第一篇：免疫組化對(duì)照設(shè)計(jì)

原則上講，所有實(shí)驗(yàn)都應(yīng)該設(shè)置陽性對(duì)照（用以檢驗(yàn)染色過程成功），陰性對(duì)照（用以檢驗(yàn)陽性結(jié)果為真陽性），空白對(duì)照（用以排除非特異背景染色）。不過，由于樣本選取的復(fù)雜性，國內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室以及國外多數(shù)小實(shí)驗(yàn)室，都無法做到規(guī)范的陰性對(duì)照，所以普遍以空白對(duì)照代替陰性對(duì)照，而這種方法也在國內(nèi)外得到承認(rèn)。1）空白對(duì)照：

第一抗體由PBS取代。2）嚴(yán)格的陰性對(duì)照： 用已知的確定不表達(dá)你所要檢測的抗原的其他組織的切片做陰性對(duì)照 3）回收實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照： 已知抗原與相應(yīng)的第一抗體混合，發(fā)生結(jié)合沉淀，再用此沉淀抗體復(fù)合物進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為陰性。

4）同型抗體替代對(duì)照： 用于第一抗體同種動(dòng)物的血清或非免疫IGg代替第一抗體結(jié)果為陰性。

5）自身對(duì)照 在同一切片上，應(yīng)將不同組織成分中的陰性結(jié)果與檢測的目的物對(duì)照比較 不過目前絕大多數(shù)人都是用PBS來代替一抗作為陰性對(duì)照，其實(shí)質(zhì)是空白對(duì)照，因?yàn)檫@樣做如果結(jié)果是陰性，也只是排除了二抗引起的非特異而已，但至于一抗是否會(huì)產(chǎn)生非特異，那只通過空白對(duì)照是不得而知的。因此你就必須做嚴(yán)格意義上的陰性對(duì)照。

第二篇：免疫組化經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

免疫組化

關(guān)鍵詞： 免疫 組織化學(xué) 細(xì)胞2012-03-30 14:41 來源：互聯(lián)網(wǎng) 點(diǎn)擊次數(shù)：14044 一，免疫組織化學(xué)簡介

免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)炕原進(jìn)行定性、定位、定量測定的一項(xiàng)新技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

二，免疫組化技術(shù)的基本原理

免疫組化技術(shù)是一種綜合定性、定位和定量；形態(tài)、機(jī)能和代謝密切結(jié)合為一體的研究和檢測技術(shù)。在原位檢測出病原的同時(shí)，還能觀察到組織病變與該病原的關(guān)系，確認(rèn)受染細(xì)胞類型，從而有助于了解疾病的發(fā)病機(jī)理和病理過程。

免疫酶組化技術(shù)是通過共價(jià)鍵將酶連接在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，再借酶對(duì)底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面及細(xì)胞內(nèi)各種抗原成分的定位，根據(jù)酶標(biāo)記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯(lián)法（多步法）等，用于標(biāo)記的抗體可以是用免疫動(dòng)物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強(qiáng)的高效價(jià)的單克隆抗體。直接法是將酶直接標(biāo)記在第一抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第二抗體上，檢測組織細(xì)胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。目前通常選用免疫酶組化間接染色法。

三，免疫組化步驟

1，切片，烤片60℃，1h；

2，脫蠟及復(fù)水

二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自來水1min，雙氧水1min；

3，1份30％H2O2加10份蒸餾水，室溫10min，蒸餾水洗3次，每次3min；

4，微波修復(fù)

將切片浸入0.01M枸櫞酸緩沖液，微波中最大火力（98℃-100℃）加熱至沸騰，冷卻（約5-10min），反復(fù)兩次；

5，將切片自然冷卻至室溫，PBS洗滌3次，每次5min；

6，封閉，5％BSA，室溫20min，甩去多余液體；

7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃過夜；

8，PBS洗滌3次，每次3min；

9，滴加二抗，37℃，15-30min；

10，PBS洗滌3次，每次3min；

11，滴加SABC，37℃，30min；

12，PBS洗滌3次，每次5min；

13，1ml蒸餾水中分別滴加顯色劑，混勻；

14，DAB顯色劑配置好后，滴加于切片，室溫，鏡下檢測反應(yīng)時(shí)間（約5min）；

15，自來水沖洗干凈，過蒸餾水；

16，蘇木素復(fù)染2min，自來水沖洗；

17，脫水

30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；

18，樹膠封片，鏡檢。

四，免疫組化常見問題分析

1，石蠟切片在染色過程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象

1）烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時(shí)間和提高烤片溫度；

2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做；

3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；

4）用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。

2，邊緣效應(yīng)

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致.解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。

3，產(chǎn)生組織切片非特異性染色

1）抗體孵育時(shí)間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條；

2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；

3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；

5）DAB孵育時(shí)間過長或濃度過高；

6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；

7）標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。

4，免疫組化染色呈陰性結(jié)果

1）抗體濃度和質(zhì)量問題以及抗體來源選擇錯(cuò)誤；

2）抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來打開抗原表位，以利于與抗體結(jié)合；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)；

