精細化學品分析實驗

實驗

薄層色譜-染料的分離和鑒別

一、實驗?zāi)康膶W習薄層板的制備方法和操作技術(shù)。

二、實驗原理

1．吸附薄層色譜的原理及作用

吸附薄層色譜的作用原理與吸附柱色譜相同，其區(qū)別在于吸附薄層色譜所用吸附的粒度較細小，且不是裝在柱中，而是被均勻地涂布于玻璃板、塑料板或金屬箔。形成一定厚度的薄層。被分離的樣品制成溶液用毛細管點在薄層上靠近一端處，作為流動相的溶劑（稱為展開劑）則靠毛細作用從點有樣品的一端向另一端運動并帶動樣點前進。經(jīng)過反復(fù)多次才吸附和溶解競爭后，受吸附力較弱而溶解度較大的組分將行進較長的路程。反之，吸附較強或溶解度較小的組分則行程較短、從而使各組分間拉開距離。用刮刀分別刮下各組分的色點（或色帶），各自以溶劑萃取。再蒸去溶劑后即得各組分的純品。

吸附薄層色譜可用于少量（一般為0.5g以下）物質(zhì)的分離，但更多應(yīng)用于化合物的鑒定和其他分離手段的效果檢測。

作為檢測手段的理論依據(jù)是同種分子在極性、溶解度、分子大小和形狀等方面完全相同，因而在薄層色譜中隨展開劑爬升的高度亦應(yīng)相同；不同種分子在這諸方面中總會有一些細微的差別，因而其爬升高度不會完全相同。如果將用其他分離手段所得的某一個組分在薄層板上點樣展開后仍為一個點，則說明該組分為同種分子。

即原來的分離方法達到了預(yù)期效果：如果展開后變成了幾個斑點，則說明該組分中仍有數(shù)種分子，即原分離手段未達到頂期效果。

吸附薄層色譜作為化合物鑒定的手段，其理論依據(jù)是每種化合物都有自己特定比移值。比移值也叫Rf值，是在薄層色譜中化合物樣點移動的距離與展開劑前沿移動距離的比值，即

例如，在下圖所示的薄層板上，（b）中由A、B兩種化合物組成的混合溶液被點在起始線上，用展開劑展開后，展開劑前沿爬升的高度為10，化合物A爬

升高度為7，則化合物A的Rf值是0.7。同理，化合物B的Rf值是0.4。

影響Rf值的因素很多，包括吸附劑的種類、活性等級、粒度、展開劑、溫度等。因此即使同一化合物要在不同薄層板上重現(xiàn)統(tǒng)一Rf值很困難，因此僅憑Rf值來鑒定未知化合物是不可取的、還是應(yīng)該用已知化合物在同一塊薄層板上點樣作對照比較可靠。如上圖（C）所示，可以認為D和E為同一化合物，C則與D和E不同。

薄層色譜吸附劑常見的有硅膠和氧化鋁兩類。薄層色譜用的硅膠分為：“硅膠H—不含膠勁劑；‘硅膠G’一含煅石膏膠黏劑；“硅膠HF254”一含熒光物質(zhì)（可用于波長為

254nm紫外光下觀察熒光）；“硅膠

GF254”一既含煅石膏又含熒光劑等類型。

與硅膠相似，氧化鋁也因含黏合劑或含熒光劑而分為氧化鋁G、氧化鋁HF254、氧化鋁GF254

2．薄層色譜的用途

在實驗室中，薄層色譜主要用于以下幾種目的。

①作為柱色譜的先導。一般說來，使用某種固定相和流動相可以在柱中分

開的混合物，使用同種固定相和流動相也可以在薄層板上分離開。所以常利用薄層色譜為柱色譜選擇吸附劑和淋洗劑。

②監(jiān)控反應(yīng)進程。在反應(yīng)過程中定時取樣，將原料和反應(yīng)混合物分別點在同一塊薄層板上，展開后觀察樣點的相對濃度變化。若只有原料點，則說明反應(yīng)沒有進行；若原料點很快變淡，產(chǎn)物點很快變濃，則說明反應(yīng)在迅速進行。若原料點基本消失，產(chǎn)物點變得很濃，則說明反應(yīng)基本完成。

③檢測其他分離純化過程。在柱色譜、結(jié)晶、萃取等分離純化過程中，將

分離出來的組分或純化所得的產(chǎn)物溶樣點板，展開后如果只有一個點，則說明已經(jīng)完全分離開了或已經(jīng)純化好了；若展開后仍有兩個或多個斑點，則說明分離純化尚未達到預(yù)期的效果。

