第一篇：氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

附件5 氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測(cè)試劑注冊(cè) 技術(shù)審查指導(dǎo)原則 本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測(cè)試劑（串聯(lián)質(zhì)譜法）注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對(duì)該類試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供申請(qǐng)人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，不涉及注冊(cè)審批等行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍 本指導(dǎo)原則提及的氨基酸、肉堿（包括游離肉堿和?；鈮A）和琥珀酰丙酮分別是指針對(duì)遺傳代謝病的疾病標(biāo)記物。相關(guān)的遺傳代謝病主要包括氨基酸代謝障礙（Disorders of amino acid metabolism）、脂肪酸氧化障礙（Fatty Acid Oxidation disorders）和有機(jī)酸代謝障礙（Organic academia disorders）等。一般來(lái)說(shuō)，氨基酸是氨基酸代謝障礙的疾病標(biāo)記物，游離肉堿與酰基肉堿是脂肪酸氧化障礙和有機(jī)酸代謝障礙的標(biāo)記物，琥珀酰丙酮是酪氨酸血癥I型的主要標(biāo)記物。

遺傳代謝病的發(fā)病機(jī)理為維持機(jī)體正常代謝所必需的酶類、受體和載體等蛋白質(zhì)缺陷，導(dǎo)致機(jī)體的生化反應(yīng)和代謝異常，從而引起一系列臨床表現(xiàn)。其臨床表現(xiàn)主要包括神經(jīng)系統(tǒng)損害、代謝紊亂、相關(guān)器官功能異常、生長(zhǎng)遲緩、皮膚及毛發(fā)異常、特殊氣味等。我國(guó)相對(duì)常見的遺傳代謝病如下表所示：

表1我國(guó)相對(duì)常見的遺傳代謝病 序號(hào) 疾病名稱 1 高苯丙氨酸血癥（HPA）2 甲基丙二酸血癥（MMA）3 原發(fā)性肉堿缺乏癥（PCD）4 中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥（MCAD）5 極長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥（VLCAD）6 異戊酸血癥（IVA）7 戊二酸血癥I型（GAI）8 楓糖尿病（MSUD）9 瓜氨酸血癥II型(希特林蛋白缺乏癥)（CIT-II）10 瓜氨酸血癥I型（CIT-Ⅰ）11 丙酸血癥（PA）12 同型半胱氨酸血癥I型（HCY）遺傳代謝病的臨床檢測(cè)方法一般包括實(shí)驗(yàn)室生化檢測(cè)、影像學(xué)檢測(cè)、負(fù)荷試驗(yàn)、酶學(xué)檢測(cè)、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析、串聯(lián)質(zhì)譜（MS-MS）分析、基因檢測(cè)等。其中串聯(lián)質(zhì)譜法是臨床檢測(cè)的常用方法，其優(yōu)點(diǎn)包括：具有高分析效率和高靈敏度，能同時(shí)分析多種代謝物，涵蓋多種遺傳代謝??；

可重復(fù)性好；

操作相對(duì)簡(jiǎn)單；

干血斑采集和保存方便等。

氨基酸、肉堿及琥珀酰丙酮檢測(cè)試劑（串聯(lián)質(zhì)譜法）的預(yù)期用途為利用串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，對(duì)全血干血斑樣本中氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮的含量進(jìn)行測(cè)量，相關(guān)待測(cè)分析物濃度及分析物之間相互比例的異常，可能提示某種遺傳代謝病。其原理是使用含有內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的溶液對(duì)干血斑進(jìn)行萃取并采用串聯(lián)質(zhì)譜分析，每種待測(cè)分析物對(duì)于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)程度與它的濃度成比例，根據(jù)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度即可計(jì)算分析物的濃度。

該類試劑使用的串聯(lián)質(zhì)譜主要為三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和四極桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Q-trap）。掃描模式主要包括以下四種：前體離子（precursor ion, PI）掃描、中性丟失（NL）掃描、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描和產(chǎn)物離子（product ion,PI）掃描。前體離子掃描通常用于酰基肉堿的分析檢測(cè)，在第二級(jí)質(zhì)量分析器中選擇特定質(zhì)荷比的產(chǎn)物離子，測(cè)定在第一級(jí)質(zhì)量分析器中一定質(zhì)量范圍內(nèi)所有能產(chǎn)生該碎片的前體離子。中性丟失掃描通常用于氨基酸的分析檢測(cè)，以恒定的質(zhì)量差異，在一定質(zhì)量范圍內(nèi)同時(shí)測(cè)定第一級(jí)、第二級(jí)質(zhì)量分析器中所有的前體離子和產(chǎn)物離子，檢測(cè)能產(chǎn)生特定中性碎片丟失的前體離子。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描是將第一級(jí)質(zhì)譜設(shè)定為用于篩選特定的前體離子，在第二級(jí)質(zhì)譜中指定所需的產(chǎn)物離子，同時(shí)監(jiān)測(cè)前體離子-產(chǎn)物離子。產(chǎn)物離子掃描是在第一級(jí)質(zhì)量分析器中選擇特定質(zhì)荷比的前體離子，測(cè)定該前體離子在第二級(jí)質(zhì)量分析器中，一定質(zhì)量范圍內(nèi)的所產(chǎn)生的特定產(chǎn)物離子。四種掃描模式各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際中應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性選擇適合的掃描模式。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。

本指導(dǎo)原則主要適用于利用串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)干血斑樣本中相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)的試劑，包括采用衍生法處理后對(duì)氨基酸和肉堿進(jìn)行檢測(cè)的試劑和采用非衍生法對(duì)氨基酸、琥珀酰丙酮和肉堿進(jìn)行檢測(cè)的試劑。對(duì)于遺傳代謝病相關(guān)的其他特征分析物或采用其他檢測(cè)方法（如基于抗原抗體反應(yīng)原理方法）、其他樣本類型進(jìn)行的檢測(cè)，有利之處可參照?qǐng)?zhí)行。本指導(dǎo)原則不適用于對(duì)相關(guān)疾病的確證和產(chǎn)前篩查項(xiàng)目。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求 （一）綜述資料 綜述資料主要包括臨床適應(yīng)癥背景情況、產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)以及其他內(nèi)容。其中，其他內(nèi)容包括同類產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況，應(yīng)著重從檢驗(yàn)方法及臨床適用范圍等方面寫明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)，以下簡(jiǎn)稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào)，以下簡(jiǎn)稱《公告》）的相關(guān)要求。

另外，建議申請(qǐng)人對(duì)以下幾方面內(nèi)容進(jìn)行著重介紹：

1.相關(guān)遺傳代謝病的發(fā)病機(jī)理、臨床癥狀、臨床發(fā)病率、檢測(cè)方法、治療方法等。

2.待測(cè)分析物的名稱、種類、相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、經(jīng)臨床驗(yàn)證的遺傳代謝病與分析物間的對(duì)應(yīng)關(guān)系等。

3.串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測(cè)原理、樣品前處理方法、掃描模式及選擇依據(jù)、數(shù)據(jù)采集及處理方法等。

（二）主要原材料的研究資料 應(yīng)提供主要原材料的選擇與來(lái)源、制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。

1.氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品：一般為經(jīng)過(guò)同位素標(biāo)記的待測(cè)分析物。每種待測(cè)分析物應(yīng)對(duì)應(yīng)其標(biāo)記后的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，如有特殊情況無(wú)法對(duì)應(yīng)其自身標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)說(shuō)明理由，并提交使用替代內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品是否會(huì)對(duì)產(chǎn)品性能產(chǎn)生影響的評(píng)價(jià)資料。應(yīng)提交內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的化學(xué)式、對(duì)應(yīng)的待測(cè)分析物、賦值資料以及質(zhì)量控制資料（一般包括分子量、化學(xué)純度、同位素純度等）。

2.氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮標(biāo)準(zhǔn)品：應(yīng)提供標(biāo)準(zhǔn)品的來(lái)源、選擇依據(jù)、性能指標(biāo)和溯源資料。

3.質(zhì)控品：質(zhì)控品為包含所有待測(cè)分析物的干血斑。質(zhì)控品使用的濾紙應(yīng)明確型號(hào)。應(yīng)至少設(shè)置高、低兩個(gè)濃度水平的質(zhì)控品。質(zhì)控品中的質(zhì)控物質(zhì)應(yīng)與待測(cè)分析物相同，如使用與待測(cè)分析物特性相似的其他物質(zhì)作為其質(zhì)控物，應(yīng)說(shuō)明理由，并提交使用替代質(zhì)控物是否會(huì)對(duì)產(chǎn)品性能產(chǎn)生影響的評(píng)價(jià)資料。應(yīng)提供質(zhì)控品的選擇、制備和賦值資料。

