第一篇：藻類(lèi)的分離和培養(yǎng)

藻類(lèi)的分離和培養(yǎng)

微型藻類(lèi)的分離和培養(yǎng)方法基本上與菌類(lèi)的方法相似，但還需加上光照條件，并以液體培養(yǎng)為主。在大量培養(yǎng)時(shí)，可不必考慮無(wú)菌條件。

一、目的

學(xué)習(xí)藻類(lèi)的分離和培養(yǎng)方法

二、藥品、材料和用具

水生生物培養(yǎng)槽，玻璃片（面積稍大于培養(yǎng)槽），橡皮管，顯微鏡，三角燒瓶，試管，篩絹，棉塞，微吸管，凹玻片，滅菌鍋，載玻片，吸管，培養(yǎng)皿，人工光源，木盆（或小型實(shí)驗(yàn)池），充二氧化碳?xì)怃撈?，抽氣泵，離心機(jī)。

土壤抽出液，青霉素，鏈霉素，瓊脂，硝酸鈣，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，過(guò)磷酸鈣，硫酸鎂，氯化鉀，碳酸鈉，三氯化鐵，硅酸鈉，葡萄糖，蛋白胨，硫酸銨，硝酸銨，氯化鈣，碳酸氫鈉，鉬酸，氯化鈉，檸檬酸鐵，硫酸錳，人尿，海泥抽出液，食鹽。

三、操作

生長(zhǎng)在靜水或水流緩慢河流中的藻類(lèi)，培養(yǎng)比較容易。取到實(shí)驗(yàn)室后，要立刻從材料瓶中移到寬大的水生生物培養(yǎng)槽內(nèi)。為了培養(yǎng)大的絲狀藻，要利用寬的、不高的容器。這些容器要用玻片蓋住，以防止培養(yǎng)物受灰塵沾污。倒入容器的水要達(dá)到容器高度的一半，或稍多些，使水面上還有充分空氣。在容器邊緣，要用一小塊縱切橡皮管墊住，可使玻片不致緊貼容器，空氣才能進(jìn)入容器中。細(xì)微的藻類(lèi)如團(tuán)藻目、硅藻門(mén)能很好地生活于培養(yǎng)皿中。很多藻類(lèi)如顫藻屬、水綿屬的若干種、輪藻屬等可在實(shí)驗(yàn)室中保存很多年。

在迅速流動(dòng)水中生長(zhǎng)的藻如絲藻屬、毛枝藻屬等比較難于培養(yǎng)，因?yàn)樗鼈円蠼?jīng)常輸入氧氣。在水層較高水中，在高容器中，這些藻類(lèi)迅速地死亡。為了把這些藻類(lèi)保存到實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)當(dāng)把它們分成一些小部分，放在水層較薄的、寬的容器內(nèi)，并須常常換水，把空氣吹入水中。還可以用橡皮管把水生生物培養(yǎng)槽和水龍頭連結(jié)起來(lái)，建立有流水的水生生物培養(yǎng)槽。

在水生生物培養(yǎng)槽中培養(yǎng)藻類(lèi)時(shí)，應(yīng)盡可能創(chuàng)造和保持藻類(lèi)天然生存條件。把藻類(lèi)培養(yǎng)在從采集藻類(lèi)那一水域取來(lái)的水中，或其他天然水（尤其不能用自來(lái)水，因其中含很多氯氣，必要的話(huà)，也須置較長(zhǎng)時(shí)間，或加以煮開(kāi)），或在水中加入混合養(yǎng)料，這些養(yǎng)料是由制造有機(jī)物質(zhì)所必需的礦質(zhì)鹽構(gòu)成。

在夏季，不要把藻類(lèi)培養(yǎng)物放在直射太陽(yáng)光下，而要放在涼爽的場(chǎng)所，例如向北窗臺(tái)上。在秋、冬季節(jié)，如希望藻類(lèi)保持積極生活活動(dòng)狀態(tài)，就要把培養(yǎng)物移到有人工光照處。

以上是一般藻類(lèi)粗放的培養(yǎng)、保存方法。如要作較深入實(shí)驗(yàn)，需注意以下問(wèn)題：

1．藻種的分離

藻類(lèi)培養(yǎng)首先要有藻種。從天然水域的混雜生物群中，用一定方法把所需藻類(lèi)個(gè)體分離出來(lái)，而獲純種培養(yǎng)。這種方法稱(chēng)為藻種分離和純化，又稱(chēng)純培養(yǎng)法。

真正的“純種培養(yǎng)”是指在排除包括細(xì)菌在內(nèi)的一切生物的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)。這是進(jìn)行科學(xué)研究不可缺少的技術(shù)，而在生產(chǎn)性培養(yǎng)中不排除細(xì)菌的稱(chēng)之為“單種培養(yǎng)”。

（1）采樣和預(yù)備培養(yǎng)：首先要采集有需要分離藻類(lèi)的水樣，采回后在顯微鏡下檢查。如發(fā)現(xiàn)需要分離的藻類(lèi)數(shù)量較多時(shí)，可立即分離。若數(shù)量很少，最好先進(jìn)行預(yù)備培養(yǎng)，待其增多后，再分離。

用作預(yù)備培養(yǎng)的培養(yǎng)液，各種藻類(lèi)是不同的，對(duì)一些難以培養(yǎng)的藻類(lèi)一般加入土壤抽出液較好。預(yù)備培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分濃度應(yīng)小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水樣中藻類(lèi)種類(lèi)較多，就應(yīng)使用幾種不同的培養(yǎng)液，使藻類(lèi)在適合于自己繁殖的培養(yǎng)液中繁殖起來(lái)。

可用三角燒瓶或試管作培養(yǎng)容器，加入容量1/4～1/3培養(yǎng)液。然后把經(jīng)篩絹過(guò)濾除去大型浮游生物的水樣接種進(jìn)去，放在合適溫度下或室內(nèi)靠北窗口下培養(yǎng)。在培養(yǎng)附著藻類(lèi)時(shí)，容器可靜止不動(dòng)；而培養(yǎng)浮游藻類(lèi)時(shí)，應(yīng)該每天搖動(dòng)一次。

有的藻類(lèi)在普通培養(yǎng)液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困難。此時(shí)需改變培養(yǎng)液濃度，加入葡萄糖、蛋白胨等有機(jī)物，補(bǔ)充微量元素和輔助生長(zhǎng)物質(zhì)，加入土壤抽出液，就有可能獲較好效果。

土壤抽出液制作方法：先在試管底部，加入高約1cm土壤（采用腐殖化的農(nóng)田和庭院土）。再加入水使達(dá)5cm，塞上棉塞，采用蒸氣間隙滅菌，每天滅菌1小時(shí)，連續(xù)二天。由于氣泡上升，棉塞可能弄臟。因此，最好先在水中煮一段時(shí)間，使氣泡跑掉后，再加棉塞進(jìn)行滅菌。

（2）分離方法：常用下列四種。

1）微吸管（毛細(xì)管）分離 選直徑較細(xì)（約5毫米）玻管，在火焰上加熱，待快熔時(shí)，快速拉成口徑極細(xì)的微吸管。將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，鏡檢。用微吸管挑選要分離的藻體，認(rèn)真仔細(xì)地吸出，放入另一淺凹載片上，鏡檢這一滴水中是否達(dá)到純分離的目的。如不成功，應(yīng)反復(fù)幾次，直至達(dá)到分離目的為止。然后移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一般在每個(gè)培養(yǎng)皿中接20～30個(gè)個(gè)體。從分離出少量細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)到200毫升的培養(yǎng)量，如硅藻一般需20天以上。為了較長(zhǎng)時(shí)期保存藻種，可將分離到的藻種用青霉素（1000～5000單位或鏈霉素（20ppm）處理后，獲得較純?cè)宸N。

此法操作技術(shù)要求高，要細(xì)心。往往吸取一個(gè)細(xì)胞，要反復(fù)幾次才能成功，且適于分離個(gè)體較大藻類(lèi)。

2）水滴分離法 用微吸管吸取稀釋適度藻液，滴到消毒過(guò)載片上，水滴盡可能滴小些，要求在低倍鏡視野中能看到水滴全部或大部分。一個(gè)載片上滴2～4滴，間隔一定距離，作直線(xiàn)排列。如一滴水中只有幾個(gè)所需同種藻類(lèi)個(gè)體，無(wú)其他生物混雜，即用吸管吸取培養(yǎng)液，把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)滅菌試管或小三角瓶中去。如未成功，需反復(fù)重做，直到達(dá)到目的。

此法簡(jiǎn)便易行，尤其適宜于分離已在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢(shì)種類(lèi)。分離受少量生物污染培養(yǎng)液中的藻類(lèi)多用此法。操作時(shí)同樣要求細(xì)致、認(rèn)真，使用工具及培養(yǎng)液經(jīng)嚴(yán)格消毒。

3）稀釋分離法 把含有需要分離的藻類(lèi)而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養(yǎng)液稀釋。通過(guò)稀釋到適宜程度的方法，達(dá)到把原混雜生物單個(gè)分離培養(yǎng)的目的。

