dòng)被保存。

按“Stop”可停止運(yùn)行。markers比較后，可精確計(jì)算樣本的分子量，對(duì)核酸電泳也可準(zhǔn) “開始采集”105℃。待蓋子預(yù)熱后按“start”鍵，選擇設(shè)定好的程序，開始運(yùn)行。顯示 agarose本系統(tǒng)包括暗箱，.軟件（3.3版）。該軟件提供對(duì)電泳凝膠、、“停止采集”、“采集圖像”等。如果圖像不清 7

10℃，例如變enter”鍵，進(jìn)入下一 紫外透射儀，攝 進(jìn)行編號(hào)，對(duì)“，蓋子的溫度一般比變性溫度要高 電泳膠片，及蛋白質(zhì)的二條以上的條帶進(jìn)行比較。

（4）采集圖像結(jié)束后，關(guān)閉暗箱電源開關(guān)，從暗箱中取出凝膠，并將玻璃板清洗干凈，晾干。

八、空氣恒溫?fù)u床

搖床（振蕩器）為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)設(shè)備。SHK-99-Ⅱ型臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床，采用微電腦控制系統(tǒng)，溫度范圍：室溫＋5℃～60℃，精度±0.5℃；時(shí)間范圍：1分鐘～99小時(shí)59分鐘；轉(zhuǎn)速范圍：60RPM～250RPM。

1.使用方法

(1）LED屏幕上各段數(shù)據(jù)：

000

00.0

屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段則為“轉(zhuǎn)速，“Time”表示時(shí)間，不設(shè)定時(shí)可自動(dòng)累計(jì)時(shí)間一直運(yùn)行。的值隨時(shí)可以修改，隨時(shí)按新值運(yùn)行。

(2）工作程序設(shè)置。按“F1”鍵，進(jìn)入設(shè)置狀態(tài)?？稍谒俣?，溫度，時(shí)間，運(yùn)行等四部分之間切換。在每一部分按“F2”鍵輸入數(shù)據(jù)，輸入完十位數(shù)據(jù)，再輸入個(gè)位數(shù)據(jù)，按“鍵，再按“F2”鍵，到小數(shù)位，再按“

(3）再按“F1”鍵，轉(zhuǎn)回運(yùn)行狀態(tài)，按“

(4）按“End”鍵，結(jié)束系統(tǒng)運(yùn)行。

2.注意事項(xiàng)

（1）打開電源，系統(tǒng)開始自檢，等待完畢，可以進(jìn)行第2步參數(shù)設(shè)置。若屏幕出現(xiàn)：錯(cuò)誤；b.“MOTOR ERROR”，表示電機(jī)部分有錯(cuò)誤。

（2）運(yùn)行過程可以打開箱蓋，這樣電機(jī)不運(yùn)行，時(shí)間也停止，蓋上蓋接著運(yùn)行。

（3）工作完畢，關(guān)閉電源。關(guān)機(jī)后，要等一段時(shí)間再開機(jī)。

九、水的凈化裝置

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)水的純度要求越來越高，RPM

Temp

Time

00:00 2”，“Temp”表示溫度，“RPM”表示每分鐘“Temp”、“RPM”、F2”鍵，又到十位，以此循環(huán)。Start”鍵，電機(jī)開始運(yùn)行，時(shí)間開始計(jì)時(shí)。LCD屏幕出現(xiàn)“WELCOME”字樣，系統(tǒng)自檢a.“TEMP ERROR”，表示溫度檢測線路有

一般蒸餾水常常難以滿足實(shí)驗(yàn)要求，大多要求要

Time”F2”

“ 進(jìn)行第二次蒸餾（雙蒸水），它可以去除水中的大部分有機(jī)雜質(zhì)，但制作時(shí)間較長，而且無機(jī)雜質(zhì)還是很多。許多實(shí)驗(yàn)還需要去離子水，這就需要陰陽離子交換樹脂進(jìn)行處理。目前，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都使用高質(zhì)量的超純水。如美國微孔濾膜公司的Milli-Q超純水制造系統(tǒng)所制造的超純水適用于許多學(xué)科領(lǐng)域，如分子克隆、各種色譜分析、氨基酸分析、DNA測序、酶反應(yīng)、組織和細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)。下面介紹RO-MB壁掛式反滲透高純水機(jī)性能及使用方法。RO-MB反滲透高純水機(jī)（杭州永潔達(dá)）產(chǎn)水量（25℃）10L/H；產(chǎn)水水質(zhì)：RO純水：<10μs/cm，高純水：>15MΩ.cm；可用自來水制成普通實(shí)驗(yàn)用水和高純水，同時(shí)滿足不同水質(zhì)要求。在線電導(dǎo)率儀對(duì)產(chǎn)水水質(zhì)連續(xù)檢測，可保證產(chǎn)水質(zhì)量。

1.使用方法

(1)準(zhǔn)備：先檢測與純水機(jī)相連的原水管路、廢水管路連接是否正常，打開原水閥門。供電電源是否正常，檢查按鈕是否在關(guān)閉狀態(tài)（按鈕彈出狀態(tài)）220V電源插座上。

(2）開機(jī)：依次按下電源開關(guān)，泵開關(guān)，純水機(jī)啟動(dòng)產(chǎn)水，同時(shí)廢水排出，指示燈亮起，并處于自動(dòng)運(yùn)行狀態(tài)。

(3）取純水：若打開閥門打開時(shí)，檢測儀表顯示高純水電導(dǎo)率或電阻值。一杯水后再取新鮮水。

(4）關(guān)機(jī)：不用時(shí)可關(guān)閉個(gè)按鈕停機(jī)，自來水進(jìn)水閥門不必關(guān)閉，這時(shí)機(jī)子內(nèi)部的進(jìn)水電磁閥已自動(dòng)切斷水路。只要管路閥門不漏，也可使機(jī)子保持自動(dòng)待機(jī)狀態(tài)。

2.注意事項(xiàng)

（1）純水機(jī)的正常使用環(huán)境溫度為度不低于5℃。

（2）預(yù)處理濾芯一般三至六個(gè)月更換一次，實(shí)際使用壽命與自來水水質(zhì)、總過濾量等有關(guān)。

（3）混床濾芯產(chǎn)高純水約水中含鹽量、總用水量等有關(guān)。天開機(jī)30分鐘沖洗一次，冬季每隔

（4）使用過程若發(fā)現(xiàn)停機(jī)后泵仍頻繁地每隔數(shù)分鐘有規(guī)則地啟動(dòng)數(shù)秒鐘又停機(jī)，此為管路漏水引起，需及時(shí)打開機(jī)箱加以解決。象，有利于沖洗和保護(hù)反滲透膜元件，十、消毒設(shè)備

細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)以及核酸等有關(guān)實(shí)驗(yàn)所用的試劑、RO純水或高純水出口閥門，則可獲得相應(yīng)水質(zhì)的純水。當(dāng)高純水出口 115～3噸，約二至四個(gè)月更換一次，2～3避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積。將電源插頭插入帶有接地線的為了獲得高質(zhì)量的高純水，可以先放掉 35℃，產(chǎn)水量會(huì)隨溫度降低而下降，冬季保養(yǎng)溫實(shí)際使用壽命與自來水水質(zhì)、2天。必須注意定期沖洗維護(hù)。夏季宜每 乃屬正?，F(xiàn)尤其高溫季節(jié)。器皿及實(shí)驗(yàn)用具，應(yīng)嚴(yán)格滅菌，有的實(shí)驗(yàn)

～設(shè)備停運(yùn)時(shí)間超過天開機(jī)沖洗一次。若每隔半小時(shí)以上啟動(dòng)數(shù)秒鐘又停機(jī)，還要求沒有核酸酶的污染，故應(yīng)將實(shí)驗(yàn)器械，試劑等進(jìn)行高壓消毒。對(duì)于經(jīng)過導(dǎo)入DNA重組分子的菌株，操作后必須進(jìn)行嚴(yán)格的高壓消毒滅活處理。

大批實(shí)驗(yàn)物品、試劑、培養(yǎng)基等可以使用大型消毒器進(jìn)行消毒。一些不能經(jīng)受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。所有的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)菌培養(yǎng)的操作，都應(yīng)在紫外線消毒后的超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

下面介紹立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40BI）的使用方法。

1.使用方法

（1）開蓋：轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使鍋蓋離開密封圈。

（2）通電：連接自動(dòng)進(jìn)水裝置。接通電源，將控制面板上電源開關(guān)按至低（LOW）紅燈亮，蒸發(fā)鍋內(nèi)屬斷水狀態(tài)；缺水（（3）加水：打開水源，水位達(dá)到低水位，控制面板上低水位紅燈和缺水黃燈相繼滅，加熱（1-綠燈）亮，繼續(xù)加水至高水位（（4）堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內(nèi)，這樣有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。

（5）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊。

（6）設(shè)定溫度：通電后數(shù)顯窗燈亮，上層為紅色，顯示溫度，下層為綠色，設(shè)定溫度和時(shí)間。先按控制面板上確認(rèn)鍵，綠色數(shù)顯閃爍，進(jìn)入溫度設(shè)定狀態(tài)。按一次移位鍵指相應(yīng)位置閃爍，根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進(jìn)行（單項(xiàng)循環(huán)）移位。按△增加鍵或所需溫度設(shè)定。設(shè)定完畢，按二次確認(rèn)鍵，進(jìn)行溫度確認(rèn)。

（7）設(shè)定時(shí)間：按一次確認(rèn)鍵，將溫度設(shè)定切換成時(shí)間設(shè)定；再按一次移位鍵，所指相應(yīng)位置閃爍，完畢，按二次確認(rèn)鍵，定時(shí)器開始倒計(jì)時(shí)。

（8）滅菌：在加熱初，將下排汽閥打開至垂直位置；下排汽閥待蒸汽冒出時(shí)，壓力表顯示指示為的15%為宜。安全閥設(shè)定數(shù)，超出壓力部分，安全閥將自動(dòng)泄壓，并開始計(jì)數(shù)滅菌所需時(shí)間。滅菌完成，電控裝置將自動(dòng)關(guān)閉加熱系統(tǒng)，伴有蜂鳴提醒；并將保溫時(shí)間切換成控制面板上電源開關(guān)按至

