第一篇：免疫細(xì)胞的分離和保存技術(shù)

免疫細(xì)胞的分離和保存技術(shù)

用體外方法對機(jī)體各種具有免疫反應(yīng)的細(xì)胞分別作鑒定、計(jì)數(shù)和功能測定，是觀察機(jī)體免疫狀態(tài)的一種重要手段。為此，須將各種參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞從血液或臟器中分離出來。參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞主要包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等。由于檢測的目的和方法有同，分離細(xì)胞的需求和技術(shù)也異。有的僅需分離白細(xì)胞，有的則需分離單個(gè)核細(xì)胞（mononuclearcell），其中含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（monocyte），有的則需分離T細(xì)胞和B細(xì)胞以及其亞群。分離細(xì)胞選用的方法應(yīng)力求簡便可行，并能獲得高純度、高獲得率、高活力的細(xì)胞?，F(xiàn)用分離細(xì)胞群的原則，一是根據(jù)各類細(xì)胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以組分，另一則按照各類細(xì)胞的表面標(biāo)志，包括細(xì)胞表面的抗原和受體加以選擇性分離。

一、白細(xì)胞的分離

（一）血液中紅細(xì)胞與白細(xì)胞比例約600～1000:1，兩者的比重不同其沉降速度亦異，通常用兩種方法加以分離。

本法是利用血細(xì)胞自然沉降率的分離法，采集血液后應(yīng)及時(shí)抗凝，通常選用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白而防止血液凝固。操作原則是將含抗凝血的試管直立靜置室溫30～60min后，血液分成明顯三層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細(xì)胞，緊貼紅細(xì)胞層上面的灰白層為白細(xì)胞，輕輕吸取即得富含白細(xì)胞的細(xì)胞群，離心洗滌后加入少量蒸餾水或含氯化銨的Gey溶液，經(jīng)短時(shí)間的低滲處理，使紅細(xì)胞裂解，經(jīng)過反復(fù)洗滌可得純度較高的白細(xì)胞懸液。

（二）聚合物加速沉淀法

本法是利用高分子量的聚合物如明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使紅細(xì)胞凝集成串，加速紅細(xì)胞沉降，使之與白細(xì)胞分離。本法的細(xì)胞獲得率比自然沉降法高。

二、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離

外周血中單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，紅細(xì)胞和多核白細(xì)胞密度較大，為1.090左右，而淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞密度為1.075～1.090，血小板為1.030～1.035。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。

（一）Ficoll分層液法

主要用于分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，是一種單次密度梯度離心分離法。聚蔗糖－泛影葡胺是一種較理想的細(xì)胞分層液，其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖（商品名為Ficoll），分子量為40kD，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點(diǎn)。高濃度的Ficoll溶液粘性高，易使細(xì)胞聚集，故通常使用60g/L的低濃度溶液，密度為1.020，添加比重為1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。國外常用商品Isopaque或Hypaque，故又稱Ficoll-Hypaque分層液，將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合適分層液。分離人外周淋巴細(xì)胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳，因?yàn)槿说募t細(xì)胞密度為1.093，粒細(xì)胞密度為1.092，單個(gè)核細(xì)胞在1.076～1.090之間。而不同動(dòng)物血中的單個(gè)核細(xì)胞對分離液的密度要求各不相同，如小鼠為1.088，馬為1.090。分離時(shí)先將分層液置試管底層，然后將肝素化全血以Hanks液或PBS液作適當(dāng)稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個(gè)清晰的界面。水平式離心后，離心管中會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)不同層次的液體和細(xì)胞帶（圖20-1）。

紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液，同時(shí)因紅細(xì)胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中，唯有與分層液密度相當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)核細(xì)胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細(xì)胞遞經(jīng)洗滌高心重懸。本法分離單個(gè)核細(xì)胞純度可達(dá)95％，淋巴細(xì)胞約占90％～95％，細(xì)胞獲得率可達(dá)80％以上，其高低與室溫有關(guān)，超過25℃時(shí)會(huì)影響細(xì)胞獲得率。

（二）Percoll分層液法

這是一種連續(xù)密度梯度離心分離法。Percoll是一種經(jīng)聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細(xì)胞無毒性。利用Percoll液經(jīng)高速離心后形成一個(gè)連續(xù)密度梯度的原理，將密度不等的細(xì)胞分離純化。用Percoll原液(密度1.135)與約等量雙離子強(qiáng)度的磷酸緩沖液均勻混合，高速離心后，使分層液形成一個(gè)從管底到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度，再將已制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液輕輕疊加在液面上，低速離心后，便得四個(gè)細(xì)胞層。表層為死細(xì)胞殘片和血小板，底層為粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，中間有兩層，上層富含單個(gè)核細(xì)胞(75％)，下層富含淋巴細(xì)胞(98％)(圖-2)。該法是純化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的一各較好的方法，但操作流程較長，手續(xù)較多。

圖-2 連續(xù)密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞中各細(xì)胞成分的分布示意圖

三、淋巴細(xì)胞及其亞群的分離

為研究免疫細(xì)胞的功能，常需高純度的淋巴細(xì)胞或其亞群，分離方法介紹如下。

（一）、純淋巴細(xì)胞群的采集

通常利用單核細(xì)胞在37℃和Ca2+存在條件下，能主動(dòng)粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，據(jù)此建立許多從單個(gè)核細(xì)胞懸液中去除單核細(xì)胞的方法，藉以獲得高純度的淋巴細(xì)胞群。

（1）粘附貼壁法

將已制備的單個(gè)核細(xì)胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細(xì)胞幾乎為純淋巴細(xì)胞，繼用橡皮刮下貼壁的細(xì)胞即為純單核細(xì)胞群。因B細(xì)胞也有貼壁現(xiàn)象，用本法分離的淋巴細(xì)胞群中B細(xì)胞有所損失。

（2）吸附柱過濾法

將單個(gè)核細(xì)胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細(xì)胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞。此法簡單易行，對細(xì)胞極少損害。

（3）磁鐵吸引法

利用單核細(xì)胞具有吞噬的特性，在單個(gè)核細(xì)胞懸液中加直徑為3μm的羰基鐵顆粒，置37℃溫箱內(nèi)短時(shí)旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，待單核細(xì)胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細(xì)胞。

（二）、淋巴細(xì)胞亞群的分離

分離相當(dāng)純化的淋巴細(xì)胞亞群是細(xì)胞免疫檢驗(yàn)的基本技術(shù)。其原則是根據(jù)相應(yīng)細(xì)胞的特性和不同的標(biāo)志加以選擇性純化。凡根據(jù)細(xì)胞的特性和標(biāo)志選擇純化所需細(xì)胞的方法是陽性選擇法；而選擇性去除不要的細(xì)胞，僅留下所需的細(xì)胞是為陰性選擇。常用以下幾種方法：

（1）E花環(huán)沉降法

本法是將淋巴細(xì)胞與一定比例的綿羊紅細(xì)胞混合，待淋巴細(xì)胞形成E花環(huán)后，繼用淋巴細(xì)胞分層液分離細(xì)胞。浮懸在分層界面而不形成E花環(huán)的群則富含B細(xì)胞，而沉降在管底的形成E花環(huán)的細(xì)胞用低滲法處理，使圍繞細(xì)胞周圍的綿羊紅細(xì)胞快速裂解，則獲得純的T細(xì)胞。

（2）尼龍毛分離法

本法利用B細(xì)胞和單核細(xì)胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性，可將T和B細(xì)胞分開。操作原則是取松散而經(jīng)過處理的尼龍毛（聚酰胺纖維），均勻充填在內(nèi)徑5～6nm的聚乙烯塑料管（飲料管即可）內(nèi)，經(jīng)Hanks液浸透保溫，將單個(gè)核細(xì)胞懸液加入柱內(nèi)，放37溫箱靜置1～2h。用預(yù)溫的含10％～20％小牛血清培養(yǎng)液灌洗，洗脫液內(nèi)含有非粘附的T細(xì)胞，重復(fù)灌洗幾次以除去管內(nèi)殘留的T細(xì)胞。再用冷或溫培養(yǎng)液邊沖邊洗邊擠壓塑料管，此時(shí)洗脫液內(nèi)富含B細(xì)胞。如此得到的T細(xì)胞純度在90％以上，B細(xì)胞純度可達(dá)80％。

