第一篇：分子生物學實驗室

分子生物學實驗室（P2設(shè)計）

1.功能：進行分

組織培養(yǎng)前實驗室設(shè)計

標簽：產(chǎn)經(jīng)/公司實驗室 微生物 潔凈室 設(shè)計說明 通風柜 實驗臺 家俱

組織培養(yǎng)前實驗室設(shè)計

在進行植物組織培養(yǎng)工作之前，首先應(yīng)對工作中需要哪些最基本的設(shè)備條件有個全面的了解，以便因地制宜地利用現(xiàn)有房屋，或新建、改建實驗室。實驗室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。以工廠化生產(chǎn)為目的，實驗室規(guī)模太小，則會限制生產(chǎn)，影響效率。

在設(shè)計組織培養(yǎng)實驗室時，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來沒計，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。植物組織培養(yǎng)是在嚴格無菌的條件下進行的。要做到無菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。

實驗室設(shè)計原則：保證無菌操作，達到工作方便，防止污染。

實驗室組成：化學實驗室、洗滌菌室、無菌操作室（接種室）、培養(yǎng)室、細胞學實驗室、其他小型儀器設(shè)備。

1)化學實驗室（準備室）：完成所使用的各種藥品的貯備、稱量、溶解、配制、培養(yǎng)基分裝等。主要設(shè)備：藥品柜、防塵櫥（放置培養(yǎng)容器）、冰箱、天平、蒸餾水器、酸度計及常用的培養(yǎng)基配制用玻璃儀器.2)洗滌、滅菌室：完成各種器具的洗滌、干燥、保存、培養(yǎng)基的滅菌等。

主要設(shè)備：水池、操作臺、高壓滅菌鍋、干燥滅菌器（如烘箱）等。

3)無菌操作室（接種室）：主要用于植物材料的消毒、接種、培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)移、試管苗的繼代、原生質(zhì)體的制備以及一切需要進行無菌操作的技術(shù)程序。

主要設(shè)備：紫外光源、超凈工作臺、消毒器、酒精燈、接種器械（接種鑷子、剪刀、解剖刀、接種針）等。

接種室宜小不宜大，一般7～8平米，要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光滑，易于清潔和消毒。配置拉動門，以減少開關(guān)門時的空氣擾動。接種室要求干爽安靜，清潔明亮。在適當位置吊裝1～2盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。最好安裝一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可使門窗緊閉，減少與外界空氣對流。接種室應(yīng)設(shè)有緩沖問，面積1m2為宜。進入無菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進出時帶入接種室雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外線滅菌燈，用以照射滅菌。

4)培養(yǎng)室：培養(yǎng)室是將接種的材料進行培養(yǎng)生長的場所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其他附屬設(shè)備而定。其設(shè)計以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。

第二篇：分子生物學實驗室工作制度

分子生物學實驗室工作制度 分子生物學實驗室分為試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、文庫構(gòu)建區(qū)、擴增區(qū)、純化區(qū)、測序準備區(qū)、測序區(qū)合計7個獨立工作區(qū)域：各區(qū)實驗用品應(yīng)有明顯標識，嚴禁混用； 實驗室工作人員均取得國家要求上崗資質(zhì)； 為有效防止后擴增區(qū)產(chǎn)物的污染，實驗工作人員應(yīng)遵循單向走動原則。試劑準備區(qū)→標品制備區(qū)→文庫構(gòu)建區(qū)→純化區(qū)→測序準備區(qū)→測序區(qū)，物品傳遞需通過傳遞窗進行，嚴禁人和物品反向流動，進入實驗室必須更換有該室特殊標識的工作服和鞋套，工作服及拖鞋均有專門的衣柜存放，每個區(qū)均有專用的一次性手套、口罩、帽子并有固定存放處。4 實驗室工作人員必須嚴格按照PCR實驗室操作程序進行，實驗開始前必須先做好室內(nèi)及工作臺的清潔消毒，離心管、吸頭等一次性用品均需高壓滅菌處理或用商品化專用耗材。建立門禁，非本室人員未經(jīng)允許不得進入，工作人員在工作時也不能隨意進出，以免造成不應(yīng)有的污染。

6實驗前后應(yīng)用70%乙醇清潔實驗室和實驗臺面，并打開紫外燈消毒30分鐘，試驗中使用過的吸頭、離心管等應(yīng)置于1mol/L HCL溶液中浸泡，消毒后集中處理，廢棄物置于有生物危害標志的待處理區(qū)。7 每天下班前處理好廢棄物品，關(guān)好水、電、門窗。定期校準和維護好PCR儀、離心機、水浴箱、冰箱等儀器設(shè)備。核心儀器設(shè)備應(yīng)做好使用登記工作。

第三篇：分子生物學實驗室常用有毒物質(zhì)

分子生物學實驗室常用有毒物質(zhì)

1.DMSO：

DMSO是二甲基亞砜，DMSO存在嚴重的毒性作用，與蛋白質(zhì)疏水集團發(fā)生作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,具有血管毒性和肝腎毒性。DMSO是毒性比較強的東西，用的時候要避免其揮發(fā)，要準備1%-5%的氨水備用，皮膚沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗滌.最為常見的為惡心、嘔吐、皮疹及在皮膚、和呼出的氣體中發(fā)出大蒜、洋蔥、牡蠣味。吸入：高揮發(fā)濃度可能導(dǎo)致頭痛，暈眩和鎮(zhèn)靜。

皮膚：能夠灼傷皮膚并使皮膚有刺痛感，如同所見的皮疹及水泡一樣。若二甲基亞砜與含水的皮膚接觸會產(chǎn)生熱反應(yīng)。

2.EB：EB（Ethidium bromide，溴化乙錠）

溴化乙錠是一種高度靈敏的熒光染色劑，用于觀察瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA。溴化乙錠溶液的凈化處理：由于溴化乙錠具有一定的毒性，實驗結(jié)束后，應(yīng)對含EB的溶液進行凈化處理再行棄置，以避免污染環(huán)境和危害人體健康。

（1）對于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下處理： ①將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5mg/ml；

②加入一倍體積的0.5mol/L KMnO4，混勻，再加入等量的25mol/L HCl，混勻，置室溫數(shù)小時； ③加入一倍體積的2.5mol/L NaOH，混勻并廢棄。（2）EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下處理：

① 按1mg/ml的量加入活性炭，不時輕搖混勻，室溫放置1小時； ② 用濾紙過濾并將活性碳與濾紙密封后丟棄。

3.DEPC：

DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可滅活各種蛋白質(zhì)，是RNA酶的強抑制劑。DEPC是一種潛在的致癌物質(zhì)，在操作中應(yīng)盡量在通風的條件下進行，并避免接觸皮膚。DEPC毒性并不是很強，但吸入的毒性是最強的，使用時戴口罩。不小心占到手上注意立即沖洗，RNaseAwayTM試劑可以替代DEPC，操作簡單，價格低，且無毒性。只需將RNaseAwayTM直接倒在玻璃器皿和塑料器皿的表面，浸泡后用水沖洗去除，即可以快速去除器皿表面的RNase，并且不會殘留而干擾后繼實驗。

4.丙烯酰胺：

屬中等毒性物質(zhì)。可通過皮膚吸收及呼吸道進入人體，因此，在搬運和使用中必須穿戴好防護用具，如防毒服，防毒口罩及防毒手套等。丙烯酰胺的危害主要是引起神經(jīng)毒性，同時還有生殖、發(fā)育毒性。神經(jīng)毒性作用表現(xiàn)為周圍神經(jīng)退行性變化和腦中涉及學習、記憶和其他認知功能部位的退行性變化，試驗還顯示丙烯酰胺是一種可能致癌物，職業(yè)接觸人群的流行病學觀察表明，長期低劑量接觸丙烯酰胺會出現(xiàn)嗜睡、情緒和記憶改變、幻覺和震顫等癥狀，伴隨末梢神經(jīng)病如手套樣感覺、出汗和肌肉無力。累積毒性，不容易排毒。

具備以下任何一項者，可列為慢性丙烯酰胺中毒觀察對象： a.接觸丙烯酰胺的局部皮膚出現(xiàn)多汗、濕冷、脫皮、紅斑； b.出現(xiàn)肢端麻木、刺痛、下肢乏力、嗜睡等癥狀； c.神經(jīng)-肌電圖顯示有可疑神經(jīng)源性損害。治療原則： 可用B族維生素、能量合劑，并輔以體療、理療及對癥治療。重度中毒者應(yīng)同時加強支持療法。

5.NN-亞甲雙丙烯酰胺，有毒，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，切勿吸入粉末。

6.DTT 二硫蘇糖醇，很強的還原劑，散發(fā)難聞的氣味?？梢蛭?、咽下或皮膚吸收而危害健康。當使用固體或高濃度儲存液時，戴手套和護目鏡，在通風櫥中操作。

7.TEMED強神經(jīng)毒性，防止誤吸，操作時快速，存放時密封。

8.PMSF：苯甲基磺酰氟[（PMSF），C7H7FO2S或C6H5CH2SO2F]是一種高強度毒性的膽堿酯酶抑制劑。它對呼吸道黏膜、眼睛和皮膚有非常大的破壞性。可因吸入、咽下或皮膚吸收而致命。戴合適的手套和安全眼鏡，始終在化學通風櫥里使用。在接觸到的情況下，要立即用大量的水沖洗眼睛或皮膚，已污染的工作服丟棄掉。

9.氯仿（CHCl3）對皮膚、眼睛、黏膜和呼吸道有刺激作用。它是一種致癌劑，可損害肝和腎。它也易揮發(fā)，避免吸入揮發(fā)的氣體。操作時戴合適的手套和安全眼鏡并始終在化學通風櫥里進行。

10.甲醛（HCOH）有很大的毒性并易揮發(fā)，也是一種致癌劑。很容易通過皮膚吸收，對眼睛、黏膜和上呼吸道有刺激和損傷作用。避免吸入其揮發(fā)的汽霧。要戴合適的手套和安全眼鏡。始終在化學通風櫥內(nèi)進行操作。遠離熱、火花及明火。

11.吉姆薩（Giemsa）染料咽下可致命或引起眼睛失明，通過吸入和皮膚吸收是有毒的。其可能的危險是不可逆的效應(yīng)。戴合適的手套和安全護目鏡。在化學通風櫥里操作，不要吸入其粉末。1 2.疊氮鈉（NaN3）毒性非常大。它阻斷細胞色素電子運送系統(tǒng)。含有疊氮鈉的溶液要標記清楚。可因吸入、咽下或皮膚吸收而損害健康。戴合適的手套和安全護目鏡，操作時要格外小心。13.十二烷基硫酸鈉（SDS）有毒，是一種刺激物，并造成對眼睛的嚴重損傷的危險。可因吸入、咽下或皮膚吸收而損害健康。戴合適的手套和安全護目鏡。不要吸入其粉末。

14.三氯乙酸（TCA）有很強的腐蝕性。戴合適的手套和安全防目鏡。

15.Triton X-100引起嚴重的眼睛刺激和灼傷?？梢蛭?、咽下或皮膚吸收而受害。戴合適的手套和護目鏡。

16.過硫酸銨[（NH4）2S2O8]對黏膜和上呼吸道組織、眼睛和皮膚有極大危害性。吸入可致命。操作時戴合適的手套、安全眼鏡和防護服。始終在通風櫥里操作，操作完后徹底洗手。

17.Trizol含有毒物質(zhì)苯酚，如皮膚接觸Trizol。請立即用大量去垢劑和水沖洗，如仍有不適，請聽取醫(yī)生意見。如果只是少量接觸，并處理后癥狀減輕，估計問題就不大了。

紫外光或紫外線可損傷眼視網(wǎng)膜。切勿用裸眼和沒有防護裝置的紫外光源。在實驗室里常用的紫外光源包括手提式紫外燈和紫外透射儀。只能通過吸收有害波長的濾片或安全玻璃片才能觀察。紫外線也是誘變劑和致癌的。為使暴露減少到最低限度，確保紫外光源要采用適當防護裝置。在紫外光下操作時要戴合適的預(yù)防性手套。

第四篇：分子生物學實驗室常用儀器及使用方法

實驗一

分子生物學實驗室常用儀器及使用

事實證明，在科學飛速發(fā)展的今天，無論從事哪個領(lǐng)域的研究，要想突破，除了有良好的理論基礎(chǔ)外，更重要的是依賴于先進的技術(shù)和優(yōu)良的儀器設(shè)備以及良好的研究環(huán)境。一個標準的分子生物學實驗室除了具有一般生物學實驗室的常規(guī)儀器設(shè)備外，還具有一些特殊用途的儀器，這些儀器一般較精密，價格昂貴。下面介紹這些儀器的使用方法和注意事項。

