第一篇：實(shí)驗(yàn)四：細(xì)菌的接種、培養(yǎng)和分離技術(shù)

實(shí)驗(yàn)四：細(xì)菌的接種、培養(yǎng)和分離技術(shù)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求：

（1）掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥等）中分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，從而獲得若干種細(xì)菌純培養(yǎng)技能

（2）掌握細(xì)菌純種分離的方法：稀釋平板分離法和平板劃線法。

（3）掌握幾種接種技術(shù)：斜面接種技術(shù)、穿刺接種、稀釋平板涂布法等。

二、實(shí)驗(yàn)原理

在土壤、水、空氣或人及動(dòng)、植物體中，不同種類(lèi)的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類(lèi)群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱(chēng)為微生物的分離與純化。

為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)。一般是根據(jù)該微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長(zhǎng)，而抑制其他菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。

三、實(shí)驗(yàn)器材

1、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

2、盛9ml無(wú)菌水的試管，盛90m1無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶，1ml和5ml無(wú)菌 吸管，無(wú)菌培養(yǎng)皿；

3、接種環(huán)，土樣，酒精燈等。

四、操作步驟

1、倒平板 將加熱融化的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒平板，并標(biāo)明培養(yǎng)基的名稱(chēng)。

2、貼標(biāo)簽 接種前在試管上貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人姓名等。貼在距試管口徑2-3厘米的位置。

3、點(diǎn)燃酒精燈。

4、接種

取接種環(huán) 右手拿接種環(huán)(如握鋼筆一樣)、在火焰上將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部分，均用火燒過(guò)滅菌。

環(huán)冷卻 將灼燒過(guò)的接種環(huán)伸入菌種管，先使環(huán)接觸邊壁，使其冷卻。

取菌種 待環(huán)冷卻后輕輕沾取經(jīng)稀釋10倍的土壤懸液-環(huán)，然后將接種環(huán)移出菌種管，注意不要使環(huán)的部分碰到管壁，取出后不可使環(huán)通過(guò)火焰。

接種 在火焰旁迅速將沾有菌種的接種環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無(wú)論哪種方法劃線，其目的都是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋?zhuān)剐纬蓡蝹€(gè)菌落。常用的劃線方法有下列二種：

⑴用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取土壤懸液一環(huán)，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線(圖A)。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。

⑵將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線(圖B)。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置溫室培養(yǎng)。

環(huán)滅菌 將接種環(huán)燒紅滅菌。

5、挑菌 將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置25℃和28℃溫室中培養(yǎng)，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

四、注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中無(wú)菌操作。

第二篇：細(xì)菌分離鑒定

細(xì)菌分離鑒定

目的要求：

熟悉臨床標(biāo)本中常見(jiàn)的病原性細(xì)菌的分離鑒定方法，細(xì)菌分離鑒定。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

一、膿汁、咽拭子等標(biāo)本中病原性細(xì)菌的分離與鑒定

(一)標(biāo)本采集

1.膿拭子：用無(wú)菌棉簽蘸取患處深部膿液或分泌物少許，置入無(wú)菌空試管內(nèi)，送檢。

2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用無(wú)菌棉簽挑取膿稠痰塊，置入無(wú)菌空試管內(nèi)，送檢。

3.咽拭子：囑病人把口張大，用壓舌板壓住舌根，用無(wú)菌棉簽迅速蘸取咽部分泌物，置入無(wú)菌空試管內(nèi)，送檢。

4.血標(biāo)本：疑為敗血癥患者，在嚴(yán)格無(wú)菌操作下，靜脈采血，床旁直接加入含50ml的肉湯瓶?jī)?nèi)，立即搖勻后送培養(yǎng)。

5.腦脊液：對(duì)疑似流腦患者，作腰椎穿刺取腦脊液，立即行直接床旁接種(送檢過(guò)程中應(yīng)注意保溫)。

6.尿道、陰-道分泌物：對(duì)可疑淋病患者，男性可從尿道取材，取材時(shí)導(dǎo)尿管應(yīng)進(jìn)入尿道1cm～2cm，如為剛排尿，應(yīng)等待1h左右;女性則可以從宮頸口取分泌物，當(dāng)內(nèi)窺器插入宮頸口后應(yīng)稍等片刻，再旋轉(zhuǎn)取出，取材應(yīng)立即送檢，不可放置冰箱。

(二)分離鑒定程序

待檢標(biāo)本可直接做涂片染色檢查鑒定，必要時(shí)可做分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)及致病性鑒定。常見(jiàn)的致病性球菌檢查程序如下。