首先把水樣稀釋到每一滴含有一個(gè)左右的生物細(xì)胞（也可能一個(gè)都沒(méi)有，也可能有兩個(gè)），在稀釋過(guò)程中配合顯微鏡檢查，調(diào)節(jié)稀釋度，然后準(zhǔn)備裝有1/4容量培養(yǎng)液的試管20支，每一試管加入稀釋適宜水樣一滴，搖勻，進(jìn)行培養(yǎng)。待藻類(lèi)生長(zhǎng)繁殖達(dá)一定濃度時(shí)，再檢查是否達(dá)到分離目的，若未達(dá)到，再重復(fù)做。

此法操作簡(jiǎn)單易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分離法效果好。

4）平板分離法 這個(gè)方法的培養(yǎng)基制備和分離方法，與菌類(lèi)的平板分離法基本相同，只是培養(yǎng)基配方不同。也可將稀釋藻液裝入消毒過(guò)的小型噴霧器中（可使用醫(yī)用喉頭噴霧器），打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，把藻液噴射在培養(yǎng)基平面上，形成分布均勻的薄層水珠。

接種后，蓋上蓋，放在適宜的光、溫條件下培養(yǎng)。一般經(jīng)過(guò)十余天，就可在培養(yǎng)基上發(fā)生互相隔離的藻類(lèi)群落，通過(guò)顯微鏡檢查，尋找需要的純?cè)迦郝洌缓笥孟具^(guò)的接種環(huán)移植到另一平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可直接移植到裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過(guò)滅菌的試管或小三角燒瓶中，加消毒棉花塞子，進(jìn)行培養(yǎng)。

此法較繁，但難度不大，而且可看到是否污染雜菌，對(duì)于分離已污染雜菌培養(yǎng)液的藻類(lèi)更合適。

5）底棲藻的分離 在顯微鏡或放大鏡下挑取個(gè)體，一般可接種在固體培養(yǎng)基平板上，反復(fù)挑選、培養(yǎng)。

6）分離浮游藍(lán)藻 可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分離硅藻則可利用其易沉淀的特性。

用以上各種方法分離到藻種，需放在適宜光照條件下（靠南或北窗口附近光線(xiàn)充足處，但嚴(yán)防陽(yáng)光直射）培養(yǎng)，有條件的可控制溫度和利用人工光源。培養(yǎng)時(shí)，每天輕輕搖動(dòng)1～2次，但需注意勿把培養(yǎng)液沾濕棉塞，避免雜菌污染。經(jīng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)物顏色逐漸變深。再經(jīng)一次顯微鏡檢查，如無(wú)其他混雜生物，才達(dá)到單種培養(yǎng)目的。

2．藻種的培養(yǎng)

獲得單種培養(yǎng)后，一方面擴(kuò)大培養(yǎng)，另一方面可把藻種作較長(zhǎng)時(shí)間保存，需要時(shí)隨時(shí)取出使用。藻種培養(yǎng)要求比較嚴(yán)格，培養(yǎng)容器可用各種不同大小的三角燒瓶，容量有100、300、500、1000毫升，適于逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)容器和工具需經(jīng)煮沸滅菌或使用化學(xué)藥品滅菌后，用煮沸水沖洗，培養(yǎng)液用加熱滅菌法滅菌。按種后瓶口用滅菌紙包扎，放在適宜光、溫條件下培養(yǎng)，每天輕輕搖動(dòng)二次。大約二周后進(jìn)行一次移植。藻種在培養(yǎng)過(guò)程中必須定期用顯微鏡檢查，保持不受其他生物污染。

3．藻種的保藏

可接在固體培養(yǎng)基上，在常溫、弱光下保藏半年到一年；也可在低溫下（冰箱內(nèi)）保藏，每天接受短時(shí)間（幾個(gè)小時(shí)）弱光，可保藏2～3年；如不照光，只能保藏幾個(gè)月。保藏藻種所用培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分濃度應(yīng)比正常培養(yǎng)基高一些，一般可增加一倍，瓊脂量為1～1.5％。也可在固體培養(yǎng)基上，再加培養(yǎng)液，然后接種到培養(yǎng)液中，可以避免固體培養(yǎng)基干涸，保藏效果比單用固體好。

4．培養(yǎng)液和培養(yǎng)基的配方

配方極多，每種配方主要適用于一定藻種，這里介紹比較常用的幾種：

水生4號(hào)和克諾普（Knop）培養(yǎng)液，一般用于綠藻；藍(lán)藻可用朱氏10號(hào)或水生105號(hào)無(wú)氮培養(yǎng)基（后者適于固氮藍(lán)藻）；硅藻可用朱氏10號(hào)和水生硅1號(hào)培養(yǎng)基；另外還有海產(chǎn)綠藻、硅藻的培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1。

以上用水量都是加至1000mL，海藻培養(yǎng)液用海水，如無(wú)海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例制備。如配制固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)液內(nèi)加入1.5％瓊脂。

從以上各種配方，可看到配制藻類(lèi)培養(yǎng)液的幾條原則：

（1）要有適量氮源（除固氮藍(lán)藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機(jī)氮等。

（2）應(yīng)包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等。

（3）要考慮各種鹽類(lèi)總濃度和pH是否適合藻類(lèi)需要，可用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH。

（4）要加入各種藻類(lèi)需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（后幾種包括在土壤抽出液中）。

（5）要滿(mǎn)足某些藻類(lèi)特殊需要，如藍(lán)藻需鉬，硅藻需硅。

（6）要添加適量生長(zhǎng)物質(zhì)如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。

5．大量培養(yǎng)過(guò)程

包拈接種、培養(yǎng)、采收等。

（1）接種：一般要求選取生活力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛藻種?？上葘饪s藻種用連續(xù)稀釋法，制備一定濃度的懸浮藻液，然后接入培養(yǎng)容器。接種時(shí)注意藻種和培養(yǎng)液比例要適當(dāng)，使藻細(xì)胞在新培養(yǎng)液中達(dá)到一定數(shù)量。使一開(kāi)始培養(yǎng)，藻類(lèi)在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢(shì)，另一方面還可縮短培養(yǎng)周期，這是培養(yǎng)得到成功的經(jīng)驗(yàn)之一。在環(huán)境條件不很適合情況下，更需提高接種量。一般所用藻種濃度，根據(jù)藻類(lèi)體積大小，每毫升30萬(wàn)～300萬(wàn)個(gè)，采用1∶2～1∶5的比例。還需注意接種時(shí)間，在自然光條件下，最好在上午8～10時(shí)，不宜在晚上。尤其是能運(yùn)動(dòng)種類(lèi)，此時(shí)明顯向上浮游，接種時(shí)可把上浮優(yōu)質(zhì)藻類(lèi)吸出做藻種，起選種作用。

（2）培養(yǎng)管理：主要是使已接種培養(yǎng)物在相對(duì)穩(wěn)定適宜環(huán)境中大量繁殖生長(zhǎng)。要注意以下因素：

1）二氧化碳濃度在開(kāi)放式不通氣方法培養(yǎng)中，攪拌是十分必要的，可以增加水和空氣的接觸面，使空氣中二氧化碳溶解到培養(yǎng)液中，而且?guī)椭恋碓孱?lèi)細(xì)胞上浮獲得光照。在通氣培養(yǎng)中，培養(yǎng)液內(nèi)應(yīng)維持二氧化碳濃度在0.1～5％之間。

2）光照強(qiáng)度 利用太陽(yáng)光源培養(yǎng)時(shí)，一般在室內(nèi)培養(yǎng)可放在近窗口地方，防止強(qiáng)直射光照射?；蚶萌斯す庠矗?0～100瓦電燈或日光燈），需1500～3000勒克斯/厘米2。

3）溫度 適溫一般在10～30℃之間，最適溫常為20～25℃。若在室外培養(yǎng)，夏季中午高溫，冬季早晚低溫，常造成不利影響，需設(shè)法調(diào)節(jié)。

4）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng) 應(yīng)不斷添加新鮮培養(yǎng)液，及時(shí)補(bǔ)充被藻吸收后減少了的某些元素。

5）注意pH變化 如變動(dòng)過(guò)大，可用酸、堿調(diào)節(jié)。

6）適當(dāng)控制培養(yǎng)物中藻細(xì)胞濃度 過(guò)高會(huì)引起光照和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)不足，并導(dǎo)致pH上升。一般控制在0.3g（干重）/L范圍內(nèi)。

7）及時(shí)觀察和檢查藻類(lèi)生長(zhǎng)情況 可以通過(guò)培養(yǎng)物呈現(xiàn)的顏色、藻類(lèi)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)情況、是否有沉淀附壁、菌膜及敵害生物污染跡象等觀察而了解一般的生長(zhǎng)情況。藻種和中繼培養(yǎng)每半月進(jìn)行一次全面顯微鏡檢查。大量培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有不正常現(xiàn)象，應(yīng)立即鏡檢，目的有兩個(gè)：了解藻細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并檢查有無(wú)敵害生物污染。

（3）采收：培養(yǎng)液中藻體的適時(shí)采收，既是培養(yǎng)的目的，也是繼續(xù)培養(yǎng)的手段。因?yàn)橥ㄟ^(guò)采收一部分藻體，可使藻細(xì)胞濃度保持恒定。通常在培養(yǎng)物細(xì)胞濃度達(dá)到干重0.4～0.5克/升時(shí)，即可采收培養(yǎng)總量1/3的藻體。

采收時(shí)，先攪拌培養(yǎng)物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明礬或6％飽和石灰水。約1～2小時(shí)，藻細(xì)胞即可完全沉淀，取出沉淀，離心、濃縮、烘干。在大型培養(yǎng)池中采收藻體，可另外設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)墓に嚵鞒獭?/p>