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時(shí)間過長；

5）DAB孵育時(shí)間過短；

6）細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)；

7）開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問題。

5，背景

1，考慮一抗?jié)舛雀撸?/p>

2，然后調(diào)整DAB孵育時(shí)間；

3，也要考慮血清封閉時(shí)間是否過短；

4，適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長浸洗時(shí)間等。

第三篇：病理科免疫組化技術(shù)員培訓(xùn)

病理科免疫組織化學(xué)技術(shù)員培訓(xùn)及技術(shù)操作規(guī)范

一、病理科免疫組織化學(xué)技術(shù)員培訓(xùn)規(guī)范：

凡新入我科的病理技術(shù)員均需進(jìn)行免疫組化理論知識(shí)的學(xué)習(xí)、培訓(xùn)，經(jīng)考核合格、具備病理技術(shù)員技士資質(zhì)后方能從事免疫組織化學(xué)染色。

二、病理科免疫組織化學(xué)染色操作規(guī)范 1.免疫組織化學(xué)染色前的準(zhǔn)備事項(xiàng)(一)組織切片的制備

常規(guī)切片脫蠟至水（組織固定需用10%中性甲醛）(二)抗體的選擇、稀釋和保存

（1）選擇抗體應(yīng)先了解其反應(yīng)譜和適用條件〔包括適用切片(石蠟切片抑或冷凍切片)、稀釋度和溫育時(shí)間等〕。

（2）對(duì)于未曾使用過的新抗體，應(yīng)按照有關(guān)說明書的提示，以幾個(gè)不同的稀釋度對(duì)適宜檢材(已知陽性切片/涂片)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn);根據(jù)染色陽性表達(dá)的程度和檢材背景著色程度，確定用于染色的最適稀釋度

（3）抗體的原液應(yīng)于分裝后置于一20℃冷室中保存，切勿反復(fù)凍存(以免效價(jià) 降低)。（4）抗體的工作液可置于4℃冰箱中保存。（5）抗體的稀釋。

(1)一般用0.01M PBS(生理鹽水磷酸鹽緩沖液)，pH值7.2。(2)或用0.05M TBS(生理鹽水三經(jīng)基氨基甲烷緩沖液)，pH值7.6。(3)必要時(shí)可按需要加適量小牛血清清蛋白。(三)被檢測組織內(nèi)抗原的修復(fù)

（1）經(jīng)4%中性甲醛之類含醛基固定劑固定的組織，其切片中的抗原決定簇因醛的交聯(lián)作用而被封閉，從而影響抗原一抗體反應(yīng)。進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色前，對(duì)于組織切片進(jìn)行抗原修復(fù)處理，會(huì)使組織中的固有抗原盡量多地暴露出來，提升了大部分檢測抗體的陽性率和反應(yīng)強(qiáng)度。有的抗體不需要進(jìn)行抗原修復(fù)。應(yīng)按抗體試劑說明書的提示決定是否進(jìn)行被檢測組織內(nèi)的抗原修復(fù)。（2）抗原修復(fù)緩沖液。

(l)一般為0.01M檸檬酸緩沖液(2.1g檸檬酸溶于100ml蒸餾水中，用2M NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.0)。(2)有些抗體需要特殊修復(fù)緩沖液，如高PH值的EDTA(50mM Tris.，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的該高，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的該高pH修復(fù)液等。（3）抗原修復(fù)的常用方法。(l)胰蛋白酶消化法: ①組織切片脫蠟、水化。

②滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于組織切片上。

③37℃下溫育20-40min(溫育時(shí)間取決于組織經(jīng)4%中性甲醛固定時(shí)間的長短和被檢測抗原)。

④蒸餾水沖洗，終止反應(yīng)。

⑤阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。

⑥進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。（配制0.1%胰蛋白酶液時(shí)，應(yīng)將0.1g胰蛋白酶溶于0.1%無水氯化鈣水溶液(pH值7.8)中。）

（2)胃蛋白酶消化法: ①組織切片脫蠟、水化.②滴加胃蛋白酶工作液于組織切片上。

③37℃下溫育10-30min(一般為10min，可延至30min，取決于組織經(jīng)4%中性甲醛固定時(shí)間的長短).④浸人蒸餾水，終止反應(yīng)。

⑤進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用1%胰蛋白酶液37℃下處理20min。(應(yīng)以 0.1M HCI配制胃蛋白酶工作液。過度的胃蛋白酶消化會(huì)使組織結(jié)構(gòu)破壞、切片 脫落。)（3)微波修復(fù)抗原法: ①組織切片脫蠟、水化(硅化玻片或經(jīng)防脫片膠處理的玻片)。

②將組織切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修復(fù)液 200ml，蓋上具有小孔的蓋子。