（3）親和板結(jié)合分離法

利用親和層析法分離淋巴細(xì)胞亞群，其原理是各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同的抗原性，將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上，繼加細(xì)胞懸液，凡抗原陽性的細(xì)胞則與相應(yīng)抗體結(jié)合，抗原陰性的細(xì)胞可從未吸附的細(xì)胞懸液中獲?。▓D-3）。同樣若用特異性抗原交聯(lián)在塑料板上，則可分離得具有特異抗原受體的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞受體與特異抗原或抗體接觸，可引起細(xì)胞激活，因此，凡欲去除細(xì)胞懸液內(nèi)某一細(xì)胞亞群時(shí)，本法更適用。如要分離CD4+或CD8+細(xì)胞，則可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。用抗Ig抗體則可分離B細(xì)胞。同樣，用活化的C3包被，可分離出有C3受體的細(xì)胞。

圖-3 親和分離法圖解

（4）熒光激活細(xì)胞分離儀分離法

熒光激活細(xì)胞分離儀（fluorescenceactivatedcellsorter，F(xiàn)ACS）主要由4部分組成：①細(xì)胞流動(dòng)系統(tǒng)及氣壓流速控制系統(tǒng)，②激光系統(tǒng)，③檢測與訊號處理系統(tǒng)，④細(xì)胞分選系統(tǒng)。其主要原理是細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動(dòng)系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個(gè)流經(jīng)檢測區(qū)進(jìn)行測定。當(dāng)細(xì)胞從流動(dòng)室噴嘴處流出時(shí)，超聲振蕩攪動(dòng)液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴（40000個(gè)/s），每小滴內(nèi)最多含一個(gè)細(xì)胞（其中只有百分之幾的液滴中含細(xì)胞），細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞的類型。如識(shí)別的是預(yù)計(jì)所需的細(xì)胞時(shí)（如T細(xì)胞、B細(xì)胞要其亞群），在細(xì)胞樣品流斷裂成小滴時(shí)，使液滴瞬即感應(yīng)陽電荷、陰電荷或不帶電荷，使所需的細(xì)胞在電場偏轉(zhuǎn)下進(jìn)入不同的收集管（圖-4）。用FACS分離細(xì)胞準(zhǔn)確快速，能保持細(xì)胞活力，并可在無菌條件下進(jìn)行，但儀器昂貴，極少用于常規(guī)，而多數(shù)僅作為研究的手段。

圖-4 熒光激活細(xì)胞分離儀簡圖

四、吞噬細(xì)胞的分離和收集

人外周血中單核－巨噬細(xì)胞可通過Pecoll密度梯度分離法獲取，但數(shù)量較少，用血量多。用斑蝥敷貼法可從人體組織液中獲取較純的巨噬細(xì)胞，不需作進(jìn)一步體外分離，細(xì)胞量損失較少。該法是用濾紙蘸取10％中藥斑蝥酒精浸出液，貼敷在臂內(nèi)側(cè)皮膚表面，4～5h后皮膚局部充血，48h后局部形成水皰，吸取皰中的組織液，內(nèi)含巨噬細(xì)胞。但此法對病人皮膚有一定損傷，有時(shí)可引起局部感染，應(yīng)慎用。

欲獲取小鼠、大鼠、豚鼠等小動(dòng)物的巨噬細(xì)胞，可經(jīng)腹腔內(nèi)注入少許石蠟油，3～4天后沖洗出腹腔滲出液，所得細(xì)胞懸液中70％～80％為巨噬細(xì)胞。

五、淋巴細(xì)胞的保存和活力測定

（一）、分離細(xì)胞的保存

在某些情況下，分離所得細(xì)胞需要加以保存，否則活力迅速下降，甚至死亡。

（1）短期保存技術(shù)

將分離到的細(xì)胞用適量含10％～20％滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養(yǎng)液稀釋重懸。所用培養(yǎng)液要求等滲，具緩沖作用，并對細(xì)胞無毒性。通常置4℃保存較好，可減低細(xì)胞代謝活動(dòng)。要注意不要迅速改變細(xì)胞所處的溫度，以免造成細(xì)胞“溫度”休克。

（2）長期冷凍保存技術(shù)

利用液氮深低溫（－196℃）環(huán)境保存細(xì)胞，是當(dāng)前世界上通用的細(xì)胞長期保存技術(shù)。其原理在于深低溫環(huán)境可中斷細(xì)胞的代謝，但在降溫過程由于冰晶的形成和滲透壓的改變均可導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和部分死亡，所以在冷凍過程中一定要加用冷凍保護(hù)劑，常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）。冷凍時(shí)的降溫速度和細(xì)胞解凍時(shí)的升溫速度對細(xì)胞活力的保存有很大影響。條件合適時(shí)，凍存細(xì)胞一旦復(fù)蘇，恢復(fù)37℃培養(yǎng)，其形態(tài)和代謝活動(dòng)均可恢復(fù)正常。操作的原則是先對需凍存的細(xì)胞作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，低速離心后，取沉積細(xì)胞用含10％二甲亞砜的小牛血清配制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管內(nèi)，速即放入降溫過渡站中，避免二甲亞砜對細(xì)胞的損傷。繼而進(jìn)行降溫冷凍，目前常用兩步降溫法，即迅速降溫至一選擇好的臨界溫作為過渡站，如－80℃低溫冰箱過夜，或在液氮罐液面以上的一層空間放置片刻，然后再放入液氮中。如需復(fù)蘇細(xì)胞，則需迅速解凍以恢復(fù)細(xì)胞的活力，要求在20s以內(nèi)完全融化。將凍存管自液氮中取出，立即放入40℃溫水中，融化后即從水中取出，吸出細(xì)胞懸液，加入10倍的培養(yǎng)液中混勻，繼而低速離心，盡快洗去保護(hù)劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)并檢查細(xì)胞活力，然后置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

（二）、細(xì)胞活力測定

細(xì)胞活力常用百分比表示，活力的大小對試驗(yàn)結(jié)果有很大影響。細(xì)胞活力的測定有許多方法，最簡便常用的方法是臺(tái)盼藍(lán)（trypanblue）染色法。臺(tái)盼藍(lán)又稱錐藍(lán)，是一種陰離子型染料，這種染料不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，但死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，可使染料通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使死細(xì)胞著色呈藍(lán)色。免疫檢測試劑中常用的防腐劑有硫柳汞、疊氮鈉、抗生素等。

1.疊氮鈉是HRP的抑制劑，凡是和HRP接觸的試劑，一定不能用；

2.硫柳汞在ELISA試劑中可普遍使用，但因其有毒，較少使用；

3.市面許多試劑盒產(chǎn)品，用抗生素做防腐劑較多，如慶大。

4.如果試劑僅在實(shí)驗(yàn)室短期使用，其實(shí)并不需加防腐劑，常規(guī)試劑放4度冰箱，抗體、酶等加甘油分裝凍存即可。

5.梅里埃生產(chǎn)的HIV診斷試劑中提到：對照血清的防腐用0.1g/L硫酸慶大霉素和0.2ml/L肉桂醛。

6.防污染可添加0.02%的疊氮鈉，或0.01%的硫柳汞。疊氮鈉在多數(shù)情況下有用且有效，但在有些實(shí)驗(yàn)中卻不合適，因?yàn)樗茏钄嗉?xì)胞的電子傳遞鏈，對許多生物體都有毒醫(yī)學(xué) 教育網(wǎng) 搜 集整理性，因此不能用于活體實(shí)驗(yàn)；因?yàn)楹邪被芨蓴_許多標(biāo)記方法；不能用于辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體。而硫柳汞不含氨基，不影響基質(zhì)的穩(wěn)定性。如果將抗體應(yīng)用于生物活性檢測、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，一般不使用任何防腐劑，這些實(shí)驗(yàn)用的抗體應(yīng)少量分裝冷存，切忌反復(fù)凍融。