4.企業(yè)參考品：應(yīng)提供企業(yè)內(nèi)部參考品的原料選擇、制備、定值、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證資料。企業(yè)參考品應(yīng)盡量使用實(shí)際待測(cè)樣本即全血干血斑，如需采用向全血基質(zhì)中模擬添加被測(cè)物的形式制備干血斑（即模擬干血斑），則應(yīng)說(shuō)明理由。企業(yè)應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性建立穩(wěn)定的參考品體系，至少應(yīng)包括：

4.1檢測(cè)限參考品 應(yīng)建立能夠覆蓋所有待測(cè)分析物的檢測(cè)限參考品。參考品中的待測(cè)分析物濃度應(yīng)為檢測(cè)限濃度，或略高于檢測(cè)限濃度。檢測(cè)限參考品應(yīng)盡量使用全血干血斑，考慮到檢測(cè)限濃度的樣本難以獲得的情況，可采用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品替代待測(cè)分析物的方式，來(lái)模擬制備檢測(cè)限參考品，例如將檢測(cè)限水平的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品加入人全血基質(zhì)中制備模擬干血斑等。

如需使用待測(cè)分析物/內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的替代物質(zhì)制備參考品，應(yīng)提交相應(yīng)的評(píng)估資料。

4.2精密度參考品 應(yīng)選擇能夠代表所有待測(cè)分析物結(jié)構(gòu)及性能評(píng)估要求的分析物建立精密度參考品。

精密度參考品應(yīng)設(shè)置多個(gè)具有代表性意義的濃度水平，一般包括正常內(nèi)源性水平、醫(yī)學(xué)決定水平、異常值（異常高值/異常低值）水平等，各待測(cè)分析物可根據(jù)臨床實(shí)際情況和指標(biāo)設(shè)置的臨床意義，選擇不同的濃度水平設(shè)定參考品，并提交選擇設(shè)定的依據(jù)。

4.3線性參考品 應(yīng)建立能夠覆蓋所有待測(cè)分析物的線性參考品。線性參考品應(yīng)選擇多個(gè)梯度濃度水平進(jìn)行設(shè)置并覆蓋整個(gè)線性范圍。如需使用待測(cè)分析物的替代物質(zhì)制備參考品，應(yīng)提交相應(yīng)的評(píng)估資料。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料 主要生產(chǎn)工藝主要包括工作液的配制、分裝和包裝等，反應(yīng)體系研究指完成檢測(cè)所涉及到的最佳反應(yīng)條件的選擇確定過(guò)程。主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝及流程，可以圖表方式表示。應(yīng)標(biāo)明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細(xì)說(shuō)明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

2.樣本采集、處理的要求和質(zhì)控品、企業(yè)參考品的干血斑制備的要求，具體可參照相關(guān)管理規(guī)范的內(nèi)容。

3.各試劑（包括各級(jí)工作液、萃取試劑、衍生化試劑、流動(dòng)相等）的選擇、配比、用量的確定和驗(yàn)證過(guò)程。

4.分析條件，如萃取方法、衍生條件、進(jìn)樣條件、質(zhì)譜條件等。

（四）分析性能評(píng)估資料 申請(qǐng)人應(yīng)提交對(duì)試劑盒的全部性能進(jìn)行評(píng)估的資料，對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括研究目的、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能評(píng)估的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)室）、人員及數(shù)量、適用儀器、儀器掃描模式、試劑規(guī)格、批號(hào)、臨床樣本來(lái)源（如涉及）等。分析性能評(píng)估的實(shí)驗(yàn)方法可以參考相關(guān)文件或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究：

1.檢測(cè)限 檢測(cè)限確定過(guò)程的研究方法有很多，因通常情況下不易獲得低于內(nèi)源水平的樣本，申請(qǐng)人可自行設(shè)計(jì)合理的模擬方法進(jìn)行研究。例如，將不同濃度的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品添加至人全血中制備成一系列干血斑，用空白萃取液萃取后進(jìn)行檢測(cè)；

或者用含不同濃度內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的萃取液對(duì)干血斑萃取后進(jìn)行檢測(cè)，等等。其目的是使基質(zhì)中分析物濃度不變，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度遞減，最終通過(guò)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度來(lái)模擬研究檢測(cè)限。測(cè)量的結(jié)果符合試劑偏差及精密度等要求的最低濃度水平作為檢測(cè)限。

研究過(guò)程中應(yīng)對(duì)各物質(zhì)濃度進(jìn)行精確的確認(rèn)，每一濃度樣本應(yīng)平行檢測(cè)多次。根據(jù)該類試劑的預(yù)期用途，每個(gè)待測(cè)分析物的檢測(cè)限應(yīng)等于或低于預(yù)期使用人群的內(nèi)源性水平。應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明檢測(cè)限的建立過(guò)程，明確使用的樣本類型、試驗(yàn)方法、接受標(biāo)準(zhǔn)和研究結(jié)論等。

2.線性范圍 線性范圍的確定研究可使用含有梯度濃度待測(cè)分析物的模擬干血斑，分析至少9-11個(gè)濃度水平，每個(gè)水平重復(fù)多次，通過(guò)評(píng)價(jià)一定范圍內(nèi)的線性關(guān)系及準(zhǔn)確度等建立所有待測(cè)分析物的線性范圍。分析物濃度水平覆蓋范圍應(yīng)具臨床意義，至少包含典型的內(nèi)源水平、醫(yī)學(xué)決定水平等。應(yīng)結(jié)合性能指標(biāo)和臨床意義，設(shè)定合理的線性范圍。

3.準(zhǔn)確度 準(zhǔn)確度包括正確度和精密度，受系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差共同影響，申請(qǐng)人應(yīng)綜合考慮偏倚和不精密度的影響，對(duì)產(chǎn)品的準(zhǔn)確度進(jìn)行研究。

3.1正確度 建議采用回收實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行正確度的評(píng)價(jià)，同時(shí)可結(jié)合其他合理方法（如方法學(xué)比對(duì)等）進(jìn)行研究?；厥諏?shí)驗(yàn)方法一般為：向全血中添加不同濃度待測(cè)分析物，制備成干血斑，檢測(cè)后計(jì)算回收率，回收率的計(jì)算方法為在含有已知“理論”分析物含量的干血斑提取物中實(shí)際測(cè)得的該分析物含量，以百分比表示?；厥章实慕Y(jié)果應(yīng)在可接受范圍內(nèi)。干血斑中分析物各濃度水平應(yīng)具臨床意義并盡量覆蓋檢測(cè)范圍。詳細(xì)描述評(píng)價(jià)方法中樣本制備過(guò)程、評(píng)價(jià)方案、試驗(yàn)過(guò)程、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法、研究結(jié)論等內(nèi)容。

3.2精密度 精密度的評(píng)價(jià)方法并無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性，具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考相關(guān)指南或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。針對(duì)本類產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求：

3.2.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑本身的影響外，應(yīng)對(duì)不同儀器、操作者、地點(diǎn)、精密度評(píng)價(jià)周期等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

例如：為期至少XX天的連續(xù)檢測(cè)，每天至少由X人完成不少于X次的完整檢測(cè)，從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。申請(qǐng)人還應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.2.2精密度的評(píng)價(jià)應(yīng)選擇多個(gè)濃度水平進(jìn)行，一般來(lái)說(shuō)應(yīng)包含正常內(nèi)源性水平、醫(yī)學(xué)決定水平、異常值（異常高值/異常低值）水平等，各待測(cè)分析物可根據(jù)臨床實(shí)際情況和指標(biāo)設(shè)置的臨床意義，選擇不同的濃度水平進(jìn)行研究，并提交濃度選擇的依據(jù)。

4.特異性 應(yīng)對(duì)樣本中常見的干擾物質(zhì)和可能引起交叉反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行研究。特異性研究的樣本可為全血干血斑或模擬添加被研究物的模擬干血斑。

4.1干擾物質(zhì) 干擾物質(zhì)應(yīng)至少包括血紅蛋白、脂類、膽紅素等。其他還可能包括潛在患者（如母親）引入的化合物、樣本采集過(guò)程中加入的化合物、血液中存在的其他化合物等，例如常用藥物、麻醉劑、消毒劑、服用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、機(jī)體其他代謝產(chǎn)物等。