③將該容器置于微波爐(705-800W)中央加熱(95℃)5min，2次(于兩次之間，應(yīng)向容器中添加蒸餾水50ml，嚴(yán)防組織切片干燥)。

④將該容器移出微波爐，置于室溫下冷卻15-20min。

⑤蒸餾水沖洗。

⑥阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，而后將切片置于蒸餾水中。

⑦用TBS或 PBS液沖洗。⑧進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。(4)熱水浴法: ①組織切片脫蠟、水化(硅化玻片或經(jīng)防脫片膠處理的玻片)。

②向裝組織切片的容器加人足量(例如200ml)抗原緩沖液，置于水浴鍋中，加熱至95-99℃(不沸騰)預(yù)熱。

③將組織切片插人已預(yù)熱的容器內(nèi)，溫育20-40min。

④將該容器由微波爐移出，置于室溫下冷卻20min。⑤室溫下，用TBS、PBS或水洗。

⑥蒸餾水沖洗。

⑦阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，而后將切片置于蒸餾水中。

⑧用TBS或PBS液沖洗。

⑨進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

（5)壓力鍋法: ①組織切片脫蠟、水化(硅化玻片或經(jīng)防脫片膠處理的玻片)。

②向4-5.5L的不銹鋼壓力鍋中加人抗原修復(fù)緩沖液(約為鍋容積的2/3)，不加閥情況 下加熱至沸騰。

③將組織切片插放于金屬切片架上，并置于壓力鍋內(nèi)沸騰的緩沖液中。

④加閥情況下，將組織切片加壓2min。

⑤壓力鍋?zhàn)孕欣鋮s或以流水冷卻減壓后，持續(xù)20min。

⑥將冷卻后的切片取出，蒸餾水沖洗后，置于TBS或PBS液中(以免組織切片干燥)。

⑦蒸餾水沖洗。

⑧阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，而后將切片置于蒸餾水中。

⑨用TBS或PBS液沖洗。

⑩進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

（四）組織切片中內(nèi)源性酶的阻斷

1.內(nèi)源性過氧化物酶 主要存在于紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞了嗜酸性粒細(xì)胞和組織內(nèi)。阻斷方法:最常用0.3%-0.5%H2O2-甲醇液，作用15-30min，阻斷液必須使用時(shí)新鮮配制。由于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶常同時(shí)導(dǎo)致被測抗原變性(使特異性著色減弱)，而大部分組織不含有內(nèi)源性過氧化物酶，所以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶一般不必作為常規(guī)步驟。必須阻斷內(nèi)源性過氧化物酶時(shí)，可安排在第一抗體反應(yīng)后進(jìn)行，以減少抗原的破壞。2.內(nèi)源性堿性磷酸酶 主要存在于嗜中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。阻斷方法:應(yīng)用1M左旋咪唑，作用15-30min。

3.內(nèi)源性生物素 肝、胰、腎等的細(xì)胞內(nèi)含有多量生物素或類生物素物質(zhì)。阻斷方法:先將切片浸于卵白素(0.5μg/ml)中15min，以緩沖液洗凈后，移浸于生物素飽和溶液中15min，再用緩沖液洗去多余的生物素飽和液;也可應(yīng)用商供的阻斷試劑盒(按說明書操作)。(五)正常血清保護(hù)

作為檢測試劑的抗體蛋白帶有一定的負(fù)電荷，免疫組織化學(xué)染色時(shí)，易與帶有正電荷的組織〔特別是纖維組織、變性和(或)壞死的細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等〕發(fā)生靜電吸引而導(dǎo)致非特異性染色。去除這種非特異性染色最有效的方法是，在滴加第一抗體前，先滴加用于制備第二抗體動(dòng)物的非免疫血清或是滴加除制備第一抗體動(dòng)物以外的其他動(dòng)物非免疫血清，濃度為1：5-1：20;必要時(shí)可滴加2%-5%牛 血清清蛋白。正常血清保護(hù)作用時(shí)間10-20min。用于阻斷非特異性結(jié)合的血清不能有明顯的溶血。(六)緩沖液

用于稀釋抗體，洗滌切片的緩沖液主要有兩種。1.TBS(0.05M，pH7.6)，Tris一HCl緩沖液(0.SM，pH 7.6)100ml 8.5%NaCl 100ml 蒸餾水加至 1000ml Tris一HCI緩沖液(0.5M，pH7.6)三經(jīng)甲基氨基甲烷(Tris)61g HCl 37ml 蒸餾水加至 1000ml 2．PBS(0.IM，pH 7.6)Na2 HPO4 · 12H2O2 29g NaH2PO4 · 2H2O 3g NaCl 85g 蒸餾水加至 1000ml 使用時(shí)用蒸餾水稀釋10倍即成0.0lM。