（9）干燥：物品滅菌后需要迅速干燥，須打開放汽閥和下排汽閥，將滅菌器內(nèi)的蒸汽迅速排出，使物品上殘留水蒸汽快速揮發(fā)。根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進(jìn)行移位；進(jìn)行時(shí)間設(shè)定確認(rèn)?！鏁r(shí)，將下排汽閥推向水平關(guān)閉位置；留有微量蒸汽逸出，以控制總汽流量使用最高滅菌溫度為OFF HIGH）綠燈亮，自動(dòng)停止加水。按增加鍵或減少鍵，時(shí)間采用倒計(jì)時(shí)，124℃～126℃，ON處，若水位LACK）黃燈亮，電源已正常輸入。

200mm×100mm×100mm為宜，各

所??減少鍵，進(jìn)行 進(jìn)行所需時(shí)間設(shè)定。設(shè)定當(dāng)滅菌鍋內(nèi)溫度達(dá)到設(shè)定溫度，0.145Mpa～0.165Mpa范圍內(nèi)屬于END顯示；此時(shí)，將

100壓力在處；關(guān)閉電源，停止加熱待其冷卻。

（10）將蓋開啟，取出已滅菌物品。關(guān)閉水源，打開下排水閥，排盡滅菌室的水與水垢，以備下次使用。

2.注意事項(xiàng)

（1）堆放滅菌物品時(shí)，嚴(yán)禁堵塞安全閥的出汽孔，必須留出空位保證其空氣暢通，否則安全閥因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。

（2）滅菌液體時(shí)，應(yīng)將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中，以不超過選用棉花紗塞，切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞，放蒸汽，必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。

（3）對(duì)不同類型，不同滅菌物要求的物品，切勿放在一起滅菌，以免顧此失彼，造成損失。

實(shí)驗(yàn)二

質(zhì)粒DNA

一、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，于染色體外的游離狀態(tài)，制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。

DNA，大小范圍從

在滅菌液體結(jié)束時(shí)不準(zhǔn)立即釋 至200kb3/4體積為好，瓶口隨著染色體的復(fù)特別注意，的提取－堿裂解法1kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；②收集和裂解細(xì)菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)介紹堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離質(zhì)粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時(shí)，因?yàn)楣矁r(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。

二、儀器及試劑

1.儀器及耗材：37℃恒溫?fù)u床、冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、微量移液器、50 ml離心管、1.5 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。

2.試劑及配制：

LB培養(yǎng)液的配制：

酵母浸提物

5.0 g；

胰蛋白胨

10.0 g；

NaCl

10.0 g；

依次稱量后加入800 ml去離子水后攪拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（約0.2 ml）調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值至7.0。再加去離子水將溶液定容至總體積為1000 ml，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。

溶液 Ⅰ（GET緩沖液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖

配制：1000 ml

mol/L Tris-HCl（pH8.0）

ml

0.5 mol/L EDTA（pH8.0）ml

20% Glucose（1.11mol/L）

ml

dH2O

910ml

將以上溶液混合裝瓶，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。

溶液II（變性液）：200 mmol/L NaOH，1% SDS

配制： 500 ml

10% SDS

ml

2N NaOH

ml

取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。室溫保存，此溶液保存時(shí)間最好不超過一個(gè)月，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要?jiǎng)×覕嚢琛?/p>

溶液 III(醋酸鉀液)：3 mol/L 醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 5.6。5 mol/L 冰醋酸

配制：500 ml

醋酸鉀

g

冰醋酸

57.5 ml

加入300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至高溫高壓滅菌后，4℃保存。

10×TE緩沖液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA

配制：1000ml mol/LTris-HCl 緩沖液(pH 8.0)

100ml

500 mmol/L EDTA(pH8.0)ml

加入約800 ml的去離子水，均勻混合。溶液定容至1 L。高溫高壓滅菌后，苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)：將量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入 13

500 ml。4℃保存。24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

其它試劑：TE（pH8.0）、異丙醇、氯仿/異戊醇（24:1）、無水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素貯存液（50 mg/ml）

三、操作步驟

1.菌體的培養(yǎng)和收獲

(1）將5～10 ml含有氨卞青霉素（后接入一單菌落，并保持通氣良好，于接一次，于37℃ 220 rpm振搖培養(yǎng)(2）吸取培養(yǎng)的菌液1.5 ml，轉(zhuǎn)入棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。

2.質(zhì)粒DNA提?。▔A裂解法）

（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重懸細(xì)菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。

（2）加200 ul溶液 Ⅱ，蓋緊管口，液變透明，粘稠）。

（3）加150 ul溶液 Ⅲ，輕微振蕩混和

（4）12000 rpm離心6 min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）

（5）加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻離心管。

（6）加1倍異丙醇，振蕩混勻，靜置倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。

（7）加200 ul 70％乙醇洗滌沉淀物，臺(tái)式離心機(jī)在室溫下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）

（8）沉淀加20μl TE, 反復(fù)吹打使質(zhì)粒

四、常見問題及可能原因

1.提取的質(zhì)粒DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵步驟反應(yīng)時(shí)間過短；離心時(shí)間或速度不夠。

2.提取的質(zhì)粒DNA呈涂布狀：操作過程中用力過猛，動(dòng)作過大；操作系統(tǒng)內(nèi)有污染。

AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml的三角瓶中，然37℃ 220 rpm振搖過夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉(zhuǎn)3～4 h。的離心管中，用臺(tái)式離心機(jī)以12000 rpm

輕緩上下顛倒離心管以混合內(nèi)容物。室溫靜置10 sec，置冰上10 min(溶液出現(xiàn)白色沉淀。1 min，12000 r/min離心6min，取上清液至另一10 min，12000 rpm離心6 min。棄上清液，將離心管 12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀。DNA充分溶解，－20℃保存。14 min。5 min（溶)。

1.5 ml離心 3.與染色體DNA分離不全：變性過程不完全；試劑配制有問題（成分，濃度或pH）。

實(shí)驗(yàn)三

瓊脂糖凝膠電泳

一、實(shí)驗(yàn)原理

瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化的多孔支持介質(zhì)（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場上。由于架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。因而可依據(jù)DNA可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，而構(gòu)型不同的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測。以提供一個(gè)用于確定EB)，其分子可插入下，呈桔紅色熒光，因此也可對(duì)分離的

一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在

二、儀器及試劑

1.儀器及耗材：

水平電泳槽、電泳儀、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。

2.試劑及配制：

50×TAE緩沖液的配制：

配制1000 ml

DNA 片段的常用技術(shù)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)DNA分子的雙螺旋骨因此在電場中向正極移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，DNA，也DNA分子。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物相對(duì)可DNA片段大小的標(biāo)準(zhǔn)。在凝膠中加入少量溴化乙錠(ethidium bromide, DNA的堿基之間，形成一種絡(luò)合物，在254～365nm波長紫外光照射DNA進(jìn)行檢測。0.2kb～50kb范圍內(nèi)的DNA片段。本實(shí)驗(yàn)介紹瓊脂糖凝

DNA片段分離中的應(yīng)用方法。

凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點(diǎn)樣板或parafilm、2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）15 分子的大小來使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的Tris

242 g

冰乙酸

57.1 ml

0.5 mol/L EDTA

ml

加入600 ml去離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1 L后。高溫高壓滅菌，室溫保存。

1×TAE緩沖液的配制：

稱量20 ml的50×TAE緩沖液，再加入980 ml的去離子水。

溴化乙啶貯存液：10 mg/ml 溴化乙啶

配制：100 ml

稱取1 g溴化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至100 ml后，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中。室溫保存。

6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。

配制：10 ml

溴酚藍(lán)mg

二甲苯青FF

mg

甘油

ml

用6×TAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。-20℃保存。

其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder、瓊脂糖、三、操作步驟

1.制備1％瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml)：稱取0.7 g中，加入70 ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。

2.膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取 16

0.5 g）瓊脂糖置于錐形瓶3次至瓊脂糖全部融化，并在固定位置放（下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。

3.加樣：在點(diǎn)樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。

4.電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60－100V，樣品由負(fù)極（黑色）向正極（紅色）方向移動(dòng)。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處時(shí)，停止電泳。

(5）電泳完畢后，取出凝膠，用含有0.5 ug/ml的溴化乙錠1×TAE用清水漂洗10 min。

(6)觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

四、常見問題及注意事項(xiàng)

1．配瓊脂糖時(shí)應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。

2．瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時(shí)要輕緩。

3．電泳時(shí)應(yīng)注意電源線路，預(yù)防觸電。

4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用時(shí)應(yīng)帶乳膠或一次性塑料手套。并在專門的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用。

5．紫外線對(duì)人體有損傷作用，開燈時(shí)間不宜太長，注意防護(hù)。

6．DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。

7．質(zhì)粒DNA的存在形式有3種，①共價(jià)閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②開環(huán)DNA（ocDNA），此種質(zhì)粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力，形成松弛的環(huán)狀分子；③線狀DNA，因質(zhì)粒處斷裂而造成。因此質(zhì)粒DNA電泳的結(jié)果中有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們的泳動(dòng)速度為：cccDNA > 線狀DNA > ocDNA。min，再DNA的兩條鏈在同一溶液染色約 DNA18

DNA

實(shí)驗(yàn)四

限制性內(nèi)切核酸酶的酶切與鑒定

一、實(shí)驗(yàn)原理

限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈分子中特異核苷酸序列的水解酶，主要存在于原核生物中。根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。其中Ⅱ類酶在分子克隆和基因操作中最為有用，是常用的分子生物學(xué)工具酶。

限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列長度一般為4～8個(gè)呈回文序列的特異核苷酸對(duì)。一般情況下，識(shí)別序列越長，在同一DNA分子中識(shí)別位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率就越小。許多限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)已被確定。例如EcoRl 酶的識(shí)別與切割序列為以下6個(gè)堿基對(duì)。

5′??GAATTC??3′

EcoR I以獨(dú)特的方式識(shí)別并裂解這個(gè)順序，形成兩個(gè) 和

……G

這些末端為互補(bǔ)的，即粘性末端，并可在連接酶的催化下與由相連接。

限制性內(nèi)切酶主要用于基因組基因片段的分離與回收以及單酶切、雙酶切或部分酶切等不同方式。大量的酶切反應(yīng)。小量酶切反應(yīng)主要應(yīng)用于質(zhì)粒的酶切鑒定，DNA，大量酶切反應(yīng)用于制備目的基因片段，體積為

本實(shí)驗(yàn)為EcoR I對(duì)質(zhì)粒性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定酶切效果。

二、儀器與試劑

1.儀器：

水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、2.試劑：

質(zhì)粒pUC18、EcoR I限制性內(nèi)切核酸酶、內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、樣緩沖液、溴化乙啶染液、無菌水等。

三、操作步驟

3′??