一、冷凍離心機

低溫分離技術(shù)是分子生物學研究中必不可少的手段。基因片段的分離、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實驗中都離不開低溫離心技術(shù)，心機成為分子生物學研究中必備的重要儀器。室的高速冷凍離心機為GL-20G-Ⅱ型（上海安亭）×10ml和12×1.5ml。極限轉(zhuǎn)速20000rpm。

1.安裝與調(diào)試

離心機應(yīng)放置在水平堅固的地面上，應(yīng)至少距離中，周圍空氣應(yīng)呈中性，且無導(dǎo)電性灰塵、易燃氣體和腐蝕性氣體，環(huán)境溫度應(yīng)在之間，相對濕度小于80%。試轉(zhuǎn)前應(yīng)先打開蓋門，用手盤動轉(zhuǎn)軸，輕巧靈活，無異?，F(xiàn)象方可上所用的轉(zhuǎn)頭。轉(zhuǎn)子準確到位后打開電源開關(guān)，然后用手按住門開關(guān)，動后立即停止，并觀察轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)向，若逆時針旋轉(zhuǎn)即為正確，機器可投入使用。2.操作程序

（1）插上電源，待機指示燈亮；打開電源開關(guān)，調(diào)速與定時系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示的閃爍數(shù)字為機器工作轉(zhuǎn)速的出廠設(shè)定，溫控系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示此時離心腔的溫度。

（2）設(shè)定機器的工作參數(shù)，如工作溫度，運轉(zhuǎn)時間，工作轉(zhuǎn)速等。

（3）將預(yù)先平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上，關(guān)閉機蓋。

（4）按控制面板的運轉(zhuǎn)鍵，離心機開始運轉(zhuǎn)。預(yù)先設(shè)定的值。

（5）在預(yù)先設(shè)定的運轉(zhuǎn)時間內(nèi)（不包括減速時間）定的減速時間內(nèi)降至零。

（6）按控制面板上的停止鍵，數(shù)碼管顯示機器已準備好下一次工作。

3.注意事項

（1）離心機應(yīng)始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線，機器不使用，要拔掉電源插頭。

（2）開機前應(yīng)檢查轉(zhuǎn)頭安裝是否牢固，機腔中有無異物掉入。

（3）樣品應(yīng)預(yù)先平衡，使用離心筒離心時離心筒與樣品應(yīng)同時平衡。

（4）揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機腔或造成事故。

在國內(nèi)，有多個廠家生產(chǎn)冷凍離心機，落地式。配有角式轉(zhuǎn)頭：10cm在預(yù)先設(shè)定的加速時間內(nèi)，其運速升，離心機開始減速，其轉(zhuǎn)速在預(yù)先設(shè)dedT，數(shù)秒鐘后即顯示閃爍的轉(zhuǎn)速值，這時1

本實驗6×50ml、120～30℃

至 因此低溫冷凍離 以上且具有良好的通風環(huán)境再按運轉(zhuǎn)鍵，轉(zhuǎn)

（5）除工作溫度、運轉(zhuǎn)速度和運轉(zhuǎn)時間外，不要隨意更改機器的工作參數(shù)，以免影響機器性能。轉(zhuǎn)速設(shè)定不得超過最高轉(zhuǎn)速，以確保機器安全運轉(zhuǎn)。

（6）使用中如出現(xiàn)0.00或其它數(shù)字，機器不運轉(zhuǎn)，應(yīng)關(guān)機斷電，10秒鐘后重新開機，待所設(shè)轉(zhuǎn)速顯示后，再按運轉(zhuǎn)鍵，機器將照常運轉(zhuǎn)。

（7）不得在機器運轉(zhuǎn)過程中或轉(zhuǎn)子未停穩(wěn)的情況下打開蓋門，以免發(fā)生事故。

（8）每次操作完畢應(yīng)做好使用情況記錄，并定期對機器各項性能進行檢修。

二、電泳儀

電泳技術(shù)是分子生物學研究不可缺少的重要手段。帶電泳大類，自由界面電泳不需支持物，泳目前已很少使用。區(qū)帶電泳需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，纖維薄膜、非凝膠性支持物、是瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用電泳法可以對不同物質(zhì)進行定性或定量分析，組份分析或單個組份提取制備。下面以為例介紹其使用方法。

1.使用方法

（1）按電源開關(guān)，顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用同時系統(tǒng)初始化，蜂鳴

U:

0V

U＝

I:

0mA

I ＝

P:

0W

P＝

T:

00:00

T＝

其中:左側(cè)大寫Mode(模式)：STD(標準

（2）設(shè)置工作程序。用鍵盤輸入新的工作程序。例如，要求工作電壓I限制在200mA以內(nèi)，功率動關(guān)掉輸出。則操作步驟如下：

①按“模式”鍵，將工作模式由標準（凝膠性支持物及硅膠―4聲，設(shè)置常設(shè)置。屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設(shè)置狀態(tài)，見圖一：

100V

50mA

｜

50W

｜ 01:00

｜U: I: P: T:)；TIME(定時W限制在 電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)如等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等，這類電G薄層等，分子生物學實驗中最常用的DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）DYY-12型電腦三恒多用電泳儀?”等字樣后，Mode：

STD

中間部分顯示程序的常設(shè)值)；VH（伏時）；STEP（分步）100W以內(nèi)，時間T為3STD）轉(zhuǎn)為定時（TIME）2

醋酸或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M行（預(yù)置值）。U＝1000V，電流20分，并且到時間自常用的支持物有濾紙、｜

為電泳時實際值； 小時 模式。每按一下模式鍵，其工作方式按下列順序改變：

STD?TIME?VH?STEP?STD。

②先設(shè)置電壓U，按“選擇”鍵，先將其反顯，然后輸入數(shù)字鍵即可設(shè)置該參數(shù)的數(shù)值。按數(shù)字1000,則電壓即設(shè)置完成。

③設(shè)置電流I，按“選擇”鍵，先使I反顯，然后輸入數(shù)字200。

④設(shè)置功率P，按“選擇”鍵，先使P反顯，然后輸入數(shù)字100。

⑤設(shè)置時間以按“清除”鍵，再重新輸入。

⑥確認各參數(shù)無誤后，按“啟動”鍵，啟動電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯示Start!并蜂鳴至設(shè)置值。同時在狀態(tài)欄中顯示“壓輸出。在狀態(tài)欄最下方，顯示實際的工作時間（精確到秒）

⑦每次啟動輸出時，儀器自動將此時的設(shè)置數(shù)值存入“要調(diào)用時可以按“讀取”鍵，再按“出執(zhí)行。

⑧電泳結(jié)束，儀器顯示：

2.注意事項

(1)U、I、P三個參數(shù)的有效輸入范圍是：

(2)一般情況下，當?shù)牡胤?，可以用萬用表的歐姆檔逐段測量。

(3)如果輸出端接多個電泳槽，則儀器顯示的電流數(shù)值為各槽電流之和，此時應(yīng)選擇穩(wěn)壓輸出，以減小各槽的相互影響。

(4)注意保持儀器的清潔，不要遮擋儀器后方進風通道。嚴禁將電泳槽放在儀器頂部，避免緩沖液灑進儀器內(nèi)部。

(5)本儀器輸出電壓較高，使用中應(yīng)不避免接觸輸出回路及電泳槽內(nèi)部，以免發(fā)生危險。

(6）長期不用儀器，應(yīng)放置在干燥通風的清潔環(huán)境中保存。

三、分析天平

分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方 T，按“選擇”鍵，先使 4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，“No Load！時，首先應(yīng)關(guān)機檢查電極導(dǎo)線與電泳槽之間是否有接觸不良

T反顯，然后輸入數(shù)字Run”，并有兩個不斷閃爍的高壓符號，表示端口已有電0”鍵，按“確定”鍵，即可將上次設(shè)置的工作程序取END”，并連續(xù)蜂鳴提醒。此時按任一鍵可止鳴。U：5 3

注意安全。3000V；I：320。如果輸入錯誤，可之后逐漸將輸出電壓加 MO”號存儲單元。以后需4～400mA P：4～400W.?！?； 法，是獲得可靠分析結(jié)果的保證。分析天平的種類很多，有普通分析天平、半自動/全自動電光分析天平及電子分析天平等。目前實驗室常規(guī)備用的是自動化程度較高的電子分析天平。下面介紹電子分析天平PL203/01型和AL104/01型(METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。PL203/01型精密電子天平：最大稱量210g；實際分度值0.001g；AL104/01型高分辨率電子分析天平：最大稱量110g；實際分度值0.0001g

1.使用方法

（1）檢查并調(diào)整天平至水平位置。檢查電源電壓是否匹配（使用配置的穩(wěn)壓器），按天平儀器要求通電預(yù)熱至所需時間

（2）打開天平開關(guān)“短時點亮，天平回零時，可進行正式稱量。

（3）稱量時將潔凈稱量瓶或稱量紙置于稱盤上，關(guān)上側(cè)門，天平將顯示該重量，點擊“?O/T?”鍵自動校對零，然后逐漸加入待稱物質(zhì)，直至所需重量為止。

（4）稱量結(jié)束應(yīng)及時除去稱量瓶（紙）

2.注意事項

（1）天平應(yīng)放置在牢固平穩(wěn)水泥臺或木臺上，室內(nèi)要求清潔、干燥，同時應(yīng)避免光線直接照射到天平上。

（2）稱量時應(yīng)從側(cè)門取放物質(zhì)，讀數(shù)時應(yīng)關(guān)閉箱門以免空氣流動引起天平擺動。

（3）揮發(fā)性、腐蝕性、強酸強堿類物質(zhì)應(yīng)盛于帶蓋稱量瓶內(nèi)稱量，防止腐蝕天平。

（4）電子分析天平若長時間不使用，則應(yīng)定時通電預(yù)熱，每周一次，每次預(yù)熱確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。

四、分光光度計

不同物質(zhì)對不同波長入射的吸收程度各不相同，從而形成各具特征的吸收光譜原理，應(yīng)用比色法可以對某些有色物質(zhì)進行定性或定量分析。而且精度低，已遠遠不能滿足高精度微量分析的要求。不斷地更新?lián)Q代，人們引進了分光光度法的概念，單色器、吸收池、接受器、顯示屏幕所組成，它不僅適應(yīng)于可見光區(qū)，同時還擴展至紫外光區(qū)及紅外光區(qū)。光密度（而測定某一溶液對該單色光的吸收值。液定量和純度的初步判斷。下面介紹紫外可見光分光光度計的使用方法。該儀器除了能檢測核酸樣品濃度外，的測定，能檢測低至幾微升樣品（30min。on”，天平則自動進行靈敏度及零點調(diào)節(jié)。待顯示屏上所有字段，關(guān)上側(cè)門，切斷電源，并做好使用情況登記。

隨著科學技術(shù)不斷發(fā)展，分光光度計隨之應(yīng)用。OD）是許多溶液中的溶質(zhì)定量的指標之一，通過所產(chǎn)生的單色光分子生物學實驗中常使用紫外分光光度計進行核酸溶還可進行蛋白質(zhì)濃度以及細胞培養(yǎng)液濃度70μl和5～7μl），樣品無需稀釋，測量后還可全部回收。4

分光光度計由光源、GeneQantTM Pro

2h，以。根據(jù)這一分析儀器也Amersham）

但由于比色法僅限于可見光區(qū)，（使用方法

(1）打開電源開關(guān)（ON），等待數(shù)秒鐘，顯示屏上顯示一系列數(shù)據(jù)，如本機型號、當前日期等，這些數(shù)據(jù)可以重新設(shè)置，當出現(xiàn)“instrument Ready”即可進入下一程序。

(2）在儀器面板上有許多功能鍵，其中包括檢測base sep、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲檢測DNA，按DNA鍵，即進入DNA檢測程序。在顯示屏上：

以上為儀器預(yù)設(shè)置的參考數(shù)據(jù)，若按“新設(shè)定。

(3）取石英樣品杯后放入儀器上的樣品槽中，放入時注意樣品杯的光學面朝前方。

(4)按“set ref”鍵，進行空白測試。顯示屏上出現(xiàn)一系列數(shù)據(jù)均““Insert sample 中進行測定。

(5）一個樣品測定完畢，按“

(6）取出樣品杯，吸出樣品，然后用高純水洗幾次，自然晾干。由于樣品杯十分昂貴，使用時要小心操作。以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過

五、數(shù)字式酸度計

酸度計是實驗室配置溶液必備的儀器。本實驗室的酸度計為臺式微電腦酸堿度計和溫度計（Hanna

1.使用方法

（1）將pH

70μl或5。將樣品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同樣吸入待測樣品，放入樣品槽 ,測量pH范圍為