二、免疫組織化學(xué)染色常用方法(一)直接法 1.脫蠟和水化。

2.3%過氧化氫或0.5%過氧化氫甲醇液，5min。

3.TBS或PBS緩沖液洗滌。4.抗原修復(fù)。

5.無關(guān)動(dòng)物正常血清(適當(dāng)稀釋)20-30min。

6.甩去正常動(dòng)物血清，滴加適當(dāng)稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，或增強(qiáng)的酶標(biāo)多聚物一步法(Enhanced Polymer One-step Staining，EPOS)抗體于切片上，20-60min。7.TBS或PBS緩沖液洗滌。

8.0.04%-0.05%DAB(二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸)H2O2液顯色5-10min，鏡下觀察控制顯色時(shí)間。底物配法:DAB 40-50mg；0.05M TBS(pH 7.6)l00ml；3% H2O2 100-200ml。9.緩沖液洗，流水洗滌。10.蘇木精淡染細(xì)胞核。11.脫水，透明，封片。(二)間接法

l-5步同“直接法”。

6.滴加第一抗體于切片上，濕盒內(nèi)溫育30-60min。7.TBS或PBS緩沖液洗滌。

8.HRP標(biāo)記抗體或用增強(qiáng)的酶標(biāo)記多聚物(Enhanced Labeled一 Polymer Sys-tem，ELPS)抗體滴加切片上，濕盒內(nèi)溫育30min。9-14步同“直接法”的7-11步。(三)過氧化物酶一抗過氧化物酶(PAP)法 1-5步同直接法。

6.適當(dāng)稀釋的第一抗體，濕盒內(nèi)溫育30-60min。7.緩沖液洗滌。

8.第二抗體，濕盒內(nèi)溫育30min。9.緩沖液洗滌。

10.滴加PAP，濕盒內(nèi)溫育30min。11-15步同“直接法”的7-11步。

雙PAP法:上述操作進(jìn)行到第10步后，再重復(fù)7-10步1次，然后繼續(xù)11-15步。(四)葡萄球菌A蛋白(SPA)免疫酶法 1-5步同“直接法”。

6.第一抗體，濕盒溫育30-60min。7.緩沖液洗滌。

8.酶聯(lián)SPA，濕盒溫育30min。9.緩沖液洗滌。

10-13步同“直接法”的8-11步。(五)ABC法和SABC法

ABC法是卵白素-生物素-酶復(fù)合物(Avidin--Biotin--Peroxidase Complex)法的簡稱。SABC法是鏈霉卵白素-生物素-酶復(fù)合物(Streptavidin一Biotin一peroxidase Complex)法的簡稱。

l-5步同“直接法”。

6.第一抗體，濕盒溫育30-60min.7.緩沖液洗滌。

8.生物素化的第二抗體，30min。9.緩沖液洗滌。

10.ABC復(fù)合物或SABC復(fù)合物(皆于使用前新鮮配制)，30-60min。11-15步同“直接法”7-11步。(六)LSAB(SP)法

LSAB(SP)法，是標(biāo)記的鏈酶卵白素-生物素(Labeled Streptavidin--Biotin)法的簡稱，操作步驟同“ABC法”，只是以LSAB復(fù)合物替代ABC復(fù)合物。(七)CSA法

CSA法是催化信號(hào)放大(Catalyzed Signal Amplifieation)法的簡稱。1-5步同“直接法”。6.第一抗體，15-30min。7.緩沖液洗滌。

8.生物素標(biāo)記的第二抗體，15-30min。9.緩沖液洗滌。

10.鏈霉卵白素-生物素-HRP復(fù)合物(用前新鮮配制)，15min。11.緩沖液洗滌。12.放大液，15min。13.緩沖液洗滌。

14.HRP-StrePtavidin，15min。15-19步同“直接法”的7-11步。(八)二步法Envision System Envision是通過一個(gè)多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個(gè)多聚體。1-5步同“直接法”。6.第一抗體，30-60min。7.緩沖液洗滌。

8.Envision TM，10-30min。9-13步同“直接法”的7-11步。(九)雙重免疫組織化學(xué)法.Sequential(1)鼠或兔抗體1，30-60min。

(2)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/HRP，30 min。(3)DAB(棕色)，2-10 min。(4)鼠或兔抗體2，30-60 min。

(5)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/AP，30 min。(6)AP(紅色)。2.Simnl一Aaneous(1)混合鼠抗體1和兔抗體2，4℃，過夜或60 min。(2)Envision TM羊抗鼠/HRP和羊抗兔/AP。(3)AP染色。(4)HRP染色。