……CTT AA DNA的片段化、重組DNA分子物理圖譜的構(gòu)建等。根據(jù)酶切目的和要求不同，可有pUC18的小量酶切。在用特定的限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)后，CTT AAG?? 5′

5′突出末端：

AATTC……

EcoR I產(chǎn)生的其它分子末端DNA分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的可分為小量酶切反應(yīng)和體積為20 μ50～100 μl，DNA

在質(zhì)粒的雙鏈環(huán)狀DNA電泳設(shè)備等。

l, 含0.210通?？刹捎? μg 30ug。6×上

G……根據(jù)酶切反應(yīng)的體積不同，～用量在～分子上有多個(gè)限制

1．限制性內(nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的0.2或0.5ml PCR薄壁離心管中進(jìn)行。

2.酶切反應(yīng)體系（10ul）：

酶解緩沖液（10×buffer）ul

限制性內(nèi)切酶

0.5 ul EcoR I(7.5U)

底物DNA（質(zhì)粒）

滅菌ddH2O

限制性內(nèi)切酶最后加入，手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸，混勻后離心15s。37℃水浴消化

3.酶切完畢，分子量標(biāo)準(zhǔn)物同時(shí)進(jìn)行電泳以確定應(yīng)，或加入適量酶后繼續(xù)反應(yīng)。

5.經(jīng)電泳觀察酶切反應(yīng)完全后，將上述反應(yīng)液置將剩余酶切產(chǎn)物保存于

四、注意事項(xiàng)

1.限制性內(nèi)切酶需保存于

2.限制性內(nèi)切酶溶液通常含有溶液底部，所以要充分搖勻。

3.加樣時(shí)吸頭垂直進(jìn)入試劑管，避免碰到管壁，每加完一樣要換一個(gè)吸頭，同時(shí)在已加的樣品前做個(gè)記號(hào)以防止錯(cuò)加或漏加，避免污染。

4.酶（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機(jī)會(huì)。加酶時(shí)吸頭深入不可過深。

5.酶解消化反應(yīng)溫度及時(shí)間根據(jù)該酶使用說明書而定。

6.注意酶的用量，加入的酶量按的10%，以避免酶液中甘油干擾反應(yīng)活性的可能，即在識(shí)別序列以外的位點(diǎn)進(jìn)行切割。此外，反應(yīng)體系中甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于12%，以及缺少

五、相關(guān)問題

2h。取5ul酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，?C20℃?zhèn)溆谩?20℃，操作時(shí)應(yīng)將酶保持在冰浴中，避免長時(shí)間置于高溫中。NACL和存在M

x ul（依質(zhì)粒濃度而定）

加至10 ul 鑒定酶切反應(yīng)效果，DNA片段的大小。如果酶切不完全，可繼續(xù)65℃水浴中10～15min，中止酶切反應(yīng)，50%甘油，加入反應(yīng)管后，因密度較大，往往沉淀至

1-3U/ug DNA計(jì)算，酶的體積應(yīng)低于反應(yīng)總體積

。酶量過大（≥25U/ug DNA）時(shí)，有產(chǎn)生所謂星號(hào) 20

6000 r/min，DNA.酶解消化反

必須用 等情況下，都有可能出現(xiàn)星號(hào)活性。

1.酶的保存

不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中，這種特定配方的緩沖液能使酶活性維持較長時(shí)間。常用的保存緩沖液各組分作用如下：

Tris-HCl（7.4―7.8）：

維持穩(wěn)定的pH范圍。

50-100mmol/L

NaCl或KCl：提供一定的離子強(qiáng)度。

0.1mmol/L EDTA：

1mmol/L

DTT：

200-500ug/ml BSA：

度，防止蛋白質(zhì)分子濃度過低而導(dǎo)致酶分子變性。

50%的甘油：

1-5 g/L的Triton-100：

白質(zhì)分子的表面變性作用。

2.酶單位的定義

限制酶的單位通常定義為：1U的酶能在約完成酶切1ug的λDNA。確定限制酶單位的具體操作方法是分別向列的酶（1U左右），當(dāng)電泳觀察到酶切片段的條帶不再發(fā)生變化時(shí)說明已作用完全，割的最少酶量定為1U的酶量。

3.限制酶的作用條件

限制酶切割DNA的反應(yīng)中，酶切條件是實(shí)驗(yàn)成功的重要因素，其中包括反應(yīng)的溫度、時(shí)間與反應(yīng)的緩沖體系，除了這些條件外，只有在正確選擇酶反應(yīng)條件時(shí)才能達(dá)到最佳酶切效果。

（1）作用溫度

早期的酶切反應(yīng)都在37℃進(jìn)行，這種方法雖然簡單、統(tǒng)一，但卻不能達(dá)到每個(gè)酶的最適反應(yīng)溫度。為了達(dá)到最佳酶切的效果，最好根據(jù)所選用的酶確定所需要的反應(yīng)溫度。

（2）緩沖體系

限制酶反應(yīng)的緩沖體系大致相同，都含有以下組分：約作用是將酶反應(yīng)體系的pH維持在7.5-8.5；約

絡(luò)合掉能激活限制酶的鎂離子。

保護(hù)酶分子上的還原性基團(tuán)。

牛血清白蛋白提高溶液中蛋白質(zhì)的濃

使酶液保存于-20℃不至凍結(jié)。

這是一種非離子型表面活性劑，能防止蛋50ul合適的反應(yīng)緩沖體系中，在1ug的底物中加入一系DNA的純度與濃度也會(huì)影響酶切效果，100mmol/L10mmol/L的MgCl2，作用是為限制酶提供激

1h內(nèi)完全切Tris-HCl，的活因子；1mmol/L的DTT，作用是保護(hù)還原性基團(tuán)；約150mmol/L的NaCl，作用是提供合適的離子強(qiáng)度。由于認(rèn)識(shí)的局限性，早期的限制酶反應(yīng)體系僅根據(jù)其中NaCl含量的不同分為高鹽、中鹽與低鹽三種，這同樣不能使每種酶獲得最適反應(yīng)條件?，F(xiàn)在提供酶的很多廠商能提供4-10種緩沖體系，其中各必需成分之間只有很小的差別，目的是使每種酶都發(fā)揮最大的作用。

緩沖液一般配成10倍的濃度，使用時(shí)以1/10的比例加入，當(dāng)然為了減小吸量誤差也可自行配制5倍的緩沖液。

(3)反應(yīng)體積與時(shí)間

酶反應(yīng)體積一般不宜小于20ul。因?yàn)檫^小的反應(yīng)體積在加入各種成分時(shí)易產(chǎn)生誤差，甘油含量易超過10%。在37℃保溫可因水分蒸發(fā)而明顯改變反應(yīng)體系中各成分的濃度，從而影響酶活力。同時(shí)還要考慮反應(yīng)完畢進(jìn)行電泳時(shí)，所加樣品中DNA的量能夠在電泳中顯出清晰的泳帶。

常規(guī)的酶切反應(yīng)一般控制在60min內(nèi)進(jìn)行，但也可以根據(jù)切割對(duì)象與所用的酶將保溫時(shí)間延長至十幾個(gè)小時(shí)。

(4)DNA的純度與濃度

除了上述酶反應(yīng)條件外，影響酶切效果的最主要因素是DNA的純度。例如，樣品中含有大量RNA雜質(zhì)時(shí)會(huì)因減少了酶的有效濃度而影響酶切效果；某些雜蛋白未除凈而結(jié)合在DNA時(shí)也會(huì)影響酶切效果。至于抽提過程中未除凈的各種影響因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是瓊脂糖凝膠中的硫酸根離子等。

DNA純度的另一個(gè)指標(biāo)是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后電泳結(jié)果顯示出不清晰條帶或成為一片紅色（術(shù)語稱Smear）時(shí)，可肯定系統(tǒng)中已經(jīng)污染了DNA酶。

DNA樣品中含有大量RNA時(shí)可用RNA酶處理；含有結(jié)合在DNA上的雜蛋白與DNA酶時(shí)都可用氯仿/異戊醇抽提；當(dāng)樣品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物質(zhì)時(shí)可以通過沉淀更換一個(gè)新的緩沖體系。當(dāng)然，酶切失敗時(shí)也不能排除除DNA外的一切因素，如無菌水，EP管，吸咀等的干凈程度以及內(nèi)切酶自身的酶活性情況。

除純度外，DNA的濃度也會(huì)影響酶切效果，一般DNA質(zhì)量濃度在1ug/20ul才能得到較好的酶切效果，質(zhì)量濃度高達(dá)1.5ug/20ul時(shí)就可能發(fā)生酶切困難。