Pathlengh

10mm

Units

μg/μl

Use 320nm

NO

Dilution Faotor 1

Insert reference，enter”鍵，和“select”鍵可以將以上的參數(shù)進行重7μl，容量大小根據(jù)需要。先用吸管吸高純水入樣品杯中，然 0.000”并提示插入樣品stop”鍵，返回“Instrument Ready”。可用溫水或稀鹽酸，乙醇15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。0.00～14.00pH；溫度為0.0～100.0℃；

～”不能用手指拿樣品杯的光學面，用后要及時洗滌，）電極和溫度探頭與主機連接，主機與電源連接。

（2）取出電極保護套，如果有結(jié)晶鹽出現(xiàn)，這是電極常見現(xiàn)象，浸入水后就會消逝。如果薄膜玻璃或透析膜發(fā)干，可在HI170300電極保存液中浸泡1小時。

（3）pH校準。將pH電極和溫度探棒浸泡在所選的標準緩沖液內(nèi)4cm（建議用pH6.86、7.01），緩沖液值可通過“D℃”或“?℃”鍵來調(diào)節(jié)。按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號及“7.01”數(shù)據(jù)。當讀數(shù)不穩(wěn)定時，屏幕會顯示“NOTREADY”；當讀數(shù)穩(wěn)定時，屏幕會顯示“READY”和“CFM”，按“CFM”鍵確認校準值。確認第一校準點后，將pH電極與溫度探棒浸泡在標準緩沖液內(nèi)4cm（建議用pH4.01、9.18、10.01）；再按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號及“4.01”數(shù)據(jù)。按“CFM”鍵確認校正值。

（4）pH測量。校準完畢后，儀器自動進入溶液約4cm，停幾分鐘讓電極讀數(shù)穩(wěn)定。

2.注意事項

（1）由于pH211酸度計內(nèi)裝有可充電電池，在剛購買或長時間放置后，再使用時，通電校正測量完畢后，可將電源繼續(xù)還插入電源插座，只需關(guān)閉開關(guān)，這樣可以保證電池充電，是校正值得以儲存，下次測量時無須校正即可進入精確測量。

（2）不可用蒸餾水、去離子水和純水浸泡電極。如果讀數(shù)偏差太大（±沒有校正或電極變干。為避免電極受損，在關(guān)機前要將狀態(tài)時，在電極浸入電極保存液前，電極要與機器分開。

（3）如儀器已測過幾種不同的樣品溶液，請用自來水清洗，樣品清洗電極。

（4）溫度會影響pH的讀數(shù)，為測量準確的補償，用HI7669/2W溫度探棒浸入樣品中，緊靠電極并停幾分鐘，如果被測溶液的溫度已知或測量是在相同溫度下進行，只需動手補償，示溫度讀數(shù)伴有℃信號閃爍。溫度可通過“

六、PCR儀

PCR儀，也稱DNA熱循環(huán)儀、基因擴增儀，它是使一對寡核苷酸引物結(jié)合到正負上的靶序列兩側(cè)，從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬倍的靶序列三種不同溫度進行DNA變性、引物復(fù)性、PCR儀主要應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等許多領(lǐng)域，如基因分析、序列分析、進化分析、臨床診斷、法醫(yī)學等等。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，因此了解PCR儀的性能，熟練掌握儀器的正確使用方法及使用過程中的注意事項，將是十分必要的。

現(xiàn)介紹PCR 擴增儀（Tl Thermocycler）的使用方法和注意事項。

pH測量狀態(tài)，將電極與溫度探棒浸泡在待測

pH電極從溶液中拿出。當處于關(guān)機 或在插入樣品溶液前，用待測pH值，溫度要在適合的范圍內(nèi)進行自動溫度那么此時溫度探棒是不用連接，?℃”或“D℃”來調(diào)節(jié)。DNA片段，它的每一循環(huán)包括在DNA聚合酶催化的延伸反應(yīng)的三個過程。PCR擴增技術(shù)也得到普及推廣應(yīng)用，6

1pH），則是由于屏幕上會顯DNA鏈 1.使用方法

(1）接通電源開關(guān)，儀器進入準備狀態(tài)；在顯示屏上記錄了當前儀器的溫度和蓋子（Lid）的溫度。若儀器正在運行時，須按“

B ”鍵（start/stop），才能退出運行并返回準備狀態(tài)。

(2）編寫程序段。在準備狀態(tài)下按“

C ”鍵(programs)進入編程狀態(tài)，選定一程序號，然后按“enter”鍵，進入下一程序；按 “A”(list)鍵后，選一文件號（empty program）；再按“enter”鍵，進入下一程序；按“ABC”鍵，進入下一程序，用上下左右鍵號選擇一個字母（A、B、C、D、?），然后按“enter”鍵，進入下一程序；按“name ok”鍵，完成文件命名。

(3）設(shè)定蓋子的溫度。性溫度是95℃，那么蓋子的溫度就要設(shè)定為程序。

(4）設(shè)定變性溫度、變性時間、延伸溫度、延伸時間、退火溫度、退火時間及循環(huán)總數(shù)等參數(shù)。從第一步依次按“間，全部參數(shù)設(shè)置完后，按“

(5）運行程序。檢查設(shè)定是否正確，屏上可觀察到系統(tǒng)運行的情況，按“

七、凝膠成像系統(tǒng)

本系統(tǒng)屬全自動電腦控制影像分析系統(tǒng)，主要拍攝核酸的acrylamide電泳膠片。在與確定量，是分子生物學及生化蛋白試驗的重要檢測工具。像頭，變焦鏡，電腦以及專業(yè)凝膠圖象采集及分析斑點測量、PCR密度的定量分析等。此外，還提供圖像采集、標注、打印、數(shù)據(jù)和圖像發(fā)送到Word、Excel、圖像處理等功能。

1.使用方法

(1)打開電腦，啟動凝膠分析軟件，進入用戶界面。

（2）打開采集凝膠圖像的暗箱裝置電源開關(guān)，放入凝膠，打開紫外光源或白光光源，將采集裝置與電腦上采集卡相連，然后選擇“文件”菜單中的“圖像采集”或工具欄的“圖像采集”按鈕，出現(xiàn)圖像窗口：晰，可以調(diào)節(jié)暗箱上的變焦鏡，使之清晰?？芍苯訉D像保存起來，也可通過“圖像處理”對圖像進行旋轉(zhuǎn)、裁剪、濾波、調(diào)節(jié)對比度??方面的處理。

(3)對讀入的電泳凝膠圖像，可以啟動電泳凝膠分析系統(tǒng)。在“功能選擇”菜單中選擇“電泳凝膠”或在工具欄上的“電泳凝膠”工具，將出現(xiàn)泳道分析工具欄，并在“圖像顯示”子窗口中出現(xiàn)一個紅色的矩形框。還可進入“條帶分析”系統(tǒng)，對條帶 lid temp：

℃”enter”鍵進入，用四個移位鍵移動設(shè)定位置。先設(shè)定溫度，后設(shè)定時pgm ok”鍵，所設(shè)定的程序自動被保存。

按“Stop”可停止運行。markers比較后，可精確計算樣本的分子量，對核酸電泳也可準 “開始采集”105℃。待蓋子預(yù)熱后按“start”鍵，選擇設(shè)定好的程序，開始運行。顯示 agarose本系統(tǒng)包括暗箱，.軟件（3.3版）。該軟件提供對電泳凝膠、、“停止采集”、“采集圖像”等。如果圖像不清 7

10℃，例如變enter”鍵，進入下一 紫外透射儀，攝 進行編號，對“，蓋子的溫度一般比變性溫度要高 電泳膠片，及蛋白質(zhì)的二條以上的條帶進行比較。

（4）采集圖像結(jié)束后，關(guān)閉暗箱電源開關(guān)，從暗箱中取出凝膠，并將玻璃板清洗干凈，晾干。

八、空氣恒溫搖床

搖床（振蕩器）為實驗室的常規(guī)設(shè)備。SHK-99-Ⅱ型臺式空氣恒溫搖床，采用微電腦控制系統(tǒng)，溫度范圍：室溫＋5℃～60℃，精度±0.5℃；時間范圍：1分鐘～99小時59分鐘；轉(zhuǎn)速范圍：60RPM～250RPM。

1.使用方法

(1）LED屏幕上各段數(shù)據(jù)：

000

00.0

屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段則為“轉(zhuǎn)速，“Time”表示時間，不設(shè)定時可自動累計時間一直運行。的值隨時可以修改，隨時按新值運行。

(2）工作程序設(shè)置。按“F1”鍵，進入設(shè)置狀態(tài)?？稍谒俣?，溫度，時間，運行等四部分之間切換。在每一部分按“F2”鍵輸入數(shù)據(jù)，輸入完十位數(shù)據(jù)，再輸入個位數(shù)據(jù)，按“鍵，再按“F2”鍵，到小數(shù)位，再按“

(3）再按“F1”鍵，轉(zhuǎn)回運行狀態(tài)，按“

(4）按“End”鍵，結(jié)束系統(tǒng)運行。

2.注意事項

（1）打開電源，系統(tǒng)開始自檢，等待完畢，可以進行第2步參數(shù)設(shè)置。若屏幕出現(xiàn)：錯誤；b.“MOTOR ERROR”，表示電機部分有錯誤。

（2）運行過程可以打開箱蓋，這樣電機不運行，時間也停止，蓋上蓋接著運行。

（3）工作完畢，關(guān)閉電源。關(guān)機后，要等一段時間再開機。

九、水的凈化裝置

分子生物學實驗對水的純度要求越來越高，RPM

Temp

Time

00:00 2”，“Temp”表示溫度，“RPM”表示每分鐘“Temp”、“RPM”、F2”鍵，又到十位，以此循環(huán)。Start”鍵，電機開始運行，時間開始計時。LCD屏幕出現(xiàn)“WELCOME”字樣，系統(tǒng)自檢a.“TEMP ERROR”，表示溫度檢測線路有

一般蒸餾水常常難以滿足實驗要求，大多要求要

Time”F2”

“ 進行第二次蒸餾（雙蒸水），它可以去除水中的大部分有機雜質(zhì)，但制作時間較長，而且無機雜質(zhì)還是很多。許多實驗還需要去離子水，這就需要陰陽離子交換樹脂進行處理。目前，分子生物學實驗室都使用高質(zhì)量的超純水。如美國微孔濾膜公司的Milli-Q超純水制造系統(tǒng)所制造的超純水適用于許多學科領(lǐng)域，如分子克隆、各種色譜分析、氨基酸分析、DNA測序、酶反應(yīng)、組織和細胞培養(yǎng)等實驗。下面介紹RO-MB壁掛式反滲透高純水機性能及使用方法。RO-MB反滲透高純水機（杭州永潔達）產(chǎn)水量（25℃）10L/H；產(chǎn)水水質(zhì)：RO純水：<10μs/cm，高純水：>15MΩ.cm；可用自來水制成普通實驗用水和高純水，同時滿足不同水質(zhì)要求。在線電導(dǎo)率儀對產(chǎn)水水質(zhì)連續(xù)檢測，可保證產(chǎn)水質(zhì)量。

1.使用方法

(1)準備：先檢測與純水機相連的原水管路、廢水管路連接是否正常，打開原水閥門。供電電源是否正常，檢查按鈕是否在關(guān)閉狀態(tài)（按鈕彈出狀態(tài)）220V電源插座上。

(2）開機：依次按下電源開關(guān)，泵開關(guān)，純水機啟動產(chǎn)水，同時廢水排出，指示燈亮起，并處于自動運行狀態(tài)。

(3）取純水：若打開閥門打開時，檢測儀表顯示高純水電導(dǎo)率或電阻值。一杯水后再取新鮮水。

(4）關(guān)機：不用時可關(guān)閉個按鈕停機，自來水進水閥門不必關(guān)閉，這時機子內(nèi)部的進水電磁閥已自動切斷水路。只要管路閥門不漏，也可使機子保持自動待機狀態(tài)。

2.注意事項

（1）純水機的正常使用環(huán)境溫度為度不低于5℃。

（2）預(yù)處理濾芯一般三至六個月更換一次，實際使用壽命與自來水水質(zhì)、總過濾量等有關(guān)。

（3）混床濾芯產(chǎn)高純水約水中含鹽量、總用水量等有關(guān)。天開機30分鐘沖洗一次，冬季每隔

（4）使用過程若發(fā)現(xiàn)停機后泵仍頻繁地每隔數(shù)分鐘有規(guī)則地啟動數(shù)秒鐘又停機，此為管路漏水引起，需及時打開機箱加以解決。象，有利于沖洗和保護反滲透膜元件，十、消毒設(shè)備