7.吐溫-20是作為穩(wěn)定劑，可減少非特異性黏合。甘油是防止凍融過程中的固-液相變而引起蛋白變性，能有效地增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，-20度凍存時(shí)甘油的濃度可以在20~30%。

第二篇：細(xì)胞免疫療法最新調(diào)研

細(xì)胞免疫療法最新調(diào)研

一、以下為調(diào)研查到的確定開展細(xì)胞免疫療法的醫(yī)院（1）對細(xì)胞免疫療法極力推薦的三甲醫(yī)院：

1、廣州復(fù)大腫瘤醫(yī)院

? 國內(nèi)首批開展生物治療衛(wèi)生機(jī)構(gòu) ? 國內(nèi)率先開展聯(lián)合免疫療法治療方案醫(yī)院 ? 同時(shí)開展T-plus腫瘤免疫治療的研究與治療 ? 作術(shù)后及放化療后的配合使用細(xì)胞免疫治療

? 多應(yīng)用于：胰腺癌，肝癌，肺癌，食管癌，胃癌，乳腺癌

2、廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院 ? 國內(nèi)首批開展生物治療的衛(wèi)生機(jī)構(gòu) ? 研究：DC-CIK療法 ? 多應(yīng)用于：肝癌、胃癌 ? 應(yīng)用病例已達(dá)幾千余例（保留）

3、北京武警總隊(duì)第二醫(yī)院

? 中華醫(yī)學(xué)會(huì)腫瘤生物治療課題定點(diǎn)醫(yī)院 ? 國內(nèi)首家多細(xì)胞免疫治療醫(yī)院

? 研究：CIK細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD3AK細(xì)胞 ? 多應(yīng)用于：食道癌、肺癌、乳腺癌

? 應(yīng)用超過3000例

4、解放軍458醫(yī)院（廣州）? 細(xì)胞治療作為放化療的支持治療 ? 多應(yīng)用于：肺癌、乳腺癌、肝癌 ? 研究：DC細(xì)胞、CIK細(xì)胞、CAPRI細(xì)胞

5、天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院

? 到2008年9月，應(yīng)用CIK細(xì)胞對腫瘤患者實(shí)施免疫治療，已進(jìn)行300余例肺癌患者的治療。

6、解放軍第123醫(yī)院（安徽）? 安徽領(lǐng)先的腫瘤治療醫(yī)院 ? 研究：DC-CIK療法

? 多應(yīng)用：肝癌、食道癌、肺癌

7、漳州市醫(yī)院（福建）

? 生物免疫治療中心：一天接待不超過5名患者

8、解放軍第454醫(yī)院（南京）? 研究：DC-CIK療法 ? 多應(yīng)用：食道癌、膽癌

9、吉林省人民醫(yī)院

? 吉林省生物免疫治療最高可報(bào)90% ? 肺癌、胃癌

10、天津市人民醫(yī)院

? 多應(yīng)用：黑色素瘤、食道癌

? 研究：DC細(xì)胞、CIK細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD3AK細(xì)胞、γδT細(xì)胞

11、遼寧省人民醫(yī)院

? 多應(yīng)用：直腸癌、宮頸癌、乳腺癌 ? 研究：CIK細(xì)胞

12、上海仁濟(jì)醫(yī)院

? 應(yīng)用：乳腺癌、肺癌

13、遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 ? 多應(yīng)用：鼻咽癌、乳腺癌

14、?？谑腥嗣襻t(yī)院

? 海南生物診療報(bào)銷比例可達(dá)90% ? 研究：DC-CIK療法

? 應(yīng)用：胃癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌

15、洛陽市中心醫(yī)院

? 研究：NK細(xì)胞、T細(xì)胞（CLS生物療法）

16、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院

? 應(yīng)用：肝癌、胃癌

? 生物治療中心每日限制最多6人就診

17、解放軍漳州175醫(yī)院

18、武警山東省總隊(duì)醫(yī)院

? 應(yīng)用：肺癌、胃癌、腎癌、黑色素瘤

19、重慶市腫瘤醫(yī)院

? 研究：DC-CIK療法

? 應(yīng)用：肺癌，曾應(yīng)用于左腮腺米庫林氏病

20、山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院

（2）簡單提及有開展細(xì)胞免疫治療的醫(yī)院

1、中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院：簡單提及

2、廣州市第一人民醫(yī)院：生物免疫治療，“近期開展”。

3、廣東省第二人民醫(yī)院：免疫細(xì)胞治療，腫瘤二科。

4、廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院：詳細(xì)提及，腫瘤生物治療。

5、廣州軍區(qū)總醫(yī)院：生物治療

6、中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院：簡單提及。

7、南方醫(yī)院：有生物治療中心

8、廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院：自體細(xì)胞免疫治療技術(shù)取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展

9、粵北人民醫(yī)院：提及生物治療。

10、深圳市人民醫(yī)院：擁有生物治療室。

11、佛山市第一人民醫(yī)院：晚期肺癌和晚期胃腸癌的細(xì)胞免疫治療。

12、中國醫(yī)科院腫瘤醫(yī)院（北京）

13、第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院（上海）

（3）全國腫瘤排名較前并開展了細(xì)胞免疫治療的醫(yī)院：

1、中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院（排名第一）

2、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院（排名第二）

3、天津市腫瘤醫(yī)院（排名第三）

4、第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院（排名第五）

5、南方醫(yī)院（排名第八）

——相信還有很多已開展了細(xì)胞免疫療法，而未在官網(wǎng)或其他渠道宣傳的三甲醫(yī)院。

二、估算：

1、細(xì)胞免疫治療現(xiàn)行應(yīng)用較多的腫瘤類型為：肺癌、胃癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、乳腺癌。相關(guān)規(guī)定，三甲醫(yī)院才能資格開展細(xì)胞免疫療法。

2、開展生物細(xì)胞免疫治療的三甲醫(yī)院的比例：以廣東65家三甲醫(yī)院（2011年），可查的在官方網(wǎng)站記載有生物免疫療法的，共有13家，比例達(dá)到20%，若按照這個(gè)比例，全國共有超過1000家三甲醫(yī)院，則大約有200家三甲在開展生物細(xì)胞免疫治療腫瘤。

3、治療費(fèi)用：綜合幾家明確給出價(jià)格參考的醫(yī)院為依據(jù)，有治療胃癌在2.5至5萬一個(gè)療程，肝癌在3萬/療程，另有2.6萬/療程。我們保守估計(jì)以2.5萬/療程作為參考值。

4、療程的時(shí)間：可查的細(xì)胞免疫治療過程為：采血、培養(yǎng)、回輸三大塊，送GMP實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行體外誘導(dǎo)6-7天，然后分5-6天，每天2次回輸，約2周一個(gè)療程。

5、市場容量的估算：以現(xiàn)時(shí)細(xì)胞免疫療法的普及程度，按保守每家醫(yī)院5例/月，廣東省13家三甲1年約780例：2.5萬/療程* 780例=1950萬左右；全國約12000例，市場容量在2.7億到3億間。

第三篇：人體免疫細(xì)胞閱讀答案

閱讀短文，完成7～8題。（共4分）

人體免疫細(xì)胞能發(fā)現(xiàn)并殺死被感染的細(xì)胞而不傷害健康的細(xì)胞，其機(jī)理一直困惑著人們。科學(xué)家最近初步揭開了其中的奧秘，原來被感染的細(xì)胞能發(fā)出信號向免疫細(xì)胞求救。