第二篇：微生物的分離與培養(yǎng)

病原物的分離與培養(yǎng)

病原物的分離與培養(yǎng)在植物病害的研究中具有重要意義，分離、培養(yǎng)病原菌的方法是植物病理學(xué)研究工作中最常應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。一方面，在一個(gè)新的病害研究中，通過(guò)分離與培養(yǎng)獲得病原物的純培養(yǎng)，完成柯氏法則，以明確該病病原；研究病原物的生物學(xué)特性和病害循環(huán)（侵染、病程等等）。所謂病原物的分離，即把該病原菌從發(fā)病組織上與其他微生物分開(kāi)；所謂病原物的培養(yǎng)，即將分離的病原菌移到可以讓這種病原菌正常生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)即培養(yǎng)基上，從而獲得其純培養(yǎng)。病原物的分離與培養(yǎng)，需經(jīng)以以幾個(gè)步驟: 1.有關(guān)器皿的滅菌和消毒； 2.制作培養(yǎng)基； 3.病原菌的分離 4.病原菌的培養(yǎng)。－、滅菌與消毒

滅菌與消毒是兩個(gè)不同的概念。滅菌則是指殺死一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體和孢子。消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營(yíng)養(yǎng)體，在植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場(chǎng)所都要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒和滅菌。消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過(guò)濾、輻射和使用化學(xué)藥品等方法。

(一)熱力滅菌

熱力滅菌分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類(lèi)。

1．干熱滅菌

干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)疑固性與其本身的含水量有關(guān)。在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高(160～170℃)，時(shí)間長(zhǎng)1～2 h。但干熱滅菌溫度不能超過(guò)180 ℃，否則包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的儀器是烘箱。

干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種。火焰燒灼滅菌適用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，無(wú)菌操作時(shí)酌試管口和瓶口也在火焰上作短暫燒灼滅菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后進(jìn)行灼燒滅菌。通常所說(shuō)的干熱滅菌是在烘箱內(nèi)利用高溫干燥空氣(160～170℃)進(jìn)行滅菌。此法適用于玻璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等的滅菌。

進(jìn)行干熱滅菌要注意以下問(wèn)題：物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通；滅菌物品不要接觸烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火；在升溫過(guò)程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內(nèi)停止加溫；電烘箱內(nèi)溫度未降到70℃以前，切勿自行打開(kāi)箱門(mén)以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。濕熱滅菌

(1)高壓蒸汽滅菌 此法是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，0.1MPa，121℃保持15～30 min進(jìn)行滅菌。時(shí)間的長(zhǎng)短可根據(jù)滅菌物品種類(lèi)和數(shù)量的不同而有所變化，以達(dá)到徹底滅菌。這種滅菌適用于培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的滅菌。

(2)常壓蒸汽滅菌 在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下：常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌法。對(duì)于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法可用阿諾氏流動(dòng)蒸汽滅菌器進(jìn)行，也可用普通蒸籠進(jìn)行滅菌。由于常壓，其溫度不超過(guò)100℃，僅能使大多數(shù)微生物被殺死，而芽孢細(xì)菌卻不能在短時(shí)間內(nèi)殺死，因此可采用間歇滅菌以殺死芽孢細(xì)菌，達(dá)到徹底滅菌的目的。

常壓間歇滅菌是將滅菌培養(yǎng)基放人滅菌器內(nèi)，每天加熱100℃，30 min，連續(xù)3 d，第一天加熱后，其中的營(yíng)養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物取出放室溫下18～24 h，使其中的芽孢發(fā)育成營(yíng)養(yǎng)體，第二天再加熱100℃，30 min，發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)體又被殺死，但可能仍留有芽孢，故再重復(fù)一次，使徹底滅菌。

(二)過(guò)濾除菌

許多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加熱消毒滅菌方法，—均會(huì)被熱破壞，因此采用過(guò)濾除菌的方法。應(yīng)用最廣泛的過(guò)濾器有：

(1)蔡氏過(guò)濾器 該過(guò)濾器是由石棉制成的圓形濾板和一個(gè)特制的金屬（銀或鋁）漏斗組成，分上、下兩節(jié)。過(guò)濾時(shí)，用螺旋把石棉板緊緊夾在上、下兩節(jié)濾器之間，然后將溶液臵于濾器中抽濾。每次過(guò)濾必須用一張新濾板。根據(jù)其孔徑大小，濾板分為3種型號(hào)：K型最大，作一般澄清用；EK濾孔較小，用來(lái)除去一般細(xì)菌；EK-S濾孔最小，可阻止大病毒通過(guò)。使用時(shí)可根據(jù)需要選用。

(2)微孔濾膜過(guò)濾器 這是一種新型濾器，其濾膜是用醋酸纖維酯和硝酸纖維酯的混合物制成的薄膜。微孔濾膜過(guò)濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝臵的塑料蓋盒組成。出口處可連接針頭，入口處可連接針筒。使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達(dá)到除菌的目的。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過(guò)濾除菌。實(shí)驗(yàn)室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm，但若要將病毒除掉，則需更小孔徑的微孔濾膜。微孔濾膜過(guò)濾除菌的主要操作步驟為：

① 組裝、滅菌 將0.22μm孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊。壓平，包裝滅菌后待用(0.1MPa、121.5℃滅菌：20 min)。連接。將滅菌濾器的入口在無(wú)菌條件下，以無(wú)菌操作方式連接于裝有待濾溶液注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無(wú)菌試管中。

② 壓濾 將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠壓過(guò)濾到無(wú)菌試管中。濾畢，將針頭撥出。壓濾時(shí)，用力要適當(dāng)，不可太猛太快，以免細(xì)菌被擠壓通過(guò)濾膜。

提示: 整個(gè)過(guò)程應(yīng)在無(wú)菌條件下嚴(yán)格無(wú)菌操作以防污染，過(guò)濾時(shí)應(yīng)避免各連接處出現(xiàn)滲透現(xiàn)象。

(三)輻射滅菌 紫外線(xiàn)滅菌是用紫外線(xiàn)燈進(jìn)行的。波長(zhǎng)為200～300 nm的紫外線(xiàn)都有殺菌能力，其中以260 nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長(zhǎng)一定的條件下，紫外線(xiàn)的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線(xiàn)殺菌機(jī)理主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成過(guò)氧化氫(H2O2)。O3和H2O2有殺菌作用。紫外線(xiàn)穿透力不大，所以只適用于無(wú)菌室、接種箱的空氣及物體表面的滅菌。

注意事項(xiàng): 紫外線(xiàn)對(duì)眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用，對(duì)皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線(xiàn)燈光，更不能在紫外線(xiàn)燈光下工作。紫外線(xiàn)燈距照射物以不超過(guò)1.2 m為宜。

此外，采用60Co-γ射線(xiàn)滅菌，也已廣泛用于不能進(jìn)行加熱滅菌的紙、塑料薄膜，各種積層材料制作的容器以及醫(yī)用生物敷料皮等的滅菌。γ射線(xiàn)滅菌的最大優(yōu)點(diǎn)是穿透力強(qiáng)，可在厚包裝完好條件下滅菌。

(四)化學(xué)藥品滅菌

化學(xué)藥品消毒滅菌法是應(yīng)用能抑制或殺死微生物的化學(xué)制劑進(jìn)行消毒滅菌的方法。能破壞細(xì)菌代謝機(jī)能并有致死作用的化學(xué)藥劑為殺菌劑，如重金屬離子等；只是阻抑細(xì)菌代謝機(jī)能，使細(xì)菌不能增殖的化學(xué)藥劑為抑菌劑，如磺胺類(lèi)及大多數(shù)抗生素等?；瘜W(xué)藥品對(duì)微生物的作用是抑菌還是殺菌以及作用效果還與化學(xué)藥品濃度的高低、處理微生物的時(shí)間長(zhǎng)短、微生物的種類(lèi)以及微生物所處的環(huán)境等有關(guān)。

植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用的化學(xué)藥品有2％煤酚皂溶液(來(lái)蘇爾)、0.25％新潔爾滅、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。

消毒與滅菌不僅是從事植物病理學(xué)和整個(gè)生命科學(xué)研究必不可少的重要環(huán)節(jié)和實(shí)用技術(shù)，而且在醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、食品、生物制品等各方面均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)不同的使用要求和條件選用合適的消毒滅菌的方法。

二、培養(yǎng)基的制作

1、目的要求

了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握培養(yǎng)基的制備方法。

2、基本原理

在植物病理學(xué)研究工作中經(jīng)常要使用各種不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是按照生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)，用人工方法配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。其中含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素以及水分等。微生物在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖還必須在最適pH范圍內(nèi)才能生長(zhǎng)得更好，因此，對(duì)不同種類(lèi)的微生物應(yīng)將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到一定的pH范圍。－般而言，真菌調(diào)節(jié)到微酸，細(xì)菌調(diào)節(jié)到微堿。

培養(yǎng)基的種類(lèi)很多，不同的微生物所需要的培養(yǎng)基不同。依物理性狀可分為液體的、固體的和半固體的三種。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入1.5 %～2 %的瓊脂，半固體培養(yǎng)基是加入0.2 %～0.5 %的瓊脂。瓊脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。