直接涂片、革蘭染色、鏡檢(形態(tài)、排列、染色性)

膿、痰、咽拭子

分泌物、腦脊液 觀察菌落性狀、溶血性、色素

血瓊脂平板→ 涂片、染色、鏡檢

↑ 挑取可疑菌落 生化反應(yīng)

血液、穿刺液 →肉湯培養(yǎng)基 純分離 致病性測(cè)定

↓ 藥敏試驗(yàn)

如培養(yǎng)液混濁時(shí)可涂片、染色、鏡檢

(三)常見(jiàn)臨床標(biāo)本的檢查方法

1．膿拭子

在膿汁中除了球菌外，也有桿菌存在，例如革蘭陽(yáng)性的有炭疽桿菌、白喉?xiàng)U菌、結(jié)核桿菌、枯草桿菌等，革蘭陰性的有大腸桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌等，此外尚可有真菌、放線菌、螺旋體等。

材料

(1)標(biāo)本：膿拭子

(2)培養(yǎng)基：血瓊脂平板

(3)兔血漿、白色濾紙片、無(wú)菌生理鹽水、載玻片

方法 膿汁 → 革蘭染色 → 鏡檢

↓ ↑

血瓊脂平板 →觀察菌落形態(tài)及溶血情況

↓

致病力試驗(yàn)

(1)將膿拭子作革蘭染色，鏡檢(先作培養(yǎng)再涂片以免污染)，鑒定材料《細(xì)菌分離鑒定》。標(biāo)本放置4℃冰箱保存，待報(bào)告發(fā)出后再丟棄。

(2)將膿汁涂布于血瓊脂平板上，再以滅菌接種環(huán)作劃線分離。置培養(yǎng)37℃培養(yǎng)18h～24h。

(3)經(jīng)培養(yǎng)后據(jù)菌落特點(diǎn)及涂片檢查結(jié)果進(jìn)行初步識(shí)別，根據(jù)需要再作進(jìn)一步鑒定。若菌落較大、溶血透明、產(chǎn)生金黃色色素、涂片為革蘭陽(yáng)性球菌并成堆排列時(shí)可能系葡萄球菌，應(yīng)確定其為何種葡萄球菌;必要時(shí)再作血漿凝固酶試驗(yàn)及甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)，確定其致病力。

2.咽拭子

咽喉中存在的細(xì)菌較多，可以有厭氧及需氧性鏈球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四聯(lián)球菌、腦膜炎球菌、卡他球菌、喉?xiàng)U菌、結(jié)核桿菌枯草桿菌、百日咳桿菌肺炎桿菌及綠膿桿菌等。此外也可有白色念珠菌奮森螺旋體等。本實(shí)驗(yàn)以咽拭子作為標(biāo)本，重點(diǎn)檢查病原性球菌。

材料

(1)標(biāo)本:咽拭子。

(2)培養(yǎng)基:血瓊脂平板。

方法

咽拭子

↓

血瓊脂平板

↓

觀察菌落形態(tài)及溶血性

↓

革蘭染色，鏡檢

取標(biāo)本涂布于血瓊脂平板，再以滅菌接種環(huán)劃線分離，置37℃培養(yǎng)18h～24h培養(yǎng)。標(biāo)本放置4℃冰箱保存，待報(bào)告發(fā)出后再丟棄。

可根據(jù)下述特點(diǎn)進(jìn)行鑒別：

(1)在菌落周?chē)a(chǎn)生2mm～4mm寬、界線分明、完全透明的溶血環(huán)、涂片為革蘭陽(yáng)性球菌并呈鏈狀排列，可能是乙型溶血性鏈球菌。

(2)菌落細(xì)孝半透明、有草綠色溶血環(huán)、涂片為革蘭陽(yáng)性球菌呈鏈狀排列，可能為甲型溶血性鏈球菌。需要進(jìn)一步與肺炎球菌區(qū)別時(shí)，可做膽汁溶菌試驗(yàn)及菊糖發(fā)酵反應(yīng)。

菌落細(xì)小半透明、不溶血、涂片為革蘭陽(yáng)性鏈狀排列的球菌時(shí)，為丙型鏈球菌。

(4)菌落扁平邊緣隆起、中央稍凹、半透明、呈草綠色溶血、革蘭染色為陽(yáng)性雙球菌、呈矛頭狀排列時(shí)為肺炎球菌，應(yīng)以膽汁溶菌及菊糖發(fā)酵反應(yīng)與甲型溶血性鏈球菌區(qū)分。