美國馬里蘭大學(xué)的一個(gè)科研小組最近在英國《自然》雜志上發(fā)表論文指出，人體細(xì)胞中大都含有肽，它是細(xì)胞健康狀態(tài)的標(biāo)志物。細(xì)菌或病毒侵入細(xì)胞后會(huì)破壞該細(xì)胞，同時(shí)自己也分解繁殖。這時(shí)肽分子就會(huì)與細(xì)菌或病毒碎片結(jié)合。這樣，附近的免疫細(xì)胞就得到該細(xì)胞受感染的信號，然后通知其他免疫細(xì)胞一同將受感染的細(xì)胞及其中的感染物殺死。

該科研小組是利用X射線晶體分析法發(fā)現(xiàn)這一奧秘的。他們選用了能誘發(fā)某些白血病的HTLV病毒作為研究對象，并在免疫細(xì)胞T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了這一病毒的受體。當(dāng)肽分子與該病毒殘片結(jié)合后，就會(huì)激發(fā)附近的T細(xì)胞上該病毒的受體，從而使T細(xì)胞發(fā)揮作用?？茖W(xué)家說，T細(xì)胞上含有上百萬個(gè)不同的受體，利用它可發(fā)現(xiàn)大量細(xì)菌或病毒并將受其感染的細(xì)包殺死。

7．第二段中,它（肽）是細(xì)胞健康狀態(tài)的標(biāo)志物的意思是（▲）（2分）

A．人體細(xì)胞在健康狀態(tài)下，其中才會(huì)有肽分子存在。

B.肽在細(xì)菌或病毒入侵后能發(fā)生求救信號，維護(hù)人體健康。

C．人體在健康的狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)含有的肽相對較多。

D．肽分子能將入侵的細(xì)菌或病毒分解并與其碎片結(jié)合。

8．下列說法不符合原文意思的一項(xiàng)是（▲）（2分）

A．向免疫細(xì)胞發(fā)生求救信號的是人體細(xì)胞中的肽分子。

B．肽分子與細(xì)菌或病毒的碎片結(jié)合后，會(huì)激發(fā)T細(xì)胞內(nèi)肽的受體。

C．最終殺死細(xì)菌或病毒的是T細(xì)胞中的細(xì)菌或病毒的受體。

D．T細(xì)胞中的受體，不僅殺死了細(xì)菌或病毒，還殺死了受感染的細(xì)胞。

參考答案：

7、B [解題思路］

它（肽）是細(xì)胞健康狀態(tài)的標(biāo)志物的意思是肽在細(xì)菌或病毒入侵后能發(fā)出求救信號，維護(hù)人體健康。

A項(xiàng)把因果關(guān)系倒轉(zhuǎn)了。是肽維護(hù)人體健康，而不是在健康狀態(tài)下才會(huì)有肽分子存在。

C項(xiàng)也是犯了同樣的錯(cuò)誤，應(yīng)是有肽在，人體才會(huì)健康，而不是相反。

D項(xiàng)是從肽分子的功能方面說的，不是對題目中那句話的直接的解釋。

8、B項(xiàng)肽分子與細(xì)菌或病毒的碎片結(jié)合后，激發(fā)的是T細(xì)胞內(nèi)病毒的受體，而非肽的受體。

第四篇：食品分離技術(shù)

食品分離技術(shù)的現(xiàn)狀及研究進(jìn)展 分離操作在食品工業(yè)中的作用

隨著食品工業(yè)的發(fā)展，化工單元操作不斷向食品工業(yè)滲透并在食品加工領(lǐng)域內(nèi)實(shí)踐和提高，形成了適應(yīng)食品加工特殊要求的新的單元操作。由于食品加工所用的動(dòng)植物性原料幾乎都為固態(tài)和液態(tài)，為了使固體和液體原料成為多種美味可口、營養(yǎng)豐富的食品，首先必須提取其精華，揚(yáng)棄其糟粕，分離出不同成分并組合成不同種類的制品。同時(shí)為了做到有益無毒，風(fēng)味別致，又必須反復(fù)提純和精制。因此分離操作已在食品工業(yè)中占有相當(dāng)重要的地位，研究分離技術(shù)在食品加工中的應(yīng)用，對食品加工的科學(xué)化具有重要意義[1]。

食品分離技術(shù)在食品工業(yè)中具有相當(dāng)重要的地位。其重要性表為以下幾個(gè)方面:(1)食品分離技術(shù)是食品工業(yè)的基礎(chǔ)[2]。絕大多數(shù)食品工業(yè)都分離不開食品分離技術(shù)，其中不少行業(yè)都是以分離工程為主要生產(chǎn)工序的。例如植物油的提取，淀粉的分離，糖制品的分離以及精練提純等等。(2)食品分離技術(shù)能提高食品原料的綜合利用程度。在食品加工工程中運(yùn)用分離技術(shù)可以有效的利用食品原料中的各種成分，提高原料的綜合利用程度，就提高了食品原料的利用價(jià)值。例如采用有效的分離方法可以從茶葉下腳料中分離出茶多酚、茶堿等，從柑橙中分離甘橙油、果膠等，使原料利用率大為增值。制糖行業(yè)中色譜分離技術(shù)的應(yīng)用使得產(chǎn)糖率大大提高。(3)食品分離技術(shù)能保持和改進(jìn)食品的營養(yǎng)和風(fēng)味。采用現(xiàn)代分離技術(shù)可以將一些需在高溫下完成的工藝改為在常溫下進(jìn)行，這樣就可以大大地改善食品的色、香、味及營養(yǎng)。如用膜分離技術(shù)代替常規(guī)的蒸發(fā)濃縮和真空濃縮咖啡、果汁、茶汁等[3-4]。

(4)食品分離技術(shù)使產(chǎn)品符合食品衛(wèi)生要求。食品分離技術(shù)包括提取原料中的有益組分和去除其中的有害成分。如花生、玉米等油制品易受黃曲霉污染而產(chǎn)生黃曲霉素，所以在加工過程中必須用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑵淙コ?。?）現(xiàn)代食品分離技術(shù)能改變食品行業(yè)的生產(chǎn)面貌。現(xiàn)代分離技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用，往往可以使行業(yè)的生產(chǎn)面貌大為改觀。例如過去利用太陽能將海水濃縮后結(jié)晶制食鹽，如今利用食品分離技術(shù)制食鹽，使得整個(gè)行業(yè)生產(chǎn)面貌大大改觀。2 食品工業(yè)中的分離操作方法

分離技術(shù)在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用，并且與我們的日常生活息息相關(guān)，同時(shí)分離機(jī)技術(shù)也在不斷促進(jìn)其它學(xué)科的發(fā)展[5]。由于采用了有效的分離技術(shù)，能夠分離和提純較純的物質(zhì)，大大的推進(jìn)了化學(xué)學(xué)科的發(fā)展。又由于各種層析技術(shù)、超離心技術(shù)和電泳技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，使生物化學(xué)等生命科學(xué)得到了迅猛的發(fā)展。

分離操作包括機(jī)械分離和傳質(zhì)分離兩大類，機(jī)械分離是指被分離的混合物由多于一相的物料所組成，分離設(shè)備只是簡單地將混合物進(jìn)行相分離，它屬于非均相物系的分離，如沉降，過濾等。另一種分離操作是指依靠組分的擴(kuò)散和傳質(zhì)來完成的分離過程，故又稱擴(kuò)散分離或傳質(zhì)分離[6]。如蒸餾，吸收，萃取或膜分離等，適用于多組分均相混合物的分離以及非均相混合物的分離[7]。3 傳統(tǒng)的機(jī)械分離技術(shù)

在食品工業(yè)中，經(jīng)常會(huì)遇到需要將懸浮液或乳濁液中的兩相加以分離。即全部或部分地將這種非均相系的分散介質(zhì)和分散質(zhì)相分開。如奶油的制取，葡萄糖品體食品的獲得，以及澄清果蔬汁的制取都是兩相分離結(jié)果。3.1過濾

過濾過程是指分散介質(zhì)相對于分散質(zhì)的遷移過程。過濾操作的基本原理是利用一種能將懸浮固體微粒截留而使液體自由通過的多孔介質(zhì)，達(dá)到懸浮液中固體與液體分離的目的。此多孔介質(zhì)稱為過濾介質(zhì)。因此過濾只適用于懸浮液。