(5)終止酶切反應(yīng)的方法

如果需對(duì)酶切片段進(jìn)行連接或標(biāo)記等操作時(shí)，首先要將限制酶滅活。滅活的方法可分為三種：第一種是向反應(yīng)緩沖體系中加入終濃度為10-12.5mmol/L的EDTA，原理是絡(luò)合掉酶反應(yīng)中所需的鎂離子。但這種方法會(huì)影響需鎂離子的后續(xù)反應(yīng)。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法來更換緩沖體系，以除去EDTA，但這樣就會(huì)造成DNA的損失。第二種方法是熱失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保溫60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保溫 22 30min方能達(dá)到目的；極端的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加熱的方法使之失活。熱失活方法的特點(diǎn)是簡單并且未向體系中引入任何物質(zhì)，特別適用于連續(xù)進(jìn)行幾個(gè)酶切反應(yīng)；熱失活法的另一個(gè)特點(diǎn)是不用更換體系，所以不會(huì)造成DNA的損失。第三種方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片段。這種方法的特點(diǎn)是處理?xiàng)l件劇烈，能使酶徹底失活（不像第一種方法中酶蛋白并未變性而只是沒有激活因子而已）。

實(shí)驗(yàn)五

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

一、實(shí)驗(yàn)原理

體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中才能大量的進(jìn)行復(fù)制、增殖和表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，用含Ca2+ 的溶液處理大腸桿菌細(xì)胞會(huì)易于吸收外源DNA。大腸桿菌吸收外源DNA的過程被稱為轉(zhuǎn)化。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài)。用理化方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)，如電轉(zhuǎn)化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前實(shí)驗(yàn)室常用的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，其原理是使細(xì)菌處于0°C、CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細(xì)胞膜表面，經(jīng)42°C短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。宿主細(xì)胞一般是限制―修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，而質(zhì)粒載體攜帶有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。若將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布與于含氨卞青霉素的平板上，則只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)胞才能生存并生長增殖。從而可以篩選出哪個(gè)克隆含有質(zhì)粒。

本實(shí)驗(yàn)以E.coli JM109菌株為受體細(xì)胞，受體菌使其處于感受態(tài)，然后與pUC18質(zhì)粒共保溫實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在含有氨卞青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，化的受體細(xì)胞則因無抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA分離提取出來，用于電泳分析、限制性內(nèi)切酶圖譜的制作以及

二、儀器及試劑

1.儀器：

恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)。

2.材料

E.coli JM109受體菌、質(zhì)粒pUC18。

3.試劑：

LB培養(yǎng)液（1L）：

胰蛋白胨

10g

酵母粉

5g

NaCl

10g（高鹽）或

氨芐青霉素（Ampicillin）

100mg/ml

用CaCl2處理而未有轉(zhuǎn)DNA測序等實(shí)驗(yàn)。5g（低鹽）在三角瓶中將胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高壓滅菌。待冷卻至55℃，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨芐青霉素。然后貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

LB平板培養(yǎng)基：

胰蛋白胨

10g

酵母粉

5g

NaCl

10g

瓊脂

13g

在三角瓶中依次將上述配方加入1L的重蒸水中并高壓滅菌。待培養(yǎng)基降溫至養(yǎng)基并輕輕旋轉(zhuǎn)以使溶解的瓊脂均勻分布于整個(gè)培養(yǎng)基溶液中，根據(jù)需要加入氨芐青霉素，然后可直接從三角瓶中倒出培養(yǎng)基鋪制平板。90mm直徑的培養(yǎng)皿約需培養(yǎng)基完全凝結(jié)后，倒置平皿并貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

其它試劑：

0.1M CaCl2溶液、滅菌蒸餾水

三、操作步驟

1.感受態(tài)細(xì)菌的制備：

（1）用接種環(huán)從E.coli JM109菌平板上挑取一單克隆菌落，培養(yǎng)基的試管中中，37℃ 220 rpm振蕩培養(yǎng)過夜（12～16h）。

（2）取0.5 ml過夜菌液接種到裝有50ml LB液體培養(yǎng)基三角瓶中中，振蕩培養(yǎng)2－3h，隔20－30min測量OD600值，至OD600值為轉(zhuǎn)至1.5ml 離心管中，每管1ml菌液，按需要決定管數(shù)。

（3）4℃，12000 rpm，離心2 min，以回收細(xì)菌。

（4）倒凈上清液，倒置離心管于濾紙上1min，使殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴30 min。

（5）4℃，12000 rpm，2 min。

（6）倒凈上清液，倒置離心管1min，使殘留液流盡。每管加CaCl2重新懸浮細(xì)胞（重懸時(shí)操作要輕），即成感受態(tài)細(xì)胞懸浮液。

2.細(xì)菌轉(zhuǎn)化：

（1）取3只滅菌的Ep管，分別編號(hào)1、2、3、分別加入以下各組分：加入

5g，30接種于裝有0.3-0.4。無菌條件下將細(xì)菌100 ul冰預(yù)冷的 50℃，取出培50ml培養(yǎng)基。5ml LB液體37℃，220 rpm每管加1ml0.1 mol/L 10～20ng

或 ～ 質(zhì)粒DNA（體積小于10ul），同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照組：

1號(hào)：受體菌對(duì)照組：

100ul感受態(tài)細(xì)胞懸浮液+2ul無菌ddH2O

2號(hào)：質(zhì)粒DNA對(duì)照組：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19

3號(hào)：正常轉(zhuǎn)化組：100ul感受態(tài)細(xì)胞懸浮液+2ul pUC19

（2）輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min，促進(jìn)DNA分子在感受態(tài)細(xì)胞表面的吸附。

（3）轉(zhuǎn)入便于DNA分子的吸附進(jìn)入，提高轉(zhuǎn)化率。

（4）迅速轉(zhuǎn)入冰上冷卻

（5）使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并且表達(dá)

（6）取200ul37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)可將之置于37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，100ul左右，用移液器吹打重懸，再全部涂于含

（7）觀察并記錄轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的數(shù)目，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

四、注意事項(xiàng)：

1.實(shí)驗(yàn)中所用的器皿均要滅菌，以防止雜菌和外源

2.實(shí)驗(yàn)過程中要注意無菌操作，溶液移取、分裝等均應(yīng)在無菌超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。

3.必須設(shè)對(duì)照組，以檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過程中是否有污染。

4.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均需置于冰上。

5.選用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，42℃水浴2min，通過熱刺激增強(qiáng)CaCL2的作用，2min，修復(fù)細(xì)胞膜。600u無抗生素lLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37℃，Ampicillin抗性基因。Ampicillin的LB平板，將平板置于無菌臺(tái)直至液體被吸收，12－16h后觀察結(jié)果，其余保存于4℃。如果平板上沒有長出菌落，同時(shí)將剩下的500ul菌液離心，Ampicillin的LB平板上，置 DNA

OD600不應(yīng)高于0.6。26

使細(xì)胞膜產(chǎn)生通道，220 rpm，振蕩倒掉大部分上清，37℃培養(yǎng)。60min。留 加菌液涂在含 的污染。

實(shí)驗(yàn)六

動(dòng)物組織細(xì)胞基因組

一、實(shí)驗(yàn)原理

真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來制備基因組的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持組織細(xì)胞在含仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的

蛋白酶K在勻漿后提取EDTA則抑制細(xì)胞中分子完整地分離出來。

二、儀器及試劑

1.恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)（離心管（滅菌）

SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶DNA的反應(yīng)體系中，Dnase

、吸頭（滅菌）DNA提取 因此，制備DNA分子的完整。提取KDNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。SDS可破壞細(xì)胞膜、活性；而蛋白酶K可將 27

DNA的原則是既要將DNADNA核膜，并使組織蛋白與蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，GeneQuant）DNA。真核生物DNA與蛋白 DNA分離，使DNA 的一般過程是將分散好的的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯從溶液中析出。的重要特性是能在的 儀器：、移液器、玻璃勻漿器、2.試劑：

（1）細(xì)胞裂解緩沖液：

Tris(pH8.0)

mmol/L

EDTA(pH 8.0)

500 mmol/L

NaCL

mmol/L

SDS

10%

胰RNA酶

20ug/ml

（2）蛋白酶K：

稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，?C20℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）TE緩沖液（pH 8.0）：高壓滅菌，室溫貯存。

（4）酚?氯仿?異戊醇（25:24:1）、（5）異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。

三、操作步驟

1.取新鮮或冰凍動(dòng)物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺(tái)式離心機(jī)以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。

2.加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）

3.加等量的酚?氯仿?異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

4.取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿?異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

5.取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min，離心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm，5min。

8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

四、常見問題

1.選擇的實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，處理時(shí)間不易過長。

2.在加入細(xì)胞裂解緩沖液前，細(xì)胞必須均勻分散，以減少

3.提取的DNA不易溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。

4.電泳檢測時(shí)DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。

5.分光光度分析DNA應(yīng)加入SDS至終濃度為

6.酚/氯仿/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊牡牧炕驕p少所取組織的量。

A280/A2600.5%，并重復(fù)步驟 DNA團(tuán)塊形成。1.8；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，2～8。DNA，可加大抽提前緩沖液29

的小于

實(shí)驗(yàn)七

DNA的定量

一、實(shí)驗(yàn)原理

核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在260 nm的紫外吸收峰，其吸收強(qiáng)度與核酸的濃度成正比，這個(gè)物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。OD260相當(dāng)于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml?？梢源藖碛?jì)算核酸樣品的濃度。

紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計(jì)核酸的純度，純的DNA制品的比值為1.8，RNA的比值為DNA高于1.8,則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。

對(duì)于很稀的核酸溶液，可用熒光光度法進(jìn)行測定。DNA 本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（EB）插入DNA 的堿基對(duì)平面之間并與之結(jié)合后，DNA樣品能在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生桔紅色熒光。熒光強(qiáng)度與被結(jié)合的EB的量成正比，而被結(jié)合的EB的量又與核酸分子長度和含量成正比，使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可比較出被測DNA溶液的濃度。靈敏度可達(dá)1～5ng。由于是基于目測，所以是估計(jì)水平。簡便，但準(zhǔn)確性較低。

二、儀器及試劑

1.儀器：Amersham

GeneQantTM Pro 紫外可見分光光度儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備。

2.試劑及配制：

5×上樣緩沖液：

配制10 ml

2.0, 波長處有特異若 該方法經(jīng)濟(jì)

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)

ml

10% SDS

ul

50% 甘油

2.5 ml

0.2% 溴酚藍(lán)

mg

0.2% 二甲苯青FF

mg

加去離子水至10 ml

其它試劑：0.1×TE、DNA標(biāo)準(zhǔn)液，EB儲(chǔ)存液（10 mg/ml），三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.紫外分光光度法