(5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革蘭染色為陰性雙球菌，呈腎形排列時(shí)，可能為腦膜炎球菌，需要進(jìn)一步作氧化酶試驗(yàn)及糖發(fā)酵試驗(yàn)(接種于含血清之葡、麥、蔗糖發(fā)酵管中)。

二、糞便標(biāo)本中腸道桿菌的分離與鑒定

(一)標(biāo)本收集

取患者的糞便或肛-門(mén)拭子。

(二)鑒定程序

腸道桿菌為一大群革蘭陰性桿菌，從形態(tài)及染色性上無(wú)法鑒別為何種菌，只能依靠生化反應(yīng)和血清學(xué)反應(yīng)進(jìn)行鑒定。

患者糞便(粘液、膿血)→腸道選擇、鑒別培養(yǎng)基(如ss、中國(guó)藍(lán)、伊紅美蘭)

↓

挑取可疑菌落(據(jù)大孝顏色、透明度而定)

↓

雙糖鐵及其他鑒別培養(yǎng)基

↓

據(jù)結(jié)果分析鑒定

↓

玻片凝集(做出特異性診斷)

葡萄糖乳糖動(dòng)力H2S尿素

⊕⊕±--艾希菌屬非致病菌

⊕+---克雷伯菌屬

⊕±+++變形桿菌

⊕-++-乙型副傷寒致病菌

⊕-+±-甲型副傷寒

+-++-傷寒桿菌

+----痢疾桿菌

第三篇：污水處理細(xì)菌培養(yǎng)規(guī)程(無(wú)接種污泥1)

污水處理好氧細(xì)菌培養(yǎng)規(guī)程

（無(wú)接種污泥）

一、培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作

1、各構(gòu)筑物建成，并經(jīng)清池清除建筑垃圾，靜壓試驗(yàn)證明無(wú)滲漏，無(wú)下沉位移，最后按有關(guān)規(guī)程驗(yàn)收合格。

2、電器、機(jī)械、管路等全部設(shè)備建成并經(jīng)單機(jī)試車(chē)、聯(lián)動(dòng)試車(chē)正常。最后按有關(guān)規(guī)程驗(yàn)收合格。

3、根據(jù)日后運(yùn)行管理需要，有條件的污水處理廠（站）需進(jìn)行最基本的常規(guī)化驗(yàn)測(cè)試，如pH、水溫、COD、DO、生物相等，用以指導(dǎo)活性污泥的培養(yǎng)過(guò)程和日常運(yùn)行。

4、基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的調(diào)查摸底，包括污水流量晝夜變化情況，水質(zhì)（pH、水溫、COD、BOD5/CODCr、含氮、含磷、有毒物質(zhì)等）及其變化情況，各種設(shè)施和設(shè)備的技術(shù)參數(shù)。

5、根據(jù)處理水質(zhì)狀況備足必需的營(yíng)養(yǎng)物(碳源：大糞及淀粉、氮源：尿素、磷源：普鈣Ca（H2PO4)2)，以備缺什么補(bǔ)什么。

6、操作人員應(yīng)熟悉整個(gè)系統(tǒng)的管道布置和公用工程方面的情況，了解污泥培養(yǎng)的基本過(guò)程和控制要求。

7、人員到位，自培養(yǎng)和馴化后一般應(yīng)使系統(tǒng)連續(xù)運(yùn)行，不能脫人。

8、編制必要的化驗(yàn)和運(yùn)轉(zhuǎn)的原始記錄報(bào)表以及初步的建章立制。從培菌伊始，逐步建立較規(guī)范的組織和管理模式，確保啟動(dòng)與正式運(yùn)行的有序進(jìn)行。

二、培菌

1.向好氧池注入清水（同時(shí)引入生活污水）至一定水位，并注意水溫 2.按風(fēng)機(jī)操作規(guī)程啟動(dòng)風(fēng)機(jī)，鼓風(fēng)。

3.向好氧池投加經(jīng)過(guò)濾的濃糞便水（當(dāng)糞便水不充足時(shí)，可用化糞池和排水溝內(nèi)的污泥補(bǔ)充。），使得污泥濃度不小于1000mg/L，BOD達(dá)到一定數(shù)值。

4.有條件時(shí)可投加活性污泥的菌種，加快培養(yǎng)速度。

5.按照活性污泥培養(yǎng)運(yùn)行工藝對(duì)反應(yīng)池進(jìn)行曝氣、攪拌、沉降、排水。水氣體積控制在1：（5~10）。曝氣時(shí)間采取6h充氧，4h停機(jī)的方式進(jìn)行，排水參見(jiàn)7。