根據(jù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源的不同，培養(yǎng)基可分為天然、半合成和合成培養(yǎng)基三類(lèi)。天然培養(yǎng)基是以自然界原有的有機(jī)物為材料經(jīng)滅菌后制成，如馬鈴薯、胡蘿卜、水果、大麥粒、高粱粒等。半合成培養(yǎng)基中既有一些天然的有機(jī)物質(zhì)，又有一些成分簡(jiǎn)單或明確的化合物。如常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、肉汁胨培養(yǎng)基(NA)等。合成培養(yǎng)基是由一些成分明確的化合物配制而成的，無(wú)任何成分不明確的物質(zhì)，常用于研究微生物的生理生化性狀，如查氏(Czapek)培養(yǎng)基等。

根據(jù)培養(yǎng)基用途不同，可分為生長(zhǎng)繁殖培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基、貯存培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基等。在植物病理學(xué)研究中，最常用培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，主要用于分離培養(yǎng)病原真菌。

在培養(yǎng)基配制完之后，必須經(jīng)過(guò)滅菌，以便徹底殺死其中原有的一切微生物。

3、材料、試劑與儀器 材料 馬鈴薯。

試劑 葡萄糖、瓊脂等。

儀器與用品 高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(或酸度計(jì))、試管、鋁鍋、攪拌棒、三角瓶、燒杯、漏斗、量筒、紗布、棉花、天平等。

4、操作步驟

PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20g、蒸餾水1000 ml，自然pH。

在PDA培養(yǎng)基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，這樣配制的培養(yǎng)基也稱(chēng)為PSA培養(yǎng)基。(1)稱(chēng)量 稱(chēng)量去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g。提示：瓊脂加入的量取決于瓊脂的質(zhì)量，質(zhì)量好的15 g就夠了，質(zhì)量差的應(yīng)適當(dāng)增加。另外，在夏天氣溫較高時(shí)，適當(dāng)增加用量。

(2)將馬鈴薯切成小塊，放入鍋中，加水1000 ml，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)?/p>

(3)將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂，加熱熔化。

提示：在瓊脂熔化的過(guò)程中，需要用玻璃棒不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入適量的水以補(bǔ)充加熱過(guò)程中損失的水分，定容至1000 ml。

提示：通常在制作培養(yǎng)基的鍋內(nèi)用紅藍(lán)鉛筆標(biāo)記出不同體積的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容時(shí)直接將水加至已標(biāo)記的刻度即可。

(5)分裝 根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可將配制的培養(yǎng)基分裝于試管內(nèi)或三角瓶?jī)?nèi)。分裝試管，其量為管高的1／5，滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的容量以不超過(guò)三角瓶容積之一半為宜。

(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脫脂的經(jīng)彈松的棉花，棉塞可過(guò)濾空氣，防止雜菌侵入并可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，故在植物病理學(xué)研究工作中普遍使用。

正確的棉塞是形狀、劃、、松緊與管口或瓶口完全適合，過(guò)緊時(shí)妨礙空氣流通，操作不便；過(guò)松則達(dá)不到濾菌的目的，且棉塞過(guò)小往往容易掉進(jìn)試管內(nèi)。正確的棉塞頭較大，約有1／3在外，2／3在試管內(nèi)。分裝過(guò)程中注意不要使培養(yǎng)基沾染在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起污染。

(7)包扎 加塞后，將試管用線(xiàn)繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道線(xiàn)繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、配制日期、組別、制作人等。

(8)滅菌 將上述培養(yǎng)基以0.1MPa，121℃，高壓蒸氣滅菌20 min。

(9)擱臵斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基豎臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱臵的斜面長(zhǎng)度以不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半為宜。

培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37℃溫箱培養(yǎng)24h，無(wú)菌生長(zhǎng)者方可使用。

PDA培養(yǎng)基一般不需要調(diào)pH。對(duì)于要調(diào)節(jié)pH的培養(yǎng)基，一般用pH試紙測(cè)定其pH。如果培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿破壞培養(yǎng)基成分。

三、病原菌的分離培養(yǎng)和純化

1、目的要求

(1)了解分離與純化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和組織分離、稀釋分離、平板劃線(xiàn)分離的基本操作技術(shù)。

(3)掌握在平板、斜面及液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原菌及觀察其培養(yǎng)性狀的方法。

2、基本方法

植物病原真菌的分離方法主要有組織分離法和稀釋分離法兩種。最常用的方法是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產(chǎn)生大量孢子的病原真菌的分離。病原細(xì)菌的分離方法以劃線(xiàn)分離法為最常用，在有些情況下也采用稀釋分離法。

為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須要進(jìn)行分離菌的純化，純化的方法類(lèi)似于分離工作中采用的稀釋分離法或劃線(xiàn)分離法。

3、材料、儀器與用具 3.1 材料

(1)稻瘟?。ㄈ~、病節(jié)、病穗頸）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）。(3)黃瓜灰霉?。˙otrytis cineria）。(4)番茄灰霉?。ü?Botrytis cinerea)。

(5)黃瓜菌核?。ü?Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黃瓜細(xì)菌性角斑?。ㄈ~）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。

(7)水稻白葉枯?。ㄈ~）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜軟腐?。ㄈ~）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。

3.2．培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；肉膏蛋白脈培養(yǎng)基；加寄主組織煎汁的培養(yǎng)基等。

3.3．儀器與用品 超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、吸管、吸水紙、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、鑷子、接種鏟(針)、接種環(huán)(鉺)、70％酒精、0.1％升汞、酒精燈、火柴、記號(hào)筆、橡皮筋套、可調(diào)式電爐、不銹鋼鍋等。

4、實(shí)驗(yàn)操作

(一)病原真菌的分離

1．組織分離法 其步驟為：

(1)取滅菌培養(yǎng)皿一個(gè)，臵于濕紗布上，在皿蓋上用玻璃鉛筆注明分離日期、材料和分離人的姓名。提示：無(wú)菌操作應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：工作前將所需的物品都放在超凈工作臺(tái)內(nèi)；操作前用肥皂洗手，操作時(shí)還需用70 ％酒精擦拭雙手；無(wú)菌操作時(shí)，呼吸要輕，不要說(shuō)話(huà)。

（2）用無(wú)菌操作法向培養(yǎng)皿中加入25％乳酸1～2滴(可減少細(xì)菌污染)，然后將融化而冷至60℃左右的PDA培養(yǎng)基倒人培養(yǎng)皿中，每皿倒10～15 ml，輕輕搖動(dòng)使之成平面。凝固后即成平板培養(yǎng)基。

提示：加入25％乳酸1～2滴，可減少平板上出現(xiàn)污染細(xì)菌菌落。除乳酸外，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)目咕匾种萍?xì)菌的生長(zhǎng)，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 細(xì)菌生長(zhǎng)；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-細(xì)菌生長(zhǎng)；加鏈霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分細(xì)菌的生長(zhǎng)。除了氯霉素可在滅菌前加入外，其他抗菌素都應(yīng)在滅菌后并冷卻到45℃左右(以手背觸三角瓶感到燙，但尚可以忍耐為宜)時(shí)加入。倒平板過(guò)程中只要遵循“穩(wěn)、輕、快”要領(lǐng)，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌葉斑病的新鮮病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個(gè)病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣(病健交界處，)切取小塊(每邊長(zhǎng)3～4 mm)病組織數(shù)塊。

提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機(jī)會(huì)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點(diǎn)病害應(yīng)在臨近健組織的部分分離。

（4）將病組織放入70％酒精中浸3～5s后，按無(wú)菌操作法將病組織移入0.1％升汞液中分別表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒劑)，如植物組織柔嫩，則表面消毒時(shí)間宜短；反之則可長(zhǎng)些。然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留的消毒劑。

提示：先用70％的酒精浸2～3 s是為了消除寄主表面的氣泡，減少表面張力，70％的酒精亦用于表面消毒，處理的時(shí)間較短(一般數(shù)秒至l min)升汞溶液消毒的時(shí)間因材料而異，可自30s至30min不等，一般情況下，需時(shí)間3～5 min。

(5)用無(wú)菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放4～6塊。

提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無(wú)菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染。

(6)將培養(yǎng)皿倒臵放入25℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般3～4 d后觀察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果。

(7)若病組織小塊上均長(zhǎng)出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。在無(wú)菌條件下，用接種針(鏟)自菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上，在25 ℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，如無(wú)雜菌生長(zhǎng)即得該分離病菌純菌種，便可臵于冰箱中保存。

提示：除根據(jù)菌落的一致性初步確定長(zhǎng)出的菌落是否目標(biāo)菌外，還要在顯微鏡下檢查，進(jìn)一步確定。如果是對(duì)未知病原菌的組織分離，則要將長(zhǎng)出的菌落分別轉(zhuǎn)出，通過(guò)進(jìn)一步的接種實(shí)驗(yàn)明確哪一種為其病原菌。

在組織分離工作中，如果植物材料體積較大且較軟(如患灰霉病的番茄果實(shí))，在分離過(guò)程中可直接挖取內(nèi)部患病組織移入平板培養(yǎng)基上，完成分離工作。

2.稀釋分離法

(1)取滅菌培養(yǎng)皿三個(gè)，平放在濕紗布上，編號(hào)，并注明日期、分離材料及分離人姓名。

(2)用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一皿中分別注入0.5～1.0 ml。(3)用移植環(huán)蘸一滴孢子懸浮液，與第一個(gè)培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，再?gòu)牡谝粋€(gè)培養(yǎng)皿移三環(huán)到第二個(gè)培養(yǎng)皿中，混合后再移三環(huán)到第三個(gè)培養(yǎng)皿中。