上述方法除注明溫度者外，均可在室溫(20-25℃)環(huán)境中進(jìn)行;第一抗體溫育后，如有必要可置于4℃ 下過夜。

三、免疫組織化學(xué)染色的常用抗體標(biāo)記物(一)上皮源性標(biāo)記物 1.一般性標(biāo)記物

（1）CK(角蛋白)CK亞型:①CK5/6;②CK7;③CK8;④CK10/13;⑤CK18;⑥CK19;⑦CK20。(2)EMA(上皮細(xì)胞膜抗原)。

2.特異性和(或)相對(duì)特異性上皮標(biāo)記物

（1）CEA(癌胚抗原，標(biāo)記胃癌、大腸癌).（2）CA242(腫瘤相關(guān)粘液抗原，標(biāo)記胰腺癌、大腸癌)。

（3）TG(甲狀腺球蛋白，標(biāo)記甲狀腺癌).（4）PSA(前列腺特異性抗原，標(biāo)記前列腺癌)。

（5）PSAP(前列腺特異性酸性磷酸酶，標(biāo)記前列腺癌).（6）34βE12(標(biāo)記前列腺底細(xì)胞).（7）AFP(甲胎蛋白，標(biāo)記肝癌、內(nèi)胚竇癌).（8）Hepatoeyte(標(biāo)記肝細(xì)胞癌)。

(9)β-HCG(β-絨毛膜促性腺激素，標(biāo)記胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞腫瘤、生殖細(xì)胞腫瘤).（10）CA125(卵巢癌).（二)間葉源性標(biāo)記物

主要是Vimentin(vim，波形蛋白)等.（三）肌源性標(biāo)記物 1.Desmin(Des，結(jié)蛋白)2.Actin(肌動(dòng)蛋白）.3.SMA(平滑肌肌動(dòng)蛋白).4.MSA(肌特異性肌動(dòng)蛋白).5.Myosin(肌球蛋白).6.Myoglobin(MG，肌紅蛋白)7.Myogen(肌漿蛋白).8.MyoDI(肌調(diào)節(jié)蛋白).(四)血管源性標(biāo)記物 FⅧRAg(第8因子相關(guān)抗原).CD31 CD34 UEA-l BNH9.(五)組織細(xì)胞源性標(biāo)記物 1.CD68/KP-l.2.Lysozyme(溶菌酶)。3.a1-AT(a1-抗胰蛋白酶).4.a1-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)5.Mac387.淋巴造血組織源性標(biāo)記物 1.全淋巴細(xì)胞

(1)CD45/LCA(白細(xì)胞共同抗原）。(2)TdT(末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶)。(3)CD30/Ki-1。2.全B細(xì)胞(1)Igκ。(2)Igλ。(3)CD20/L26。(4)CD79a。

(5)BLA36(B淋巴細(xì)胞抗原)。3.B細(xì)胞亞型(1)CDl0。

(2)CD21(標(biāo)記濾泡性樹突狀細(xì)胞)。(3)CD23。

(4)CD35(標(biāo)記濾泡性樹突狀細(xì)胞)。(5)CD38.4.全T細(xì)胞(1)CD3。(2)CD5。(3)CD43。(4)CD45RO/UCHL-1.5.T細(xì)胞亞型(1)CDla。(2)CD4。(3)CD8。6.NK細(xì)胞(1)CD56。(2)CD57/Leu-7。(3)CD16/Leu-11。7.粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞(1)CD11c/LeuM5。(2)CD15/LeuM5。(3)Lysozyme(溶菌酶)。(4)al-AT(al-抗胰蛋白酶)。(5)al-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)。(6)CD68.(7)S-100蛋白.(8)Mac387。8.其他

(1)EMA(上皮細(xì)胞膜抗原).(2)CD99(尤因肉瘤標(biāo)記物).(3)ALK-l(間變性淋巴瘤激酶)。(4)HLA-DR。(5)Bel-2。(6)Bel-6。(7)Bel-10。(8)Ki-67。

(9)CyclinD1(周期素D1)。(10)CD25。

(11)CD34。

（七）神經(jīng)源性標(biāo)記物 1.S-100蛋白.2.NSE（神經(jīng)原特異性烯醇化酶）.3.Leu7。

4.Neurofilament(NF，神經(jīng)微絲蛋白)。5.GFAP(膠質(zhì)纖維酸性蛋白）

（八）神經(jīng)內(nèi)分泌源性標(biāo)記物 1.激素標(biāo)記物(1)CA(兒茶酚胺)。(2)5-HT(5-經(jīng)色胺).(3)垂體激素。

①GH(促生長素)。

②PRL(催乳素)。

③ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素).④TSH(促甲狀腺素).⑤FSH(促濾泡素).⑥LH(促黃體素)。(4)甲狀腺。

①TG(甲狀腺球蛋白)。

②CT(降鈣素)。

(5)甲狀旁腺:PTH(甲狀旁腺素)。(6)胰島。

①Insulin(胰島素)。

②Glueagon(胰高糖素)。

③VIP(舒血管腸肽).④PP(胰多肽).⑤Someitostatin(生長抑素)。

⑥Gastrin(胃泌素)。2.非激素標(biāo)記物

(1)NSE(神經(jīng)原特異性烯醇化酶).(2)CgA(嗜鉻素A).(3)SY(突觸素).3.激素受體（1）ER(雌激素受體）.（2）AR(雄激素受體）.（3）PR(孕激素受體).(九)細(xì)胞增殖標(biāo)記物 1.PCNA(增殖細(xì)胞核抗原).2.Ki-67.（十）黑色素標(biāo)記物 1.S-100蛋白.2.HMB45.3.Melanoma。