6.通過(guò)鏡檢及測(cè)定沉降比、污泥濃度，注意觀察活性污泥的增長(zhǎng)情況。并注意觀察在線PH值、DO的數(shù)值變化，及時(shí)對(duì)工藝進(jìn)行調(diào)整。

7.測(cè)定初期水質(zhì)及排水階段上清液的水質(zhì)，根據(jù)進(jìn)出水NH3-N、BOD、COD、NO3-、NO2-等濃度數(shù)值的變化，判斷出活性污泥的活性及優(yōu)勢(shì)菌種的情況，并由此調(diào)節(jié)進(jìn)水量、置換量、糞水、碳源、氮源、磷源的投加量及周期內(nèi)時(shí)間分布情況

8.注意觀察活性污泥增長(zhǎng)情況，當(dāng)通過(guò)鏡檢觀察到菌膠團(tuán)大量密實(shí)出現(xiàn)，并能觀察到原生動(dòng)物（如鐘蟲(chóng)），且數(shù)量由少迅速增多時(shí)，說(shuō)明污泥培養(yǎng)成熟，可以進(jìn)生產(chǎn)廢水，進(jìn)行馴化。

三、活性污泥的馴化（調(diào)試）步驟

1.通過(guò)分析確認(rèn)來(lái)水各項(xiàng)指標(biāo)在允許范圍內(nèi)，準(zhǔn)備進(jìn)水。

2.開(kāi)始進(jìn)入少量生產(chǎn)廢水，進(jìn)入量不超過(guò)馴化前處理能力的20％。同時(shí)補(bǔ)充新鮮水、糞便水及氮源。

3.達(dá)到較好處理后，可增加生產(chǎn)廢水投加量，每次增加不超過(guò)10～20％，同時(shí)減少氮源投加量。且待微生物適應(yīng)鞏固后再繼續(xù)增生產(chǎn)廢水，直至完全停加氮源。同步監(jiān)測(cè)出水CODcr濃度等指標(biāo),并觀察混合液污泥性狀。在污泥馴化期還要適時(shí)排放代謝產(chǎn)物,即泥水分離后上清液。

4.繼續(xù)增加生產(chǎn)廢水投加量，直至滿負(fù)荷。滿負(fù)荷運(yùn)行階段,由于池中已培養(yǎng)和保持了高濃度、高活性的足夠數(shù)量的活性污泥,池中曝氣后混合液的MLSS達(dá)到5000mg/1,此過(guò)程同步監(jiān)測(cè)溶解氧,控制曝氣機(jī)的運(yùn)行,并進(jìn)行污泥的生物相鏡檢。

四、調(diào)試期間的監(jiān)測(cè)和控制

在調(diào)試及運(yùn)行過(guò)程有許多影響處理效果的因素,主要有進(jìn)水CODcr濃度、pH值、溫度、溶解氧等,所以對(duì)整個(gè)系統(tǒng)通過(guò)感官判斷和化學(xué)分析方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)是必不可少的。根據(jù)監(jiān)測(cè)分析的結(jié)果對(duì)影響因素進(jìn)行調(diào)整，使處理達(dá)到最佳效果。

1、溫度 溫度是影響整個(gè)工藝處理的主要環(huán)境因素,各種微生物都在特定范圍的溫度內(nèi)生長(zhǎng)。生化處理的溫度范圍在10～40℃,最佳溫度在20～30℃。任何微生物只能在一定溫度范圍內(nèi)生存，在適宜的溫度范圍內(nèi)可大量生長(zhǎng)繁殖。在污泥培養(yǎng)時(shí)，要將它們置于最適宜溫度條件下，使微生物以最快的生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)，過(guò)低或過(guò)高的溫度會(huì)使代謝速率緩慢、生長(zhǎng)速率也緩慢，過(guò)高的溫度對(duì)微生物有致死作用。

2、pH值

微生物的生命活動(dòng)、物質(zhì)代謝與pH值密切相關(guān)。大多數(shù)細(xì)菌、原生動(dòng)物的最適pH值為6.5～7.5，在此環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖最好，它們對(duì)pH值的適應(yīng)范圍在4～10。而活性污泥法處理廢水的曝氣系統(tǒng)中，作為活性污泥的主體，菌膠團(tuán)細(xì)菌在7～8.5的pH值條件下可產(chǎn)生較多粘性物質(zhì)，形成良好的絮狀物。

3、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)

廢水中的微生物要不斷地?cái)z取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)過(guò)分解代謝(異化作用)使復(fù)雜的高分子物質(zhì)或高能化合物降解為簡(jiǎn)單的低分子物質(zhì)或低能化合物，并釋放出能量；通過(guò)合成代謝(同化作用)利用分解代謝所提供的能量和物質(zhì)，轉(zhuǎn)化成自身的細(xì)胞物質(zhì)；同時(shí)將產(chǎn)生的代謝廢物排泄到體外。