（1）用0.1×TE對(duì)待測DNA樣品按1:20或合適的倍數(shù)稀釋。

（2）開機(jī)，儀器會(huì)自動(dòng)對(duì)光路及分析軟件進(jìn)行檢測，待顯示屏上出現(xiàn)“instrument Ready”時(shí)，進(jìn)入核酸測定窗口

（3）調(diào)零。先用0.1×TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。點(diǎn)擊“set ref”鍵，儀器自動(dòng)校正零點(diǎn)。將樣品槽內(nèi)的樣品杯取出，換上待測樣品。

（4）吸70 ul已稀釋的DNA樣品轉(zhuǎn)入石英樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。如果樣品很少，可以用5～7ul的石英樣品杯。點(diǎn)擊“enter” 鍵，儀器即進(jìn)入分析狀態(tài)。窗口同時(shí)顯示260和280nm處的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA樣品的濃度等。

（5）打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用高純水清潔石英樣品杯，風(fēng)干后，再加入下一個(gè)待測樣品。

（6）DNA純度：以O(shè)D260/ OD280比值來反映。當(dāng)OD60 /OD80比值 <1.8時(shí)，說明樣品存在蛋白質(zhì)或酚等雜質(zhì)，可采用平衡酚/氯仿―異戊醇再抽提除去蛋白質(zhì)或用乙醚抽提去除殘留酚，再用無水乙醇沉淀，TE懸浮后再測定。當(dāng)OD60/OD280比值>2.0，說明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去處RNA。

2.EB熒光分析法

（1）瓊脂糖凝膠的制備。

（2）樣品的準(zhǔn)備。把待測DNA樣品進(jìn)行1:2連續(xù)稀釋，并準(zhǔn)備一份DNA標(biāo)準(zhǔn)液作對(duì)照。

（3）上樣。稀釋樣品與上樣緩沖液按1:5混合均勻后上樣。

（4）電泳。用100V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠的3/4處停止電泳。

（5）取出凝膠，入EB熒光染液中作用20min，取出后清水漂洗干凈，然后紫外檢測。肉眼可見到的最高稀釋度約含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸樣品中的嚴(yán)重污染干擾核酸紫外線吸收物質(zhì)的情況。

四、常見問題

1． 紫外分光光度法不能區(qū)分三種構(gòu)型，也不能區(qū)分染色體染色體DNA、以及偏高。

2．OD320值是背景，若溶液鹽濃度越高，3．的光面以避免干擾測定。

DNADNA和DNA解鏈的增色效應(yīng)等因素的影響，因此測得的數(shù)據(jù)往往比實(shí)際濃度 RNA等。由于測定吸收光度OD320也越高。要小心不要摔破，32

DNA分子的超螺旋、開環(huán)、線狀A(yù)260時(shí)，難以排除 持杯時(shí)也不要接觸透明RNA、分子的構(gòu)型，如質(zhì)粒測樣品時(shí)使用的石英樣品杯比較貴，實(shí)驗(yàn)八

PCR基因擴(kuò)增

一、實(shí)驗(yàn)原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，其原理類似DNA分子的天然復(fù)制過程，是將在待擴(kuò)增的DNA片段和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，生物學(xué)中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

PCR的工作程序?qū)嶋H上是一個(gè)在模板種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)。擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的結(jié)合。整個(gè)擴(kuò)增過程分三步：①變性，加熱使模板裂而形成兩條單鏈；②退火，突然降低溫度后模板存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度、物與模板之間；③延伸，在DNA聚合酶及鎂離子等的存在條件下，從引物的結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補(bǔ)的新的循環(huán)，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的40個(gè)循環(huán)后，DNA 可擴(kuò)增106～109倍。

二、儀器及試劑

1.儀器：PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器及吸頭、2.試劑：

10X PCR 緩沖液配制（部分隨Taq

250～500 mmol/L

100～500 mmol/L

15～20 mmol/L

0.5%

1mg/L

其它試劑：模板DNA、dNTP 混合液、凝膠、等

DNA擴(kuò)增 DNA、一對(duì)已知序列的寡核苷酸引物和四DNA引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，也結(jié)構(gòu)簡單等特點(diǎn)，DNA鏈。完成以上三步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過一個(gè)DNA鏈又成為下一輪循環(huán)的模板。現(xiàn)用圖示說明PCRPCR薄壁管、電泳儀等： KCl Tris-Cl（pH8.4）

MgCl2

Tween-20

BSA Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、瓊脂糖33

2n 倍。該技術(shù)已成為分子DNA主要的結(jié)合發(fā)生在引: 3 ′端開始，經(jīng)過25～ 雙鏈間的氫鍵斷 原理酶提供）

三、操作步驟

1.PCR 體系（40ul）：

4ul

10XPCR 緩沖液

4ul

25mM MgCl2（根據(jù)不同公司PCR 緩沖液的不同而定）

Xul

模板DNA ≥50ng

1ul

上游引物（50-100ng）

1ul

下游引物（50-100ng）

1ul

dNTP Mixture（終濃度

0.4 ul

Taq聚合酶

加ddH2O至40ul

視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2.將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，使反應(yīng)成分集于管底。

3.PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序設(shè)置：

（1）95℃

300s

變性

（2）94℃

45s

變性

（3）55℃

45s

退火（根據(jù)不同引物可能有不同退火溫度）

（4）72℃

45s

延伸（每分鐘可延伸

重復(fù)步驟2-4共 30 循環(huán)

（5）72℃

600s

延伸

反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，吸取少量（10ul）進(jìn)行分析，其余置

4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

20－200uM）1kp）6000 rpm 15 sec

離心

四、注意事項(xiàng)：

1.PCR 體系所加成分的實(shí)際用量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進(jìn)行核算。

2.加樣時(shí)要認(rèn)真,吸頭垂直進(jìn)入試劑管，每加完一樣要換一個(gè)吸頭，同時(shí)在已加的樣品前做個(gè)記號(hào)以防止錯(cuò)加或漏加，避免污染。

3.Taq聚合酶（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機(jī)會(huì)。加酶時(shí)吸頭深入不可過深，酶量不能過多。

五、影響PCR的主要因素

1.模板DNA

單鏈、雙鏈DNA白水解酶等的污染。模板用量依具體實(shí)驗(yàn)而定，PCR反應(yīng)時(shí)模板變性要充分。

2.PCR引物

PCR引物設(shè)計(jì)是否成功是能否獲得高質(zhì)量應(yīng)用時(shí)，需注意以下重要環(huán)節(jié)：

（1）PCR引物的長度約為以使它們在相近的溫度下與其互補(bǔ)序列結(jié)合。隨機(jī)的，應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的單一堿基，否則會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。引物免選用T ,尤其應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)

（2）一般來說，PCR引物長度選擇24bp左右為宜。

（3）要避免引物分子自身序列互補(bǔ)，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。兩個(gè)互之間的3，末端序列不能有明顯的互補(bǔ)性，以免形成引物二聚體。

（4）引物的熔點(diǎn)溫度（引物的GC/AT應(yīng)與要擴(kuò)增的模板

（5）引物的3，末端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，而

（6）目前在引物選擇中已廣泛應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件，從基因序列，并對(duì)設(shè)計(jì)的引物在引物二聚體形成、自身互補(bǔ)性及特異性等方面進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。PCR

18～30個(gè)核苷酸，并且成對(duì)引物間的2個(gè)以上T500bp時(shí)，引物長度選擇 Tm值）要適當(dāng)。DNA相當(dāng)或略高些。一般熔點(diǎn)溫度以大于DNA樣品盡量純凈，不能有核酸酶、蛋一般為100ul反應(yīng)液有105-106個(gè)目標(biāo)分子。PCR產(chǎn)物最關(guān)鍵的因素之一。在設(shè)計(jì)和G＋C含量應(yīng)相似。G+C含量應(yīng)為45%～55%之間。堿基分布是尤其是不應(yīng)在其3，端出現(xiàn)3個(gè)連續(xù)G或C，3，端堿基最好選用A、G、C,盡可能地避16-18bp；PCR產(chǎn)物≥5kb時(shí)，PCR引物相 Tm值與引物的堿基組成和長度有關(guān)；PCR55℃為宜。5，末端的要求可靈活些。EMBL或Genebank中查找有關(guān)

均可作為的模板。產(chǎn)物≤

（7）用于亞克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。為了保證內(nèi)切酶有效酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，一般在酶切位點(diǎn)的5，端再加上幾個(gè)額外的堿基。

（8）引物的濃度，在終濃度為0.2～1.0 umol/L的范圍內(nèi)產(chǎn)量基本相同，低于0.2 umol/L時(shí)會(huì)影響產(chǎn)量。但過高時(shí)一乃不經(jīng)濟(jì)，二則會(huì)出現(xiàn)非特異擴(kuò)增及增加引物二聚體的產(chǎn)生。

3.熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）

一般用量為2.5 U/100uL 反應(yīng)體積。酶量過多易導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。適溫度為75℃，在低溫下仍保留相當(dāng)高的活性，易引起不完全配對(duì)的引物伸及引物二聚體的擴(kuò)增延伸，所以應(yīng)注意防止非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)。

4.dNTPs

PCR常用的dNTP濃度在50-200umol/L。四種

低則反應(yīng)速度下降，過高則特異性下降，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來確定最適的

5.PCR緩沖液

因PCR反應(yīng)中的dNTP能與Mg2+結(jié)合，影響反應(yīng)液中游離應(yīng)按不同條件，確定合適的Mg2+濃度。一般在標(biāo)準(zhǔn)的Mg2+濃度約為1.5mmol/L。Mg2+離子濃度可顯著影響出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，過低則酶活性顯著下降。應(yīng)用無核酸酶的及5mmol的二硫蘇糖醇（DTT）對(duì)酶有一定的保護(hù)作用。

6.PCR循環(huán)的溫度

預(yù)變性：起始變性的時(shí)間應(yīng)該長些，以使變性充分。一般為不完全時(shí)，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，影響PCR反應(yīng)，但若變性溫度太高（不宜超過會(huì)影響Taq酶的活性。