細菌和細胞培養(yǎng)以及核酸等有關(guān)實驗所用的試劑、RO純水或高純水出口閥門，則可獲得相應(yīng)水質(zhì)的純水。當高純水出口 115～3噸，約二至四個月更換一次，2～3避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積。將電源插頭插入帶有接地線的為了獲得高質(zhì)量的高純水，可以先放掉 35℃，產(chǎn)水量會隨溫度降低而下降，冬季保養(yǎng)溫實際使用壽命與自來水水質(zhì)、2天。必須注意定期沖洗維護。夏季宜每 乃屬正?，F(xiàn)尤其高溫季節(jié)。器皿及實驗用具，應(yīng)嚴格滅菌，有的實驗

～設(shè)備停運時間超過天開機沖洗一次。若每隔半小時以上啟動數(shù)秒鐘又停機，還要求沒有核酸酶的污染，故應(yīng)將實驗器械，試劑等進行高壓消毒。對于經(jīng)過導(dǎo)入DNA重組分子的菌株，操作后必須進行嚴格的高壓消毒滅活處理。

大批實驗物品、試劑、培養(yǎng)基等可以使用大型消毒器進行消毒。一些不能經(jīng)受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。所有的細胞培養(yǎng)、細菌培養(yǎng)的操作，都應(yīng)在紫外線消毒后的超凈工作臺中進行。

下面介紹立式自動壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40BI）的使用方法。

1.使用方法

（1）開蓋：轉(zhuǎn)動手輪，使鍋蓋離開密封圈。

（2）通電：連接自動進水裝置。接通電源，將控制面板上電源開關(guān)按至低（LOW）紅燈亮，蒸發(fā)鍋內(nèi)屬斷水狀態(tài)；缺水（（3）加水：打開水源，水位達到低水位，控制面板上低水位紅燈和缺水黃燈相繼滅，加熱（1-綠燈）亮，繼續(xù)加水至高水位（（4）堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內(nèi)，這樣有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。

（5）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊。

（6）設(shè)定溫度：通電后數(shù)顯窗燈亮，上層為紅色，顯示溫度，下層為綠色，設(shè)定溫度和時間。先按控制面板上確認鍵，綠色數(shù)顯閃爍，進入溫度設(shè)定狀態(tài)。按一次移位鍵指相應(yīng)位置閃爍，根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進行（單項循環(huán)）移位。按△增加鍵或所需溫度設(shè)定。設(shè)定完畢，按二次確認鍵，進行溫度確認。

（7）設(shè)定時間：按一次確認鍵，將溫度設(shè)定切換成時間設(shè)定；再按一次移位鍵，所指相應(yīng)位置閃爍，完畢，按二次確認鍵，定時器開始倒計時。

（8）滅菌：在加熱初，將下排汽閥打開至垂直位置；下排汽閥待蒸汽冒出時，壓力表顯示指示為的15%為宜。安全閥設(shè)定數(shù)，超出壓力部分，安全閥將自動泄壓，并開始計數(shù)滅菌所需時間。滅菌完成，電控裝置將自動關(guān)閉加熱系統(tǒng)，伴有蜂鳴提醒；并將保溫時間切換成控制面板上電源開關(guān)按至

（9）干燥：物品滅菌后需要迅速干燥，須打開放汽閥和下排汽閥，將滅菌器內(nèi)的蒸汽迅速排出，使物品上殘留水蒸汽快速揮發(fā)。根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進行移位；進行時間設(shè)定確認?！鏁r，將下排汽閥推向水平關(guān)閉位置；留有微量蒸汽逸出，以控制總汽流量使用最高滅菌溫度為OFF HIGH）綠燈亮，自動停止加水。按增加鍵或減少鍵，時間采用倒計時，124℃～126℃，ON處，若水位LACK）黃燈亮，電源已正常輸入。

200mm×100mm×100mm為宜，各

所??減少鍵，進行 進行所需時間設(shè)定。設(shè)定當滅菌鍋內(nèi)溫度達到設(shè)定溫度，0.145Mpa～0.165Mpa范圍內(nèi)屬于END顯示；此時，將

100壓力在處；關(guān)閉電源，停止加熱待其冷卻。

（10）將蓋開啟，取出已滅菌物品。關(guān)閉水源，打開下排水閥，排盡滅菌室的水與水垢，以備下次使用。

2.注意事項

（1）堆放滅菌物品時，嚴禁堵塞安全閥的出汽孔，必須留出空位保證其空氣暢通，否則安全閥因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。

（2）滅菌液體時，應(yīng)將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中，以不超過選用棉花紗塞，切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞，放蒸汽，必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。

（3）對不同類型，不同滅菌物要求的物品，切勿放在一起滅菌，以免顧此失彼，造成損失。

實驗二

質(zhì)粒DNA

一、實驗原理

細菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的在于細胞質(zhì)中、獨立于細胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，于染色體外的游離狀態(tài)，制而復(fù)制，并通過細胞分裂傳遞到后代。

DNA，大小范圍從

在滅菌液體結(jié)束時不準立即釋 至200kb3/4體積為好，瓶口隨著染色體的復(fù)特別注意，的提?。瓑A裂解法1kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個步驟：①培養(yǎng)細菌，使質(zhì)粒DNA大量擴增；②收集和裂解細菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點以及質(zhì)粒DNA的用途進行選擇。本實驗介紹堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離質(zhì)粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。當加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時，因為共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。

二、儀器及試劑

1.儀器及耗材：37℃恒溫搖床、冷凍離心機、臺式離心機、微量移液器、50 ml離心管、1.5 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。

2.試劑及配制：

LB培養(yǎng)液的配制：

酵母浸提物

5.0 g；

胰蛋白胨

10.0 g；

NaCl

10.0 g；

依次稱量后加入800 ml去離子水后攪拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（約0.2 ml）調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值至7.0。再加去離子水將溶液定容至總體積為1000 ml，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。

溶液 Ⅰ（GET緩沖液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖

配制：1000 ml

mol/L Tris-HCl（pH8.0）

ml

0.5 mol/L EDTA（pH8.0）ml

20% Glucose（1.11mol/L）

ml

dH2O

910ml

將以上溶液混合裝瓶，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。

溶液II（變性液）：200 mmol/L NaOH，1% SDS

配制： 500 ml

10% SDS

ml

2N NaOH

ml

取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。室溫保存，此溶液保存時間最好不超過一個月，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要劇烈攪拌。

溶液 III(醋酸鉀液)：3 mol/L 醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 5.6。5 mol/L 冰醋酸

配制：500 ml

醋酸鉀

g

冰醋酸

57.5 ml

加入300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至高溫高壓滅菌后，4℃保存。

10×TE緩沖液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA

配制：1000ml mol/LTris-HCl 緩沖液(pH 8.0)

100ml

500 mmol/L EDTA(pH8.0)ml

加入約800 ml的去離子水，均勻混合。溶液定容至1 L。高溫高壓滅菌后，苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)：將量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入 13

500 ml。4℃保存。24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

其它試劑：TE（pH8.0）、異丙醇、氯仿/異戊醇（24:1）、無水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素貯存液（50 mg/ml）

三、操作步驟

1.菌體的培養(yǎng)和收獲

(1）將5～10 ml含有氨卞青霉素（后接入一單菌落，并保持通氣良好，于接一次，于37℃ 220 rpm振搖培養(yǎng)(2）吸取培養(yǎng)的菌液1.5 ml，轉(zhuǎn)入棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。

2.質(zhì)粒DNA提取（堿裂解法）

（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重懸細菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。

（2）加200 ul溶液 Ⅱ，蓋緊管口，液變透明，粘稠）。

（3）加150 ul溶液 Ⅲ，輕微振蕩混和

（4）12000 rpm離心6 min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）

（5）加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻離心管。

（6）加1倍異丙醇，振蕩混勻，靜置倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。

（7）加200 ul 70％乙醇洗滌沉淀物，臺式離心機在室溫下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）

（8）沉淀加20μl TE, 反復(fù)吹打使質(zhì)粒

四、常見問題及可能原因

1.提取的質(zhì)粒DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵步驟反應(yīng)時間過短；離心時間或速度不夠。

2.提取的質(zhì)粒DNA呈涂布狀：操作過程中用力過猛，動作過大；操作系統(tǒng)內(nèi)有污染。

AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml的三角瓶中，然37℃ 220 rpm振搖過夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉(zhuǎn)3～4 h。的離心管中，用臺式離心機以12000 rpm

輕緩上下顛倒離心管以混合內(nèi)容物。室溫靜置10 sec，置冰上10 min(溶液出現(xiàn)白色沉淀。1 min，12000 r/min離心6min，取上清液至另一10 min，12000 rpm離心6 min。棄上清液，將離心管 12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀。DNA充分溶解，－20℃保存。14 min。5 min（溶)。

1.5 ml離心 3.與染色體DNA分離不全：變性過程不完全；試劑配制有問題（成分，濃度或pH）。

實驗三

瓊脂糖凝膠電泳

一、實驗原理

瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化的多孔支持介質(zhì)（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場上。由于架兩側(cè)帶有含負電荷的磷酸根殘基，分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。因而可依據(jù)DNA可以分離相對分子質(zhì)量相同，而構(gòu)型不同的相對分子質(zhì)量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。以提供一個用于確定EB)，其分子可插入下，呈桔紅色熒光，因此也可對分離的

一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在

二、儀器及試劑

1.儀器及耗材：

水平電泳槽、電泳儀、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。

2.試劑及配制：

50×TAE緩沖液的配制：

配制1000 ml

DNA 片段的常用技術(shù)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)DNA分子的雙螺旋骨因此在電場中向正極移動。在一定的電場強度下，DNA具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，DNA，也DNA分子。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對分子質(zhì)量標準參照物相對可DNA片段大小的標準。在凝膠中加入少量溴化乙錠(ethidium bromide, DNA的堿基之間，形成一種絡(luò)合物，在254～365nm波長紫外光照射DNA進行檢測。0.2kb～50kb范圍內(nèi)的DNA片段。本實驗介紹瓊脂糖凝

DNA片段分離中的應(yīng)用方法。

凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點樣板或parafilm、2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）15 分子的大小來使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的Tris

242 g

冰乙酸

57.1 ml

0.5 mol/L EDTA

ml

加入600 ml去離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1 L后。高溫高壓滅菌，室溫保存。

1×TAE緩沖液的配制：

稱量20 ml的50×TAE緩沖液，再加入980 ml的去離子水。

溴化乙啶貯存液：10 mg/ml 溴化乙啶

配制：100 ml

稱取1 g溴化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至100 ml后，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中。室溫保存。

6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。

配制：10 ml

溴酚藍mg

二甲苯青FF

mg

甘油

ml

用6×TAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。-20℃保存。

其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder、瓊脂糖、三、操作步驟

1.制備1％瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml)：稱取0.7 g中，加入70 ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。

2.膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取 16

0.5 g）瓊脂糖置于錐形瓶3次至瓊脂糖全部融化，并在固定位置放（下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。

3.加樣：在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品，應(yīng)更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。

4.電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓60－100V，樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳。

(5）電泳完畢后，取出凝膠，用含有0.5 ug/ml的溴化乙錠1×TAE用清水漂洗10 min。

(6)觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

四、常見問題及注意事項

1．配瓊脂糖時應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。

2．瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時要輕緩。

3．電泳時應(yīng)注意電源線路，預(yù)防觸電。

4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用時應(yīng)帶乳膠或一次性塑料手套。并在專門的實驗室內(nèi)使用。

5．紫外線對人體有損傷作用，開燈時間不宜太長，注意防護。

6．DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。

7．質(zhì)粒DNA的存在形式有3種，①共價閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②開環(huán)DNA（ocDNA），此種質(zhì)粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力，形成松弛的環(huán)狀分子；③線狀DNA，因質(zhì)粒處斷裂而造成。因此質(zhì)粒DNA電泳的結(jié)果中有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們的泳動速度為：cccDNA > 線狀DNA > ocDNA。min，再DNA的兩條鏈在同一溶液染色約 DNA18

DNA

實驗四

限制性內(nèi)切核酸酶的酶切與鑒定

一、實驗原理

限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈分子中特異核苷酸序列的水解酶，主要存在于原核生物中。根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。其中Ⅱ類酶在分子克隆和基因操作中最為有用，是常用的分子生物學工具酶。

限制性內(nèi)切酶識別序列長度一般為4～8個呈回文序列的特異核苷酸對。一般情況下，識別序列越長，在同一DNA分子中識別位點出現(xiàn)的頻率就越小。許多限制性內(nèi)切酶的酶切位點已被確定。例如EcoRl 酶的識別與切割序列為以下6個堿基對。

5′??GAATTC??3′

EcoR I以獨特的方式識別并裂解這個順序，形成兩個 和

……G

這些末端為互補的，即粘性末端，并可在連接酶的催化下與由相連接。

限制性內(nèi)切酶主要用于基因組基因片段的分離與回收以及單酶切、雙酶切或部分酶切等不同方式。大量的酶切反應(yīng)。小量酶切反應(yīng)主要應(yīng)用于質(zhì)粒的酶切鑒定，DNA，大量酶切反應(yīng)用于制備目的基因片段，體積為

本實驗為EcoR I對質(zhì)粒性內(nèi)切核酸酶酶切位點。瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定酶切效果。

二、儀器與試劑

1.儀器：

水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、2.試劑：

質(zhì)粒pUC18、EcoR I限制性內(nèi)切核酸酶、內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、樣緩沖液、溴化乙啶染液、無菌水等。

三、操作步驟

3′??