水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及生長(zhǎng)因素為微生物生長(zhǎng)的條件。廢水中應(yīng)按BOD5∶N∶P=100∶4∶1的比例補(bǔ)充氮源、含磷無(wú)機(jī)鹽，為活性污泥的培養(yǎng)創(chuàng)造良好的營(yíng)養(yǎng)條件。

4、懸浮物質(zhì)SS 污水中含有大量的懸浮物,通過(guò)預(yù)處理懸浮物已大部分去除,但也有部分不能降解,曝氣時(shí)會(huì)形成浮渣層,但不影響系統(tǒng)對(duì)污水的處理。

5、溶解氧量DO 好養(yǎng)的生化細(xì)菌屬于好氧性的。氧對(duì)好氧微生物有兩個(gè)作用：①在呼吸作用中氧作為最終電子受體；②在醇類(lèi)和不飽和脂肪酸的生物合成中需要氧。且只有溶于水的氧(稱(chēng)溶解氧)微生物才能利用。

在活性污泥的培養(yǎng)中，DO的供給量要根據(jù)活性污泥的結(jié)構(gòu)狀況、濃度及廢水的濃度綜合考慮。具體說(shuō)來(lái)，也就是通過(guò)觀察顯微鏡下活性污泥的結(jié)構(gòu)即成熟程度，測(cè)量曝氣池混合液的濃度、監(jiān)測(cè)曝氣池上清液中CODCr的變化來(lái)確定。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在培養(yǎng)初期DO控制在1～2mg/l，這是因?yàn)榫z團(tuán)此時(shí)尚未形成絮狀結(jié)構(gòu)，氧供應(yīng)過(guò)多，使微生物代謝活動(dòng)增強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不上而使污泥自身產(chǎn)生氧化，促使污泥老化。在污泥培養(yǎng)成熟期，要將DO提高到3～4mg/l左右，這樣可使污泥絮體內(nèi)部微生物也能得到充足的DO，具有良好的沉降性能。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中要根據(jù)污泥培養(yǎng)情況逐步提高DO。

特別注意DO不能過(guò)低，DO不足，好氧微生物得不到足夠的氧，正常的生長(zhǎng)規(guī)律將受到影響，新陳代謝能力降低，而同時(shí)對(duì)DO要求較低的微生物將應(yīng)運(yùn)而生，這樣正常的生化細(xì)菌培養(yǎng)過(guò)程將被破壞。

6、混合液MLSS濃度

微生物是生物污泥中有活性的部分,也是有機(jī)物代謝的主體,在生物處理工藝中起主要作用,而混合液污泥MLSS的數(shù)值即大概能表示活性部分的多少。對(duì)高濃度有機(jī)污水的生物處理一般均需保持較高的污泥濃度,本工程調(diào)試運(yùn)行期間MLSS范圍在:4.4～5.6g/l之間,最佳值為4.8g/l左右。

7、進(jìn)水CODcr濃度，進(jìn)水中有機(jī)物濃度對(duì)處理影響很大。

8、污泥的生物相鏡檢

活性污泥處于不同的生長(zhǎng)階段,各類(lèi)微生物也呈現(xiàn)出不同的比例。細(xì)菌承擔(dān)著分解有機(jī)物的基本和基礎(chǔ)的代謝作用,而原生動(dòng)物〈也包括后生動(dòng)物〉則吞食游離細(xì)菌。污水調(diào)試運(yùn)行期間出現(xiàn)的微生物種類(lèi)繁多,有細(xì)菌、綠藻等藻類(lèi)、原生動(dòng)物和后生動(dòng)物,原生動(dòng)物有太陽(yáng)蟲(chóng)、蓋纖蟲(chóng)、累校蟲(chóng)等,后生動(dòng)物出現(xiàn)了線蟲(chóng)。調(diào)試運(yùn)行后期混合液中固著型纖毛蟲(chóng),如累校蟲(chóng)的大量存在,說(shuō)明處理系統(tǒng)有良好的出水水質(zhì)。

9、污泥指數(shù)SVI,正常運(yùn)行時(shí)污泥指數(shù)在800/mg左右。

第四篇：稠油四組分分離學(xué)生實(shí)驗(yàn)講義

實(shí)驗(yàn)一

（二）柱層析法分離稠油中的四組份

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、了解復(fù)雜物質(zhì)的柱層析分離分析方法；

2、掌握柱層析分離稠油四組分的操作；

3、復(fù)習(xí)過(guò)濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等操作步驟。實(shí)驗(yàn)意義：