變性：一般為94℃ 30s或95℃ 20s。

引物退火：應(yīng)根據(jù)具體反應(yīng)中引物與模板的堿基配對(duì)情況及實(shí)驗(yàn)的目的確定。一般為50-72℃。退火溫度增高會(huì)增強(qiáng)對(duì)不正確退火引物的識(shí)別，還能降低引物酸的錯(cuò)誤延伸。

延伸：一般為72℃ 60-90s。最后一個(gè)循環(huán)后應(yīng)在物合成的完整性。

7．平臺(tái)效應(yīng)和PCR循環(huán)的次數(shù)

dNTPsPCR反應(yīng)中（PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性。BSA 72℃保留該類酶的最-模板的非特異延

dNTP濃度。Mg2+的濃度，所以dNTP濃度200umol/L），濃度高則Tween-20(0.05%～0.1%)94℃ 3-5min。變性95℃），3，端不正確核苷5min，以保證PCR產(chǎn)應(yīng)等當(dāng)量。濃度、在PCR基因擴(kuò)增的后期，由于產(chǎn)物的堆積，將使原來產(chǎn)物以指數(shù)增加的速度變?yōu)槠教骨€，即所謂平臺(tái)效應(yīng)。它的出現(xiàn)是由于PCR原料的不斷消耗、酶的穩(wěn)定性的降低、終產(chǎn)物的阻滯效應(yīng)及非特異性產(chǎn)物等多種因素造成的，所以選擇合理的循環(huán)次數(shù)，既能得到足夠量的PCR產(chǎn)物，又不要無意義地增加循環(huán)次數(shù)。

8.操作環(huán)境

避免環(huán)境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目標(biāo)DNA的污染等。

實(shí)驗(yàn)九 瓊脂糖凝電泳分離與純化目的一、實(shí)驗(yàn)原理

不同大小的片段分離位于不同的位置，的片段。有許多型號(hào)的低熔點(diǎn)瓊脂糖可在雙鏈DNA的解鏈溫度高于收DNA片段。該法的優(yōu)點(diǎn)是可直接在熔化的凝膠中進(jìn)行各種酶反應(yīng)，如合成同位素探針、進(jìn)行限制酶切割和連接反應(yīng)等。

二、儀器及試劑：

1.儀器

電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器、離心管、吸頭等。

2.試劑：

低熔點(diǎn)瓊脂糖、待純化的

三、操作步驟：

1.配制1％的瓊脂糖凝膠，在適當(dāng)?shù)奈恢们幸粭l與加樣槽平行的槽，換低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠。

2.加樣，100V

DNA DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在電泳過程中切下目的片段并采用低熔點(diǎn)瓊脂糖回收法即可獲得目65℃時(shí)熔化成液體，在65℃，所以可以熔化凝膠而 DNA、凝膠回收試劑盒、去離子水或38

30℃時(shí)凝固成凝膠。由于DNA并不變性，在凝膠成液態(tài)時(shí)回TE（pH7.6）

分離和純化。

電泳，觀察所需片段是否移至低熔點(diǎn)膠內(nèi)。3.在紫外燈下切含有DNA的低熔點(diǎn)膠，置1.5 ml離心管中，于70℃熱水中熔化。

4.按凝膠回收試劑盒說明書操作。

12.取適量純化好的目的DNA在 GeneQuant 中檢測，確定純度和濃度，其余樣品于-20℃保存。

四、注意事項(xiàng)：

1.配凝膠的三角瓶、電泳槽和配膠板要先沖洗干凈

實(shí)驗(yàn)十

DNA重組

一、實(shí)驗(yàn)原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這種重新組合的DNA在體外的連接重組是基因工程操作的核心技術(shù)之一，其本質(zhì)是一個(gè)酶促反應(yīng)過程。即在一定的條件下，DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈DNA用，形成磷酸二酯鍵的過程。常用的DNA連接酶有兩種：菌DNA連接酶。其中T4噬菌體DNA連接酶對(duì)底物的要求低，能更有效地連接末端，應(yīng)用更廣泛。

T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分連接酶通過ATP的磷酸與連接酶的賴氨酸的氨基形成酶―隨后從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的51端的磷酸基團(tuán)上，形成磷酸―磷酸鍵。③鏈31端的羥基被活化，取代ATP后與DNA51端的磷酸根形成磷酸二酯鍵，完成DNA之間的連接。T4噬菌體DNA連接酶需要鎂離子和溫度和pH條件下進(jìn)行連接反應(yīng)。

二、儀器及試劑：

1.儀器：

臺(tái)式離心機(jī)、移液器、吸頭、恒溫水浴鍋等。

2.試劑：

T4 DNA連接酶、10×T4 DNA連接酶緩沖液、載體

三、操作步驟

1.外源DNA片段和載體DNA的連接

DNA51端磷酸和31端羥基之間相互作T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿3步：①首先，ATP與T4ATP復(fù)合物。②被激活的并釋放出ATP作為輔助因子，DNA、外源DNA。DNA的平DNAAMPDNAAMP，在一定的 叫做重組子。片段的噬菌體

取1只無菌Ep管、用微量進(jìn)樣器按下列順序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer

2.5 ul

酶切后的DNA片段

*1

約0.3 pmol

酶切后的載體DNA *2

約0.03pmol

T4 DNA Ligase

ddH2O

*1 DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體

*2 相同末端的載體與DNA自身環(huán)化。

2.蓋好蓋子，用手指輕彈Ep

3.將反應(yīng)管放入16℃過夜反應(yīng)（4.取出約25ng的DNA連接液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，片段和酶切DNA片段作電泳。

5.用0.1×TE將連接混合物稀釋至

四、注意事項(xiàng)

1.連接產(chǎn)物經(jīng)鑒定后應(yīng)迅速做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

2.根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)酶的用量。平端連接或接頭連接都比黏端連接慢得多，而且酶的用量也增大。

3.單價(jià)陽離子或低濃度的聚乙二醇可提高平端連接的效率。

4.防止載體DNA自身環(huán)化，常用堿性磷酸酶處理線性載體，去掉載體的DNA片段的自身環(huán)化。

5.正確調(diào)整載體DNA和外源

五、相關(guān)問題

1.連接反應(yīng)的影響因素

1ul

加至 25ul DNA摩爾數(shù)的3－12～16h）。鑒定連接結(jié)果，50ul，使用10～20ul DNA之間的比例有助于獲得高產(chǎn)量的重組產(chǎn)物。40

10倍。2s 以集中溶液。以未經(jīng)連接的質(zhì)粒 51?CDNA

片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，以防止其管數(shù)次，并于臺(tái)式離心機(jī)離心轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。磷酸以抑制

除了載體、供體的濃度及其比例等因素外，影響連接反應(yīng)的因素還有很多，如緩沖液組分、連接溫度與時(shí)間、酶濃度、DNA濃度及片段末端的堿基序列等。

（1）連接緩沖液的影響

不同的公司提供的連接緩沖液可能有所不同，但大體上都含有以下組分：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的范圍在7.4-7.8，較多用7.8，目的是提供合適酸堿度的連接體系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應(yīng)；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L，作用是維持還原性環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。與限制酶緩沖液不同的是連接酶緩沖液還含有0.5-4mmol/L的ATP，現(xiàn)多用1mmol/L，是酶反應(yīng)所必需的。

（2）pH的影響

一般將緩沖液的pH調(diào)節(jié)到7.4-7.8，較多用7.8。有實(shí)驗(yàn)表明，若把pH為7.5-8.0時(shí)的酶活力定為100%，那么體系偏堿（pH為8.3）時(shí)僅為全部活力的65%；當(dāng)體系偏酸（PH為6.9）時(shí)僅為全部活力的40%。

（3）ATP濃度的影響

連接緩沖液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，較多用1mmol/L。研究發(fā)現(xiàn)，ATP的最適濃度為0.5-1mmol/L，過濃會(huì)抑制反應(yīng)。例如，5mmol/L的ATP會(huì)完全抑制平末端連接，黏端的連接也有10%被抑制；還有報(bào)道，當(dāng)ATP的濃度為0.1mmol/L時(shí)，去磷酸載體的自環(huán)比例最大。由于ATP極易分解，所以當(dāng)連接反應(yīng)失敗時(shí)，除了DNA與酶的問題外，還應(yīng)考慮ATP的因素。含有ATP的緩沖液應(yīng)于-20℃保存，溶化取用后立即放回。連接緩沖液體積較大時(shí)最好分小管貯存，防止反復(fù)凍融引起ATP分解。與限制酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長期保存），臨用時(shí)加入新配制的ATP母液。

（4）連接溫度與時(shí)間的影響

因?yàn)轲ば阅┒说腄NA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會(huì)使氫鍵不穩(wěn)定，但連接酶的最適溫度又恰為37℃。為了解決這一矛盾，在經(jīng)過綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16℃，時(shí)間為4-16h?，F(xiàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于一般的黏性末端來說，20℃ 30min就足以取得相當(dāng)好的連接效果，當(dāng)然如果時(shí)間充裕的話，20℃ 60min能使連接反應(yīng)進(jìn)行得更完全一些。對(duì)于平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。

（5）酶濃度的影響

根據(jù)New England Biolabs公司對(duì)T4 DNA連接酶的定義，1U的酶可在16℃ 30min內(nèi)連接20ul體系中Hind Ⅲ酶切片段（黏性末端為0.12umol/L 5,末端，此時(shí)DNA質(zhì)量濃度約為300ng/ul）的50%。日常使用的DNA濃度比酶單位定義狀態(tài)低10-20倍，連接平末端時(shí)酶用量要比連接黏端大10-100倍，廠商為了滿足這一要求，又往往提供高濃度的酶（幾百個(gè) 41 單位/ul），所以進(jìn)行黏末端連接時(shí)需先行稀釋。除了立即用于反應(yīng)的部分可用酶反應(yīng)緩沖液稀釋外，其余都應(yīng)使用廠商提供的稀釋液。稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似，稀釋液中的酶能在長時(shí)間保持活力，也便于隨時(shí)取用。