建議申請(qǐng)人在干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（即“最差條件”）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)。建議至少在內(nèi)源性水平附近濃度對(duì)每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行評(píng)價(jià)。

4.2交叉反應(yīng) 交叉反應(yīng)物質(zhì)一般是指在血液中存在的，在待測(cè)分析物掃描模式下，與待測(cè)分析物有相同質(zhì)荷比的其他化合物。應(yīng)研究血液中可能存在的交叉反應(yīng)物質(zhì)對(duì)待測(cè)分析物造成的干擾，對(duì)每一對(duì)交叉反應(yīng)物質(zhì)/分析物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床意義上的分析，評(píng)估可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。常見的交叉反應(yīng)物質(zhì)有天冬酰胺、羥脯氨酸、甲硫氨酸砜、甲硫氨酸硫氧化物、谷氨酸鹽和不完全丁基化的酰基肉堿等。應(yīng)至少對(duì)上述幾種交叉反應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行研究，并結(jié)合申報(bào)試劑的臨床適應(yīng)癥對(duì)其他可能存在交叉反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。

5.殘留 對(duì)于該類試劑來(lái)說(shuō)，還應(yīng)考慮進(jìn)樣器等分析系統(tǒng)的殘留對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響。例如，設(shè)計(jì)高低兩個(gè)濃度樣本交叉連續(xù)進(jìn)樣，并重復(fù)多次，較低濃度樣本的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合其準(zhǔn)確性的要求。

6.在分析性能評(píng)估資料中還需注意以下幾點(diǎn)：

6.1應(yīng)明確性能研究使用的儀器掃描模式，不同的掃描模式可能會(huì)導(dǎo)致不同的研究結(jié)果，必要時(shí)應(yīng)分別描述不同模式下的性能指標(biāo)。若不同的機(jī)型會(huì)導(dǎo)致不同的研究結(jié)果，也應(yīng)分別進(jìn)行詳述。

6.2進(jìn)行性能研究所使用的樣本形式應(yīng)為干血斑，且應(yīng)從萃取溶解開始進(jìn)行分析性能的評(píng)價(jià)。

6.3 以上性能研究原則上應(yīng)包括所有的待測(cè)分析物，并應(yīng)盡可能使用全血干血斑進(jìn)行評(píng)估。由于某些待測(cè)分析物的特殊性質(zhì)，可能無(wú)法采用上述常規(guī)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，需使用其他方法或替代物質(zhì)進(jìn)行研究的，應(yīng)對(duì)具體情況進(jìn)行說(shuō)明，并提供相應(yīng)的研究資料。

（五）陽(yáng)性判斷值/參考區(qū)間確定資料 對(duì)于此類試劑，應(yīng)對(duì)每種待測(cè)分析物設(shè)定陽(yáng)性判斷值或參考區(qū)間。應(yīng)盡量獲取足夠大的樣本量，設(shè)定合理的臨床靈敏度和臨床特異度預(yù)期值進(jìn)行陽(yáng)性判斷值/參考區(qū)間的研究。根據(jù)該類試劑的臨床用途，應(yīng)盡量降低產(chǎn)品的假陰性率，并將假陽(yáng)性率控制在一定范圍。應(yīng)采用合理的方法進(jìn)行相關(guān)研究，并明確方法的選擇依據(jù)。

應(yīng)明確樣本入組標(biāo)準(zhǔn)（例如體重、年齡等），并說(shuō)明試驗(yàn)方案及其合理性。

另外，如存在灰區(qū)，應(yīng)提交灰區(qū)設(shè)定的依據(jù)，并在說(shuō)明書【陽(yáng)性判斷值】和【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】項(xiàng)進(jìn)行解釋說(shuō)明。如無(wú)灰區(qū)設(shè)置，也應(yīng)提交相關(guān)的依據(jù)。

（六）穩(wěn)定性研究資料 穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)產(chǎn)品的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。

1.申報(bào)產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、運(yùn)輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

2.適用樣本的穩(wěn)定性研究：本類試劑的適用樣本類型為干血斑，可參考相關(guān)管理規(guī)范等文件對(duì)樣本的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。主要包括冷藏和冷凍條件下的儲(chǔ)存條件研究、有效期驗(yàn)證、運(yùn)輸穩(wěn)定性驗(yàn)證以及干血斑萃取后儲(chǔ)存條件的驗(yàn)證等?？梢栽诤侠淼臏囟确秶鷥?nèi)選擇溫度點(diǎn)（溫度范圍），每間隔一定的時(shí)間段對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行檢測(cè)，從而確認(rèn)樣本的穩(wěn)定性。由于某些化合物在干血斑中不穩(wěn)定，應(yīng)對(duì)這些分析物的情況進(jìn)行研究，提供其在干血斑中的儲(chǔ)存有效期數(shù)據(jù)。樣本保存時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響應(yīng)在說(shuō)明書中進(jìn)行說(shuō)明。

（七）臨床評(píng)價(jià)資料 1.研究方法 建議以前瞻性的臨床試驗(yàn)方式為主，以試驗(yàn)用體外診斷試劑（以下稱考核試劑）與臨床診斷結(jié)果進(jìn)行比較研究的方法，評(píng)價(jià)考核試劑的臨床診斷性能相關(guān)指標(biāo)，從而證明其臨床性能滿足預(yù)期用途的要求。臨床診斷結(jié)果中陽(yáng)性病例的確認(rèn)應(yīng)有充分的依據(jù)，包括采用現(xiàn)有條件下公認(rèn)的、可靠的、權(quán)威的疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)，疾病診療指南中明確的疾病診斷方法，行業(yè)內(nèi)的專家共識(shí)等。

申請(qǐng)人還應(yīng)同時(shí)選擇已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，與考核試劑進(jìn)行一定例數(shù)的比較研究試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)考核試劑的臨床準(zhǔn)確性。

2.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)及人員 應(yīng)選擇至少3家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求開展臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇應(yīng)盡量考慮擬申報(bào)產(chǎn)品的特點(diǎn)和預(yù)期用途。建議選擇不同地區(qū)的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)，且臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有相關(guān)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。操作人員應(yīng)經(jīng)過(guò)相應(yīng)的培訓(xùn)，并能熟練操作實(shí)驗(yàn)。機(jī)構(gòu)和人員應(yīng)遵循《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》及其他相關(guān)規(guī)定。試驗(yàn)應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

3.適用人群及樣本量 臨床試驗(yàn)應(yīng)選擇預(yù)期適用人群作為研究對(duì)象，樣本的采集、處理和保存應(yīng)符合產(chǎn)品說(shuō)明書及其他相關(guān)指導(dǎo)文件的要求。所有樣本均應(yīng)可以溯源。若適用人群包含新生兒，應(yīng)設(shè)定合理、明確的樣本入組標(biāo)準(zhǔn)（例如體重、年齡等）。

應(yīng)根據(jù)疾病發(fā)病率和性能要求等估算合理的樣本量，并在臨床試驗(yàn)方案中明確樣本量確定的依據(jù)。在與同類產(chǎn)品進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)時(shí)，試驗(yàn)樣本應(yīng)盡量覆蓋各分析物的線性范圍，樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

根據(jù)臨床發(fā)病率、臨床診治情況及其他因素綜合考慮，對(duì)于我國(guó)相對(duì)常見的遺傳代謝病如高苯丙氨酸血癥（HPA）、甲基丙二酸血癥（MMA）、原發(fā)性肉堿缺乏癥（PCD）等,應(yīng)通過(guò)前瞻性臨床試驗(yàn)檢出真陽(yáng)性病例；

其他發(fā)病率相對(duì)更低的疾病也應(yīng)盡可能在前瞻性臨床試驗(yàn)中檢出所聲稱疾病病例。建議聲稱的遺傳代謝病種類應(yīng)盡量覆蓋我國(guó)常見的病種，可參考表1中所列的疾病。同時(shí)，臨床試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果應(yīng)盡量覆蓋所有待測(cè)分析物指標(biāo)異常情況。

若臨床試驗(yàn)中使用部分已確診（回顧性）的陽(yáng)性病例進(jìn)行研究，應(yīng)提供充分的理由，并在試驗(yàn)方案和報(bào)告中對(duì)病例選擇的方式和原因進(jìn)行明確的說(shuō)明。在產(chǎn)品說(shuō)明書中應(yīng)根據(jù)臨床結(jié)果對(duì)檢出的遺傳代謝病和分析物指標(biāo)異常情況進(jìn)行描述，其中采用回顧性病例進(jìn)行的研究應(yīng)另行說(shuō)明。