……CTT AA DNA的片段化、重組DNA分子物理圖譜的構(gòu)建等。根據(jù)酶切目的和要求不同，可有pUC18的小量酶切。在用特定的限制性內(nèi)切核酸酶對質(zhì)粒進行酶切反應(yīng)后，CTT AAG?? 5′

5′突出末端：

AATTC……

EcoR I產(chǎn)生的其它分子末端DNA分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的可分為小量酶切反應(yīng)和體積為20 μ50～100 μl，DNA

在質(zhì)粒的雙鏈環(huán)狀DNA電泳設(shè)備等。

l, 含0.210通常可采用1 μg 30ug。6×上

G……根據(jù)酶切反應(yīng)的體積不同，～用量在～分子上有多個限制

1．限制性內(nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的0.2或0.5ml PCR薄壁離心管中進行。

2.酶切反應(yīng)體系（10ul）：

酶解緩沖液（10×buffer）ul

限制性內(nèi)切酶

0.5 ul EcoR I(7.5U)

底物DNA（質(zhì)粒）

滅菌ddH2O

限制性內(nèi)切酶最后加入，手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸，混勻后離心15s。37℃水浴消化

3.酶切完畢，分子量標準物同時進行電泳以確定應(yīng)，或加入適量酶后繼續(xù)反應(yīng)。

5.經(jīng)電泳觀察酶切反應(yīng)完全后，將上述反應(yīng)液置將剩余酶切產(chǎn)物保存于

四、注意事項

1.限制性內(nèi)切酶需保存于

2.限制性內(nèi)切酶溶液通常含有溶液底部，所以要充分搖勻。

3.加樣時吸頭垂直進入試劑管，避免碰到管壁，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。

4.酶（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深。

5.酶解消化反應(yīng)溫度及時間根據(jù)該酶使用說明書而定。

6.注意酶的用量，加入的酶量按的10%，以避免酶液中甘油干擾反應(yīng)活性的可能，即在識別序列以外的位點進行切割。此外，反應(yīng)體系中甘油的質(zhì)量分數(shù)大于12%，以及缺少

五、相關(guān)問題

2h。取5ul酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，?C20℃?zhèn)溆谩?20℃，操作時應(yīng)將酶保持在冰浴中，避免長時間置于高溫中。NACL和存在M

x ul（依質(zhì)粒濃度而定）

加至10 ul 鑒定酶切反應(yīng)效果，DNA片段的大小。如果酶切不完全，可繼續(xù)65℃水浴中10～15min，中止酶切反應(yīng)，50%甘油，加入反應(yīng)管后，因密度較大，往往沉淀至

1-3U/ug DNA計算，酶的體積應(yīng)低于反應(yīng)總體積

。酶量過大（≥25U/ug DNA）時，有產(chǎn)生所謂星號 20

6000 r/min，DNA.酶解消化反

必須用 等情況下，都有可能出現(xiàn)星號活性。

1.酶的保存

不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中，這種特定配方的緩沖液能使酶活性維持較長時間。常用的保存緩沖液各組分作用如下：

Tris-HCl（7.4―7.8）：

維持穩(wěn)定的pH范圍。

50-100mmol/L

NaCl或KCl：提供一定的離子強度。

0.1mmol/L EDTA：

1mmol/L

DTT：

200-500ug/ml BSA：

度，防止蛋白質(zhì)分子濃度過低而導(dǎo)致酶分子變性。

50%的甘油：

1-5 g/L的Triton-100：

白質(zhì)分子的表面變性作用。

2.酶單位的定義

限制酶的單位通常定義為：1U的酶能在約完成酶切1ug的λDNA。確定限制酶單位的具體操作方法是分別向列的酶（1U左右），當電泳觀察到酶切片段的條帶不再發(fā)生變化時說明已作用完全，割的最少酶量定為1U的酶量。

3.限制酶的作用條件

限制酶切割DNA的反應(yīng)中，酶切條件是實驗成功的重要因素，其中包括反應(yīng)的溫度、時間與反應(yīng)的緩沖體系，除了這些條件外，只有在正確選擇酶反應(yīng)條件時才能達到最佳酶切效果。

（1）作用溫度

早期的酶切反應(yīng)都在37℃進行，這種方法雖然簡單、統(tǒng)一，但卻不能達到每個酶的最適反應(yīng)溫度。為了達到最佳酶切的效果，最好根據(jù)所選用的酶確定所需要的反應(yīng)溫度。

（2）緩沖體系

限制酶反應(yīng)的緩沖體系大致相同，都含有以下組分：約作用是將酶反應(yīng)體系的pH維持在7.5-8.5；約

絡(luò)合掉能激活限制酶的鎂離子。

保護酶分子上的還原性基團。

牛血清白蛋白提高溶液中蛋白質(zhì)的濃

使酶液保存于-20℃不至凍結(jié)。

這是一種非離子型表面活性劑，能防止蛋50ul合適的反應(yīng)緩沖體系中，在1ug的底物中加入一系DNA的純度與濃度也會影響酶切效果，100mmol/L10mmol/L的MgCl2，作用是為限制酶提供激

1h內(nèi)完全切Tris-HCl，的活因子；1mmol/L的DTT，作用是保護還原性基團；約150mmol/L的NaCl，作用是提供合適的離子強度。由于認識的局限性，早期的限制酶反應(yīng)體系僅根據(jù)其中NaCl含量的不同分為高鹽、中鹽與低鹽三種，這同樣不能使每種酶獲得最適反應(yīng)條件。現(xiàn)在提供酶的很多廠商能提供4-10種緩沖體系，其中各必需成分之間只有很小的差別，目的是使每種酶都發(fā)揮最大的作用。

緩沖液一般配成10倍的濃度，使用時以1/10的比例加入，當然為了減小吸量誤差也可自行配制5倍的緩沖液。

(3)反應(yīng)體積與時間

酶反應(yīng)體積一般不宜小于20ul。因為過小的反應(yīng)體積在加入各種成分時易產(chǎn)生誤差，甘油含量易超過10%。在37℃保溫可因水分蒸發(fā)而明顯改變反應(yīng)體系中各成分的濃度，從而影響酶活力。同時還要考慮反應(yīng)完畢進行電泳時，所加樣品中DNA的量能夠在電泳中顯出清晰的泳帶。

常規(guī)的酶切反應(yīng)一般控制在60min內(nèi)進行，但也可以根據(jù)切割對象與所用的酶將保溫時間延長至十幾個小時。

(4)DNA的純度與濃度

除了上述酶反應(yīng)條件外，影響酶切效果的最主要因素是DNA的純度。例如，樣品中含有大量RNA雜質(zhì)時會因減少了酶的有效濃度而影響酶切效果；某些雜蛋白未除凈而結(jié)合在DNA時也會影響酶切效果。至于抽提過程中未除凈的各種影響因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是瓊脂糖凝膠中的硫酸根離子等。

DNA純度的另一個指標是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后電泳結(jié)果顯示出不清晰條帶或成為一片紅色（術(shù)語稱Smear）時，可肯定系統(tǒng)中已經(jīng)污染了DNA酶。

DNA樣品中含有大量RNA時可用RNA酶處理；含有結(jié)合在DNA上的雜蛋白與DNA酶時都可用氯仿/異戊醇抽提；當樣品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物質(zhì)時可以通過沉淀更換一個新的緩沖體系。當然，酶切失敗時也不能排除除DNA外的一切因素，如無菌水，EP管，吸咀等的干凈程度以及內(nèi)切酶自身的酶活性情況。

除純度外，DNA的濃度也會影響酶切效果，一般DNA質(zhì)量濃度在1ug/20ul才能得到較好的酶切效果，質(zhì)量濃度高達1.5ug/20ul時就可能發(fā)生酶切困難。

(5)終止酶切反應(yīng)的方法

如果需對酶切片段進行連接或標記等操作時，首先要將限制酶滅活。滅活的方法可分為三種：第一種是向反應(yīng)緩沖體系中加入終濃度為10-12.5mmol/L的EDTA，原理是絡(luò)合掉酶反應(yīng)中所需的鎂離子。但這種方法會影響需鎂離子的后續(xù)反應(yīng)。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法來更換緩沖體系，以除去EDTA，但這樣就會造成DNA的損失。第二種方法是熱失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保溫60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保溫 22 30min方能達到目的；極端的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加熱的方法使之失活。熱失活方法的特點是簡單并且未向體系中引入任何物質(zhì)，特別適用于連續(xù)進行幾個酶切反應(yīng)；熱失活法的另一個特點是不用更換體系，所以不會造成DNA的損失。第三種方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片段。這種方法的特點是處理條件劇烈，能使酶徹底失活（不像第一種方法中酶蛋白并未變性而只是沒有激活因子而已）。

實驗五

大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化

一、實驗原理

體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的宿主細胞中才能大量的進行復(fù)制、增殖和表達。研究發(fā)現(xiàn)，用含Ca2+ 的溶液處理大腸桿菌細胞會易于吸收外源DNA。大腸桿菌吸收外源DNA的過程被稱為轉(zhuǎn)化。細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài)。用理化方法可以誘導(dǎo)細胞進入感受態(tài)，如電轉(zhuǎn)化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前實驗室常用的制備感受態(tài)細胞的方法，其原理是使細菌處于0°C、CaCl2低滲溶液中，細胞膨脹成球形，細胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細胞膜表面，經(jīng)42°C短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復(fù)合物。宿主細胞一般是限制―修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，而質(zhì)粒載體攜帶有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。若將轉(zhuǎn)化的細胞涂布與于含氨卞青霉素的平板上，則只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細胞才能生存并生長增殖。從而可以篩選出哪個克隆含有質(zhì)粒。

本實驗以E.coli JM109菌株為受體細胞，受體菌使其處于感受態(tài)，然后與pUC18質(zhì)粒共保溫實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細胞進行適當稀釋，在含有氨卞青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，化的受體細胞則因無抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過擴增后，可將轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA分離提取出來，用于電泳分析、限制性內(nèi)切酶圖譜的制作以及

二、儀器及試劑

1.儀器：

恒溫搖床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺、分光光度計、高速冷凍離心機、臺式離心機。

2.材料

E.coli JM109受體菌、質(zhì)粒pUC18。

3.試劑：

LB培養(yǎng)液（1L）：

胰蛋白胨

10g

酵母粉

5g

NaCl

10g（高鹽）或

氨芐青霉素（Ampicillin）

100mg/ml

用CaCl2處理而未有轉(zhuǎn)DNA測序等實驗。5g（低鹽）在三角瓶中將胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高壓滅菌。待冷卻至55℃，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨芐青霉素。然后貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

LB平板培養(yǎng)基：

胰蛋白胨

10g

酵母粉

5g

NaCl

10g

瓊脂

13g

在三角瓶中依次將上述配方加入1L的重蒸水中并高壓滅菌。待培養(yǎng)基降溫至養(yǎng)基并輕輕旋轉(zhuǎn)以使溶解的瓊脂均勻分布于整個培養(yǎng)基溶液中，根據(jù)需要加入氨芐青霉素，然后可直接從三角瓶中倒出培養(yǎng)基鋪制平板。90mm直徑的培養(yǎng)皿約需培養(yǎng)基完全凝結(jié)后，倒置平皿并貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

其它試劑：

0.1M CaCl2溶液、滅菌蒸餾水

三、操作步驟

1.感受態(tài)細菌的制備：

（1）用接種環(huán)從E.coli JM109菌平板上挑取一單克隆菌落，培養(yǎng)基的試管中中，37℃ 220 rpm振蕩培養(yǎng)過夜（12～16h）。

（2）取0.5 ml過夜菌液接種到裝有50ml LB液體培養(yǎng)基三角瓶中中，振蕩培養(yǎng)2－3h，隔20－30min測量OD600值，至OD600值為轉(zhuǎn)至1.5ml 離心管中，每管1ml菌液，按需要決定管數(shù)。

（3）4℃，12000 rpm，離心2 min，以回收細菌。

（4）倒凈上清液，倒置離心管于濾紙上1min，使殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細胞，冰浴30 min。