（6）DNA濃度的影響

盡管有的實(shí)驗(yàn)手冊上推薦使用0.1-1nmol/L的DNA濃度，但考慮到用質(zhì)粒作為載體克隆時(shí)，最后要求得到環(huán)化的有效連接產(chǎn)物，所以DNA濃度不可過高，一般不會(huì)超過20nmol/L。相比較而言，以噬菌體、cosmid質(zhì)粒為載體的克隆過程最后要求線性化的連接產(chǎn)物，所以，DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。此外，在用大質(zhì)粒載體進(jìn)行大片段克隆時(shí)，以及在雙酶切片段的連接反應(yīng)中，DNA濃度還應(yīng)降低，甚至是DNA的總濃度低至幾個(gè)nmol/L。另據(jù)研究，T4 DNA連接酶對(duì)DNA末端的表觀Km值為1.5nmol/L，所以，連接時(shí)DNA濃度不應(yīng)低于1nmol/L。即應(yīng)具有2nmol/L的末端濃度。

2.三種連接酶單位定義

（1）Weiss單位

連接酶單位最早是1968年由Weiss提出的Weiss單位，現(xiàn)也稱PPi單位。他的單位定義為：37℃ 20min內(nèi)將1nmol的32P從焦磷酸根上置換到ATP分子上所需的酶量。現(xiàn)在大多數(shù)廠商仍使用這種單位。

（2）d（A-T）環(huán)化單位

由于Weiss單位定義中測試的是T4 DNA連接酶中除連接功能外的另一種磷交換功能，并且測試溫度高達(dá)30℃，與實(shí)際連接反應(yīng)相比無論在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich與Lehman提出了真正度量連接功能的d(A-T)環(huán)化單位，又稱外切酶抗性檢測。d（A-T）環(huán)化單位的定義為：30℃ 30min 內(nèi)將100nmol/L的d（A-T）（約2kb長）轉(zhuǎn)化成抗外切酶的形式。

（3）黏性末端單位

與Weiss單位相比，d（A-T）環(huán)化單位更接近實(shí)際，但仍有一定的問題，例如，環(huán)化單位測試中用的是純AT片段，與實(shí)際連接中4種堿基隨機(jī)排列不符；再說，如果連接酶將片段連接成多聚體而末環(huán)化時(shí)，仍可能被外切酶組所切；除此之外，與實(shí)際上大多數(shù)連接反應(yīng)使用的溫度16℃相比，30℃仍顯得偏高。為了衡量實(shí)際連接條件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最實(shí)用的黏性末端單位，它的單位定義為：16℃ 30min內(nèi)將5,末端濃度為0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片段的50%連接上。

實(shí)驗(yàn)十一 動(dòng)物組織細(xì)胞總RNA的提取

一、實(shí)驗(yàn)原理

RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物，存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對(duì)中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA 是很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所必需的，如雜交、cDNA合成及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)的成敗，在很大程度上取決于內(nèi)的大部分RNA是以核蛋白復(fù)合體的形式存在，所以在提取質(zhì)變性劑，迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與RNA分離，釋放出機(jī)溶劑處理、離心，使RNA與其他細(xì)胞組分分離，得到純化的總抑制內(nèi)源和外源的RNase活性，保護(hù)RNA分子不被降解。中進(jìn)行?？墒褂肦Nase抑制劑，如DEPC是RNase的強(qiáng)抑制劑，常用來抑制外源性。提取緩沖液中一般含SDS、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質(zhì)變性劑，也能抑制并有助于除去非核酸成分。

本實(shí)驗(yàn)介紹異硫氰酸胍法和TRIzol法提取動(dòng)物組織總

二、儀器和試劑

1.儀器：

超凈工作臺(tái)、高速冷凍離心機(jī)、電泳儀、紫外分光光度計(jì)、吸頭、Ep管、玻璃勻漿器、試管、玻璃器皿洗凈后置180℃烘烤8h；不耐高溫的器皿（如塑料制品）應(yīng)用2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高壓20min，再70～80

2.試劑：

(1)細(xì)胞裂解液：

異硫氰酸胍

4mol/L

檸檬酸鈉（pH7.0）

25mmol/L

十二烷基肌氨酸鈉

0.5%

RNA進(jìn)行操作在分子生物學(xué)NorthernRNA的質(zhì)量。由于細(xì)胞RNA時(shí)要利用高濃度的蛋白R(shí)NA。再通過酚、氯仿等有RNA。在提取的過程中要RNase的環(huán)境RNase活RNase活性。RNA并通過電泳 進(jìn)行鑒定。振蕩器、移液器、0.1% DEPC浸泡 因此提取必須在無凝膠成像系統(tǒng)、℃烘烤干燥方可使用。

β-巰基乙醇

0.1mol/L

稱取檸檬酸鈉0.64g，十二烷基肌氨酸鈉0.415g，吸取β-巰基乙醇0.7ml，用無Rnase的蒸餾水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，異硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)10×凝膠緩沖液：

嗎啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0）

200mmol/L

NaAc

EDTA(pH 8.0)

過濾除菌后避光保存。

（3）5×變性上樣緩沖液：

水飽和的溴酚藍(lán)

500mmol/LEDTA(pH 8.0)

甲醛（37%）

甘油

甲酰胺

10×凝膠緩沖液

加無RNase水至10ml，4℃可保存

（4）TRIzol RNA抽提試劑

（5）2mol醋酸鈉

（6）0.1% DEPC

(7)平衡酚：氯仿：異戊醇（（8）平衡酚、氯仿

（9）無水乙醇、70%乙醇、異丙醇

100mmol/L

10mmol/L

16μl

80μl

720μl

2ml

3084μl

4ml 3個(gè)月。25：24：1）

(10)無RNase水

三、操作步驟

（一）異硫氰酸胍法（PLT）

1.取新鮮動(dòng)物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液1ml,在冰浴中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細(xì)胞懸浮液吸入另一試管中。

2.加入2mol醋酸鈉（pH4.0）120μl，充分混勻。

3.加入1.2ml酚：氯仿：異戊醇，充分混勻搖振10s，冰浴15min。

4.將混合物轉(zhuǎn)移至1.5ml Ep管中，4℃，離心10 000r/min,20min.5.移取上層水相至另一Ep管中，加入等體積的異丙醇，靜置?C20℃，30min沉淀RNA.6.4℃，離心12 000r/min，15min.7.棄上清液，加入70%乙醇400μl,洗滌RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被懸浮，則4℃離心10 000r/min，10min。

8.棄上清液，自然干燥，但應(yīng)避免沉淀完全干燥，否則RNA難以溶解。

9.加入100μl無RNase水重懸RNA，或加1ml無水乙醇和1/10體積3mol醋酸鈉（pH4.0），?C70℃保存。

（二）TRIzol試劑提取RNA

1.取新鮮動(dòng)物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的Trizol液 1ml 于玻璃勻漿器中，在冰浴中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細(xì)胞懸浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室溫下靜置5min。

2.加入200μl氯仿，劇烈振搖15s混勻后，室溫靜置3min。

3.4℃，10 000r/min離心15min，RNA分布于水相中。

4.將上層無色水相轉(zhuǎn)移到另一Ep管中，加入500μl 異丙醇，室溫靜置10min。

5.4℃，10 000r/min離心10min。

6.棄上清液，用1ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀物，4℃，7500r/min離心5min。

7.棄上清液，室溫干燥15min.45

8.向干燥過的沉淀物中加入200μl DEPC處理水（無核水）溶解沉淀物，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（三）RNA檢測

1.在紫外分光光度計(jì)上檢測RNA濃度及純度。

方法同實(shí)驗(yàn)四，用DEPC處理水校正零點(diǎn)；用DEPC處理水稀釋RNA樣品；讀取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。

2.瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳檢測

（1）制備凝膠（1.2%）。稱1.2g瓊脂糖，加72ml DEPC處理水，加熱熔化。冷卻至60℃，在通風(fēng)櫥內(nèi)加入10×凝膠緩沖液10ml，甲醛（37%）18ml，混勻后，倒膠。

（2）制備樣品。在離心管中，將RNA樣品與5×變性上樣緩沖液以4：1溫育5～10min，迅速在冰上冷卻5min，離心數(shù)秒。

（3）上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品卷入上樣孔。以5V/cm的電壓電泳2h.。

（4）待溴酚藍(lán)遷移至凝膠長度的2/3～4/5處結(jié)束電泳。將凝膠置于溴化乙啶溶液μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配制）中染色約30min。

（5）在凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析。

四、注意事項(xiàng)

1.RNA是極易降解的核酸分子。因此提取總RNA必須在無RNase 環(huán)境中，戴口罩、手套、使用無RNase污染的試劑、材料、容器。

2.所有溶液應(yīng)加DEPC至0.05%～0.1%，室溫處理過夜，然后高壓處理或加熱至小時(shí)或60℃過夜，以除去石油殘留的DEPC。

3.所用的化學(xué)試劑應(yīng)為新包裝，稱量時(shí)使用干烤處理的稱量勺，所有操作均應(yīng)在冰浴中進(jìn)行，低溫條件可減低RNA酶活性。

4.根據(jù)RNA樣品的紫外吸收OD值，可計(jì)算出RNAd 濃度。

單鏈RNA [ssRNA]=40×（OD260-OD310）×稀釋倍數(shù)

純RNA OD260 / OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,說明有蛋白質(zhì)等污染，/氯仿在抽提。若比值低于2.0,表明有鹽、胍、糖可用LiCL選擇沉淀RNA以除去雜質(zhì)。

65℃1.5～（0.570℃ 1 應(yīng)用酚 混勻。

5.RNA樣品電泳后，可見28S、18S及5S小分子RNA條帶，則說明完整性好。若有降解可能是操作不當(dāng)或污染了RNase.。28S和18S RNA比值約為2：1,表明RNA無降解。如比值逆轉(zhuǎn)，則表明RNA降解。電泳中如果在28S 后方還有條帶，表明有DNA污染，應(yīng)用DNase處理后再進(jìn)行純化。

主要參考書：

1..金冬雁等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第二版.北京：科學(xué)出版社，1995

2.子穎等譯.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南

3.周俊宜編.分子生物學(xué)基本技能和策略

4.姜泊等編.分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法

5.劉進(jìn)元等編.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

.科學(xué)出版，.科學(xué)出版社.北京：人民軍醫(yī)出版社，.北京：清華大學(xué)出版社，47

1996.2002.