過濾設(shè)備在食品工業(yè)上的應(yīng)用非常廣泛:(1)作為一般固一液系的分離手段:如蔗掂榨汁中會(huì)有許多固形雜質(zhì)，除用澄清法外還須過濾精制。在食用油的浸取與精煉上，用板框壓濾機(jī)，箱式壓濾機(jī)和加壓葉濾機(jī)等設(shè)備可除去種子碎片和組織細(xì)胞，還可用于油類脫色后濾去漂白土等[8];(2)作為澄清設(shè)備:如對啤酒，葡萄酒，果汁，搪漿等用陶質(zhì)管濾機(jī)進(jìn)行過濾澄清。如制品含有極細(xì)固體微粒或呈膠泥狀，則過濾時(shí)一般以預(yù)授形式應(yīng)用助濾劑或?qū)⒅鸀V劑加人漿液中混合后再送人過濾機(jī)進(jìn)行過濾;(3)用過濾法除去微生物:管濾機(jī)常用于葡萄酒、啤酒和果汁的過濾以降低微生物的數(shù)目。3.2沉降

沉降過程是分散質(zhì)相對于分散介質(zhì)的相對遷移過程。在重力場中:使混合物中密度不同的兩相獲得分離的操作，稱重力沉降。根據(jù)分散質(zhì)集態(tài)的不同，可分為懸浮液沉降和乳濁液沉降。

實(shí)現(xiàn)重力沉降分離的設(shè)備稱為沉降器，按操作方式可分為間歇式，半連續(xù)式和連續(xù)式，無論是何種方式的沉降器，其生產(chǎn)能力Q都取決于沉降面積和沉降速度的乘積，而與沉降器的高度無關(guān)。故現(xiàn)代化的沉降器的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)都是截面大，高度低[9]。

沉降在食品工業(yè)中的應(yīng)用主要有三個(gè)方面：(1)以澄清為目的。如果汁、酒類等制品的澄清處理以除去懸浮液中的混濁雜質(zhì)。(2)以增稠為目的。如淀粉制造，首先利用沉降達(dá)到懸浮液的沉淀增濃。(3)以分級或分離為目的利用同一物質(zhì)的粒徑或不同物質(zhì)粒子的密度不同而使它們得到分離故沉降也是食品加工的常見手段。4 新型的分離技術(shù)

科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展導(dǎo)致了對分離技術(shù)的要求越來越高，分離的難度也越來越大[10]。特別是隨著各種天然資源的不斷開采使用，含有用物質(zhì)的資源逐步減少，迫使人們從含量較少的資源中去分離、提取有用物質(zhì)。所有這些，促進(jìn)了分離技術(shù)的不斷發(fā)展，舊的分離方法不斷改進(jìn)完善，新的分離方法不斷發(fā)現(xiàn)，如近幾十年來發(fā)展起來的一些新型傳質(zhì)分離技術(shù)，如膜分離技術(shù)，超臨界萃取技術(shù)及泡沫吸附分離技術(shù)等已引起了食品工業(yè)界的重視并已嶄露頭角[11]。4.1 膜分離技術(shù)

反滲透、超濾、微濾、電滲析這四大過程在技術(shù)上已經(jīng)相當(dāng)成熟，已有大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用，形成了相當(dāng)規(guī)模的產(chǎn)業(yè)，有許多商品化的產(chǎn)品可供不同用途使用[12]。（1）反滲透是利用反滲透膜(一般為均質(zhì)膜或表面致密的復(fù)合膜)選擇地透過溶劑的性質(zhì)，對溶液施加壓力，克服溶劑的滲透壓，使溶劑通過膜而從溶質(zhì)中分離出來的過程，這種技術(shù)可用于海水淡化、果蔬汁的濃縮、茶葉抽提液的濃縮等[13]。

（2）超濾應(yīng)用孔徑為10一ZOOA的超濾膜來過濾含有大分子或微細(xì)粒子的溶液，使之從溶液中分離的過程。與反滲透不同的是小分子溶質(zhì)與溶劑一起通過超濾膜[14]。這種分離過程可用于果蔬汁的濃縮和澄清、天然色素和食品添加劑的分離和濃縮、奶的分離和濃縮、酒和醋的澄清與提純等。

（3）微濾以孔徑小于10四的多孔膜過濾含有微粒的溶液將微粒從溶液中除去?？捎糜谑程堑木啤⒊吻?、過濾及啤酒的冷過濾除菌等。

（4）實(shí)質(zhì)上，電滲析可以說是一種除鹽技術(shù)，因?yàn)楦鞣N不同的水（包括天然水、自來水、工業(yè)廢水）中都有一定量的鹽分，而組成這些鹽的陰、陽離子在直流電場的作用下會(huì)分別向相反方向的電極移動(dòng)[15]。如果在一個(gè)電滲析器中插入陰、陽離子交換膜各一個(gè)，由于離子交換膜具有選擇透過性，即陽離子交換膜只允許陽離子自由通過，陰離子交換膜只允許陰離子以通過，這樣在兩個(gè)膜的中間隔室中，鹽的濃度就會(huì)因?yàn)殡x子的定向遷移而降低，而靠近電極的兩個(gè)隔室則分別為陰、陽離子的濃縮室，最后在中間的淡化室內(nèi)達(dá)到脫鹽的目的。

膜分離共同的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)約能源；②在常溫下進(jìn)行，特別適用于熱敏性物質(zhì)的處理，能夠防止食品品質(zhì)的惡化和營養(yǎng)成分及香味物質(zhì)的損失；③ 食品的色澤變化小，能保持食品的自然狀態(tài)；④設(shè)備體積小且構(gòu)造簡單，費(fèi)用較低，效率較高；⑤適用范圍廣，有機(jī)物和無機(jī)物都可濃縮，可用于分離、濃縮、純化、澄清等工藝。

膜分離的缺點(diǎn)是：①產(chǎn)品被濃縮的程度有限；②有時(shí)其適用范圍受到限制，因加工溫度、食品成分、pH、膜的耐藥性、膜的耐溶劑性等的不同，有時(shí)不能使用分離膜；③ 規(guī)模經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢較低，一般需與其他工藝相結(jié)合[16]。

由于膜分離過程不需要加熱，可防止熱敏物質(zhì)失活、雜茵污染，無相變，集分離、濃縮、提純、殺菌為一體，分離效果高，操作簡單、費(fèi)用低，特別適合食品工業(yè)的應(yīng)用[17]。4.2 超臨界萃取技術(shù)

超臨界萃取是利用超臨界流體這種在臨界點(diǎn)附近具有特殊性能的物質(zhì)作為溶劑進(jìn)行萃取的一種分離方法。超臨界流體是指超過臨界溫度與臨界壓力的氣體[18]。如果某種氣體處于臨界溫度以上，無論壓力多高，也不能液化，仍然是氣體，這時(shí)稱此氣體是超臨界流體。超臨界流體具有這樣的物理性質(zhì):其密度與液體較接近，粘度和自擴(kuò)散能力卻接近于氣體。因此超臨界流體對液體、固體物質(zhì)的溶解度與液體溶劑相接近，且在臨界點(diǎn)附近，壓力和溫度的微小變化會(huì)引起其溶解能力的極大變化[19]。利用超臨界流體的這些特性，通過改變溫度或壓力可在近臨界點(diǎn)附近實(shí)現(xiàn)萃取劑與待分離物質(zhì)的分離。

(1)由于在臨界點(diǎn)附近，流體溫度或壓力的微小變化會(huì)引起溶解能力的極大變化，這種極強(qiáng)的選擇性對分離溶解度相接近的兩種成分非常有利，且萃取后溶劑與溶質(zhì)的分離很容易。

(2)由于超臨界流體具有與液體相接近的溶解能力，同時(shí)它又保持了氣體所具有的傳遞性，這種具有液體與氣體雙重性能的流體能使傳質(zhì)很快地達(dá)到平衡，有利于高效分離的實(shí)現(xiàn)。