(4)將熔化并冷卻到45～50℃的培養(yǎng)基，分別倒在三個(gè)培養(yǎng)皿中(為防止細(xì)菌污染，也可以向每個(gè)培養(yǎng)皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，搖勻，凝固，要使培養(yǎng)基與稀釋的菌液充分混勻。

提示： 倒平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度一定要掌握好，過(guò)熱易將病原菌燙死而使分離失敗，過(guò)冷則倒入培養(yǎng)皿中后難以形成平板，不利于分離。

(5)將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)后臵恒溫箱(25℃)中培養(yǎng)，數(shù)日后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

(6)挑菌 將培養(yǎng)后長(zhǎng)出較為整齊一致的單個(gè)菌落分別挑取，接種到斜面培養(yǎng)基上，臵25℃左右培養(yǎng)。待菌長(zhǎng)出后，檢查菌是否單純，若有其他菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離純化，直到獲得純培養(yǎng)。

(二)病原細(xì)菌的分離

病原細(xì)菌的分離方法以稀釋分離法和劃線(xiàn)分離法為最常用。在進(jìn)行分離之前，首先應(yīng)對(duì)病組織材料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)初步診斷，即經(jīng)過(guò)鏡檢確認(rèn)有噴菌現(xiàn)象以后，才對(duì)該病組織作分離工作。稀釋分離法是最經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)分離法，方法同上述真菌分離。

除去上述稀釋分離法以外，較為方便的是劃線(xiàn)分離法：(1)預(yù)先把熔化好的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝成平板后，翻轉(zhuǎn)放在30℃恒溫箱中2～4 h，使表面無(wú)水滴凝結(jié)。也可凝成平板后直接使用。(2)將病組織先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用無(wú)菌水換洗3次后，放在滅菌培養(yǎng)皿中的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并讓組織碎塊在水中浸泡20～60 min，讓細(xì)菌釋放到滅菌水中。

(3)用滅菌的接種鉺，(接種環(huán))；蘸取浸泡液在干燥的培養(yǎng)基平板表面劃線(xiàn)，盡量不要把平板表面劃破。劃過(guò)第一批線(xiàn)后的接種環(huán)應(yīng)放在火焰上燒灼，冷卻后直接在第一批劃線(xiàn)的末端向另一方向劃線(xiàn)。滅菌后再劃第三次線(xiàn)。

提示：劃過(guò)第一批線(xiàn)后接種鉺放在火焰上燒過(guò)這一步驟非常重要，這樣做可以使第一批線(xiàn)和第二批線(xiàn)上的細(xì)菌數(shù)量相差很大。

(4)用玻璃鉛筆在培養(yǎng)皿上寫(xiě)上分離材料、日期和分離者姓名后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，放在26～28℃恒溫箱中培養(yǎng)。1～3 d后觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，在哪些地方有單菌落生長(zhǎng)出來(lái)?其中的優(yōu)勢(shì)單菌落應(yīng)為待分離菌形成的。

(5)仔細(xì)挑取病原菌的單菌落，并移植到斜面培養(yǎng)基上。同時(shí)，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮液作第二次劃線(xiàn)分離，經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時(shí)，即表明已獲得純培養(yǎng)。最好要經(jīng)過(guò)連續(xù)三次單菌落的分離，才能確保純化。

(三)真菌、細(xì)菌培養(yǎng)性狀

1．真菌培養(yǎng)性狀觀察 取已分離，純化的某種真菌菌種；按前述稀釋分離法中(1)～(5)步驟進(jìn)行，待某培養(yǎng)皿中形成單個(gè)菌落后觀察。記載以下內(nèi)容：菌落顏色、菌叢密集及繁茂程度、是否有色素分泌出來(lái)而滲透到培養(yǎng)基中、菌落生長(zhǎng)速度快慢等。同時(shí)要記載培養(yǎng)基種類(lèi)(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

2．細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察

(1)仿照上述真菌菌落形成步驟，觀察記載以下內(nèi)容：菌落顏色、菌落邊緣形狀、菌落表面是光亮還是粗糙或有皺折、、菌落隆起情況、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中，菌落生長(zhǎng)速度快慢，是否有特殊氣味形成等。同時(shí)要記載培養(yǎng)基種類(lèi)(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

(2)用接種鉺(環(huán))蘸細(xì)菌菌種后，通過(guò)無(wú)菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培養(yǎng)基表面從下向上劃一直線(xiàn)，過(guò)2～3 d后長(zhǎng)出的細(xì)菌群體稱(chēng)為菌苔，可仿照觀察記載細(xì)菌菌落的記載內(nèi)容，記載菌苔顏色、邊緣形狀、表面是光亮還是粗糙有皺折、隆起情況、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中，是否有特殊氣味生成，生長(zhǎng)速度快慢等。也要記載培養(yǎng)基種類(lèi)(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

(3)用接種鉺(環(huán))蘸取細(xì)菌菌種后，通過(guò)無(wú)菌操作，將其接種在某種液體培養(yǎng)基中，數(shù)日后觀察記載培養(yǎng)基中是否變混濁、是否有色素、氣體、沉淀生成，培養(yǎng)液表面是否可生成菌膜等。也要記載培養(yǎng)基種類(lèi)(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

第三篇：病原菌分離培養(yǎng)總結(jié)

病原菌的分離培養(yǎng)方法

一、基本原理

植物病原菌的分離培養(yǎng)，是植物病理實(shí)驗(yàn)室工作中的基本技能。為了獲得某微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、酸堿度、氧氣等條件要求不同，而供給它們適宜的生活條件，即讓病原菌生活在適宜的培養(yǎng)基上，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長(zhǎng)，而抑制其他菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而得到純菌株。

植物病原真菌的分離方法主要有組織分離法和稀釋分離法兩種。最常用的方法是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產(chǎn)生大量孢子的病原真菌的分離。

為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須要進(jìn)行分離菌的純化，純化的方法類(lèi)似于分離工作中采用的稀釋分離法或劃線(xiàn)分離法。

二． 病原真菌的分離培養(yǎng)（花生褐斑病為例）

1.分離的準(zhǔn)備工作

（1）分離材料準(zhǔn)備：花生褐斑病葉片：病斑圓形或近圓形暗褐色、黑褐色，淡黃色暈圈。背面有許多黑色小點(diǎn)，呈同心輪紋狀排列。

（2）培養(yǎng)基的準(zhǔn)備: PDA培養(yǎng)基,加熱熔化，紫外滅菌后倒板； ?（3）分離工作儀器與用品：超鏡工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、無(wú)菌培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、接種鏟(針)、70％酒精、0．1％升汞、酒精燈、火機(jī)、記號(hào)筆、橡皮筋套、可調(diào)式電爐等。（升汞是劇毒藥物，在操作時(shí)應(yīng)特別小心）。

2.組織分離法

（1）工作前用肥皂洗手，無(wú)菌操作前還要用70％酒精擦拭雙手；在使用無(wú)菌操作間時(shí)，呼吸要輕，不要說(shuō)話(huà)。

（2）酒精燈放入中間合適位置，點(diǎn)燃后不要在移動(dòng)，保證火焰周?chē)鸁o(wú)菌環(huán)境；

（3）取花生褐斑病的癥狀典型病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個(gè)病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣(病健交界處)切取小塊病組織數(shù)塊。（選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機(jī)會(huì)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點(diǎn)病害應(yīng)在臨近健全組織的部分分離。）（4）表面消毒：用菌培養(yǎng)皿一次準(zhǔn)備流程（75%酒精—0.1%升汞—無(wú)菌水—無(wú)菌水—無(wú)菌水），將病組織放人70％酒精中浸3—5s后，按無(wú)菌操作法將病組織移人0．1％升汞液中分別表面消毒1 min左右（如植物組織柔嫩，則表面消毒時(shí)間宜短；反之則可長(zhǎng)些），然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留的消毒劑。

（5）用無(wú)菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放3-5塊。（在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無(wú)菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染）。

（6）將培養(yǎng)皿倒置放人25 ℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般3—4d后觀察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果；若病組織小塊上均長(zhǎng)出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。

（7）除根據(jù)菌落的一致性初步確定長(zhǎng)出的菌落是否目標(biāo)菌外，還要在顯微鏡下檢查，并且根據(jù)保濕培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)一步確定；

（8）在無(wú)菌條件下，用打孔菌落邊緣挑取小塊移入培養(yǎng)基上，在25℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，如無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即得該分離病菌純菌種，便可保存。

三． 病原細(xì)菌的分離培養(yǎng)（蘿卜黑腐病為例）

1.分離的準(zhǔn)備工作

（1）分離材料準(zhǔn)備：蘿卜黑腐病俗稱(chēng)黑心、爛心，該病是由細(xì)菌引起的病害。主要危害葉和根。幼苗期發(fā)病子葉呈水浸狀，根髓變黑腐爛。葉片發(fā)病，葉緣多處產(chǎn)生黃色斑，后變“V”字形向內(nèi)發(fā)展，葉脈變黑呈網(wǎng)紋狀，逐漸整葉變黃干枯。病菌沿葉脈和維管束向短縮莖和根部發(fā)展，最后使全株葉片變黃枯死。蘿卜肉質(zhì)根受浸染后，透過(guò)日光可看到暗灰色病變；橫切蘿卜可看到維管束呈放射線(xiàn)狀、黑褐色；重者呈干縮空洞，維管束溢出菌膿，這一點(diǎn)與缺硼引起的生理性變黑不同。