稠油是一種成分復(fù)雜的非常規(guī)烴類(lèi)資源，按照極性可分為飽和烴、芳香烴、膠質(zhì)和瀝青質(zhì)四個(gè)組分。對(duì)稠油的研究首先要將其分成上述四個(gè)組分，再通過(guò)各種檢測(cè)手段（IR、EL、GCMS、HNMR等）進(jìn)行分析。

柱層析技術(shù)又稱(chēng)柱色譜技術(shù)，是根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動(dòng)相中分配系數(shù)不同，經(jīng)多次反復(fù)分配平衡后，最終將組分分離的方法。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)稠油四組分柱層析方法分離，使學(xué)生掌握使用柱層析分離稠油四組分的實(shí)驗(yàn)方法和操作。實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：

儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式真空泵、索氏提取器、冷凝管、電熱套、超聲波清洗器、分析天平、25mL小燒杯、250mL平底燒瓶、滴管、玻璃棒、分離柱、洗耳球、長(zhǎng)頸漏斗、11cm定性濾紙

試劑：中性三氧化二鋁（100~200目）、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇（以上均為AR）、石英砂

實(shí)驗(yàn)步驟：

一、分離前準(zhǔn)備

1、活化氧化鋁

取中性氧化鋁（100-200目）若干于瓷坩堝中，置于馬弗爐，400-450℃煅燒6h；取出后放至干燥器中泠卻至室溫，加入1%（按氧化鋁質(zhì)量計(jì)）的蒸餾水，劇烈搖晃10min至混合均勻，干燥器中過(guò)夜備用。

2、溶解油樣

取0.5g-0.6g油樣于250mL平底燒瓶中，用80mL正己烷溶解，蓋好蓋子超聲15min，靜置十分鐘。

3、準(zhǔn)備四個(gè)250ml平底燒瓶貼上標(biāo)簽稱(chēng)重備用。

二、過(guò)濾與抽提

1、過(guò)濾油樣

將濾紙折為菊花狀，過(guò)濾之前準(zhǔn)備好的油樣。

2、抽提組分

將濾紙放入索氏抽提器，濾液中加入正己烷至液面高于電熱套加熱邊緣；打開(kāi)電熱套至沸騰，抽提至抽提器中液體澄清為止，得到三組分溶液；取一燒瓶加入氯仿90ml，打開(kāi)電熱套至沸騰，抽提至抽提器中液體澄清為止，得到瀝青質(zhì)溶液。

三、柱層析分離三組分

1、填裝柱子

層析柱中填充約20cm高活化好的氧化鋁，敲打柱子5min至填充的氧化鋁變實(shí)，鋪上一層石英砂防止被沖開(kāi)。

2、柱層析分離三組分

先倒入少量正己烷排出柱子中空氣；至液面余約1cm時(shí)，緩慢倒入三組分溶液，并用少量正己烷將燒瓶中殘留溶液洗凈；少量多次倒入總量70mL正己烷，淋洗得飽和烴；接著少量多次倒入正己烷+二氯甲烷（30+30）混合液60mL，淋洗得芳香烴；最后少量多次倒入甲醇+二氯甲烷（30+30）混合液60mL，淋洗得膠質(zhì)。

四、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，揮干稱(chēng)重

1、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

對(duì)分出的四組分溶液進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溫度為40-45℃，蒸發(fā)至燒瓶中無(wú)液體為止。

2、稱(chēng)重

旋蒸后的重量減去燒瓶重量，計(jì)算出四組份的粗重及各組分所占百分比。數(shù)據(jù)處理：

某一組分% =（某一組分質(zhì)量/四組份總質(zhì)量）X 100% 問(wèn)題思考：

1、稠油四組分的極性大小如何排列，依據(jù)是什么？

2、如柱子填充不實(shí)，對(duì)分離效果有何影響？

3、淋洗時(shí)為何每次加液要待液面余約1cm時(shí)？

4、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還有哪些操作會(huì)影響分離效果？

第五篇：土壤微生物的分離培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

重慶大學(xué)研究生專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)

實(shí)驗(yàn)報(bào)告書(shū)

實(shí)驗(yàn)課程名稱(chēng)： 實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師： 學(xué)

院： 專(zhuān)業(yè)及類(lèi)別： 學(xué)

號(hào)： 姓

名： 實(shí)驗(yàn)日期： 成績(jī)：

重慶大學(xué)研究生院制

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、了解分離與純化微生物的基本原理及方法；

2、了解倒平板配制土豆培養(yǎng)基的方法與平板劃線分離的基本操作技術(shù)；；

3、學(xué)習(xí)習(xí)近平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法，并掌握其基本技能；