(3)超臨界流體如CO2(Tc=31.1℃，Pc=7.38Mp)適合于食品工業(yè)中一些熱敏性物質(zhì)的萃取。

當(dāng)然，超臨界萃取的缺點(diǎn)是設(shè)備和操作都要求在高壓下進(jìn)行，設(shè)備投資費(fèi)用高。在食品工業(yè)方面，利用超臨界萃取技術(shù)可從咖啡豆和茶葉中脫除咖啡因，還可用于提取啤酒花中的有用成分及從煙草中脫除尼古丁等。超臨界流體萃取技術(shù)作為一種新的分離技術(shù)，正越來越受到人們的重視，將在各個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用[20]。4.3 泡沫吸附分離技術(shù)

泡沫分離是根據(jù)表面吸附的原理，借助鼓泡使溶液中的表面活性物質(zhì)聚集在氣-液界面，隨氣泡上浮至溶液主體上方，形成泡沫層，將泡沫和液相主體分開，從而達(dá)到濃縮表面活性物質(zhì)（在泡沫層），凈化液相主體的目的。從液相主體中濃縮分離的既可以是表面活性物質(zhì)，也可以是能與表面活性物質(zhì)相互親和的任何溶質(zhì)，比如金屬陽離子、蛋白質(zhì)、酶、染料等等。另外，一些固體粒子（沉淀微?；虻V石小顆粒），也可以被表面活性物質(zhì)吸附，從溶液中分離出來。

泡沫吸附分離技術(shù)是近幾十年發(fā)展比較快的的新興分離技術(shù)，通常把凡是利用氣體在溶液中鼓泡，以達(dá)到分離或濃縮的這類方法，總稱為泡沫分離技術(shù)[21]。泡沫分離必須具備兩個(gè)基本條件，首先，所需分離的溶質(zhì)應(yīng)該是表面活性物質(zhì)，或者是可以和某些活性物質(zhì)相絡(luò)合的物質(zhì)，它們都可以吸附在氣-液界面上；其次，富集質(zhì)在分離過程中借助氣泡與液相主體分離，并在塔頂富集。因此，它的傳質(zhì)過程在鼓泡區(qū)中是在液相主體和氣泡表面之間進(jìn)行，在泡沫區(qū)中是在氣泡表面和間隙液之間進(jìn)行。所以，表面化學(xué)和泡沫本身的結(jié)構(gòu)和特征是泡沫分離的基礎(chǔ)[22]。

隨著人們對環(huán)境污染的日益重視，要求治理污染的呼聲越來越高，政府對企業(yè)污染的控制也越來越嚴(yán)格，泡沫分離技術(shù)作為一種新興的分離技術(shù)，越來越受到人們廣泛的關(guān)注，它的優(yōu)點(diǎn)就在于適合低濃度的分離回收，能在很低濃度下十分有效地除去表面活性物質(zhì)；設(shè)備簡單，投資少、能耗小，并且操作方便。5 分離技術(shù)的展望

目前，各種新型分離技術(shù)比傳統(tǒng)分離法已有了突破性進(jìn)展，這對于進(jìn)一步提純功能性食品成分，開發(fā)功能性產(chǎn)品，更大限度地發(fā)揮銀杏資源優(yōu)勢具有推動(dòng)作用。隨著高精度、高靈敏度分析技術(shù)的應(yīng)用，天然產(chǎn)物活性成分的提取純化和結(jié)構(gòu)鑒定尤其是在產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域顯示了更為廣闊的前景，同時(shí)這也促進(jìn)了植物有效物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、藥理、藥效等方面的深入研究。銀杏葉加工集成優(yōu)化工藝的探究，微量天然產(chǎn)物成分的高效快速高純分離和鑒定的集成系統(tǒng)技術(shù)的建立，都將提高銀杏葉及其特色藥用資源的利用率，有利于實(shí)現(xiàn)資源優(yōu)勢向技術(shù)優(yōu)勢的轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和環(huán)境效益[23]。分離操作在食品加工中占有非常重要的地位。分離技術(shù)的發(fā)展方興未艾，研究掌握各種分離技術(shù)的原理和技術(shù)，尤其是一些新叮的傳質(zhì)分離技術(shù)可以提高現(xiàn)有的分離技術(shù)冰平，是一項(xiàng)非常重要的工作，對食品加工的科學(xué)化具有重要的意義。

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第五篇：分子分離技術(shù)

目錄

摘要................................................1 關(guān)鍵詞..............................................1 1 前言..............................................1 2 傳統(tǒng)分離方法......................................2 3 現(xiàn)代分離方法......................................3 3.1 色譜方法.......................................................................................3 3.2 電泳技術(shù)及其它...........................................................................6 展望..............................................8 參考文獻(xiàn)............................................9

生物大分子分離技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

姓名：陳紹勇

學(xué)號：20124016016

專業(yè)：動(dòng)物學(xué) 摘要: 生物大分子包括多肽、酶、蛋白質(zhì)、核酸(DNA 和RNA)以及多糖等。生物大分子分離技術(shù)是生命科學(xué)研究中的關(guān)鍵技術(shù)之一。當(dāng)前, 各學(xué)科之間的交叉滲透為生物大分子分離技術(shù)的發(fā)展提供了更多的契機(jī)。對以沉淀、透析、超濾和溶劑萃取為代表的傳統(tǒng)分離技術(shù), 以及色譜, 電泳等現(xiàn)代分離技術(shù)的發(fā)展概況、原理、特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行了綜述。并結(jié)合生命科學(xué)的發(fā)展現(xiàn)狀, 展望了生物大分子分離技術(shù)的發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞: 生物大分子,傳統(tǒng)分離方法,現(xiàn)代分離方法 1 前言

生物大分子包括多肽、酶、蛋白質(zhì)、核酸(DNA和RNA)以及多糖等。生命科學(xué)的發(fā)展給生物大分子分離技術(shù)提出了新的要求。各種生化、分子研究都要求得到純的, 以及結(jié)構(gòu)和活性完整的生物大分子樣品, 這就使得其分離技術(shù)在各項(xiàng)研究中起著舉足輕重的作用。對生物大分子分離技術(shù)的研究和開發(fā)也就應(yīng)運(yùn)而生。而且隨著各學(xué)科之間的交叉滲透, 材料化學(xué)、自動(dòng)化技術(shù)等學(xué)科的發(fā)展也為生物大分子分離技術(shù)的發(fā)展提供了更多的契機(jī)。生物大分子的制備具有如下主要特點(diǎn): 生物材料的組成極其復(fù)雜;許多生物大分子在生物材料中的含量極微, 分離純化的步驟繁多, 流程長;許多生物大分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境就極易失活(因此分離過程中如何防止其失活, 就是生物大分子提取制備最困難之處);生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進(jìn)行的, 溫度、pH 值、離子 強(qiáng)度等各種參數(shù)對溶液中各種組成的綜合影響, 很難準(zhǔn)確估計(jì)和判斷[1]。這些都要求生物大分子的分離技術(shù)以此為依據(jù), 突破這些難點(diǎn), 優(yōu)化分離程序, 以獲得符合要求的生物大分子樣品。傳統(tǒng)分離方法

常用的傳統(tǒng)生物大分子分離方法有沉淀、透析、超濾和溶劑萃取等。它們都是一些較早就建立起來的分離方法, 至今仍然被廣泛應(yīng)用。如在蛋白質(zhì)領(lǐng)域, 應(yīng)用鹽析法使蛋白質(zhì)沉淀出來已有80 多年的歷史。其突出的優(yōu)點(diǎn)是成本低, 不需要特別昂貴的設(shè)備;操作簡單、安全;對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用[2]。該法雖然分辨能力不高,但在粗級分離中仍然被經(jīng)常采用。有機(jī)溶劑沉淀法也是較早使用的沉淀方法之一。有機(jī)溶劑對于許多蛋白質(zhì)、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能產(chǎn)生沉淀作用。其引起沉淀的主要原因在于改變介質(zhì)的介電常數(shù), 以及類似鹽析的爭奪水化水現(xiàn)象[2]。等電點(diǎn)沉淀法利用具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì), 在達(dá)到電中性時(shí)溶解度最低, 易發(fā)生沉淀, 從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì), 可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離, 此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白[3], 而不用于沉淀目的物。非離子型多聚物是20 世紀(jì)60 年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑, 它們具有很強(qiáng)的親水性和較大的溶解度, 在溶液中可通過空間位置排斥作用使生物大分子、病毒和細(xì)菌等聚集沉淀。該法溫和的操作條件和較高的沉淀效能, 使得其經(jīng)常被用于細(xì)菌、病毒、核酸和蛋白質(zhì)的分離, 其中應(yīng)用最多的多聚物是聚乙二醇[4,5]。