（2）培養(yǎng)基的準(zhǔn)備:PDA，后劃線(xiàn)純化NB；

（3）分離工作儀器與用品：超鏡工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、無(wú)菌培養(yǎng)皿、剪刀、解剖刀、鑷子、70％酒精、酒精燈、火機(jī)、記號(hào)筆、橡皮筋套、可調(diào)式電爐等。

2.黑腐病菌分離（1）工作前用肥皂洗手，無(wú)菌操作前還要用70％酒精擦拭雙手；在使用無(wú)菌操作間時(shí)，呼吸要輕，不要說(shuō)話(huà)。

（2）酒精燈放入中間合適位置，點(diǎn)燃后不要在移動(dòng)，保證火焰周?chē)鸁o(wú)菌環(huán)境；

（3）取蘿卜黑腐病塊莖，用75 %酒精進(jìn)行表面消毒；用滅菌解剖刀切去表面，并向內(nèi)切取病組織，切成長(zhǎng)條小塊（2mm*3mm），用無(wú)菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放3-5塊。（在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無(wú)菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染）。

（4）將培養(yǎng)皿倒置放人28 ℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般3—4d后觀察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果；若病組織小塊上均長(zhǎng)出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。

（5）根據(jù)菌落的一致性初步確定長(zhǎng)出的菌落，選擇長(zhǎng)出的三種菌落（黃、紅、生防），分別在無(wú)菌條件下在NB培養(yǎng)基進(jìn)行劃線(xiàn)；在28℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時(shí)，即表明已獲得純培養(yǎng)；最好要經(jīng)過(guò)連續(xù)三次單菌落的分離，才能確保純化。（6）觀察到的菌落特征：蘿卜黑腐病菌，圓形，同心環(huán)狀，內(nèi)環(huán)呈金黃色，外圍白色菌膿，濕潤(rùn)，隨環(huán)隆起、凹陷，半透明，邊緣不整齊。

四．資料查詢(xún)其他分離培養(yǎng)方法

1.病原真菌 稀釋分離法

(1)取滅菌培養(yǎng)皿三個(gè)，平放在濕紗布上，編號(hào)，并注明日期、分離材料及分離人姓名。

(2)用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一皿中分別注入0．5～1．0ml。

(3)用移植環(huán)蘸一滴孢子懸浮液，與第一個(gè)培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，再?gòu)牡谝粋€(gè)培養(yǎng)皿移三環(huán)到第二個(gè)培養(yǎng)皿中，混合后再移三環(huán)到第三個(gè)培養(yǎng)皿中。

(4)將熔化開(kāi)冷卻到45～50C的培養(yǎng)基，分別倒在三個(gè)培養(yǎng)皿中(為防止細(xì)菌污染，也可以向每個(gè)培養(yǎng)皿中事先加入1-2滴25％乳酸)，搖勻，凝固，要使培養(yǎng)基與稀釋的菌液充分混勻。

提示：倒平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度一定要掌握好，過(guò)熱易將病原菌燙死而使分離失敗，過(guò)冷則倒入培養(yǎng)皿中后難以形成平板，而成為起伏不平的表面，不利于分離。為大體估計(jì)培養(yǎng)基溫度，可將盛培養(yǎng)基的器皿靠在人手背上，如果手背感到燙但尚可以忍耐，則大體為45~50C。

(5)將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)后置恒溫箱(25℃)中培養(yǎng)，數(shù)日后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

(6)挑菌。將培養(yǎng)后長(zhǎng)出較為整齊一致的單個(gè)菌落分別挑取，接種到斜面培養(yǎng)基上，置25℃左右培養(yǎng)。待菌長(zhǎng)出后，檢查菌是否單純，若有其他菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離純化，直到獲得純株培養(yǎng)。

2.病原細(xì)菌

病原細(xì)菌的分離方法以稀釋分離法和劃線(xiàn)分離法為最常用。在進(jìn)行分離之前，首先應(yīng)對(duì)病組織材料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)初步診斷，即經(jīng)過(guò)鏡檢確認(rèn)有噴菌現(xiàn)象以后，才對(duì)該病組織作分離工作。稀釋分離法是最經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)分離法，方法同上述真菌分離。

除去上述稀釋分離法以外，較為方便的是劃線(xiàn)分離法：

(1)預(yù)先把熔化好的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒在培養(yǎng)皿中，凝成平板后，翻轉(zhuǎn)放在30C恒溫箱中2—4h，使表面無(wú)水滴凝結(jié)。也可凝成平板后直接使用。

(2)將病組織先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min，再用無(wú)菌水換洗3次后，放在滅菌培養(yǎng)皿中的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并讓組織碎塊在水中浸泡20—60min，讓細(xì)菌釋放到滅菌水中。

(3)用滅菌的接種鉺(接種環(huán))蘸取浸泡液在干燥的培養(yǎng)基平板表面劃線(xiàn)，盡量不要把平板表面劃破。劃過(guò)第一批線(xiàn)后的接種環(huán)應(yīng)放在火焰上燒灼．冷卻后直接在第一批劃線(xiàn)的末端向另一方向劃線(xiàn)。滅菌后再劃第三次線(xiàn)。

提示：劃過(guò)第一批線(xiàn)后接種鉺放在火焰上燒過(guò)這一步驟非常重要，這樣做可以使第一批線(xiàn)和第二批線(xiàn)上的細(xì)菌數(shù)量相差很大。

(4)用玻璃鉛筆在培養(yǎng)皿上寫(xiě)上分離材料、日期和分離者姓名后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，放在26～28C恒溫箱中培養(yǎng)。1—3d后觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，在哪些地方有單菌落生長(zhǎng)出來(lái)?其中的優(yōu)勢(shì)單菌落應(yīng)為待分離菌形成的。

(5)仔細(xì)挑取病原菌的單菌落，并移植到斜面培養(yǎng)基上。同時(shí)，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮液作第二次劃線(xiàn)分離，經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時(shí)，即表明已獲得純培養(yǎng)。最好要經(jīng)過(guò)連續(xù)三次單菌落的分離，才能確保純化。

五． 常用的幾種典型的病原菌分離方法

1．斑點(diǎn)病原菌的分離。從病斑部分切取每邊3—5mm的小塊組織，在70％酒精中浸數(shù)秒鐘后，移人0．1％的升汞水溶液中處理3—5rain，以滅菌水沖洗3次，移置培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)。

2．維管束組織內(nèi)病原菌的分離。從根莖維管束組織分離病菌，可先將寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，將表皮組織用滅菌的解剖刀削去，然后切取其中小塊變色的維管束組織，用升汞或漂白粉液消毒后，用滅菌水沖洗幾次，移置培養(yǎng)基面上。

3．根腐病病原菌的分離。根腐或基腐病的分離，由材料的大小決定。材料小的可仿照斑點(diǎn)病的分離法，材料大的則可以用維管束組織內(nèi)病原的分離法。

4．肉質(zhì)組織中病原菌的分離。多肉的根、莖及果實(shí)等，可以采用維管束組織內(nèi)病菌分離法除去表面組織，切取小塊病組織分離。如有雜菌感染可采用“直接接種”法，待出現(xiàn)癥狀后，用此法再行分離。

5．種子內(nèi)病原菌分離。將整個(gè)種子或者種子的一部分進(jìn)行表面消毒(升汞或漂白粉)，用滅菌水洗滌后，移置培養(yǎng)基上。

6．孢子分離法。能產(chǎn)生大量孢子的病菌如青霉素、鏈格孢等，則可配制成孢子懸浮液以稀釋法或劃線(xiàn)法分離之。

7．土壤帶菌分離法。為了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，從有病的土壤中分離它們是必要的。分離方法是將土壤取出少許，配制成懸浮液，然后用稀釋法或劃線(xiàn)法分離。

第四篇：藻類(lèi)項(xiàng)目可行性研究報(bào)告

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藻類(lèi)項(xiàng)目可行性研究報(bào)告

藻類(lèi)包括數(shù)種不同類(lèi)以光合作用產(chǎn)生能量的生物。它們一般被認(rèn)為是簡(jiǎn)單的植物，并且一些藻類(lèi)與比較高等的植物有關(guān)。雖然其它藻類(lèi)看似從藍(lán)綠藻得到光合作用的能力，但是在演化上有獨(dú)立的分支。所有藻類(lèi)缺乏真的根、莖、葉和其它可在高等植物上發(fā)現(xiàn)的組織構(gòu)造。藻類(lèi)與細(xì)菌和原生動(dòng)物不同之處，是藻類(lèi)產(chǎn)生能量的方式為光合自營(yíng)性。

藻類(lèi)的概念古今不同。中國(guó)古書(shū)上說(shuō)：“薻，水草也，或作藻”。可見(jiàn)在中國(guó)古代所說(shuō)的藻類(lèi)是對(duì)水生植物的總稱(chēng)。

在中國(guó)現(xiàn)代的植物學(xué)中，仍然將一些水生高等植物的名稱(chēng)中貫以“藻”字（如金魚(yú)藻、黑藻、茨藻、狐尾藻等），也可能來(lái)源于此。與此相反，人們往往將一些水中或潮濕的地面和墻壁上個(gè)體較小，粘滑的綠色植物統(tǒng)稱(chēng)為青苔，實(shí)際上這也不是現(xiàn)在所說(shuō)的苔類(lèi)，而主要是藻類(lèi)。