(十一）癌基因和（或）抑癌基因 1.bel-2.2.c-erbB-2.3.p53 4.p16(多腫瘤抑制基因)。5.nm23。(十二)病原體標(biāo)記物

1.Myoeobaeterium Bovis(分枝桿菌，抗卡介苗)。2.HBsAg(乙型肝炎病毒表面抗原).3.HBcAg(乙型肝炎病毒核心抗原).4.HPV(人乳頭狀瘤病毒)5.HTLV-1(人類T細(xì)胞白血病病毒)。

第四篇：免疫組化常用方法介紹及個(gè)人經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

免疫組化常用方法介紹及個(gè)人經(jīng)驗(yàn)總結(jié)、定義

用標(biāo)記的特異性抗體對(duì)組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中某些化學(xué)成分的分布和含量進(jìn)行組織和細(xì)胞原位定性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）技術(shù)。

2、原理

根據(jù)抗原抗體反應(yīng)和化學(xué)顯色原理，組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的抗原先和一抗結(jié)合，再利用一抗與標(biāo)記生物素、熒光素等的二抗進(jìn)行反應(yīng)，前者再用標(biāo)記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結(jié)合，最后通過呈色反應(yīng)或熒光來顯示細(xì)胞或組織中化學(xué)成分，在光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物，從而能夠在細(xì)胞爬片或組織切片上原位確定某些化學(xué)成分的分布和含量。、分類

1）按標(biāo)記物質(zhì)的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標(biāo)法和免疫金銀法等。2）按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。

3）按結(jié)合方式可分為抗原-抗體結(jié)合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）法等，其中 SP 法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內(nèi)源性生物素含量高的組織抗原檢測。、目前幾種常用免疫組化方法簡單介紹 1）免疫熒光方法

是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣。

2）免疫酶標(biāo)方法

免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于 60 年代發(fā)展起來的技術(shù)?；驹硎窍纫悦笜?biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。

本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)點(diǎn)是：定位準(zhǔn)確，對(duì)比度好，染色標(biāo)本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。

免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，且隨著方法的不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的有 ABC 法、SP 三步法、即用型二步法檢測系統(tǒng)等。

3）免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。、被檢測的物質(zhì)

組織或細(xì)胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測。、特點(diǎn)

1）特異性強(qiáng)。免疫學(xué)的基本原理決定抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細(xì)胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA 顯示淋巴細(xì)胞成分。只有當(dāng)組織細(xì)胞中存在交叉抗原時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

2）敏感性高。在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術(shù)，那時(shí)的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于 ABC 法或 SP 三步法的出現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細(xì)胞中與抗原結(jié)合，這樣高敏感性的抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法越來越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。

3）定位準(zhǔn)確、形態(tài)與功能相結(jié)合。該技術(shù)通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織和細(xì)胞中進(jìn)行抗原的準(zhǔn)確定位，因而可同時(shí)對(duì)不同抗原在同一組織或細(xì)胞中進(jìn)行定位觀察，這樣就可以進(jìn)行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對(duì)病理學(xué)領(lǐng)域開展深入研究是十分有意義的。、從蛋白水平檢測角度，免疫組化技術(shù)與 Western blotting、ELISA 的異同

1）Western blotting：蛋白質(zhì)免疫印跡，也是利用抗體抗原反應(yīng)原理，結(jié)合化學(xué)發(fā)光等技術(shù)來檢查組織或細(xì)胞樣品內(nèi)蛋白含量的檢測方法。與免疫組化技術(shù)相比，定量可能更加準(zhǔn)確；當(dāng)然 Western blotting 也可定性和定位（通過提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量，進(jìn)而間接反映它們的定位），但敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于免疫組化技術(shù)。

2）ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，也是利用抗體-抗原-抗原結(jié)合反應(yīng)原理來檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測。與免疫組化技術(shù)相比，定量最準(zhǔn)確，是分泌性蛋白檢測首選方法之一。

8、免疫組化個(gè)人經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

1、方法操作不難，最大的難處是出現(xiàn)異常結(jié)果時(shí)如何解決？這就需要掌握免疫組化實(shí)驗(yàn)原理，每一步知道為什么這樣做，這樣你才敢大膽地改革先前的不對(duì)的方法步驟。如抗體孵育條件主要是抗體濃度、溫度、時(shí)間，這三者一般是相互成反比的（相對(duì)），其中濃度是最重要的先決條件，溫度決定反應(yīng)的速度、時(shí)間決定反應(yīng)的量。就拿溫度來說，可以有 4 度、室溫、37 度，我推薦4 度最佳，反應(yīng)最溫和，背景較淺；而 37 度反應(yīng)速度較快，時(shí)間較短；室溫我不太提倡，除非你每次都把環(huán)境溫度控制在一定的范圍，否則，盡量選擇前兩者。