4.臨床試驗(yàn)方案 開展臨床試驗(yàn)前，申請(qǐng)人應(yīng)與各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)協(xié)商制定統(tǒng)一的、科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)方案，并按照臨床試驗(yàn)方案組織制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，并進(jìn)行驗(yàn)證，以確保臨床試驗(yàn)操作在各個(gè)臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)之間的一致性。在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中均應(yīng)遵循預(yù)定的方案，不可隨意改動(dòng)。

臨床試驗(yàn)應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過(guò)程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定合理、嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。方案中應(yīng)明確樣本入組的要求，以及樣本的收集、處理及保存要求等。

在試驗(yàn)操作過(guò)程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法，以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性，并在臨床試驗(yàn)方案中明確。

方案中應(yīng)明確，當(dāng)對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果不一致時(shí)，應(yīng)分析原因并給出解釋，必要時(shí)進(jìn)行第三方復(fù)核。

5.臨床試驗(yàn)報(bào)告 臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。應(yīng)對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行詳述：

5.1臨床試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及方案描述 5.1.1 臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選擇、臨床主要研究人員簡(jiǎn)介等基本情況介紹。

5.1.2 病例納入/排除的情況、盲法操作流程等。

5.1.3 樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

5.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)軟件、評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。

5.2 具體的臨床試驗(yàn)情況 5.2.1 臨床試驗(yàn)所用各體外診斷試劑及儀器的名稱、批號(hào)、機(jī)型等信息。

5.2.2 各試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的病例數(shù)、陰性/陽(yáng)性檢出例數(shù)、檢出的遺傳代謝病情況等。

5.2.3 質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、儀器校準(zhǔn)、質(zhì)控品運(yùn)行情況。

5.2.4 具體試驗(yàn)過(guò)程，樣本檢測(cè)、數(shù)據(jù)收集、結(jié)果不一致樣本的校驗(yàn)；

陽(yáng)性病例后續(xù)操作方法、病例脫落情況，以及是否符合臨床試驗(yàn)方案等。

5.2.5 具體試驗(yàn)過(guò)程及試驗(yàn)過(guò)程中需要說(shuō)明的問(wèn)題，是否涉及對(duì)方案的修改等。

5.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法。應(yīng)對(duì)考核試劑與臨床診斷結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建議分別對(duì)每種待測(cè)分析物和每種疾病的臨床性能相關(guān)指標(biāo)（例如臨床靈敏度和臨床特異度、假陽(yáng)性率和假陰性率、陰性似然比和陽(yáng)性似然比、陰性預(yù)測(cè)值和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值等）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。同時(shí)，應(yīng)根據(jù)臨床診斷結(jié)果，統(tǒng)計(jì)并明確每種疾病與待測(cè)分析物指標(biāo)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

對(duì)于考核試劑與對(duì)比試劑的比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)采用回歸分析的方法分析其定量結(jié)果的相關(guān)性，同時(shí)也可選用特定的數(shù)據(jù)分析模型（如Bland-Altman 模型）對(duì)定量分析結(jié)果的一致性進(jìn)行分析。亦可同時(shí)對(duì)二者的陰/陽(yáng)性符合率和總符合率進(jìn)行分析，對(duì)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或kappa檢驗(yàn)以檢驗(yàn)其定性結(jié)果的一致性。

應(yīng)針對(duì)每一種待測(cè)分析物（或相關(guān)分析物間的比值）和每種疾病的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單獨(dú)統(tǒng)計(jì)分析，以列表的形式進(jìn)行總結(jié)。

應(yīng)明確樣本的納入與排除情況。說(shuō)明其他情況，如數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測(cè)以及最終是否納入數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、對(duì)異常值或缺失值的處理等。

5.4 討論和結(jié)論 對(duì)總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡(jiǎn)要分析試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)本次臨床研究有無(wú)特別說(shuō)明，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。

6.批準(zhǔn)上市條件 由于該類產(chǎn)品的特殊性，技術(shù)審評(píng)中可根據(jù)產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)受益、產(chǎn)品預(yù)期臨床應(yīng)用情況、上市前研究等因素，附帶條件批準(zhǔn)上市。具體情況可參見《用于罕見病防治醫(yī)療器械注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求 擬定產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》和《公告》的相關(guān)規(guī)定。申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下,根據(jù)申請(qǐng)人產(chǎn)品研制、前期臨床評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的有關(guān)要求編寫。

第三類產(chǎn)品技術(shù)要求中還應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求。附錄中應(yīng)將內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品的設(shè)計(jì)及來(lái)源，參考品設(shè)置，生產(chǎn)工藝流程及質(zhì)控關(guān)鍵點(diǎn)等重點(diǎn)內(nèi)容予以明確。

（九）產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告 應(yīng)提供該產(chǎn)品在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行的、符合產(chǎn)品技術(shù)要求的產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告。應(yīng)提供連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的檢驗(yàn)合格報(bào)告。

（十）產(chǎn)品說(shuō)明書 產(chǎn)品說(shuō)明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，進(jìn)口產(chǎn)品的中文說(shuō)明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，若某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明參考文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對(duì)說(shuō)明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

1.【預(yù)期用途】 1.1第一自然段：描述預(yù)期用途，包括適用人群，樣本類型，被測(cè)物等。

舉例：該產(chǎn)品用于定量檢測(cè)XXX（適用人群）全血干血斑中的氨基酸、游離肉堿和?；鈮A、琥珀酰丙酮的濃度。

1.2介紹臨床適應(yīng)癥及背景，說(shuō)明相關(guān)的臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷方法等。另外，需明確所有待測(cè)分析物名稱、對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、經(jīng)臨床驗(yàn)證的遺傳代謝病與分析物之間的關(guān)系。建議聲稱的遺傳代謝病應(yīng)盡量覆蓋我國(guó)相對(duì)常見的病種，可參考表1中所列的疾病。

1.3明確檢測(cè)結(jié)果僅能初步提示某種遺傳代謝病，其最終結(jié)果要由相應(yīng)方法進(jìn)行確認(rèn)。

2.【檢驗(yàn)原理】 詳細(xì)說(shuō)明該產(chǎn)品檢測(cè)各類分析物的前處理方式（衍生/非衍生）、檢測(cè)原理及掃描模式（必要時(shí)可用圖示說(shuō)明）。

3.【主要組成成分】 說(shuō)明試劑盒所包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

試劑盒中不包含但該項(xiàng)檢測(cè)必需的組分，說(shuō)明書中應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、生產(chǎn)企業(yè)、貨號(hào)、注冊(cè)證號(hào)/備案憑證編號(hào)（如有）及其他相關(guān)信息，質(zhì)控品的濾紙應(yīng)明確型號(hào)。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】 按照穩(wěn)定性研究資料，說(shuō)明試劑盒的效期穩(wěn)定性，其他穩(wěn)定性也應(yīng)視情況明確，如開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應(yīng)標(biāo)明具體的儲(chǔ)存條件及有效期。

5.【適用儀器】 明確所有適用儀器的具體型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【樣本要求】 樣本的收集、處理和保存：應(yīng)參照相關(guān)文件的要求，并詳細(xì)描述采樣步驟和注意事項(xiàng)。明確采樣前處理、消毒、采樣量、保存條件及期限（短期、長(zhǎng)期）、運(yùn)送條件、凍融次數(shù)的限制等。另外應(yīng)說(shuō)明采樣過(guò)程中使用的濾紙型號(hào)應(yīng)與質(zhì)控品的濾紙型號(hào)一致。

上述內(nèi)容均需在穩(wěn)定性研究資料中詳述并進(jìn)行性能評(píng)估驗(yàn)證。

7.【檢驗(yàn)方法】 應(yīng)詳細(xì)描述完成完整檢測(cè)所需的全部步驟以指導(dǎo)用戶正確操作，包括：

7.1 干血斑的前處理、萃取、衍生化（如有）、復(fù)溶及上機(jī)檢測(cè)等。

7.2 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品溶液、各級(jí)工作液的配制方式。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和工作液的短期和長(zhǎng)期保存方式、凍融次數(shù)等。

7.3 上機(jī)檢測(cè)：儀器準(zhǔn)備、設(shè)置、儀器使用相關(guān)參數(shù)及結(jié)果處理。

7.4 質(zhì)量控制：質(zhì)控品的設(shè)置及檢測(cè)時(shí)的質(zhì)量控制方法、要求等。

7.5 說(shuō)明檢測(cè)時(shí)應(yīng)特別注意的事項(xiàng)，如對(duì)精密度的控制措施、溶液的保存條件、其他影響檢測(cè)的因素等。