4、初步觀察來(lái)自土壤中的幾類(lèi)微生物的菌落形態(tài)特征，并能判斷菌的類(lèi)型。

二、實(shí)驗(yàn)原理

1、培養(yǎng)基的種類(lèi)

培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒別、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。一般的培養(yǎng)基應(yīng)包含適合微生物生長(zhǎng)的6大營(yíng)養(yǎng)素即水分、碳源、氮源、能源、無(wú)機(jī)鹽和生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)基的種類(lèi)很多，根據(jù)培養(yǎng)成分的不同可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基與半合成培養(yǎng)基；根據(jù)物理狀態(tài)的不同又可分為液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。微生物的分離、純化、記數(shù)等方面的研究常常使用的就是固體培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)就是使用的固體培養(yǎng)基。

已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌，如來(lái)不及滅菌，應(yīng)暫存冰箱，以防止其中微生物生長(zhǎng)繁殖而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)基酸堿度所帶來(lái)不利影響。

培養(yǎng)基的原材料來(lái)源十分廣泛，本實(shí)驗(yàn)采用的原材料為土豆。

2、接種方法與無(wú)菌接種

將微生物的培養(yǎng)物或含有微生物的樣品移植到培養(yǎng)基上的操作技術(shù)稱(chēng)之為接種。接種是微生物實(shí)驗(yàn)及科學(xué)研究中的一項(xiàng)最基本的操作技術(shù)。接種的關(guān)鍵是要嚴(yán)格的進(jìn)行無(wú)菌操作。微生物的接種方法很多，劃線接種、三點(diǎn)接種、穿刺接種、混澆接種與涂布接種是幾種常用的接種方法。

劃線接種是最常用的接種方法，即在固體培養(yǎng)基表面作來(lái)回直線形的移動(dòng)，就可以達(dá)到接種的目的。常用的接種工具為接種環(huán)、針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。三點(diǎn)接種是把少量的微生物接種在平板表面，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來(lái)觀察研究它們的形態(tài)。研究霉菌形態(tài)時(shí)就常用此法。

穿刺接種是用針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺。該法常用于厭氧菌種的保藏或微生物的動(dòng)力研究。

混澆接種是先將待接的微生物放入培養(yǎng)皿中再倒入冷卻至45℃左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就被稀釋了。待平板凝固后，置于適宜溫度下培養(yǎng)，就可以長(zhǎng)出單個(gè)菌落的微生物。

涂布接種是將菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作來(lái)回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可以長(zhǎng)出單個(gè)菌落的微生物。

本實(shí)驗(yàn)采用的是劃線接種。為了防止接種時(shí)引入其它微生物，整個(gè)操作過(guò)程均需在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行，還需對(duì)操作員的雙手進(jìn)行酒精消毒，每次劃線前都需灼燒接種環(huán)，接種時(shí)才打開(kāi)培養(yǎng)皿且不能全部打開(kāi)，接種完馬上關(guān)上。

三、實(shí)驗(yàn)器材

1、儀器

培養(yǎng)皿、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、酒精燈、玻璃棒、接種環(huán)、15ml離心管、試管架、鑷子、電磁爐、鍋、恒溫培養(yǎng)箱、高溫滅菌鍋、無(wú)菌操作臺(tái)、酒精燈、天平、濾紙等。

2、材料

土豆、瓊脂、蒸餾水、酒精、土壤樣品

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、土壤稀釋液的配制

① 在菜地用九點(diǎn)取樣法取適量土壤樣品，具體操作為：在菜地選取九個(gè)取樣點(diǎn)，在每個(gè)取樣點(diǎn)取相同量的表層土壤（10cm左右），然后將其混合均勻；

② 稱(chēng)取1g土壤樣品與99ml蒸餾水，將其配制成100ml的土壤溶液； ③ 用移液管取9ml蒸餾水于15ml離心管中，再用移液槍取1ml前一步已配制的土壤溶液于離心管中，搖勻，即為10-3的土壤溶液；

④ 重復(fù)前一步，將土壤溶液稀釋為10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-8一系列稀釋液。