藻類(lèi)藻類(lèi)植物并不是一個(gè)純一的類(lèi)群，各分類(lèi)系統(tǒng)對(duì)它的分門(mén)也不盡一致，一般分為藍(lán)藻門(mén)、眼蟲(chóng)藻門(mén)、金藻門(mén)、甲藻門(mén)、綠藻門(mén)、褐藻門(mén)、紅藻門(mén)等。藻類(lèi)的分類(lèi)有其特殊性，由于它們均無(wú)根、莖、葉等器官的分化，所以它們的分類(lèi)一般只能根據(jù)它們的形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)所含色素、貯藏養(yǎng)料和生殖方式以及生活史等來(lái)進(jìn)行。

另：提供國(guó)家發(fā)改委甲、乙、丙級(jí)工程咨詢(xún)資質(zhì)

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可行性研究報(bào)告大綱（具體可根據(jù)客戶(hù)要求進(jìn)行調(diào)整）第一章 藻類(lèi)項(xiàng)目總論

1.1藻類(lèi)項(xiàng)目概況

1.1.1藻類(lèi)項(xiàng)目名稱(chēng) 1.1.2藻類(lèi)項(xiàng)目建設(shè)單位

1.1.3藻類(lèi)項(xiàng)目擬建設(shè)地點(diǎn) 1.1.4藻類(lèi)項(xiàng)目建設(shè)內(nèi)容與規(guī)模 1.1.5藻類(lèi)項(xiàng)目性質(zhì)

1.1.6藻類(lèi)項(xiàng)目總投資及資金籌措 1.1.7藻類(lèi)項(xiàng)目建設(shè)期

1.2藻類(lèi)項(xiàng)目編制依據(jù)和原則

1.2.1藻類(lèi)項(xiàng)目編輯依據(jù) 1.2.2藻類(lèi)項(xiàng)目編制原則

1.3藻類(lèi)項(xiàng)目主要技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)

1.4藻類(lèi)項(xiàng)目可行性研究結(jié)論

第二章 藻類(lèi)項(xiàng)目背景及必要性分析

2.1藻類(lèi)項(xiàng)目背景

2.1.1藻類(lèi)項(xiàng)目產(chǎn)品背景

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2.1.2藻類(lèi)項(xiàng)目提出理由 2.2藻類(lèi)項(xiàng)目必要性

2.2.1藻類(lèi)項(xiàng)目是國(guó)家戰(zhàn)略意義的需要

2.2.2藻類(lèi)項(xiàng)目是企業(yè)獲得可持續(xù)發(fā)展、增強(qiáng)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的需要 2.2.3藻類(lèi)項(xiàng)目是當(dāng)?shù)厝嗣衩撠氈赂缓驮黾泳蜆I(yè)的需要

第三章 藻類(lèi)項(xiàng)目市場(chǎng)分析與預(yù)測(cè) 3.1產(chǎn)品市場(chǎng)現(xiàn)狀

3.3市場(chǎng)形勢(shì)分析預(yù)測(cè)

3.4行業(yè)未來(lái)發(fā)展前景分析

第四章 藻類(lèi)項(xiàng)目建設(shè)規(guī)模與產(chǎn)品方案

4.1藻類(lèi)項(xiàng)目建設(shè)規(guī)模

4.2藻類(lèi)項(xiàng)目產(chǎn)品方案

4.3藻類(lèi)項(xiàng)目設(shè)計(jì)產(chǎn)能及產(chǎn)值預(yù)測(cè)

第五章 藻類(lèi)項(xiàng)目選址及建設(shè)條件 5.1藻類(lèi)項(xiàng)目選址

5.1.1藻類(lèi)項(xiàng)目建設(shè)地點(diǎn)

5.1.2藻類(lèi)項(xiàng)目用地性質(zhì)及權(quán)屬 5.1.3土地現(xiàn)狀

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5.1.4藻類(lèi)項(xiàng)目選址意見(jiàn)

5.2藻類(lèi)項(xiàng)目建設(shè)條件分析 5.2.1交通、能源供應(yīng)條件 5.2.2政策及用工條件

5.2.3施工條件

5.2.4公用設(shè)施條件 5.3原材料及燃動(dòng)力供應(yīng)

5.3.1原材料 5.3.2燃動(dòng)力供應(yīng)

第六章 技術(shù)方案、設(shè)備方案與工程方案 6.1項(xiàng)目技術(shù)方案

6.1.1項(xiàng)目工藝設(shè)計(jì)原則 6.1.2生產(chǎn)工藝

6.2設(shè)備方案

6.2.1主要設(shè)備選型的原則 6.2.2主要生產(chǎn)設(shè)備 6.2.3設(shè)備配置方案 6.2.4設(shè)備采購(gòu)方式 6.3工程方案

6.3.1工程設(shè)計(jì)原則

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6.3.2藻類(lèi)項(xiàng)目主要建、構(gòu)筑物工程方案 6.3.3建筑功能布局 6.3.4建筑結(jié)構(gòu)

第七章 總圖運(yùn)輸與公用輔助工程 7.1總圖布置

7.1.1總平面布置原則

7.1.2總平面布置 7.1.3豎向布置

7.1.4規(guī)劃用地規(guī)模與建設(shè)指標(biāo) 7.2給排水系統(tǒng)

7.2.1給水情況

7.2.2排水情況

7.3供電系統(tǒng) 7.4空調(diào)采暖

7.5通風(fēng)采光系統(tǒng)

7.6總圖運(yùn)輸

第八章 資源利用與節(jié)能措施

8.1資源利用分析

8.1.1土地資源利用分析

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8.1.2水資源利用分析

8.1.3電能源利用分析

8.2能耗指標(biāo)及分析 8.3節(jié)能措施分析

8.3.1土地資源節(jié)約措施 8.3.2水資源節(jié)約措施

8.3.3電能源節(jié)約措施

第九章 生態(tài)與環(huán)境影響分析

9.1項(xiàng)目自然環(huán)境

9.1.1基本概況

9.1.2氣候特點(diǎn)

9.1.3礦產(chǎn)資源

9.2社會(huì)環(huán)境現(xiàn)狀

9.2.1行政劃區(qū)及人口構(gòu)成 9.2.2經(jīng)濟(jì)建設(shè)

9.3項(xiàng)目主要污染物及污染源分析 9.3.1施工期 9.3.2使用期

9.4擬采取的環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn) 9.4.1國(guó)家環(huán)保法律法規(guī)

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9.4.2地方環(huán)保法律法規(guī) 9.4.3技術(shù)規(guī)范

9.5環(huán)境保護(hù)措施

9.5.1施工期污染減緩措施 9.5.2使用期污染減緩措施

9.5.3其它污染控制和環(huán)境管理措施

9.6環(huán)境影響結(jié)論

第十章 藻類(lèi)項(xiàng)目勞動(dòng)安全衛(wèi)生及消防

10.1勞動(dòng)保護(hù)與安全衛(wèi)生

10.1.1安全防護(hù) 10.1.2勞動(dòng)保護(hù) 10.1.3安全衛(wèi)生 10.2消防

10.2.1建筑防火設(shè)計(jì)依據(jù)

10.2.2總面積布置與建筑消防設(shè)計(jì) 10.2.3消防給水及滅火設(shè)備 10.2.4消防電氣 10.3地震安全

第十一章 組織機(jī)構(gòu)與人力資源配置

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11.1組織機(jī)構(gòu)

11.1.1組織機(jī)構(gòu)設(shè)置因素分析 11.1.2項(xiàng)目組織管理模式

11.1.3組織機(jī)構(gòu)圖

11.2人員配置

11.2.1人力資源配置因素分析 11.2.2生產(chǎn)班制 11.2.3勞動(dòng)定員

表11-1勞動(dòng)定員一覽表

11.2.4職工工資及福利成本分析

表11-2工資及福利估算表 11.3人員來(lái)源與培訓(xùn)

第十二章 藻類(lèi)項(xiàng)目招投標(biāo)方式及內(nèi)容

第十三章 藻類(lèi)項(xiàng)目實(shí)施進(jìn)度方案 13.1藻類(lèi)項(xiàng)目工程總進(jìn)度

13.2藻類(lèi)項(xiàng)目實(shí)施進(jìn)度表

第十四章 投資估算與資金籌措

14.1投資估算依據(jù)

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14.2藻類(lèi)項(xiàng)目總投資估算

表14-1藻類(lèi)項(xiàng)目總投資估算表單位：萬(wàn)元

14.3建設(shè)投資估算

表14-2建設(shè)投資估算表單位：萬(wàn)元

14.4基礎(chǔ)建設(shè)投資估算

表14-3基建總投資估算表單位：萬(wàn)元

14.5設(shè)備投資估算

表14-4設(shè)備總投資估算單位：萬(wàn)元

14.6流動(dòng)資金估算

表14-5計(jì)算期內(nèi)流動(dòng)資金估算表單位：萬(wàn)元

14.7資金籌措

14.8資產(chǎn)形成第十五章 財(cái)務(wù)分析

15.1基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與參數(shù)選取

15.2營(yíng)業(yè)收入、經(jīng)營(yíng)稅金及附加估算

表15-1營(yíng)業(yè)收入、營(yíng)業(yè)稅金及附加估算表單位：萬(wàn)元 15.3總成本費(fèi)用估算

表15-2總成本費(fèi)用估算表單位：萬(wàn)元

15.4利潤(rùn)、利潤(rùn)分配及納稅總額預(yù)測(cè)