8.【陽(yáng)性判斷值/參考區(qū)間】 明確設(shè)定及驗(yàn)證陽(yáng)性判斷值/參考區(qū)間所使用的樣本例數(shù)及類型、試驗(yàn)方法、統(tǒng)計(jì)方法及計(jì)算結(jié)果。

9.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】 應(yīng)對(duì)不同的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行解釋，并明確后續(xù)處理方法。如存在灰區(qū)，應(yīng)對(duì)灰區(qū)結(jié)果的處理方式一并詳述。

10.【檢驗(yàn)方法的局限性】 10.1 本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅能初步提示某種遺傳代謝病，其結(jié)果僅供臨床參考，不能作為診斷。對(duì)患者的臨床診斷應(yīng)采用相應(yīng)方法并結(jié)合其癥狀/體征、病史等情況綜合進(jìn)行。

10.2 本試劑盒適用于全血干血斑樣本檢測(cè)，不適用于其它樣本檢測(cè)。

10.3 異常的紅細(xì)胞比容、年齡、早產(chǎn)、疾病等因素可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

10.4樣本采集、運(yùn)輸及處理不當(dāng)、未按說(shuō)明書操作等均有可能導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，例如：血液未均勻浸透血斑區(qū)域、濾紙干血片打孔時(shí)打得太靠近血斑的邊緣、樣品收集或樣品干燥有問(wèn)題、由于樣品受熱受潮，不能洗脫血斑、血斑濾紙受排泄物污染等等。應(yīng)描述在樣本采集，保存、運(yùn)輸中需遵循的原則及注意事項(xiàng)。

10.5 說(shuō)明可能影響檢測(cè)結(jié)果的干擾因素。

10.6 單一代謝產(chǎn)物往往無(wú)法提供足夠的遺傳代謝病信息，應(yīng)建立代謝物模型來(lái)研究相關(guān)疾病。

10.7其他局限性。

11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 按照分析性能評(píng)估資料內(nèi)容描述以下性能指標(biāo)：檢測(cè)限、企業(yè)內(nèi)部參考品符合率（如適用）、準(zhǔn)確性、線性、特異性等。各項(xiàng)評(píng)估應(yīng)包括評(píng)估方法、數(shù)據(jù)和結(jié)果。應(yīng)描述臨床評(píng)價(jià)的試驗(yàn)結(jié)果，包括臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)數(shù)量、樣本情況、試驗(yàn)結(jié)果等內(nèi)容。

12.【注意事項(xiàng)】 應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

12.1 如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

12.2 檢驗(yàn)過(guò)程有關(guān)的有機(jī)溶劑的安全性要求，例如操作和廢棄的注意事項(xiàng)。

12.3 相關(guān)操作人員應(yīng)經(jīng)過(guò)專業(yè)的培訓(xùn)，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書的方法來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)。

三、名詞解釋 1.全血干血斑 本指導(dǎo)原則中指臨床檢驗(yàn)過(guò)程中使用的實(shí)際待測(cè)樣本，即將人全血滴加至濾紙上，再經(jīng)過(guò)打孔處理的樣本。

2.模擬干血斑 本指導(dǎo)原則中指在研究過(guò)程中，將添加了其他物質(zhì)（例如待測(cè)物、干擾物質(zhì)等）的人全血（或模擬血液基質(zhì)）滴加至濾紙上，再經(jīng)過(guò)打孔處理的樣本。

3.同位素純度 被同位素標(biāo)記的分子的相對(duì)含量。

四、參考文獻(xiàn) 1.顧學(xué)范.《臨床遺傳代謝病》，人民衛(wèi)生出版社，2015.2.《中國(guó)藥典》（2015年版），中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.3.《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范》（2010年版），（衛(wèi)婦社發(fā)〔2010〕96號(hào)）,2010年12月1日.4.《新生兒疾病篩查管理辦法》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部令第64號(hào)），2009年3月5日.5.Newborn Screening Test Systems for Amino Acids, Free Carnitine, and Acylcarnitines Using Tandem Mass Spectrometry，Guidance for Industry and FDA Staff，F(xiàn)DA，2004.6.CLSI.Newborn Screening by Tandem Mass Spectrometry；

Approved Guideline.CLSI document I/LA32-A.Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute;2010.五、起草單位 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。

第二篇：地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2020年）

附件3

地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑

注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，也不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

地中海貧血（簡(jiǎn)稱地貧）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于珠蛋白基因發(fā)生突變（包括點(diǎn)突變和缺失等），致使珠蛋白肽鏈合成減少或完全不能合成而導(dǎo)致的一組單基因遺傳性溶血性疾病，輕者可無(wú)臨床表現(xiàn)，重者以進(jìn)行性溶血性貧血為主要特征。根據(jù)珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類型，地貧分為α-，β-和γ-地貧等，臨床上最常見的是α-和β-地貧。地貧主要分布在地中海沿岸、東南亞和少數(shù)非洲地區(qū)，具有明顯的種族特性和地域分布差異。地貧是我國(guó)南方地區(qū)最常見、危害最大的遺傳病之一，尤以廣西、云南、廣東、海南、四川和貴州等省份為甚，云南、海南和廣東的地貧基因人群攜帶率可達(dá)10%以上，廣西更是達(dá)到了20%以上。

α-地貧主要是由于α-珠蛋白基因發(fā)生突變而引起。α-珠蛋白基因簇位于16p13.3，包括胎兒期和成人期表達(dá)的2個(gè)基因（α2和α1），基因的排列順序?yàn)?’-α2-α1-3’。根據(jù)單倍型的情況，可將α地貧分為3類：（1）缺失型α+地貧（-α/），缺失1個(gè)α基因；（2）缺失型α0地貧（--/），2個(gè)α基因同時(shí)缺失；（3）非缺失型α+地貧（αTα/或ααT/），1個(gè)α1或α2基因發(fā)生點(diǎn)突變或少數(shù)幾個(gè)堿基的缺失。中國(guó)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少19種α-珠蛋白基因大片段缺失和38種α-珠蛋白基因點(diǎn)突變。其中，6

種α-珠蛋白基因的突變：--SEA/、-α3.7/、-α4.2/、αWSα/（HBA2：c.369C>G）、αQSα/（HBA2：c.377

T>C）；αCSα/（HBA2：c.427T>C）占患病人群總數(shù)的98%。

α-地貧基因型和臨床分型的關(guān)系已經(jīng)基本闡明。α-地貧的表型嚴(yán)重程度隨著功能性α-珠蛋白基因的減少而加重：（1）1個(gè)α-基因缺失或點(diǎn)突變（-α/αα或ααT/αα或αTα/αα），稱為靜止型α-地貧，通常不貧血，血液學(xué)表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素；（2）2個(gè)α-基因缺失或復(fù)合-α基因點(diǎn)突變，或點(diǎn)突變，其基因型為--/αα或-α/-α或-α/ααT或αTα/-α或αTα/αTα，稱為輕型α-地貧，臨床表現(xiàn)為不貧血或輕度貧血，血液學(xué)檢查有小細(xì)胞低色素特征；（3）3個(gè)α-基因缺失或復(fù)合α基因點(diǎn)突變，基因型為--/-α或--/αTα，稱為中間型α-地貧，又稱Hb

H病，患者有輕至重度貧血。某些基因型為αTα/αTα的病例（如αCSα/αCSα、αQSα/αQSα和αCSα/αQSα）也表現(xiàn)為Hb

H病。通常，--/αTα的非缺失型

Hb

H病較單純?nèi)笔虷b

H?。?-/-α）的臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重，特別是基因型為--/αCSα或--/αQSα的Hb