2、免疫組化最大的優(yōu)勢是定位和定性。相比于其他蛋白檢測方法，免疫組化具有定性靈敏度高、定位較直接準(zhǔn)確，是定位檢測分析首選方法。尤其對(duì)于有些因子的轉(zhuǎn)位研究十分有用。

3、免疫組化結(jié)果定量分析的前提是高質(zhì)量的染色切片。免疫組化結(jié)果也能定量分析，但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下，分析最為準(zhǔn)確，這種原則可能也是我們?nèi)粘徃鍟r(shí)判定研究結(jié)果的必備條件。

4、免疫組化實(shí)驗(yàn)一定要設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽性對(duì)照一般是用肯定表達(dá)這種抗原的切片來做；陰性對(duì)照一般是用 PBS 或非一抗替代一抗來進(jìn)行反應(yīng)，其余步驟均一致。前者是排除方法和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有無問題；后者是排除有無一抗外的非特異性染色。

5、免疫組化的應(yīng)用廣泛，是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)研究的最重要方法之一。如今發(fā) SCI 論文時(shí)，明顯感覺僅靠量化的數(shù)據(jù)來發(fā)文章很難，加一些形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)或圖片，老外十分歡迎，可能是怕你學(xué)術(shù)造假吧。當(dāng)然也不能做假陽性或假陰性結(jié)果。

6、免疫組化技術(shù)掌握與否的鑒定標(biāo)準(zhǔn)是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出優(yōu)良的染色切片。

免疫組化技術(shù)掌握與否的鑒定標(biāo)準(zhǔn)是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出優(yōu)良的染色切片。我在平時(shí)帶教中就發(fā)現(xiàn)許多研究生把我已經(jīng)摸索很成熟的反應(yīng)條件、濃度、方法步驟，重復(fù)運(yùn)用于同一性質(zhì)的切片和同一種抗體，做出來后就覺得自己已經(jīng)掌握了免疫組化方法，更換一種抗體后，居然連二抗的種屬來源都拿錯(cuò)了。失敗往往促進(jìn)你去思考試驗(yàn)原理和過程，成功有時(shí)也加快你自傲。

7、實(shí)驗(yàn)方法需要?jiǎng)邮? 動(dòng)腦。如今我還不敢說我在免疫組化什么都知道。我只所以今天敢在這里說這說那，這是因?yàn)槲医?jīng)過了反復(fù)的動(dòng)手+動(dòng)腦，把理論原理運(yùn)用于實(shí)踐，在把實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)的問題帶到理論知識(shí)中去解決，最終把理論與實(shí)踐融會(huì)貫通。

第五篇：病理切片與免疫組化個(gè)人經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

免疫組織化學(xué)中對(duì)載波片和蓋波片的處理

（一）載波片的清潔

進(jìn)行免疫組化染色必須保證載波片的潔凈否則常導(dǎo)致非特異性染色和組織脫片現(xiàn)象的出現(xiàn)而新的載波片常有油污等可能影響免疫組化染色的異物。因此必須對(duì)載波片進(jìn)行清潔工作。常用的載波片清潔液是用重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水以不同比例混合配成不同強(qiáng)度的清潔液。

1． 常用清潔液的配制方法：

1．1重鉻酸鉀：濃硫酸：蒸餾水=1：1：10 重鉻酸鉀10g., 濃硫酸10ml, 蒸餾水100ml 1.2重鉻酸鉀：濃硫酸：蒸餾水=2：3：25 1.3重鉻酸鉀：濃硫酸：蒸餾水=2：5：25 2載波片的清潔方法

1。1先將載波片用清潔液浸泡12-24h 1．2流水沖洗后再用蒸餾水清洗3-5遍 1。3 95%的酒精中浸泡2h，用紗布擦干

1．4放入60℃烤箱中烤干或者自然晾干儲(chǔ)存在玻片盒內(nèi)備用

（二）載玻片的表面處理

在免疫組化試驗(yàn)中由于實(shí)驗(yàn)操作步驟的繁多常引起組織切片或者細(xì)胞涂片的脫落，影響檢測效果，因此常需要用粘附濟(jì)對(duì)切片進(jìn)行處理。

1APES黏附劑APES是一種新型玻片黏附劑它的黏附劑機(jī)制是通過對(duì)玻璃表面的化學(xué)修飾改變玻璃表面的化學(xué)物理特性使組織切片活細(xì)胞成分牢固的貼附于玻璃表面不易脫落并可長期保存。是目前應(yīng)用最多的組織黏附劑。