第四篇：儀器保養(yǎng)計(jì)劃

2017儀器設(shè)備日常維護(hù)保養(yǎng)計(jì)劃

實(shí)驗(yàn)室：

根據(jù)本公司2017檢測工作要求，同時(shí)為了滿足儀器設(shè)備日常管理的規(guī)定，符合本公司《程序文件》的要求，特制訂2017儀器設(shè)備日常維護(hù)保養(yǎng)計(jì)劃如下：

一、日常保養(yǎng)儀器名稱和保養(yǎng)周期。

見儀器設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)2017計(jì)劃表

二、日常保養(yǎng)儀器的方法 參照儀器設(shè)備說明書內(nèi)容。

三、儀器設(shè)備保養(yǎng)人

由儀器設(shè)備管理員總體負(fù)責(zé)，具體儀器保養(yǎng)由使用人進(jìn)行保養(yǎng)。

四、總體要求

1、實(shí)驗(yàn)室人員要嚴(yán)格遵守各項(xiàng)規(guī)章制度，充分管理好、用好儀器、設(shè)備，必須明確管理人員的職責(zé)，堅(jiān)持“誰使用、誰負(fù)責(zé)、誰維護(hù)，誰保養(yǎng)”的原則，確保本公司固定資產(chǎn)的正常運(yùn)行。

2、實(shí)驗(yàn)室人員要熟練掌握所負(fù)責(zé)儀器、設(shè)備的性能、操作規(guī)程、維護(hù)保養(yǎng)常識(shí)，確保儀器設(shè)備的正常使用，最大限度地發(fā)揮所用儀器、設(shè)備的效益，提高利用率。

3、認(rèn)真做好儀器、設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)工作，根據(jù)儀器、設(shè)備的不同性質(zhì)和要求，要做好防塵、防潮、防震、防腐蝕等工作，“定人保管，定期保養(yǎng)，定期校驗(yàn)”，使儀器設(shè)備保持應(yīng)有的性能和精密度，經(jīng)常處于完好的可用狀態(tài)。

4、儀器、設(shè)備的使用人員應(yīng)做好詳細(xì)的使用記錄，經(jīng)常檢查、了解儀器、設(shè)備的運(yùn)行情況，發(fā)現(xiàn)失靈、損壞等情況應(yīng)及時(shí)與維修部門取得聯(lián)系，及時(shí)進(jìn)行維修。對(duì)于不能維護(hù)檢修的儀器、設(shè)備，經(jīng)公司批準(zhǔn)后，可送外單位或外請專業(yè)技術(shù)人員來我單位進(jìn)行儀器、設(shè)備的維修工作。

5、儀器、設(shè)備的使用人員一定要認(rèn)真做好經(jīng)常性的維護(hù)保養(yǎng)工作，仔細(xì)監(jiān)測儀器、設(shè)備的工作運(yùn)行狀態(tài)，并按有關(guān)規(guī)定，做好書面記錄，若發(fā)現(xiàn)一般性故障，應(yīng)及時(shí)予以排除。如出現(xiàn)重大故障，必須向公司匯報(bào)，要充分發(fā)揮技術(shù)協(xié)作的功能，盡快采取維護(hù)、維修措施以保證儀器設(shè)備的正常運(yùn)行。編制人：

批準(zhǔn)人： 2017 年 2月6日

第五篇：實(shí)驗(yàn)室儀器的維修、保養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)管理規(guī)程

實(shí)驗(yàn)室儀器的維修、保養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)管理規(guī)程

一、目 的：闡述實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)儀器的常規(guī)檢查、保養(yǎng)與校正的規(guī)則；制定分析儀器設(shè)備維修、保養(yǎng)、管理制度，確保分析儀器分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及儀器、設(shè)備正常運(yùn)行。

二、適用范圍：適用于化驗(yàn)室所有儀器操作人員的操作全過程。

三、責(zé) 任 者：質(zhì)量檢驗(yàn)主任、儀器使用人員、設(shè)備維修人員。

四、正 文： 儀器：化驗(yàn)室的所有儀器必須進(jìn)行定期檢查、保養(yǎng)以及校正。

1.1 登記：所有儀器均需登記在裝訂的注明頁數(shù)的記錄本內(nèi)。每一儀器均有一登記號(hào)，登記內(nèi)容包括：

——儀器名稱 ——儀器類別 ——儀器型號(hào) ——生產(chǎn)廠家 ——供應(yīng)商 ——購買日期 ——使用日期 ——安放地點(diǎn)

——檢查、保養(yǎng)及校正時(shí)間表 1.2 分類：儀器分下列二類：

（1）計(jì)量儀器（2）滿足一定要求的計(jì)量儀器

1.3 第一類儀器必須一年檢查與校正一次或數(shù)次。第二類儀器每年至少檢查一次以確保該儀器滿足所規(guī)定的要求。2 檢查范圍：每類儀器均須檢查下列各項(xiàng)：

——儀器功能的檢查，主要部件的連接、電氣接觸、地線、旋鈕及調(diào)節(jié)器、面板開關(guān)等的檢查?！\(yùn)轉(zhuǎn)部件的潤滑。

——常規(guī)測試或按說明書操作器?！鍧?。

——儀器附件的檢查。

——有無使用說明書和維修說明書

2.1 第一類儀器：必須1 第一類器：必須用規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、電子儀器或其它試驗(yàn)設(shè)備對(duì)儀器進(jìn)行校對(duì)、調(diào)整。

2.2 第二類儀器：檢查儀器以證實(shí)其功能正常。3 儀器檔案：

3.1 儀器檢驗(yàn)方法：儀器試驗(yàn)包括下列各項(xiàng)：

——試驗(yàn)方法的試行日期。——儀器名稱，制造廠家型號(hào)?！獌x器試驗(yàn)方法制訂人的姓名。

——確定的標(biāo)準(zhǔn)品及其制造廠家、純度、代號(hào)和有關(guān)含量測定方法的參考?！蘩磉^的，應(yīng)注明維修報(bào)告。——計(jì)量數(shù)據(jù)的公差范圍。

——計(jì)量數(shù)據(jù)超出允許的公差范圍，所應(yīng)采取的措施?！獌x器工作日記記錄，給儀器作標(biāo)記的步驟。

3.2 每件儀器試驗(yàn)方法必須按專門格式書寫，根據(jù)其類型列出具體內(nèi)容。3.3 儀器的試驗(yàn)方法或測試的方法必須由儀器主管人員分發(fā)至所有相關(guān)人員。登記儀器、設(shè)備名稱、型號(hào)、生產(chǎn)廠商名稱、生產(chǎn)日期、公司內(nèi)部的固定資產(chǎn)設(shè)備登記號(hào)及安裝地點(diǎn)，并存檔。檢查并記錄所用的儀器、設(shè)備是否符合廠方規(guī)定的規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)；檢查并確保該儀器、設(shè)備的使用說明書、維修保養(yǎng)手冊和備件齊全；檢查安裝是否恰當(dāng)，氣、電及管路連接是否符合要求。分析儀器屬于精密儀器，必須置于恒溫、恒濕、防震、防塵及避光等條件或儀器規(guī)定條件下使用，并由專人負(fù)責(zé)。每種分析儀器應(yīng)有正確的儀器操作規(guī)程，操作人員應(yīng)先熟識(shí)儀器性能才能進(jìn)行操作，并嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行各項(xiàng)分析。為了保證分析測試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，每臺(tái)分析儀器必須定期進(jìn)行校驗(yàn)。9 儀器出現(xiàn)故障時(shí)，由儀器的負(fù)責(zé)人提出維修申請，報(bào)請主管領(lǐng)導(dǎo)，經(jīng)批準(zhǔn)后方可進(jìn)行維修。維修人員必須是專業(yè)技術(shù)人員，最好是生產(chǎn)廠家的專業(yè)技術(shù)人員。其他任何人不可對(duì)儀器進(jìn) 行亂動(dòng)。維修完畢，由維修人員填寫維修記錄，存入儀器檔案。各種儀器，每年校正一次。但當(dāng)更換輻射源（光源）、檢測器等主要部件時(shí)，需重新全面校 正合格后方可使用，滅菌設(shè)備用溫度計(jì)、壓力表每半年須檢定一次。操作人員進(jìn)行儀器操作完畢后，應(yīng)如實(shí)填寫使用記錄。進(jìn)行清場工作后才可離去。13 維修、保養(yǎng)：

13.1 各種設(shè)備和儀器都是藥品檢驗(yàn)的重要工具，必須正確使用，認(rèn)真保養(yǎng)，確保各種設(shè)備和儀 器處在正常狀態(tài)，以保證完成檢驗(yàn)任務(wù)。

13.2 各種設(shè)備和儀器須有專人保管，任務(wù)落實(shí)到人，維修工作由專人負(fù)責(zé)，大型精密儀器例外。

13.3 設(shè)備儀器室內(nèi)應(yīng)保持整潔，根據(jù)衛(wèi)生要求安排包干到個(gè)人，每天打掃衛(wèi)生，天平應(yīng)定期更換干燥劑。

13.4 為保證儀器測量的準(zhǔn)確性和靈敏度，室內(nèi)保持溫度在 20-30℃，相對(duì)濕度在 60%以下，進(jìn)出儀器室應(yīng)隨手關(guān)門。

13.5 在使用精密儀器之前先檢查“儀器使用登記本”，了解儀器使用情況是否正常，測量前認(rèn)真檢查。13.6 使用精密儀器必須嚴(yán)格按規(guī)程操作。

13.7 外單位人員未經(jīng)領(lǐng)導(dǎo)同意不得進(jìn)入精密儀器室和使用精密儀器。