④確定混合物中的組分數(shù)目。一般說來，混合物溶液點樣展開后出現(xiàn)幾個樣點，就說明混合物中有幾個組分。

⑤確定兩個或多個樣品是否為同一物質(zhì)。將各樣品點在同一塊薄層板上展開后若各樣點上升的高度相同，則大體上可以認定為同一物質(zhì)，若上升高度不同則肯定不是同一物質(zhì)。

⑥根據(jù)薄層板上各組分斑點的相對濃度可粗略地判斷各組分的相對含量。

⑦迅速分離出少量純凈樣品。為了盡快從反應(yīng)混合物中分離出少量純凈樣品做分析測試，可擴大薄層板的面積，加大薄層的厚度，并將混合物樣液點成一條直線，一次可分離出幾十毫克到約五百毫克的樣品。

本實驗以硅膠作為固定相，以乙酸乙酯一甲醇一水為流動相。未知染料混合樣和染料標準樣分別點在薄層板上，用流動相加以展開。染料色點可直接觀察到無需進行顯色處理。

染料組分可通過比較薄層板上各色點的位置或通過Rf值的測定進行鑒別。

三、儀器和試劑

250mL廣口瓶；載玻片。燒杯；玻璃棒；烘箱；毛細管；鉛筆；直尺：濾紙。

羅丹明B、孔雀綠、品紅等染料的乙醇溶液（1％左右）；乙酸乙酯；甲醇；去離子水：青島硅膠H60；數(shù)甲基纖維素鈉CMC-Na

四、實驗步驟

1．薄層極的制備

（1）取一

400mL燒杯，加入250mL去離子水，再加入

1.5gCMC-Na，放在煤氣燈上小火加熱，并用玻璃棒攪拌直至羧甲基纖維素鈉溶解，放在一旁靜置，冷卻待用。

（2）取載玻片

10塊，用洗滌劑洗滌干凈，標準是水能夠在上面形成均勻薄膜。然后用紙擦凈表面待用。

（3）稱取硅膠

H60

10g置于100mL燒杯中，加入CMC澄清液，邊加邊磨，加入CMC溶液至提起玻璃棒時，殘留液剛好是一滴一滴的而不是線狀流下。

（4）將所得稠狀物用藥勺倒在載玻片上，然后振動使其均勻鋪平，注意硅膠量不必太多，否則鋪出來的硅膠板太厚，在層折時速度慢，而且效果變差、平放使其自然瓊干。

（5）將晾干的硅膠板小心放在一搪瓷托盤內(nèi)，置于烘箱中經(jīng)

105℃活化30min。

（6）用紗手套將托盤從烘箱內(nèi)取出，降溫至50℃后轉(zhuǎn)移到干燥器內(nèi)待用。

2、點樣

用毛細管在薄層板離底邊1cm處點加各染料標準液和未知試樣液。色點之間與色點到板邊距離1cm。注意：點樣量宜少。

3、展開

（1）在一100mL錐形瓶內(nèi)加入39mL乙酸乙酯、10mL甲醇和

lmL水，搖晃

混合均勻得到展開劑。

（2）取一個250mL的廣口瓶，在廣口瓶底部放上一個比內(nèi)腔直徑略小的圓濾紙。

（3）把配好的展開劑倒入廣口瓶中，注意廣口瓶底部液層厚度應(yīng)在0.5～0.8cm左右。蓋上瓶蓋，放置5～10min以保證瓶內(nèi)均勻地被展開劑蒸氣所飽和。