H病患者，貧血程度較為嚴(yán)重；（4）4個(gè)α-基因缺失，其基因型為--/--，稱為重型α-地貧，又稱Hb

Bart’s胎兒水腫綜合征，此類個(gè)體一般無(wú)法存活到出生或分娩后半小時(shí)內(nèi)死亡。

β-地貧是由于β-珠蛋白基因發(fā)生突變而引起，以點(diǎn)突變?yōu)橹?，少?shù)為缺失型。β-珠蛋白基因簇位于11p15.3，包括2個(gè)成人期表達(dá)基因（β和δ），基因的排列順序?yàn)?’-δ-β-3’。根據(jù)β-珠蛋白鏈合成量的程度，可將β-地貧分為3類：（1）β0地貧，β-珠蛋白鏈完全不能合成，其所在的等位基因稱為β0地貧等位基因；（2）β+地貧，β-珠蛋白鏈合成減少，其所在的等位基因稱為β+地貧等位基因；（3）β++地貧，又稱沉默型β-地貧，β-珠蛋白鏈合成輕微減少。中國(guó)已至少報(bào)道84種β-珠蛋白基因點(diǎn)突變和11種β-珠蛋白基因缺失。其中，6種點(diǎn)突變：HBB：c.126_129delCTTT，HBB：c.52A>T，HBB：c.-78A>G，HBB：

c.79G>A，HBB：

c.316-197C>T和HBB：

c.216_217insA占了全部突變類型的90%以上。

β-地貧的臨床表型可分為4種：（1）靜止型β-地貧，基因型為β++/βN，血液學(xué)表型正?；蚺R界，一般只能通過(guò)分子診斷識(shí)別；（2）輕型β-地貧，基因型為β0/βN或β+/βN，臨床表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素和HbA2值升高；（3）中間型β-地貧，基因型為β+/β+或β+/β0，表型變異范圍大，可從輕度貧血到中度貧血，多于幼兒期出現(xiàn)中度貧血；（4）重型β-地貧，基因型為β+/β0或β0/β0，通常伴有嚴(yán)重貧血，需要定期輸血才能存活?；純撼錾鷷r(shí)無(wú)癥狀，常于嬰兒期（3-12月齡）發(fā)病。如不治療，患兒多于5歲前死亡。此外，中間型的分子基礎(chǔ)較為復(fù)雜，顯性β-地貧突變的雜合子（βD/βN），合并α-地貧突變的β-地貧突變純合子（β0/β0），或合并α-珠蛋白三聯(lián)體的β-地貧突變雜合子（β0/βN或β+/βN），也會(huì)顯示中間型的表型。

2018年發(fā)布的《重型β-地中海貧血的診斷和治療指南》明確規(guī)定：對(duì)于重型β-地中海貧血的診斷，有條件者均應(yīng)進(jìn)行基因診斷，基因型為純合子或雙重雜合子為確診本病的指標(biāo)。2018年發(fā)布的《兒童非輸血依賴型地中海貧血的診治和管理專家共識(shí)》也明確規(guī)定：地貧基因檢測(cè)為非輸血依賴型地貧的診斷依據(jù)之一。

另外，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的相關(guān)文件要求：為減少重型地貧患兒出生，在我國(guó)地貧高發(fā)省份實(shí)施地貧防控試點(diǎn)項(xiàng)目。主要流程包括：（1）對(duì)新婚夫婦和計(jì)劃懷孕夫婦在懷孕前或孕期進(jìn)行血常規(guī)初篩；（2）對(duì)夫婦一方或雙方血常規(guī)檢查結(jié)果陽(yáng)性的夫婦進(jìn)行血紅蛋白分析復(fù)篩；（3）對(duì)血紅蛋白分析復(fù)篩結(jié)果均為陽(yáng)性的夫婦，取其抗凝靜脈全血進(jìn)行相應(yīng)的α+β地貧基因檢測(cè)；（4）綜合夫婦雙方病史詢問(wèn)、地貧篩查和基因檢測(cè)結(jié)果，判定為高風(fēng)險(xiǎn)夫婦。對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)夫婦進(jìn)行追蹤，及時(shí)了解受檢婦女懷孕情況，指導(dǎo)女方在懷孕后適宜時(shí)期接受產(chǎn)前診斷。產(chǎn)前診斷的對(duì)象為胎兒，樣本類型為胎兒的絨毛、羊水和臍帶血，檢測(cè)項(xiàng)目為相應(yīng)的地貧基因檢測(cè)。

綜上，結(jié)合該類產(chǎn)品臨床使用的實(shí)際情況，本指導(dǎo)原則的預(yù)期用途可為：用于體外定性檢測(cè)人外周靜脈全血或胎兒羊水等樣本中基因組DNA的α-和/或β-地貧相關(guān)基因，用于α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估，或胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷等。

結(jié)合該類產(chǎn)品在中國(guó)注冊(cè)的實(shí)際情況以及當(dāng)前的認(rèn)知，本指導(dǎo)原則僅對(duì)“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預(yù)期用途的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了詳細(xì)闡述。針對(duì)其他預(yù)期用途，本指導(dǎo)原則僅對(duì)部分內(nèi)容進(jìn)行了闡述，申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性，對(duì)本指導(dǎo)原則未涉及的內(nèi)容進(jìn)行補(bǔ)充并做出相應(yīng)評(píng)價(jià)。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于PCR探針?lè)ǚ椒ń⒌?，?duì)于其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)（如：PCR-反向點(diǎn)雜交法和gap-PCR法等），可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)、檢驗(yàn)原理、檢測(cè)的突變類型以及臨床意義等方面詳細(xì)說(shuō)明申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。

綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（原總局令第5號(hào)，以下簡(jiǎn)稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（原總局公告2014年第44號(hào)），以下簡(jiǎn)稱《44號(hào)公告》的要求。

（二）主要原材料的研究資料

主要原材料研究資料包括主要反應(yīng)成分、對(duì)照品（質(zhì)控品）及企業(yè)參考品的研究資料。

1.此類產(chǎn)品的主要反應(yīng)成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測(cè)所需引物、探針、酶、dNTPs、反應(yīng)緩沖液等。申請(qǐng)人應(yīng)提交相關(guān)原材料的選擇、制備和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。如為申請(qǐng)人自制，應(yīng)提交詳細(xì)的工藝穩(wěn)定性研究資料；如為外購(gòu)，還應(yīng)提交供應(yīng)商篩選資料以及供應(yīng)商提供的原材料質(zhì)量檢定報(bào)告。

1.1

核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。

1.2

引物、探針

申請(qǐng)人應(yīng)詳述引物、探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議設(shè)計(jì)多套引物探針以供篩選，針對(duì)待測(cè)位點(diǎn)的特異性等進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇最佳設(shè)計(jì)，并提交詳細(xì)的篩選研究數(shù)據(jù)。

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)選定的引物、探針原材料進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，一般包括：分子量、純度（HPLC等）、濃度、探針熒光標(biāo)記基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，以及功能性試驗(yàn)等，并依據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.3酶

酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)各種酶的活性進(jìn)行驗(yàn)證，提交功能性試驗(yàn)資料，并確定酶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

DNA聚合酶應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應(yīng)具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

1.4脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應(yīng)提交對(duì)其純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料，以及功能性試驗(yàn)資料，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.對(duì)照品（質(zhì)控品）

試劑盒的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置各種試劑盒對(duì)照品（質(zhì)控品）來(lái)實(shí)現(xiàn)。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)至少包括代表性的突變位點(diǎn)和突變類型。陰性對(duì)照可以是含有野生型序列的核酸溶液?？瞻讓?duì)照為不含核酸的溶液。

如該類產(chǎn)品所采用的方法學(xué)和檢驗(yàn)原理顯示：無(wú)論檢測(cè)何種樣本（野生型、雜合突變和純合突變），其反應(yīng)體系均可報(bào)出核酸序列結(jié)果，均可對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，則無(wú)需另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)；否則，試劑盒應(yīng)另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)。

對(duì)照品可采用人基因組DNA、細(xì)胞系或質(zhì)粒等。空白對(duì)照應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。申請(qǐng)人應(yīng)提供對(duì)照品原料選擇、制備、定值過(guò)程等的詳細(xì)研究數(shù)據(jù)，并對(duì)其檢測(cè)結(jié)果做出明確的范圍要求。

3.企業(yè)參考品

企業(yè)參考品主要包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品和精密度參考品等。申請(qǐng)人應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料選擇、制備方法、基因序列確認(rèn)及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的詳細(xì)研究資料等。

3.1

陽(yáng)性參考品：可采用臨床樣本或其核酸溶液，如采用臨床樣本，則樣本類型應(yīng)與待測(cè)樣本一致。應(yīng)至少包含所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合型樣本，同時(shí)盡量納入純合突變型樣本。對(duì)于某些稀有基因型，也可采用細(xì)胞系或質(zhì)粒。

3.2

陰性參考品：應(yīng)包括野生型臨床樣本或其核酸溶液，以及易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的同源序列樣本，同時(shí)應(yīng)盡量包含檢測(cè)范圍外其他檢測(cè)位點(diǎn)的樣本等。

3.3檢測(cè)限參考品可選擇最低檢測(cè)限濃度（例如：95%檢出率水平）或接近最低檢測(cè)限濃度（例如100%檢出率水平）的臨床樣本或其核酸溶液，至少包含所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合型樣本。