自Thomas Graham 1861 年發(fā)明透析方法至今已有140 多年, 透析已 成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中最簡便最常用的分離純化技術(shù)之一, 在生物大分子的制備過程中, 除鹽、少量有機(jī)溶劑、生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技術(shù), 同時(shí)半透膜的材料也更加多樣化、透析方式也更加豐富。超濾是一種加壓膜分離技術(shù), 自20 世紀(jì)20 年代問世后, 直至60 年代以來其發(fā)展迅速, 很快由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的分離手段發(fā)展成重要的工業(yè)單元操作技術(shù)[6]。超濾作為一種高效分離技術(shù), 廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子的脫鹽、濃縮和分級分離。溶劑萃取法(是用一種溶劑將產(chǎn)物自另一種溶劑(如水)中提取出來, 以達(dá)到濃縮和提純的目的)是20世紀(jì)40 年代興起的一項(xiàng)化工分離技術(shù), 并很快應(yīng)用到了生物分子的提取和分離上。最初是用于抗生素、有機(jī)酸、維生素等生物小分子的提取。最近幾十年來隨著與其它技術(shù)的結(jié)合而產(chǎn)生了一系列新的分離技術(shù), 如逆膠束萃取、超臨界萃取、液膜萃取等, 可以用于生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)、多肽等的提取和精制?，F(xiàn)代分離方法 3.1 色譜方法

1903 年俄國植物學(xué)家Tswett, 在一填有碳酸鈣的玻璃柱中注入用石油醚萃取的植物色素, 在室溫下展層, 得到不同的色素區(qū)帶, 后來稱之為色譜[7]。色譜分離又稱層析。最初, 層析技術(shù)并未得到關(guān)注。20 世紀(jì)50 年代, 氣液層析得到發(fā)展, 并在石油、化工、制藥等領(lǐng)域得到應(yīng)用。到60 年代, 由于開發(fā)出適用于生物物質(zhì)分離純化的層析固定相, 層析技術(shù)才被用于生物物質(zhì)的分離純化并得到迅速發(fā)展[7]。至今, 已有豐富的色譜技術(shù)被用于生物大分子的分離。液相色譜法是分析化學(xué)中發(fā)展最快, 應(yīng)用最廣的分析方法, 它在許多領(lǐng)域成為必不可少的手段,其中高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)更是以其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)占據(jù)突出地位。HPLC 用于生物化學(xué)樣品分析始于20 世紀(jì)70年代中期, 80 年代針對生命科學(xué)領(lǐng)域分離和制備而設(shè)計(jì)的生物色譜填料為HPLC 在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的地位奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ);90 年代, 隨著生物醫(yī)藥研究與開發(fā)的迅速發(fā)展, 各種類型的高通量及手性色譜柱紛紛出現(xiàn)[8]。HPLC 是目前最通用、最有力和最多能的層析形式, 在生物大分子的分離分析中,HPLC 分離模式主要有反相色譜（RPC), 空間排阻色譜(SEC), 離子交換色譜(IEC), 疏水作用色譜(HIC), 親和色譜(AC)等。反相液相色譜柱效高、分離能力強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡便、保留機(jī)理清楚, 是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種。它與多數(shù)其它形式的層析不同之處在于固定相基本上是惰性的, 固定相與被分離物之間只可能有疏水作用。它吸引人的地方在于流動(dòng)相的小小變化, 例如加入鹽, 改變pH 或有機(jī)溶劑的量就能成功地影響分離特性。它在20 世紀(jì)50 年代就已用于許多有機(jī)小分子的分離和分析,80 年代后逐步應(yīng)用于生物大分子如蛋白質(zhì)、多肽、核酸的鑒定,并用于制備規(guī)模的分離[8]。半個(gè)世紀(jì)前, 隨著交聯(lián)聚苯乙烯的出現(xiàn)和發(fā)展, 離子交換色譜成為一種重要的分離工具。離子交換色譜的填料及含鹽的緩沖流動(dòng)相系統(tǒng)類似于蛋白質(zhì)穩(wěn)定存在的生理?xiàng)l件, 有利于保持生物分子的活性和構(gòu)象。因此, 它在解決生物學(xué)中許多難于分離的問題上起到了重大作用。隨著HPLC 的飛速發(fā)展, 以及各種新型離子交換材料的出現(xiàn), 離子交換色譜在氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、有機(jī)酸、糖類及藥物等方面的應(yīng)用越來越廣?？臻g排阻色譜所用 的固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性物質(zhì)凝膠, 是按溶質(zhì)分子大小進(jìn)行分離的色譜技術(shù), 又稱尺寸排阻色譜或凝膠色譜。按流動(dòng)相類型不同分為凝膠滲透色譜和凝膠過濾色譜。十多年來該法在凝膠制備, 儀器技術(shù)性能, 數(shù)據(jù)處理和理論研究上取得的進(jìn)展, 促進(jìn)了該技術(shù)在許多領(lǐng)域的應(yīng)用。親和層析是60 年代發(fā)展起來的一種高效、快速的分離純化技術(shù)。它是一種利用生物大分子能夠通過范德華力、疏水力、空間和靜電相互作用,與配體特異、可逆地結(jié)合在一起的生物學(xué)特性, 從復(fù)雜的生物樣品中分離得到目標(biāo)產(chǎn)物的液相色譜技術(shù)。親和層析容量大, 選擇性強(qiáng), 分離效率高, 且對目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性起到一定的保護(hù)作用, 最先被用于酶的純化, 現(xiàn)在已廣泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受體、細(xì)胞器甚至完整細(xì)胞的純化[3]?？茖W(xué)的發(fā)展使得分離分析的對象越來越復(fù)雜,從而提高了對分離分析技術(shù)的要求, 促進(jìn)了各種新技術(shù)的發(fā)展。二維液相分離方法, 二維液相分離/ 質(zhì)譜分析方法等多種自動(dòng)化二維系統(tǒng)均得到了開發(fā)利用, 如Lundell 和Markides采用離子交換和反相色譜二維液相模式分離了復(fù)雜生物樣品中的肽;Bushey 和Jorgenson設(shè)計(jì)了用陽離子交換和體積排除分離模式的自動(dòng)化二維系統(tǒng)等。HPLC 與光譜或波譜技術(shù)的在線聯(lián)用也成為了解決復(fù)雜樣品體系的有力手段。目前最常用最有效的是高效液相色譜-質(zhì)譜(mass spectroscopy, MS)聯(lián)用技術(shù), 高效液相色譜-核磁共振(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)等也在研究開發(fā)中。與此同時(shí),快速分離技術(shù)也得到了迅猛發(fā)展, 在20 世紀(jì)70 和80 年代需要1h 分離的樣品現(xiàn)在可能只要幾分鐘甚至幾秒鐘即可完成, 有關(guān)快速HPLC 及其應(yīng)用也多有報(bào)道, 如Unger 等最早 采用緩沖溶液鹽濃度梯度, 以4mL/min 流速在2.5min 內(nèi)分離了8 種蛋白質(zhì)。近年來, 隨著生物技術(shù)和醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展, 傳統(tǒng)的分離手段已經(jīng)不能滿足對大量樣品高純度分離的要求, 液相制備色譜的發(fā)展研究為解決實(shí)際應(yīng)用中出現(xiàn)的問題帶來希望。20 世紀(jì)70 年代初開發(fā)出的模擬移動(dòng)床色譜具備分離能力強(qiáng),設(shè)備體積小,投資成本低, 便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制并特別有利于分離熱敏性及難以分離的物系等優(yōu)點(diǎn), 在制備色譜技術(shù)中最適含用于進(jìn)行連續(xù)性大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn), 其應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大, 已出現(xiàn)采用該技術(shù)分離氨基酸、單克隆抗體和蛋白質(zhì)的研究[17]。超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography,(SFC)是以超臨界流體(supercritical fluid, SF)作為流動(dòng)相的一種新穎的色譜技術(shù), 具有分析速度快、選擇性好、分離效率高、分析條件溫和等優(yōu)點(diǎn),可分析氣相色譜不宜分析的高沸點(diǎn)、高分子量、低揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定試樣, 又比高效液相色譜有更快的分析速度和更高的柱效。自60 年代起逐漸出現(xiàn)一些有關(guān)該技術(shù)的研究報(bào)道。超臨界流體色譜應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛, 可用于分離分析熱敏性物質(zhì)、非揮發(fā)性高分子、生物大分子、極性物質(zhì)和手性對映體等。目前, SFC 與MS、FT-IR(fourier transform infraredspectrometer, 傅里葉變換紅外光譜儀)、NMR等聯(lián)用技術(shù)也逐漸得到開發(fā)。