表15-3利潤(rùn)、利潤(rùn)分配及納稅總額估算表單位：萬(wàn)元

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15.5現(xiàn)金流量預(yù)測(cè)

表15-4現(xiàn)金流量表單位:萬(wàn)元 15.6贏利能力分析

15.6.1動(dòng)態(tài)盈利能力分析

16.6.2靜態(tài)盈利能力分析

15.7盈虧平衡分析

15.8財(cái)務(wù)評(píng)價(jià)

表15-5財(cái)務(wù)指標(biāo)匯總表

第十六章 藻類(lèi)項(xiàng)目風(fēng)險(xiǎn)分析

16.1風(fēng)險(xiǎn)影響因素

16.1.1可能面臨的風(fēng)險(xiǎn)因素 16.1.2主要風(fēng)險(xiǎn)因素識(shí)別

16.2風(fēng)險(xiǎn)影響程度及規(guī)避措施 16.2.1風(fēng)險(xiǎn)影響程度評(píng)價(jià)

16.2.2風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避措施

第十七章 結(jié)論與建議 17.1藻類(lèi)項(xiàng)目結(jié)論

17.2藻類(lèi)項(xiàng)目建議

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第五篇：香菇的組織分離及培養(yǎng)

香菇的組織分離和培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、了解食用菌的基礎(chǔ)知識(shí)。

2、了解、掌握食用菌培養(yǎng)基的配置原理。

3、通過(guò)平菇栽培實(shí)驗(yàn)，掌握食用菌代料栽培的一般方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

（食用菌的組織分離法）

食用菌的母種一般是采用孢子分離法或組織分離法得到的純培養(yǎng)物。利用食用菌子實(shí)體內(nèi)部組織進(jìn)行分離，是獲得母種最簡(jiǎn)便的方法。

三、實(shí)驗(yàn)材料

1、原種制作實(shí)驗(yàn)材料（1）食用菌：香菇。

（2）培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基斜面。

（3）儀器或其他用具： 75%酒精棉球、接種針記號(hào)筆等。

2、食用菌的組織

離

2、食用菌的組織分離

（1）試劑： 棉籽殼、麩皮、蔗糖、CaCO3（2）儀器或其他用具：平菇菌種、香菇菌種、金針菇菌種、姬菇菌種、茶樹(shù)菌種、臺(tái)秤、盆子、聚丙烯塑料袋、頸圈、封口膜、橡皮筋、高壓蒸氣滅菌鍋、pH試紙（pH 5.5—9.0）、記號(hào)筆、麻繩等

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、原種制作實(shí)驗(yàn)材料

（1）拌料 按培養(yǎng)料配方準(zhǔn)確稱(chēng)取所需棉籽殼和麩皮放入大盆中用手?jǐn)嚢杌旌暇鶆?，將所需的蔗糖和CaCO3溶于水中，然后潑灑在棉籽殼和麩皮上，邊加水邊攪拌，直至均勻。攪拌好后，燜30分鐘，使培養(yǎng)料吸水均勻。

（2）側(cè)培養(yǎng)水分 培養(yǎng)料攪拌好后，用于抓一把培養(yǎng)料握在手中，攥緊，手指縫中有水印但無(wú)水滴滴下，這時(shí)的含水量適合，為60%—62%，若含水量不足，可再加少量的水，充分?jǐn)嚢杈鶆?，在檢測(cè)，直至含水量合適為止。

（3）裝袋 邊加邊將培養(yǎng)料壓實(shí)，裝至3/4左右，袋口套上頸圈，用木棒在培養(yǎng)料中打一洞，蓋上封口膜，用橡皮筋扎緊。（4）滅菌 126 ℃高壓蒸氣滅菌90分鐘。

（5）接種 栽培袋冷卻到25℃左右，在超凈工作臺(tái)上用鑷子或接種槍夾取所需菌種（1個(gè)雞蛋大?。┓湃肱囵B(yǎng)料袋的洞中。

（6）培養(yǎng) 接種后的栽培袋，放入23-25℃培養(yǎng)室，堆放高度三至四層，空氣濕度60%-65%，每周翻堆一次，使上下發(fā)菌一致，同時(shí)挑出污染的栽培袋丟棄，一般30-40天，菌絲即可長(zhǎng)滿(mǎn)菌袋。

（7）出菇管理（8）采收

2、食用菌的組織分離

1、整菇插種法

（1）選擇種菇：選擇肥壯菇體作種菇；

（2）種菇消毒：取1張菇片，用 70%的酒精輕擦表面進(jìn)行消毒；

（3）菇肉接種：將菇片縱向撕開(kāi)，在每個(gè)裂面靠近菇柄與菌蓋的交界處取一米粒大小的菇肉組織接于PDA試管斜面上；

（4）培養(yǎng)：將試管斜面置于15～30℃下培養(yǎng)；

2、貼附法（1）、將接種針在酒精燈上灼燒，然后將接種針迅速插入斜面培養(yǎng)基的中間位置，使產(chǎn)生的水蒸氣冷凝到試管壁上，再用接種針勾取香菇小片剛破膜的成熟菌褶，貼附于斜面相對(duì)應(yīng)的試管相對(duì)應(yīng)的試管內(nèi)壁上，并使試管斜面朝上，平放在培養(yǎng)箱內(nèi)，12—24h后，在試管斜面上就落下許多孢子。

2、貼附法（1）、將接種針在酒精燈上灼燒，然后將接種針迅速插入斜面培養(yǎng)基的中間位置，使產(chǎn)生的水蒸氣冷凝到試管壁上，再用接種針勾取香菇小片剛破膜的成熟菌褶，貼附于斜面相對(duì)應(yīng)的試管相對(duì)應(yīng)的試管內(nèi)壁上，并使試管斜面朝上，平放在培養(yǎng)箱內(nèi)，12—24h后，在試管斜面上就落下許多孢子。

（2）在無(wú)菌條件下，用接種針將貼附在試管壁上的菌褶取出。

（3）將試管放入25℃溫箱中培養(yǎng)1—2周，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，選菌絲純潔、粗壯、生長(zhǎng)旺盛的試管進(jìn)行保存并作出菇實(shí)驗(yàn)。

3、懸鉤法（1）、在350ml容積的三角瓶?jī)?nèi)，裝入50ml馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，瓶口處垂掛一根“S”形的鐵絲鉤，塞上棉塞進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，冷卻后在將三角瓶放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2—3天，使培養(yǎng)基表面的冷凝水蒸發(fā)，備用。

（2）將銀耳或木耳的新鮮子實(shí)體在無(wú)菌水中洗滌3次。

（3）在無(wú)菌室內(nèi)用滅菌濾紙將耳片上的水吸干，如耳片過(guò)大，可用滅菌刀片切去一部分，然后將耳片懸鉤在“S”形鉤子上，子實(shí)體面朝下放入三角瓶?jī)?nèi)，將耳片離培養(yǎng)基2—3cm，勿使耳片碰到三角瓶壁，并將三角瓶移到有散射光的地方，在18—25℃下放置12—20h，即將有很多孢子散落在培養(yǎng)基表面上。

（4）取出耳片，將三角瓶至于28—30℃的恒溫箱，待孢子萌發(fā)后，將萌發(fā)的孢子帶著培養(yǎng)基塊移入新的試管斜面培養(yǎng)基內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，待長(zhǎng)出純凈、潔白的菌絲后即視為分離成功。

五、注意事項(xiàng)

1、在整個(gè)操作過(guò)程中都要注意無(wú)菌操作，一切用具都要消毒。

2、要等刀片冷卻后再切取組織塊。

3、栽培種在培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)經(jīng)常檢查，污染袋要及時(shí)檢查出處理掉。經(jīng)過(guò)30—40天的培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)袋后即可使用。若菌袋內(nèi)長(zhǎng)出原基，說(shuō)明菌種已經(jīng)老化。若有黃、綠、黑等雜色斑點(diǎn)或連成片時(shí)，說(shuō)明菌種已經(jīng)污染，不可使用。

4、菌種的選擇：優(yōu)質(zhì)菌種是決定栽培產(chǎn)量的主要因素。菌種選擇不當(dāng)會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)量。一般選擇外觀為白色的菌種。如有其它真菌污染, 從菌種外觀上可看到其它顏色的菌落。正常的原種和栽培種在生長(zhǎng)中和長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)都應(yīng)色澤鮮亮、上下一致、潔白、而不應(yīng)灰暗蒼白。如果一瓶(袋)菌種, 上下色澤不一致, 特別是上部灰暗時(shí), 應(yīng)剔除不用。

5、優(yōu)質(zhì)的栽培材料和良好的栽培環(huán)境：原料是提供食用菌發(fā)菌和出菇的物質(zhì)條件。不管利用什么原料, 都必須嚴(yán)格掌握質(zhì)量, 其中生料和發(fā)酵料尤為重要。基本要求是: 原料新鮮、干凈、無(wú)霉變, 沒(méi)有因潮濕而產(chǎn)生的結(jié)塊。播種前和栽培管理中后期, 必須對(duì)栽培場(chǎng)所進(jìn)行認(rèn)真的清潔和消毒。、