1．1APES工作液配制APES1ml丙酮50ml，混勻即可。

1．2切片處理方法1。1。1干警的切片放入盛有丙酮的染色缸中浸泡5min 1．1．2浸入APES工作液停留20-30s 1．1．3純丙酮洗2次1。1。4放入烤箱37℃過夜1。1。5用干凈玻片盒裝好室溫保存?zhèn)溆靡话憧纱娣虐肽暌陨?/p>

2多聚賴氨酸（poly-l-lycine.pll）多聚賴氨酸水溶液是一種良好的組織黏附劑使用濃度在0。005-0。01％但是由于價(jià)格較高在免疫組化中很少用。1．1多聚賴氨酸儲(chǔ)備液的配制，將0.5g多聚賴氨酸充分溶于100 ml蒸餾水中，4℃或者-20℃保存?zhèn)溆茫╬ll可反復(fù)水融）工作液可將pll原液稀釋10-50倍使用 1。2切片的處理方法

1。1。1干凈干燥切片浸入pll工作液，停留20-30s 1.1.3用干凈玻片盒裝好，室溫保存?zhèn)溆靡话憧纱娣虐肽暌陨?/p>

（三）蓋波片的處理

蓋波片的處理方法如上,處理時(shí)間可適當(dāng)縮短,清潔液浸泡2h即可（摘自常雙鎖主編醫(yī)學(xué)常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)精編）

石蠟切片微波修復(fù)抗原染色程序

1載玻片防脫片劑處理：可選擇APES或poly-l-lycine。撈片后置烤箱58-60℃30-60分鐘以上使切片緊密黏附 2． 切片常規(guī)脫蠟至水

3．30％H2O2+蒸餾水10份混合，室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次 4．熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01M購船酸鹽緩沖液中（PH6。0），電路或微波爐加熱之沸騰后斷電間隔5-10分鐘后，反復(fù)1-2次。冷卻后PBS（PH7。2-7。6）洗1-2次。5滴加5％BSA封閉液室溫20分鐘，甩去多余液體不洗。6滴加適當(dāng)稀釋的抗（小鼠或兔IgG）.37℃1h左右或20℃時(shí)左右，也可4℃過夜，PBS（PH7。2-7。6）洗2分鐘×3次。（一抗的稀釋度孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來說陽性染色強(qiáng)度不夠時(shí)可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時(shí)間背景過高時(shí)可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時(shí)間）

7．滴加生物素化山羊抗小鼠IgG（或兔、人IgG），20-37℃20分鐘PBS（PH7。2-7。6）洗2分鐘×3次。

8滴加試劑SABC,20-37℃20分鐘.PBS（PH7。2-7。6）洗5分鐘×4次.9.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒（AR1022）。取蒸餾水1ml加試劑盒中A,B,C試劑各1滴,混勻后加至切片,室溫顯色,鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,一般在5-30分鐘之間.也可自配顯色劑顯色。蒸餾水洗滌。

0．02M PBS（PH7。2-7。6）配法：

1000ml蒸餾水中加氯化鈉8.5g,Na2HPO42.8g, Na2H2PO40.4g.如果用的是含水磷酸鹽，應(yīng)加上分子式中水的含量。

0．02M枸椽酸鹽緩沖液：1000ml蒸餾水中加枸椽酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）3g, 枸椽酸（C6H8O7·H2O）0.4g 注意事項(xiàng)：

如果染色背景較高，在SABC反應(yīng)之后，DAB顯色之前，用加水0。01-0。02％TWEEN20的PBS（PH7。2-7。6）洗滌切片4次，單純PBS洗2次，然后顯色。

以上摘自武漢博士德生物工程有限工程公司所產(chǎn)的即用型SABC免疫組化染色試劑和使用說明書。

HE染色方法

1二甲苯I脫蠟10-15min 2二甲苯II脫蠟10-15min 3無水乙醇脫二甲苯1min×2次 4.95％乙醇 5.90％乙醇 6.85％乙醇 7自來水洗2min 8蘇木蘇染色1-5 min 9自來水洗1 min 10.0.5％-1％鹽酸乙醇分化20S 11自來水洗1min 12稀氨水（1％）返藍(lán)數(shù)秒，自來水或蒸餾水洗1 min 13尹紅染色1-5 min 14自來水洗

15.85％乙醇脫水20S 16.90％乙醇30S 17.95％乙醇I 1 min 18.95％乙醇II 1 min 19.無水乙醇I 2min 20.無水乙醇II2min 21二甲苯I 2min 22二甲苯II2min 23二甲苯III2min 24中性樹膠或加拿大樹膠封固。結(jié)果：

細(xì)胞核呈藍(lán)色，鈣鹽和各種微生物呈藍(lán)染色或紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)，肌纖維，纖維結(jié)締組織，紅細(xì)胞和嗜尹紅顆粒呈不同程度的紅色。摘自梁曉俐主編病理學(xué)基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)