（5）4℃，12000 rpm，2 min。

（6）倒凈上清液，倒置離心管1min，使殘留液流盡。每管加CaCl2重新懸浮細胞（重懸時操作要輕），即成感受態(tài)細胞懸浮液。

2.細菌轉(zhuǎn)化：

（1）取3只滅菌的Ep管，分別編號1、2、3、分別加入以下各組分：加入

5g，30接種于裝有0.3-0.4。無菌條件下將細菌100 ul冰預(yù)冷的 50℃，取出培50ml培養(yǎng)基。5ml LB液體37℃，220 rpm每管加1ml0.1 mol/L 10～20ng

或 ～ 質(zhì)粒DNA（體積小于10ul），同時做兩個對照組：

1號：受體菌對照組：

100ul感受態(tài)細胞懸浮液+2ul無菌ddH2O

2號：質(zhì)粒DNA對照組：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19

3號：正常轉(zhuǎn)化組：100ul感受態(tài)細胞懸浮液+2ul pUC19

（2）輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min，促進DNA分子在感受態(tài)細胞表面的吸附。

（3）轉(zhuǎn)入便于DNA分子的吸附進入，提高轉(zhuǎn)化率。

（4）迅速轉(zhuǎn)入冰上冷卻

（5）使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并且表達

（6）取200ul37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)可將之置于37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，100ul左右，用移液器吹打重懸，再全部涂于含

（7）觀察并記錄轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的數(shù)目，計算轉(zhuǎn)化率。

四、注意事項：

1.實驗中所用的器皿均要滅菌，以防止雜菌和外源

2.實驗過程中要注意無菌操作，溶液移取、分裝等均應(yīng)在無菌超凈工作臺上進行。

3.必須設(shè)對照組，以檢驗實驗過程中是否有污染。

4.整個實驗過程均需置于冰上。

5.選用對數(shù)生長期細胞，42℃水浴2min，通過熱刺激增強CaCL2的作用，2min，修復(fù)細胞膜。600u無抗生素lLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37℃，Ampicillin抗性基因。Ampicillin的LB平板，將平板置于無菌臺直至液體被吸收，12－16h后觀察結(jié)果，其余保存于4℃。如果平板上沒有長出菌落，同時將剩下的500ul菌液離心，Ampicillin的LB平板上，置 DNA

OD600不應(yīng)高于0.6。26

使細胞膜產(chǎn)生通道，220 rpm，振蕩倒掉大部分上清，37℃培養(yǎng)。60min。留 加菌液涂在含 的污染。

實驗六

動物組織細胞基因組

一、實驗原理

真核生物的一切有核細胞（包括培養(yǎng)細胞）都能用來制備基因組的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內(nèi)，質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持組織細胞在含仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的

蛋白酶K在勻漿后提取EDTA則抑制細胞中分子完整地分離出來。

二、儀器及試劑

1.恒溫水浴鍋、臺式離心機、紫外分光光度計（離心管（滅菌）

SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶DNA的反應(yīng)體系中，Dnase

、吸頭（滅菌）DNA提取 因此，制備DNA分子的完整。提取KDNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。SDS可破壞細胞膜、活性；而蛋白酶K可將 27

DNA的原則是既要將DNADNA核膜，并使組織蛋白與蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，GeneQuant）DNA。真核生物DNA與蛋白 DNA分離，使DNA 的一般過程是將分散好的的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯從溶液中析出。的重要特性是能在的 儀器：、移液器、玻璃勻漿器、2.試劑：

（1）細胞裂解緩沖液：

Tris(pH8.0)

mmol/L

EDTA(pH 8.0)

500 mmol/L

NaCL

mmol/L

SDS

10%

胰RNA酶

20ug/ml

（2）蛋白酶K：

稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，?C20℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）TE緩沖液（pH 8.0）：高壓滅菌，室溫貯存。

（4）酚?氯仿?異戊醇（25:24:1）、（5）異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。

三、操作步驟

1.取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。

2.加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進行PCR反應(yīng)等，需要進一步純化的按下列步驟進行）

3.加等量的酚?氯仿?異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

4.取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿?異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

5.取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min，離心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm，5min。

8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

四、常見問題

1.選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不易過長。

2.在加入細胞裂解緩沖液前，細胞必須均勻分散，以減少

3.提取的DNA不易溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。

4.電泳檢測時DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。

5.分光光度分析DNA應(yīng)加入SDS至終濃度為

6.酚/氯仿/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊牡牧炕驕p少所取組織的量。

A280/A2600.5%，并重復(fù)步驟 DNA團塊形成。1.8；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，2～8。DNA，可加大抽提前緩沖液29

的小于

實驗七

DNA的定量

一、實驗原理

核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在260 nm的紫外吸收峰，其吸收強度與核酸的濃度成正比，這個物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。OD260相當于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml?？梢源藖碛嬎愫怂針悠返臐舛?。

紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計核酸的純度，純的DNA制品的比值為1.8，RNA的比值為DNA高于1.8,則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。

對于很稀的核酸溶液，可用熒光光度法進行測定。DNA 本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（EB）插入DNA 的堿基對平面之間并與之結(jié)合后，DNA樣品能在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生桔紅色熒光。熒光強度與被結(jié)合的EB的量成正比，而被結(jié)合的EB的量又與核酸分子長度和含量成正比，使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，可比較出被測DNA溶液的濃度。靈敏度可達1～5ng。由于是基于目測，所以是估計水平。簡便，但準確性較低。

二、儀器及試劑

1.儀器：Amersham

GeneQantTM Pro 紫外可見分光光度儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備。

2.試劑及配制：

5×上樣緩沖液：

配制10 ml

2.0, 波長處有特異若 該方法經(jīng)濟

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)

ml

10% SDS

ul

50% 甘油

2.5 ml

0.2% 溴酚藍

mg

0.2% 二甲苯青FF

mg

加去離子水至10 ml

其它試劑：0.1×TE、DNA標準液，EB儲存液（10 mg/ml），三、實驗步驟

1.紫外分光光度法

（1）用0.1×TE對待測DNA樣品按1:20或合適的倍數(shù)稀釋。

（2）開機，儀器會自動對光路及分析軟件進行檢測，待顯示屏上出現(xiàn)“instrument Ready”時，進入核酸測定窗口

（3）調(diào)零。先用0.1×TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。點擊“set ref”鍵，儀器自動校正零點。將樣品槽內(nèi)的樣品杯取出，換上待測樣品。

（4）吸70 ul已稀釋的DNA樣品轉(zhuǎn)入石英樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。如果樣品很少，可以用5～7ul的石英樣品杯。點擊“enter” 鍵，儀器即進入分析狀態(tài)。窗口同時顯示260和280nm處的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA樣品的濃度等。

（5）打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用高純水清潔石英樣品杯，風干后，再加入下一個待測樣品。

（6）DNA純度：以O(shè)D260/ OD280比值來反映。當OD60 /OD80比值 <1.8時，說明樣品存在蛋白質(zhì)或酚等雜質(zhì)，可采用平衡酚/氯仿―異戊醇再抽提除去蛋白質(zhì)或用乙醚抽提去除殘留酚，再用無水乙醇沉淀，TE懸浮后再測定。當OD60/OD280比值>2.0，說明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去處RNA。

2.EB熒光分析法

（1）瓊脂糖凝膠的制備。

（2）樣品的準備。把待測DNA樣品進行1:2連續(xù)稀釋，并準備一份DNA標準液作對照。

（3）上樣。稀釋樣品與上樣緩沖液按1:5混合均勻后上樣。

（4）電泳。用100V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍指示劑遷移到凝膠的3/4處停止電泳。

（5）取出凝膠，入EB熒光染液中作用20min，取出后清水漂洗干凈，然后紫外檢測。肉眼可見到的最高稀釋度約含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸樣品中的嚴重污染干擾核酸紫外線吸收物質(zhì)的情況。

四、常見問題

1． 紫外分光光度法不能區(qū)分三種構(gòu)型，也不能區(qū)分染色體染色體DNA、以及偏高。

2．OD320值是背景，若溶液鹽濃度越高，3．的光面以避免干擾測定。

DNADNA和DNA解鏈的增色效應(yīng)等因素的影響，因此測得的數(shù)據(jù)往往比實際濃度 RNA等。由于測定吸收光度OD320也越高。要小心不要摔破，32

DNA分子的超螺旋、開環(huán)、線狀A(yù)260時，難以排除 持杯時也不要接觸透明RNA、分子的構(gòu)型，如質(zhì)粒測樣品時使用的石英樣品杯比較貴，實驗八

PCR基因擴增

一、實驗原理

聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統(tǒng)，其原理類似DNA分子的天然復(fù)制過程，是將在待擴增的DNA片段和與其兩側(cè)互補的兩個寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，生物學中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

PCR的工作程序?qū)嶋H上是一個在模板種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)。擴增的特異性取決于引物與模板DNA的結(jié)合。整個擴增過程分三步：①變性，加熱使模板裂而形成兩條單鏈；②退火，突然降低溫度后模板存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度、物與模板之間；③延伸，在DNA聚合酶及鎂離子等的存在條件下，從引物的結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新的循環(huán)，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的40個循環(huán)后，DNA 可擴增106～109倍。

二、儀器及試劑

1.儀器：PCR儀、臺式離心機、移液器及吸頭、2.試劑：

10X PCR 緩沖液配制（部分隨Taq

250～500 mmol/L

100～500 mmol/L

15～20 mmol/L

0.5%

1mg/L

其它試劑：模板DNA、dNTP 混合液、凝膠、等

DNA擴增 DNA、一對已知序列的寡核苷酸引物和四DNA引物按堿基配對原則互補結(jié)合，也結(jié)構(gòu)簡單等特點，DNA鏈。完成以上三步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個DNA鏈又成為下一輪循環(huán)的模板?，F(xiàn)用圖示說明PCRPCR薄壁管、電泳儀等： KCl Tris-Cl（pH8.4）

MgCl2

Tween-20

BSA Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、瓊脂糖33

2n 倍。該技術(shù)已成為分子DNA主要的結(jié)合發(fā)生在引: 3 ′端開始，經(jīng)過25～ 雙鏈間的氫鍵斷 原理酶提供）

三、操作步驟

1.PCR 體系（40ul）：

4ul

10XPCR 緩沖液

4ul

25mM MgCl2（根據(jù)不同公司PCR 緩沖液的不同而定）

Xul

模板DNA ≥50ng

1ul

上游引物（50-100ng）

1ul

下游引物（50-100ng）

1ul

dNTP Mixture（終濃度

0.4 ul

Taq聚合酶

加ddH2O至40ul

視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2.將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，使反應(yīng)成分集于管底。

3.PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序設(shè)置：

（1）95℃

300s

變性

（2）94℃

45s

變性

（3）55℃

45s

退火（根據(jù)不同引物可能有不同退火溫度）

（4）72℃

45s

延伸（每分鐘可延伸

重復(fù)步驟2-4共 30 循環(huán)

（5）72℃

600s

延伸

反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，吸取少量（10ul）進行分析，其余置

4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

20－200uM）1kp）6000 rpm 15 sec

離心

四、注意事項：

1.PCR 體系所加成分的實際用量應(yīng)根據(jù)實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進行核算。

2.加樣時要認真,吸頭垂直進入試劑管，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。

3.Taq聚合酶（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深，酶量不能過多。

五、影響PCR的主要因素

1.模板DNA

單鏈、雙鏈DNA白水解酶等的污染。模板用量依具體實驗而定，PCR反應(yīng)時模板變性要充分。

2.PCR引物

PCR引物設(shè)計是否成功是能否獲得高質(zhì)量應(yīng)用時，需注意以下重要環(huán)節(jié)：

（1）PCR引物的長度約為以使它們在相近的溫度下與其互補序列結(jié)合。隨機的，應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基，否則會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。引物免選用T ,尤其應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)

（2）一般來說，PCR引物長度選擇24bp左右為宜。

（3）要避免引物分子自身序列互補，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。兩個互之間的3，末端序列不能有明顯的互補性，以免形成引物二聚體。

（4）引物的熔點溫度（引物的GC/AT應(yīng)與要擴增的模板

（5）引物的3，末端必須與模板嚴格互補，而

（6）目前在引物選擇中已廣泛應(yīng)用計算機軟件，從基因序列，并對設(shè)計的引物在引物二聚體形成、自身互補性及特異性等方面進行分析評價。PCR

18～30個核苷酸，并且成對引物間的2個以上T500bp時，引物長度選擇 Tm值）要適當。DNA相當或略高些。一般熔點溫度以大于DNA樣品盡量純凈，不能有核酸酶、蛋一般為100ul反應(yīng)液有105-106個目標分子。PCR產(chǎn)物最關(guān)鍵的因素之一。在設(shè)計和G＋C含量應(yīng)相似。G+C含量應(yīng)為45%～55%之間。堿基分布是尤其是不應(yīng)在其3，端出現(xiàn)3個連續(xù)G或C，3，端堿基最好選用A、G、C,盡可能地避16-18bp；PCR產(chǎn)物≥5kb時，PCR引物相 Tm值與引物的堿基組成和長度有關(guān)；PCR55℃為宜。5，末端的要求可靈活些。EMBL或Genebank中查找有關(guān)