3.2 電泳技術(shù)及其它

電泳現(xiàn)象于1808 年被發(fā)現(xiàn), 在1937 年由瑞典科學(xué)家Tiselius A 首次將其作為一種分離技術(shù)所應(yīng)用。隨著電泳支持物的改進(jìn), 電泳條件的完善,區(qū)帶電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳等技術(shù)逐漸建立起來。同時(shí), 在 電泳模式上也有了極大的發(fā)展, 先后出現(xiàn)了圓盤電泳、垂直板電泳、脈沖電泳等, 電泳分辨率也隨之得到提高。1956 年Smithies 和Poulik最早引入雙向電泳技術(shù), 他們將紙電泳和淀粉凝膠電泳結(jié)合起來分離血清蛋白, 隨后雙向電泳技術(shù)得到很快的發(fā)展。目前所應(yīng)用的雙向電泳體系由O’Farrell 等于1975 年發(fā)明, 第一向?yàn)榈入娋劢闺娪? 第二向?yàn)樽冃跃郾０纺z電泳。這是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離與展示的分離技術(shù)。該技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展對開展“蛋白質(zhì)組”的研究具有重要意義。同時(shí),針對雙向電泳技術(shù)的某些缺陷, 相應(yīng)的改進(jìn)技術(shù)也得以應(yīng)用, 如窄范圍pH 膠條的使用, 膠上差示電泳(differential in-gel electrophoresis, DIGE)技術(shù)。然而, 由于蛋白質(zhì)二維凝膠分離、染色體轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)操作困難, 且十分費(fèi)時(shí), 已被公認(rèn)為是蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)“瓶頸”。因此, 發(fā)展快速、高效、高通量、在線的分離監(jiān)督方法已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重大科學(xué)問題之一。誰率先取得突破, 誰將占據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有利地位。毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)是20世紀(jì)80 年代初期迅速發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù), 是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物。與傳統(tǒng)的分離方法相比, CE 具有分離效率高、分析速度快、樣品及試劑用量少等特點(diǎn), 使其成為極為有效的分離技術(shù), 廣泛應(yīng)用于分離蛋白質(zhì)、糖類、核酸等多種物質(zhì)。目前, 不同分離模式的毛細(xì)管電泳技術(shù)已成為最重要的生物樣品分離分析手段, 如毛細(xì)管區(qū)帶電泳、毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜、毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管等速電泳、毛細(xì)管等電聚焦等。近來, 許多有關(guān)多維毛細(xì)管電泳分離技術(shù)的設(shè)想已被提出, 有些還得到了初步的嘗試, 其分離的優(yōu)勢也 得到人們的關(guān)注[9]。毛細(xì)管電色譜(CEC)是利用電滲流或電滲流結(jié)合壓力來推動(dòng)流動(dòng)相移動(dòng)的一種液相色譜分離法。它集CE 和HPLC的優(yōu)勢與一身, 既有CE 水平的高柱效, 同時(shí)還具有HPLC 的高選擇性。近年來其應(yīng)用已引起廣泛關(guān)注。目前, 毛細(xì)管電色譜的研究主要側(cè)重于方法本身的完善和發(fā)展, 以及與質(zhì)譜等定性分析技術(shù)聯(lián)用的研究開發(fā)。微流控芯片于20 世紀(jì)90 年代初由瑞士的Manz 和Widmer 提出, 它是通過微細(xì)加工技術(shù)將微通道、微泵、微閥、微儲(chǔ)液器、微電極、微檢測元件窗口和連接器等功能元件像集成電路一樣, 使它們集成在芯片材料上的微全分析系統(tǒng)。近10 年來,隨著微制造技術(shù)和電子技術(shù)的不斷進(jìn)步, 微流控芯片得到了迅速的發(fā)展, 并成為生物樣品分離分析的重要手段和研究熱點(diǎn), 先后出現(xiàn)了毛細(xì)管電泳芯片、毛細(xì)管電色譜芯片、樣品制備和分離的集成系統(tǒng)等。展望

生命科學(xué)的發(fā)展決定了追求高效、快速、高通量、集成化的生物樣品分離分析方法必將成為未來的發(fā)展方向。分子生物學(xué)中一個(gè)眾所周知的事實(shí)是蛋白質(zhì)生物活性和功能多是在溶液中顯現(xiàn)的, 因此液相色譜的強(qiáng)大功能使得其在生命科學(xué)及其它領(lǐng)域的重要地位不會(huì)動(dòng)搖, 面對復(fù)雜體系的分離任務(wù), 它仍在不斷完善發(fā)展。芯片系統(tǒng)將不斷發(fā)展建立更多的實(shí)用體系, 開發(fā)更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。多通道毛細(xì)管電色譜儀器也將被開發(fā)。對超臨界流體性質(zhì)的認(rèn)識(shí)深入, 將推動(dòng)超臨界流體色譜技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。各種分離模式相結(jié)合構(gòu)成的多維分離方法也將得到進(jìn)一步的研究開發(fā), 以實(shí)現(xiàn)將一根色譜柱上未分開的組分在另一根柱上用不同的 分離原理加以完全分離。各種分離設(shè)備將與光譜、波譜這類提供結(jié)構(gòu)信息的儀器進(jìn)行在線連接, 建立起更多的聯(lián)用方式, 以實(shí)現(xiàn)分離, 定性定量分析一體化。

隨著生物技術(shù)成果的不斷積累和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的不斷推進(jìn), 生物制品的分離與純化技術(shù)已成為實(shí)現(xiàn)生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵, 在理論和技術(shù)研究上都得到了長足的發(fā)展。發(fā)展層析柱和凝膠過濾柱的放大技術(shù), 大規(guī)模分離過程的自動(dòng)控制,下游工程的集成優(yōu)化技術(shù)等成為工業(yè)化生產(chǎn)中的關(guān)鍵。液相色譜是工業(yè)生產(chǎn)上常用的有效方法,而模擬移動(dòng)床色譜和徑向色譜等將在生物工程領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。在研究和完善一些適用于生化工程的新型分離技術(shù)的同時(shí), 進(jìn)行各種分離技術(shù)的高效集成化, 可以達(dá)到提高產(chǎn)品收率、降低過程能耗和增加生產(chǎn)效益的目標(biāo)。在這個(gè)各學(xué)科快速發(fā)展, 并相互影響的時(shí)代,生物大分子分離技術(shù)必將不斷的推陳出新, 以更加方便、高效、快捷的方式應(yīng)用于科研和生產(chǎn)領(lǐng)域。參考文獻(xiàn)

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