3.4

精密度參考品應(yīng)至少包括低濃度雜合突變型臨床樣本或其核酸溶液，應(yīng)至少包括代表性的突變位點(diǎn)和突變類型，且在每一反應(yīng)體系均有分布。

目前，該類產(chǎn)品已有國(guó)家參考品，對(duì)于申報(bào)產(chǎn)品所聲稱的檢測(cè)位點(diǎn)，企業(yè)參考品的要求應(yīng)不低于國(guó)家參考品。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTPs濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標(biāo)記（如有）等工藝過(guò)程的描述及確定依據(jù)。生產(chǎn)過(guò)程應(yīng)對(duì)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標(biāo)明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細(xì)說(shuō)明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

反應(yīng)體系研究指反應(yīng)條件的選擇確定過(guò)程，包括樣本采集、預(yù)處理（如有）、樣本用量、試劑用量、核酸提取純化步驟、PCR反應(yīng)條件、閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）等的確定。

不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如有差異應(yīng)分別提交。

（四）分析性能評(píng)估資料

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)下述各項(xiàng)分析性能提交詳細(xì)的評(píng)估資料，包括試驗(yàn)地點(diǎn)、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)樣本（類型、來(lái)源、數(shù)量、處理方法、基因型和濃度確認(rèn)等）、可接受標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計(jì)方法、試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)論等。分析性能評(píng)估的實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則。

每項(xiàng)性能評(píng)估應(yīng)盡量采用與適用樣本類型一致的臨床樣本，對(duì)于某些稀有基因型，也可采用細(xì)胞系等。

1.核酸提取/純化性能（如有）

在進(jìn)行靶核酸檢測(cè)前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)暮怂崽崛?純化步驟。該步驟應(yīng)最大量分離和純化目的核酸并盡可能去除PCR抑制物。無(wú)論檢測(cè)試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請(qǐng)人都應(yīng)對(duì)配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度等做充分的驗(yàn)證，并評(píng)價(jià)該方法能否滿足該類產(chǎn)品的要求。

2.檢測(cè)準(zhǔn)確性

建議采用若干份臨床樣本驗(yàn)證該類產(chǎn)品的檢測(cè)準(zhǔn)確性，樣本類型與說(shuō)明書聲稱的樣本類型一致。樣本應(yīng)涵蓋野生型、所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合突變型，同時(shí)盡量納入純合突變型。對(duì)于某些稀有基因型，也可采用細(xì)胞系或質(zhì)粒。

3.最低檢測(cè)限

該類產(chǎn)品的最低檢測(cè)限可定義為：在滿足一定的檢測(cè)準(zhǔn)確性和精密度的條件下，能夠檢出目標(biāo)序列的最低人基因組DNA的濃度?？刹捎锰荻葷舛鹊娜嘶蚪MDNA樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)，確定適當(dāng)檢出率水平（如：95%）下的最低人基因組DNA濃度。檢測(cè)限評(píng)價(jià)建議采用臨床樣本或細(xì)胞系，并至少包含所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合突變型。應(yīng)明確臨床樣本或細(xì)胞系與人基因組DNA濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

4.分析特異性

4.1

應(yīng)針對(duì)同源序列或檢測(cè)范圍外基因和位點(diǎn)進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證，說(shuō)明交叉反應(yīng)樣本的制備方法、核酸序列確認(rèn)方法，提交詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

4.2

應(yīng)針對(duì)可能的內(nèi)源和外源性干擾物進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究。內(nèi)源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白、母體細(xì)胞的干擾等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑和常用藥物等。

干擾試驗(yàn)可通過(guò)在臨床樣本中人工添加干擾物質(zhì)的方式，評(píng)價(jià)干擾物質(zhì)對(duì)目標(biāo)序列檢測(cè)的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進(jìn)行干擾試驗(yàn)評(píng)價(jià)。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)；如有干擾，應(yīng)確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

5.精密度

精密度評(píng)價(jià)應(yīng)采用臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)操作完全按照說(shuō)明書執(zhí)行，包含核酸提取/純化等步驟（如有）。應(yīng)對(duì)每一反應(yīng)體系進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，并至少覆蓋代表性的突變位點(diǎn)和突變類型。

精密度評(píng)價(jià)需滿足如下要求：

5.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要因素進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑本身外，還包括分析儀器、操作者、地點(diǎn)、時(shí)間、檢測(cè)輪次和試劑批次等。

5.2設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

5.3用于精密度評(píng)價(jià)的臨床樣本至少設(shè)置低濃度和中/高濃度水平。

5.4精密度指標(biāo)可設(shè)置為CV等（如有），申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。

（五）陽(yáng)性判斷值確定資料

建議納入一定數(shù)量的臨床樣本，應(yīng)包括所有檢測(cè)位點(diǎn)的各種基因型（野生型、雜合突變型，同時(shí)盡量納入純合突變型），采用受試者工作特征（ROC）曲線或其他合理方法確定陽(yáng)性判斷值。

如試劑判讀存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說(shuō)明灰區(qū)范圍的確定方法。

對(duì)于某些檢測(cè)方法學(xué)，陽(yáng)性判斷值研究可能不適用，申請(qǐng)人應(yīng)說(shuō)明理由。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要包括申報(bào)產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究和適用樣本的穩(wěn)定性研究?jī)刹糠帧Ｇ罢咧饕ㄉ陥?bào)產(chǎn)品的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、開瓶/復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制的研究等；后者則是指適用樣本的保存條件和保存時(shí)間等的研究。

實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究應(yīng)采用至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后，選取多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)品性能評(píng)價(jià)，從而確定產(chǎn)品保存條件和有效期。

如核酸提取液可保存，還需對(duì)核酸提取液的保存條件和保存時(shí)間進(jìn)行研究。

（七）臨床試驗(yàn)

應(yīng)滿足《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。下面僅說(shuō)明該類產(chǎn)品臨床試驗(yàn)中應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。

1．針對(duì)“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預(yù)期用途

1.1

臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)及人員

申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學(xué)背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規(guī)要求的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)。

1.2

臨床試驗(yàn)適用人群和臨床樣本

具有地貧癥狀和/或體征，或血液學(xué)表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素的疑似地貧患者和攜帶者；需與地貧進(jìn)行鑒別診斷的其他疾病患者，如：缺鐵性貧血、鐵粒細(xì)胞性貧血或先天性紅細(xì)胞生成異常性貧血等。

臨床試驗(yàn)所用樣本應(yīng)為抗凝外周血樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)分別滿足申報(bào)產(chǎn)品說(shuō)明書、對(duì)比試劑說(shuō)明書（如適用）及第三方試劑說(shuō)明書（如適用）的相關(guān)要求。

1.3臨床試驗(yàn)方法

1.3.1已有同類產(chǎn)品上市的申報(bào)產(chǎn)品

對(duì)于已批準(zhǔn)的α-地貧突變和β-地貧突變，原則上選擇已上市同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，評(píng)價(jià)申報(bào)產(chǎn)品的臨床檢測(cè)性能。

1.3.2無(wú)同類產(chǎn)品上市的申報(bào)產(chǎn)品

1.3.2.1

如新突變位點(diǎn)的臨床意義已獲行業(yè)認(rèn)可（如：國(guó)內(nèi)相關(guān)指南或?qū)＜夜沧R(shí)），且上述認(rèn)可基于充分的中國(guó)人群的臨床數(shù)據(jù)，則臨床試驗(yàn)可選擇Sanger基因測(cè)序（針對(duì)新的點(diǎn)突變）或臨床普遍使用的其他公認(rèn)方法（針對(duì)其他類型的新突變位點(diǎn)，如缺失）作為對(duì)比方法，評(píng)價(jià)新突變位點(diǎn)的臨床檢測(cè)性能。除此之外，還應(yīng)提交新位點(diǎn)臨床意義已獲行業(yè)認(rèn)可的相關(guān)證據(jù)，該部分資料可不納入臨床方案和報(bào)告。

1.3.2.2

如新突變位點(diǎn)的臨床意義未獲行業(yè)認(rèn)可，則臨床試驗(yàn)應(yīng)包括兩個(gè)目的，新突變位點(diǎn)的臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)和臨床意義評(píng)價(jià)。新突變位點(diǎn)的臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)可參考1.3.2.1；新突變位點(diǎn)的臨床意義評(píng)價(jià)應(yīng)提交基于中國(guó)人群的充分的臨床證據(jù)，證明基因型與表型的關(guān)系，如：隨訪或其他可證明基因型與表型關(guān)系的臨床驗(yàn)證資料。