均可作為的模板。產(chǎn)物≤

（7）用于亞克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性內(nèi)切酶位點。為了保證內(nèi)切酶有效酶切擴增產(chǎn)物，一般在酶切位點的5，端再加上幾個額外的堿基。

（8）引物的濃度，在終濃度為0.2～1.0 umol/L的范圍內(nèi)產(chǎn)量基本相同，低于0.2 umol/L時會影響產(chǎn)量。但過高時一乃不經(jīng)濟，二則會出現(xiàn)非特異擴增及增加引物二聚體的產(chǎn)生。

3.熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）

一般用量為2.5 U/100uL 反應(yīng)體積。酶量過多易導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。適溫度為75℃，在低溫下仍保留相當高的活性，易引起不完全配對的引物伸及引物二聚體的擴增延伸，所以應(yīng)注意防止非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)。

4.dNTPs

PCR常用的dNTP濃度在50-200umol/L。四種

低則反應(yīng)速度下降，過高則特異性下降，可根據(jù)具體實驗來確定最適的

5.PCR緩沖液

因PCR反應(yīng)中的dNTP能與Mg2+結(jié)合，影響反應(yīng)液中游離應(yīng)按不同條件，確定合適的Mg2+濃度。一般在標準的Mg2+濃度約為1.5mmol/L。Mg2+離子濃度可顯著影響出現(xiàn)非特異擴增，過低則酶活性顯著下降。應(yīng)用無核酸酶的及5mmol的二硫蘇糖醇（DTT）對酶有一定的保護作用。

6.PCR循環(huán)的溫度

預(yù)變性：起始變性的時間應(yīng)該長些，以使變性充分。一般為不完全時，DNA雙鏈會很快復(fù)性，影響PCR反應(yīng)，但若變性溫度太高（不宜超過會影響Taq酶的活性。

變性：一般為94℃ 30s或95℃ 20s。

引物退火：應(yīng)根據(jù)具體反應(yīng)中引物與模板的堿基配對情況及實驗的目的確定。一般為50-72℃。退火溫度增高會增強對不正確退火引物的識別，還能降低引物酸的錯誤延伸。

延伸：一般為72℃ 60-90s。最后一個循環(huán)后應(yīng)在物合成的完整性。

7．平臺效應(yīng)和PCR循環(huán)的次數(shù)

dNTPsPCR反應(yīng)中（PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性。BSA 72℃保留該類酶的最-模板的非特異延

dNTP濃度。Mg2+的濃度，所以dNTP濃度200umol/L），濃度高則Tween-20(0.05%～0.1%)94℃ 3-5min。變性95℃），3，端不正確核苷5min，以保證PCR產(chǎn)應(yīng)等當量。濃度、在PCR基因擴增的后期，由于產(chǎn)物的堆積，將使原來產(chǎn)物以指數(shù)增加的速度變?yōu)槠教骨€，即所謂平臺效應(yīng)。它的出現(xiàn)是由于PCR原料的不斷消耗、酶的穩(wěn)定性的降低、終產(chǎn)物的阻滯效應(yīng)及非特異性產(chǎn)物等多種因素造成的，所以選擇合理的循環(huán)次數(shù)，既能得到足夠量的PCR產(chǎn)物，又不要無意義地增加循環(huán)次數(shù)。

8.操作環(huán)境

避免環(huán)境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目標DNA的污染等。

實驗九 瓊脂糖凝電泳分離與純化目的一、實驗原理

不同大小的片段分離位于不同的位置，的片段。有許多型號的低熔點瓊脂糖可在雙鏈DNA的解鏈溫度高于收DNA片段。該法的優(yōu)點是可直接在熔化的凝膠中進行各種酶反應(yīng)，如合成同位素探針、進行限制酶切割和連接反應(yīng)等。

二、儀器及試劑：

1.儀器

電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器、離心管、吸頭等。

2.試劑：

低熔點瓊脂糖、待純化的

三、操作步驟：

1.配制1％的瓊脂糖凝膠，在適當?shù)奈恢们幸粭l與加樣槽平行的槽，換低熔點瓊脂糖凝膠。

2.加樣，100V

DNA DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在電泳過程中切下目的片段并采用低熔點瓊脂糖回收法即可獲得目65℃時熔化成液體，在65℃，所以可以熔化凝膠而 DNA、凝膠回收試劑盒、去離子水或38

30℃時凝固成凝膠。由于DNA并不變性，在凝膠成液態(tài)時回TE（pH7.6）

分離和純化。

電泳，觀察所需片段是否移至低熔點膠內(nèi)。3.在紫外燈下切含有DNA的低熔點膠，置1.5 ml離心管中，于70℃熱水中熔化。

4.按凝膠回收試劑盒說明書操作。

12.取適量純化好的目的DNA在 GeneQuant 中檢測，確定純度和濃度，其余樣品于-20℃保存。

四、注意事項：

1.配凝膠的三角瓶、電泳槽和配膠板要先沖洗干凈

實驗十

DNA重組

一、實驗原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這種重新組合的DNA在體外的連接重組是基因工程操作的核心技術(shù)之一，其本質(zhì)是一個酶促反應(yīng)過程。即在一定的條件下，DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA用，形成磷酸二酯鍵的過程。常用的DNA連接酶有兩種：菌DNA連接酶。其中T4噬菌體DNA連接酶對底物的要求低，能更有效地連接末端，應(yīng)用更廣泛。

T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分連接酶通過ATP的磷酸與連接酶的賴氨酸的氨基形成酶―隨后從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的51端的磷酸基團上，形成磷酸―磷酸鍵。③鏈31端的羥基被活化，取代ATP后與DNA51端的磷酸根形成磷酸二酯鍵，完成DNA之間的連接。T4噬菌體DNA連接酶需要鎂離子和溫度和pH條件下進行連接反應(yīng)。

二、儀器及試劑：

1.儀器：

臺式離心機、移液器、吸頭、恒溫水浴鍋等。

2.試劑：

T4 DNA連接酶、10×T4 DNA連接酶緩沖液、載體

三、操作步驟

1.外源DNA片段和載體DNA的連接

DNA51端磷酸和31端羥基之間相互作T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿3步：①首先，ATP與T4ATP復(fù)合物。②被激活的并釋放出ATP作為輔助因子，DNA、外源DNA。DNA的平DNAAMPDNAAMP，在一定的 叫做重組子。片段的噬菌體

取1只無菌Ep管、用微量進樣器按下列順序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer

2.5 ul

酶切后的DNA片段

*1

約0.3 pmol

酶切后的載體DNA *2

約0.03pmol

T4 DNA Ligase

ddH2O

*1 DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體

*2 相同末端的載體與DNA自身環(huán)化。

2.蓋好蓋子，用手指輕彈Ep

3.將反應(yīng)管放入16℃過夜反應(yīng)（4.取出約25ng的DNA連接液進行瓊脂糖凝膠電泳，片段和酶切DNA片段作電泳。

5.用0.1×TE將連接混合物稀釋至

四、注意事項

1.連接產(chǎn)物經(jīng)鑒定后應(yīng)迅速做轉(zhuǎn)化實驗。

2.根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)酶的用量。平端連接或接頭連接都比黏端連接慢得多，而且酶的用量也增大。

3.單價陽離子或低濃度的聚乙二醇可提高平端連接的效率。

4.防止載體DNA自身環(huán)化，常用堿性磷酸酶處理線性載體，去掉載體的DNA片段的自身環(huán)化。

5.正確調(diào)整載體DNA和外源

五、相關(guān)問題

1.連接反應(yīng)的影響因素

1ul

加至 25ul DNA摩爾數(shù)的3－12～16h）。鑒定連接結(jié)果，50ul，使用10～20ul DNA之間的比例有助于獲得高產(chǎn)量的重組產(chǎn)物。40

10倍。2s 以集中溶液。以未經(jīng)連接的質(zhì)粒 51?CDNA

片段進行連接時，應(yīng)首先將載體進行去磷酸化處理，以防止其管數(shù)次，并于臺式離心機離心轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。磷酸以抑制

除了載體、供體的濃度及其比例等因素外，影響連接反應(yīng)的因素還有很多，如緩沖液組分、連接溫度與時間、酶濃度、DNA濃度及片段末端的堿基序列等。

（1）連接緩沖液的影響

不同的公司提供的連接緩沖液可能有所不同，但大體上都含有以下組分：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的范圍在7.4-7.8，較多用7.8，目的是提供合適酸堿度的連接體系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應(yīng)；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L，作用是維持還原性環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。與限制酶緩沖液不同的是連接酶緩沖液還含有0.5-4mmol/L的ATP，現(xiàn)多用1mmol/L，是酶反應(yīng)所必需的。

（2）pH的影響

一般將緩沖液的pH調(diào)節(jié)到7.4-7.8，較多用7.8。有實驗表明，若把pH為7.5-8.0時的酶活力定為100%，那么體系偏堿（pH為8.3）時僅為全部活力的65%；當體系偏酸（PH為6.9）時僅為全部活力的40%。

（3）ATP濃度的影響

連接緩沖液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，較多用1mmol/L。研究發(fā)現(xiàn)，ATP的最適濃度為0.5-1mmol/L，過濃會抑制反應(yīng)。例如，5mmol/L的ATP會完全抑制平末端連接，黏端的連接也有10%被抑制；還有報道，當ATP的濃度為0.1mmol/L時，去磷酸載體的自環(huán)比例最大。由于ATP極易分解，所以當連接反應(yīng)失敗時，除了DNA與酶的問題外，還應(yīng)考慮ATP的因素。含有ATP的緩沖液應(yīng)于-20℃保存，溶化取用后立即放回。連接緩沖液體積較大時最好分小管貯存，防止反復(fù)凍融引起ATP分解。與限制酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長期保存），臨用時加入新配制的ATP母液。

（4）連接溫度與時間的影響

因為黏性末端的DNA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會使氫鍵不穩(wěn)定，但連接酶的最適溫度又恰為37℃。為了解決這一矛盾，在經(jīng)過綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16℃，時間為4-16h?，F(xiàn)經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，對于一般的黏性末端來說，20℃ 30min就足以取得相當好的連接效果，當然如果時間充裕的話，20℃ 60min能使連接反應(yīng)進行得更完全一些。對于平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。

（5）酶濃度的影響

根據(jù)New England Biolabs公司對T4 DNA連接酶的定義，1U的酶可在16℃ 30min內(nèi)連接20ul體系中Hind Ⅲ酶切片段（黏性末端為0.12umol/L 5,末端，此時DNA質(zhì)量濃度約為300ng/ul）的50%。日常使用的DNA濃度比酶單位定義狀態(tài)低10-20倍，連接平末端時酶用量要比連接黏端大10-100倍，廠商為了滿足這一要求，又往往提供高濃度的酶（幾百個 41 單位/ul），所以進行黏末端連接時需先行稀釋。除了立即用于反應(yīng)的部分可用酶反應(yīng)緩沖液稀釋外，其余都應(yīng)使用廠商提供的稀釋液。稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似，稀釋液中的酶能在長時間保持活力，也便于隨時取用。

（6）DNA濃度的影響

盡管有的實驗手冊上推薦使用0.1-1nmol/L的DNA濃度，但考慮到用質(zhì)粒作為載體克隆時，最后要求得到環(huán)化的有效連接產(chǎn)物，所以DNA濃度不可過高，一般不會超過20nmol/L。相比較而言，以噬菌體、cosmid質(zhì)粒為載體的克隆過程最后要求線性化的連接產(chǎn)物，所以，DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。此外，在用大質(zhì)粒載體進行大片段克隆時，以及在雙酶切片段的連接反應(yīng)中，DNA濃度還應(yīng)降低，甚至是DNA的總濃度低至幾個nmol/L。另據(jù)研究，T4 DNA連接酶對DNA末端的表觀Km值為1.5nmol/L，所以，連接時DNA濃度不應(yīng)低于1nmol/L。即應(yīng)具有2nmol/L的末端濃度。

2.三種連接酶單位定義

（1）Weiss單位

連接酶單位最早是1968年由Weiss提出的Weiss單位，現(xiàn)也稱PPi單位。他的單位定義為：37℃ 20min內(nèi)將1nmol的32P從焦磷酸根上置換到ATP分子上所需的酶量。現(xiàn)在大多數(shù)廠商仍使用這種單位。