（4）把點過樣的薄層板斜放入廣口瓶中，略微傾斜靠在瓶壁上，盡快蓋上頂

底

展開劑自下而上均勻上升。

（5）待展開劑前沿到達離板頂端約1cm處，取出薄層板，用鉛筆在溶劑前沿處做一標記。

16）用電吹風機將薄層板上的溶劑吹干。

17）測量各染料樣點移動的距離與展開劑前沿移動距離。

I（8）根據(jù)各染料樣點移動的距離與展開劑前沿移動距離的比值測量并比較各染料色斑和未知樣的Rf值，定出未知樣的組成。

五、實驗裝置

六、實驗注意事項

1．CMC-Na濃度在5‰～6‰為宜，太稀了硅膠層強度較差，容易掉粉。

2．硅膠與CMC-Na混合要均勻，注意混合物內(nèi)不要有包裹干硅膠的顆粒存在。3．硅膠與CMC-Na混合以稠狀物能沿玻璃棒細直線往下流為宜，如果以滴狀

往下流則大稀，應(yīng)加硅膠。如果太稠不往下流則應(yīng)加水稀釋。

4．硅膠鋪在載玻片硅膠層厚度要適中，太厚容易使硅膠板中間高兩邊低；太

薄則容易引起邊沿高，中間低，兩種情況都會影響使用效果。

七、思考題

1．制備薄層板是加入羧甲基纖維素鈉的作用是什么？如果不加會出現(xiàn)什么

情況？

2．點樣的濃度太濃時在展開的過程中會出現(xiàn)什么情況？

3．薄層色譜板為何要進行“活化”？

4．展開前層析缸內(nèi)空間為什么要用溶劑蒸氣預(yù)先進行飽和？

實驗

醋酸甲酯、環(huán)己烷、甲醇等混合樣品的色譜測定

一、[目的要求]

1、進一步掌握色譜定量分析的原理

2、了解校正因子的含義，用途和測定方法

3、學會面積歸一化定量方法

二、[基本原理]

色譜定量分析的依據(jù)是，在一定條件下，被測物質(zhì)的重量w

與檢測器的響應(yīng)值成正比，即：

Ai:被測組分的峰面積；hi:被測組分的峰高；Fi:比例常數(shù)（以峰面積表示時）

Fih:比例常數(shù)（以峰高表示時）

所以定量時需要：

（1）準確測量響應(yīng)信號A

或h。

A

或h

是最基本的定量數(shù)據(jù)，h可以直接測得，A和其他參數(shù)計算求得。

如：A=1.065hW1/2

（2）準確求得校正因子F

響應(yīng)值除正比于組分含量外，與樣品的性質(zhì)也有關(guān)，即在相同的條件下，數(shù)量相等的不同物質(zhì)產(chǎn)生的信號的大小可能不同。因此，在進行定量分析時需加以校正。

由前述可知：

即單位峰面積所代表的樣品重量，由于受操作條件影響較大，F(xiàn)的測定較困難。所以在實際操作中都采用相對校正因子f′。f′為組分i

和標準物質(zhì)s的絕對校正因子之比：

Wi、Ws分別為待測物和標準物之重量；As、Ai分別為待測物和標準物之峰面積。f

′與檢測器類型有關(guān)，而與檢測器結(jié)構(gòu)特性及操作條件無關(guān)。

因物質(zhì)的量可以用重量或摩爾表示，故：

其中Mi，Ms

——分別為待測物和標準物的分子量

f′、f

可以從文獻查得，亦可直接測量。準確稱量一定重量的待測物質(zhì)和標準物質(zhì)，混勻后進樣，分別測得峰面積，即可求其校正因子。

（3）選擇合適的定量方法

常用的定量方法有好多種，本實驗采用歸一法。

歸一法就是分別求出樣品中所有組分的峰面積和校正因子，然后依次求各組分的百分含量。

歸一法優(yōu)點：簡潔；進樣量無需準確；條件變化時對結(jié)果影響不大。

缺點：混合物中所有組分必須全出峰；必須測出所有峰面積。

[儀器試劑]

氣相色譜儀（附TCD、FID）；微量注射器：1

μL、5

μL；

三組分混合樣：甲醇，醋酸甲酯，環(huán)己烷

[色譜條件]

色譜柱：GDX-102(60—80

目)。

溫度：T

c——100-120℃；T

D

——150℃；T

i

——150℃

載氣：H2

mL/min

三、[實驗步驟]

按上述條件開機調(diào)試，待儀器穩(wěn)定后依次進行。

1、定性分析

（1）調(diào)記錄紙速為5

cm/min，用

μL

注射器進分別進甲醇，醋酸甲酯，環(huán)己烷

0.1

μL，記錄色譜圖，準確測量各峰的保留時間（tR）。

（2）在相同條件下進0.1

μL—0.2

μL

三組分混合樣記錄色譜圖，準確測量各峰的保留時間（tR）。

2、測量校正因子

于分析天平上準確稱取三標準試樣與同一小瓶中混勻，在設(shè)定的條件下進樣0.1

μL—0.2μL，記錄峰面積。

3、定量分析

進

0.1

μL—0.2

μL

未知混合樣。記錄色譜圖，測量峰面積。

4、關(guān)機。

四、[數(shù)據(jù)處理]

1、根據(jù)保留時間確定各峰歸屬。

2、根據(jù)所稱標樣重量和各峰面積，計算相對校正因子（以甲醇為標準物）。

3、根據(jù)未知樣品中峰面積，用歸一化法計算待測樣品中各組分的百分含量

五、[思考題]

1、歸一化法使用的條件是什么？

2、如何求校正因子？在什么條件下可以不考慮校正因子？

僅供參考