2、土豆培養(yǎng)基的制備

① 用天平稱(chēng)取200g土豆，清洗干凈后去皮切?。?/p>

② 用量筒量取1000ml蒸餾水與電磁爐鍋中，再加入已準(zhǔn)備好的土豆，將其煮爛；

③ 從鍋中取出已煮爛的土豆，用紗布過(guò)濾，濾液待用； ④ 稱(chēng)取20g瓊脂與濾液中，再用蒸餾水定容至1000ml；

⑤ 在制備好的濾液中加入0.1ml菌液，然后放入高溫滅菌鍋中，在121℃下滅菌20min；

⑥ 取出已滅菌的土豆培養(yǎng)基，待其熔化后冷卻至60℃，倒入每付平板約15-20ml，待其凝固后便可使用。

3、微生物的接種與分離

① 將接種需要的所有器材均放置于無(wú)菌操作臺(tái)上；

② 用浸泡在酒精里棉花給雙手滅菌，點(diǎn)燃酒精燈，右手拿接種環(huán)，左手拿培養(yǎng)基；

③ 將接種環(huán)放在火焰上燒灼，待其冷卻后在10-6土壤稀釋液中蘸取少量液體，打開(kāi)培養(yǎng)基的一部分，采用劃線接種，使之形成單菌落，一共劃線3-4次，每劃線一次就需在火焰上燒灼一次；

④ 重復(fù)上步，接種10-

7、10-8的土壤稀釋液的微生物；

⑤ 接種完的培養(yǎng)基放在恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h，取出觀察。

五、結(jié)果與思考

1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，采用劃線接種土壤微生物的培養(yǎng)皿里有單菌落出現(xiàn)，這說(shuō)明劃線接種能達(dá)到分離培養(yǎng)的目的。

學(xué)習(xí)過(guò)微生物這門(mén)課程的同學(xué)都知道，真菌的菌落較大且疏松，菌絲細(xì)長(zhǎng)，呈絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀、棉絮狀，無(wú)固定大小，多有光澤，不易挑，孢子會(huì)呈現(xiàn)紅色、褐色、綠色、黑色、黃色等不同的顏色；細(xì)菌的菌落較小，形狀表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多為白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有細(xì)菌。

2、思考題

⑴在平板劃線法中，為什么每次都需要將接種環(huán)上的剩余物燒掉？

答：這么做的主要目的是殺死上次劃線后接種環(huán)上殘留的菌種，以使下次劃線的菌種直接來(lái)自于上次劃線的末端，使每次劃線菌種數(shù)目減少，從而達(dá)到分離菌株的目的。

⑵為什么要把培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？

答：①操作時(shí)培養(yǎng)皿蓋上可能粘有水珠或者細(xì)菌，倒著培養(yǎng)可以避免培養(yǎng)皿蓋上的水珠或者微生物落在培養(yǎng)皿上；

②培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)菌在代謝繁殖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些有害于細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的代謝物，釋放熱量及有水排出，如果不倒著培養(yǎng)會(huì)有水珠滴落到培養(yǎng)基中，影響菌落的生長(zhǎng);③如果培養(yǎng)目標(biāo)是收集細(xì)菌代謝物，而且代謝物易溶于水，倒著培養(yǎng)可能會(huì)方便收集。

六、實(shí)驗(yàn)總結(jié) 我本科所學(xué)專(zhuān)業(yè)是材料科學(xué)與工程，本次實(shí)驗(yàn)是我高中后第一次接觸微生物方面的知識(shí)。在本次實(shí)驗(yàn)課里，段老師先給我們?cè)敿?xì)講解了微生物分離培養(yǎng)方面的許多理論知識(shí)，然后才進(jìn)入了理論環(huán)節(jié)。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中段老師一直在我們旁邊觀察我們的實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程，一旦出現(xiàn)錯(cuò)誤，會(huì)立即指出并耐心的給我們講解應(yīng)該怎么做，我擔(dān)心自己從來(lái)沒(méi)做過(guò)微生物培養(yǎng)方面的實(shí)驗(yàn)會(huì)做不好，段老師還一直在旁邊鼓勵(lì)我，并給我講解了許多微生物分離培養(yǎng)方面的知識(shí)，最后我獨(dú)立完成了本次實(shí)驗(yàn)。此次實(shí)驗(yàn)課，我真的是受益匪淺，學(xué)到了許多微生物分離培養(yǎng)方面的知識(shí)，十分感謝段老師。

圖2 如圖2所示，本次微生物分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，有些培養(yǎng)皿里菌落很少，只有一個(gè)，有的甚至沒(méi)有。我認(rèn)為出現(xiàn)這種情況原因可能是：劃線接種時(shí)，未等接種環(huán)冷卻就開(kāi)始接種，微生物可能被高溫殺死；在接種時(shí)，酒精燈火焰太大，進(jìn)行接種操作的全過(guò)程又離酒精燈火焰很近，這也可能將微生物殺死。