（2）d（A-T）環(huán)化單位

由于Weiss單位定義中測試的是T4 DNA連接酶中除連接功能外的另一種磷交換功能，并且測試溫度高達30℃，與實際連接反應(yīng)相比無論在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich與Lehman提出了真正度量連接功能的d(A-T)環(huán)化單位，又稱外切酶抗性檢測。d（A-T）環(huán)化單位的定義為：30℃ 30min 內(nèi)將100nmol/L的d（A-T）（約2kb長）轉(zhuǎn)化成抗外切酶的形式。

（3）黏性末端單位

與Weiss單位相比，d（A-T）環(huán)化單位更接近實際，但仍有一定的問題，例如，環(huán)化單位測試中用的是純AT片段，與實際連接中4種堿基隨機排列不符；再說，如果連接酶將片段連接成多聚體而末環(huán)化時，仍可能被外切酶組所切；除此之外，與實際上大多數(shù)連接反應(yīng)使用的溫度16℃相比，30℃仍顯得偏高。為了衡量實際連接條件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最實用的黏性末端單位，它的單位定義為：16℃ 30min內(nèi)將5,末端濃度為0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片段的50%連接上。

實驗十一 動物組織細胞總RNA的提取

一、實驗原理

RNA是基因表達的中間產(chǎn)物，存在于細胞質(zhì)與核中。對中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA 是很多分子生物學實驗所必需的，如雜交、cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上取決于內(nèi)的大部分RNA是以核蛋白復(fù)合體的形式存在，所以在提取質(zhì)變性劑，迅速破壞細胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與RNA分離，釋放出機溶劑處理、離心，使RNA與其他細胞組分分離，得到純化的總抑制內(nèi)源和外源的RNase活性，保護RNA分子不被降解。中進行?？墒褂肦Nase抑制劑，如DEPC是RNase的強抑制劑，常用來抑制外源性。提取緩沖液中一般含SDS、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質(zhì)變性劑，也能抑制并有助于除去非核酸成分。

本實驗介紹異硫氰酸胍法和TRIzol法提取動物組織總

二、儀器和試劑

1.儀器：

超凈工作臺、高速冷凍離心機、電泳儀、紫外分光光度計、吸頭、Ep管、玻璃勻漿器、試管、玻璃器皿洗凈后置180℃烘烤8h；不耐高溫的器皿（如塑料制品）應(yīng)用2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高壓20min，再70～80

2.試劑：

(1)細胞裂解液：

異硫氰酸胍

4mol/L

檸檬酸鈉（pH7.0）

25mmol/L

十二烷基肌氨酸鈉

0.5%

RNA進行操作在分子生物學NorthernRNA的質(zhì)量。由于細胞RNA時要利用高濃度的蛋白RNA。再通過酚、氯仿等有RNA。在提取的過程中要RNase的環(huán)境RNase活RNase活性。RNA并通過電泳 進行鑒定。振蕩器、移液器、0.1% DEPC浸泡 因此提取必須在無凝膠成像系統(tǒng)、℃烘烤干燥方可使用。

β-巰基乙醇

0.1mol/L

稱取檸檬酸鈉0.64g，十二烷基肌氨酸鈉0.415g，吸取β-巰基乙醇0.7ml，用無Rnase的蒸餾水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，異硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)10×凝膠緩沖液：

嗎啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0）

200mmol/L

NaAc

EDTA(pH 8.0)

過濾除菌后避光保存。

（3）5×變性上樣緩沖液：

水飽和的溴酚藍

500mmol/LEDTA(pH 8.0)

甲醛（37%）

甘油

甲酰胺

10×凝膠緩沖液

加無RNase水至10ml，4℃可保存

（4）TRIzol RNA抽提試劑

（5）2mol醋酸鈉

（6）0.1% DEPC

(7)平衡酚：氯仿：異戊醇（（8）平衡酚、氯仿

（9）無水乙醇、70%乙醇、異丙醇

100mmol/L

10mmol/L

16μl

80μl

720μl

2ml

3084μl

4ml 3個月。25：24：1）

(10)無RNase水

三、操作步驟

（一）異硫氰酸胍法（PLT）

1.取新鮮動物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的細胞裂解液1ml,在冰浴中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細胞懸浮液吸入另一試管中。

2.加入2mol醋酸鈉（pH4.0）120μl，充分混勻。

3.加入1.2ml酚：氯仿：異戊醇，充分混勻搖振10s，冰浴15min。

4.將混合物轉(zhuǎn)移至1.5ml Ep管中，4℃，離心10 000r/min,20min.5.移取上層水相至另一Ep管中，加入等體積的異丙醇，靜置?C20℃，30min沉淀RNA.6.4℃，離心12 000r/min，15min.7.棄上清液，加入70%乙醇400μl,洗滌RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被懸浮，則4℃離心10 000r/min，10min。

8.棄上清液，自然干燥，但應(yīng)避免沉淀完全干燥，否則RNA難以溶解。

9.加入100μl無RNase水重懸RNA，或加1ml無水乙醇和1/10體積3mol醋酸鈉（pH4.0），?C70℃保存。

（二）TRIzol試劑提取RNA

1.取新鮮動物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的Trizol液 1ml 于玻璃勻漿器中，在冰浴中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細胞懸浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室溫下靜置5min。

2.加入200μl氯仿，劇烈振搖15s混勻后，室溫靜置3min。

3.4℃，10 000r/min離心15min，RNA分布于水相中。

4.將上層無色水相轉(zhuǎn)移到另一Ep管中，加入500μl 異丙醇，室溫靜置10min。

5.4℃，10 000r/min離心10min。

6.棄上清液，用1ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀物，4℃，7500r/min離心5min。

7.棄上清液，室溫干燥15min.45

8.向干燥過的沉淀物中加入200μl DEPC處理水（無核水）溶解沉淀物，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（三）RNA檢測

1.在紫外分光光度計上檢測RNA濃度及純度。

方法同實驗四，用DEPC處理水校正零點；用DEPC處理水稀釋RNA樣品；讀取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。

2.瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳檢測

（1）制備凝膠（1.2%）。稱1.2g瓊脂糖，加72ml DEPC處理水，加熱熔化。冷卻至60℃，在通風櫥內(nèi)加入10×凝膠緩沖液10ml，甲醛（37%）18ml，混勻后，倒膠。

（2）制備樣品。在離心管中，將RNA樣品與5×變性上樣緩沖液以4：1溫育5～10min，迅速在冰上冷卻5min，離心數(shù)秒。

（3）上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品卷入上樣孔。以5V/cm的電壓電泳2h.。

（4）待溴酚藍遷移至凝膠長度的2/3～4/5處結(jié)束電泳。將凝膠置于溴化乙啶溶液μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配制）中染色約30min。

（5）在凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析。

四、注意事項

1.RNA是極易降解的核酸分子。因此提取總RNA必須在無RNase 環(huán)境中，戴口罩、手套、使用無RNase污染的試劑、材料、容器。

2.所有溶液應(yīng)加DEPC至0.05%～0.1%，室溫處理過夜，然后高壓處理或加熱至小時或60℃過夜，以除去石油殘留的DEPC。

3.所用的化學試劑應(yīng)為新包裝，稱量時使用干烤處理的稱量勺，所有操作均應(yīng)在冰浴中進行，低溫條件可減低RNA酶活性。

4.根據(jù)RNA樣品的紫外吸收OD值，可計算出RNAd 濃度。

單鏈RNA [ssRNA]=40×（OD260-OD310）×稀釋倍數(shù)

純RNA OD260 / OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,說明有蛋白質(zhì)等污染，/氯仿在抽提。若比值低于2.0,表明有鹽、胍、糖可用LiCL選擇沉淀RNA以除去雜質(zhì)。

65℃1.5～（0.570℃ 1 應(yīng)用酚 混勻。

5.RNA樣品電泳后，可見28S、18S及5S小分子RNA條帶，則說明完整性好。若有降解可能是操作不當或污染了RNase.。28S和18S RNA比值約為2：1,表明RNA無降解。如比值逆轉(zhuǎn)，則表明RNA降解。電泳中如果在28S 后方還有條帶，表明有DNA污染，應(yīng)用DNase處理后再進行純化。

主要參考書：

1..金冬雁等譯.分子克隆實驗指南.第二版.北京：科學出版社，1995

2.子穎等譯.精編分子生物學實驗指南

3.周俊宜編.分子生物學基本技能和策略

4.姜泊等編.分子生物學常用實驗方法

5.劉進元等編.分子生物學實驗指導(dǎo)

.科學出版，.科學出版社.北京：人民軍醫(yī)出版社，.北京：清華大學出版社，47

1996.2002.

第五篇：分子生物學實驗室常用有毒藥品（定稿）

分子生物學實驗室有毒常用藥品

1.溴化乙錠（EB）：具有強誘變致癌性，使用時一定要戴一次性手套，注意操作規(guī)范，不要隨便觸摸別的物品。

2.DEPC(焦碳酸二乙酯):聞起來香香甜甜的,可是害人不眨眼!一種強有力的蛋白質(zhì)變性劑,而且懷疑是致癌劑.開瓶時將瓶子遠離你,內(nèi)壓可導(dǎo)致濺潑.操作時戴合適的手套,穿工作服,并在化學通風櫥里進行.3.PMSF(苯甲基磺酰氟):老板說是神經(jīng)毒！!是一種高強度毒性的膽堿酯酶抑制劑.它對呼吸道黏膜,眼睛和皮膚有非常大的破壞性.可因吸入,咽下或皮膚吸收而致命.戴合適的手套和安全眼鏡,始終在化學通風櫥里使用.在接觸到的情況下,要立即用大量的水沖洗眼鏡或皮膚,已污染的工作服丟棄掉.4.乙腈，易揮發(fā)易燃，是一種刺激物和化學窒息劑，通風櫥中遠離熱、火。5.放線菌素D，是一種致畸劑和致癌劑，通風櫥中操作。6.alpha-鵝膏蕈毒環(huán)肽，具有強毒性，可能致命。

7.NN-亞甲雙丙烯酰胺，有毒，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，切勿吸入粉末。8.甲醇，有毒，能引起失明。

9.乙酸（濃的）： 可能因為吸入或皮膚吸收而受到傷害，要戴手套和護目鏡，最好在化學通風櫥中操作。

10.過硫酸酸銨：對粘膜和上呼吸道、眼睛和皮膚又較大危害性，吸入可致命。操作時戴手套、護目鏡。始終在通風櫥中操作。

11.氯化銫：可因吸入、咽下或皮膚吸收而危害健康。操作時戴手套和護目鏡。

12.DTT: 很強的還原劑，散發(fā)難聞的氣味?？梢蛭搿⒀氏禄蚱つw吸收而危害健康。當使用固體或高濃度儲存液時，戴手套和護目鏡，在通風櫥中操作。

13.甲醛：毒性較大且易揮發(fā)，也是一種致癌劑，易通過皮膚吸收，對眼睛、粘膜和上呼吸道有刺激和損傷作用。避免一如其揮發(fā)的氣霧。戴手套和護目鏡。始終在通風櫥中操作。遠離熱、火花及明火。

14.TRIzol，對眼睛有刺激性，腐蝕皮膚。有一次不小心濺出一小滴在臉上，馬上就紅了，過一會兒感覺到疼，一周之后才好。如果濺上，馬上用大量的水沖洗。

大家在實驗室里，接觸到的化學試劑多半都有危害性，紫外燈，如果離心機不是很好的話的噪聲污染，VORTEX會導(dǎo)致手指需要震動，等等，所以每個人都應(yīng)該注意保護自己，而不能因為圖省事或者別的什么原因而放松對安全的注意。另外就是注意規(guī)范操作，搞微生物的尤其要注意，不要實驗室感染。

15.疊氮鈉，有毒，阻斷細胞色素電子運送系統(tǒng) 16.氟化鈉，有毒可致命，通風櫥中操作

17.放射性物質(zhì)（同位素標記時），要戴手套，護目鏡，穿工作服，最好買試劑盒（如果有商品化的）

18.beta-巰基乙醇，可致命，對呼吸道、皮膚和眼睛有傷害 19.氨甲蝶呤，致癌和致畸

20.甲醛，有毒，易揮發(fā)，致癌，對眼睛和呼吸道有刺激損傷，通風櫥中遠離熱和火

21.雙丙烯酰胺，神經(jīng)毒劑，效應(yīng)累積 22.二甲胂酸鈉，致癌，有毒 23.鏈霉素，致癌，引起過敏反應(yīng)

24.哌啶，有毒，對眼睛和呼吸道有影響，遠離熱和火 25.腐胺，易燃，有腐蝕性，遠離熱和火 26.硫酸鎳，致癌，引起遺傳損傷 27.肼，有毒，能爆炸，院里熱和火