1.4最低樣本量和陽(yáng)性例數(shù)

臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行估算，并詳細(xì)描述所使用統(tǒng)計(jì)方法及各參數(shù)的確定依據(jù)。

1.4.1

臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)的樣本量估算

臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)的樣本量估算可分為以下幾種情況。

對(duì)于常見突變位點(diǎn)，建議采用單組目標(biāo)值法分別估算每個(gè)突變位點(diǎn)臨床試驗(yàn)的最低樣本量，通過(guò)陽(yáng)性符合率計(jì)算所需陽(yáng)性樣本的例數(shù)，通過(guò)陰性符合率計(jì)算所需陰性樣本的例數(shù)，同時(shí)考慮脫落情況，估算最低樣本總量。陽(yáng)性符合率和陰性符合率的目標(biāo)值（臨床可接受的最低標(biāo)準(zhǔn)）建議均不低于95%。

對(duì)于罕見突變位點(diǎn)，陰性樣本的例數(shù)可根據(jù)上述方法進(jìn)行估算，陽(yáng)性樣本則應(yīng)保證一定的例數(shù)。

對(duì)于極其罕見的、且有確切臨床證據(jù)證明其臨床意義的突變位點(diǎn)，陰性樣本的例數(shù)可根據(jù)上述方法進(jìn)行估算，陽(yáng)性樣本的例數(shù)則應(yīng)結(jié)合臨床證據(jù)確定。

1.4.2

新位點(diǎn)臨床意義評(píng)價(jià)的樣本量估算

新位點(diǎn)臨床意義評(píng)價(jià)的樣本量估算，建議采用抽樣調(diào)查公式或其他合理方法進(jìn)行估算。

2.針對(duì)“地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估”和“胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷”預(yù)期用途

針對(duì)上述兩個(gè)預(yù)期用途，本指導(dǎo)原則僅對(duì)部分內(nèi)容進(jìn)行了闡述，申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性，充分考慮本指導(dǎo)原則未涉及的內(nèi)容，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.1臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和人員

如申報(bào)產(chǎn)品的預(yù)期用途為胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷，除滿足法規(guī)要求外，臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)還應(yīng)取得產(chǎn)前診斷技術(shù)服務(wù)資質(zhì)。臨床試驗(yàn)人員應(yīng)為經(jīng)過(guò)專門培訓(xùn)的取得資質(zhì)的人員。機(jī)構(gòu)和人員應(yīng)遵循《產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法》《母嬰保健專項(xiàng)技術(shù)服務(wù)許可及人員資格管理辦法》，機(jī)構(gòu)應(yīng)取得《母嬰保健技術(shù)服務(wù)執(zhí)業(yè)許可證》，人員應(yīng)取得《母嬰保健技術(shù)考核合格證書》。

2.2

臨床試驗(yàn)適用人群和臨床樣本

如預(yù)期用途為地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估，則適用人群為：地貧表型篩查陽(yáng)性的育齡人群。地貧表型篩查陽(yáng)性的育齡人群可根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)和地貧高發(fā)地區(qū)相關(guān)政策確定。

如預(yù)期用途為胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷，則適用人群為：地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的胎兒。地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的確定可參考國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)等相關(guān)文件。

臨床試驗(yàn)所用樣本應(yīng)為胎兒羊水等臨床樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)符合國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)等相關(guān)文件的要求，并滿足產(chǎn)品說(shuō)明書的要求。

2.3

最低樣本量和陽(yáng)性例數(shù)

針對(duì)每種不同的預(yù)期用途，應(yīng)分別采用合理方法估算最低樣本量。同一預(yù)期用途的不同樣本類型（羊水和臍帶血等），也應(yīng)分別采用合理方法估算最低樣本量。

3.如有其他預(yù)期用途，也應(yīng)設(shè)計(jì)科學(xué)的臨床試驗(yàn)，提供充分的證據(jù)，證明其預(yù)期用途。

4.不同預(yù)期用途的通用要求

4.1

臨床試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析

4.1.1應(yīng)在臨床試驗(yàn)方案或報(bào)告中明確申報(bào)產(chǎn)品、對(duì)比試劑和第三方試劑的試驗(yàn)方法。

4.1.2臨床試驗(yàn)病例總結(jié)表應(yīng)以列表方式表示，包括申報(bào)產(chǎn)品的結(jié)果、對(duì)比試劑的結(jié)果、第三方試劑的檢測(cè)結(jié)果（如有）、臨床診斷、年齡和性別等。

4.1.3以交叉表分別總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以驗(yàn)證兩種試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性。

4.1.4

結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，對(duì)于兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，采用合理方法進(jìn)行復(fù)核，并對(duì)差異原因進(jìn)行分析。如無(wú)需復(fù)核，應(yīng)說(shuō)明理由。

4.2

臨床試驗(yàn)方案

各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由該實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

試驗(yàn)方案應(yīng)確定嚴(yán)格的入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程和結(jié)果判定時(shí)，應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比試劑/方法應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外，申報(bào)產(chǎn)品的樣本類型不應(yīng)超越對(duì)比試劑/方法對(duì)樣本類型的要求。

4.3臨床試驗(yàn)報(bào)告

應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》、《44號(hào)公告》和《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的相關(guān)要求。該類產(chǎn)品作為三類體外診斷試劑，應(yīng)將主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求等內(nèi)容作為附錄附于技術(shù)要求正文后。

目前，該類產(chǎn)品已有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

（九）產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告

根據(jù)《辦法》的要求，第三類體外診斷試劑申請(qǐng)注冊(cè)時(shí)應(yīng)提交連續(xù)三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的檢驗(yàn)報(bào)告。目前，該產(chǎn)品已有國(guó)家參考品，產(chǎn)品檢驗(yàn)應(yīng)滿足國(guó)家參考品的要求。

（十）產(chǎn)品說(shuō)明書

產(chǎn)品說(shuō)明書應(yīng)滿足《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，產(chǎn)品說(shuō)明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料的相關(guān)研究結(jié)果保持一致。下面對(duì)該類產(chǎn)品說(shuō)明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行闡述。

1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于定性檢測(cè)人xx樣本基因組DNA中的α-和/或β-地貧xx突變，用于：α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估，或胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷。

1.2介紹地貧相關(guān)的臨床背景信息及實(shí)驗(yàn)室診斷方法等，介紹被測(cè)靶標(biāo)（突變位點(diǎn)）的相關(guān)情況。

2.【主要組成成分】

2.1說(shuō)明試劑盒包含組分的名稱或數(shù)量等信息，說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組分，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱及其他相關(guān)信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以和醫(yī)療器械備案號(hào)（如有）等詳細(xì)信息。

3.【檢驗(yàn)原理】

3.1對(duì)試劑盒的被測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行詳細(xì)描述（基因位置、突變位點(diǎn)及相關(guān)特征等），對(duì)試劑盒所用探針、引物或突變的判定等進(jìn)行詳細(xì)介紹；對(duì)不同樣本反應(yīng)管組合、對(duì)照品設(shè)置及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行介紹。

3.2試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行適當(dāng)介紹。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

說(shuō)明試劑盒的效期穩(wěn)定性等，應(yīng)明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期等信息。

5.【樣本要求】

樣本的采集、處理、運(yùn)送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限以及運(yùn)送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測(cè)前是否需要恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的限制等。

6.【適用儀器】

所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

7.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

7.1實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。

7.2試劑配制方法和注意事項(xiàng)。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)（如適用），對(duì)核酸提取純化環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)控，明確提取核酸的濃度純度等質(zhì)量要求。

7.4擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.5

PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動(dòng)化檢測(cè)程序及相關(guān)注意事項(xiàng)。

7.6儀器設(shè)置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標(biāo)記情況、對(duì)待測(cè)樣本及其他對(duì)照品的熒光通道選擇等。

8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合對(duì)照品、樣本管檢測(cè)結(jié)果以及檢測(cè)類型，以列表形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。如存在檢測(cè)灰區(qū)，應(yīng)詳述對(duì)于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

9.【檢驗(yàn)方法的局限性】

9.1申報(bào)產(chǎn)品僅對(duì)下述檢測(cè)類型xx進(jìn)行了驗(yàn)證。

9.2有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運(yùn)送及處理或核酸過(guò)度降解均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

9.2.2未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】簡(jiǎn)述以下性能指標(biāo)：

10.1最低檢測(cè)限：簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的確定方法，并明確最低檢測(cè)限結(jié)果。

10.2陽(yáng)性/陰性參考品符合率。

10.3精密度：簡(jiǎn)單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結(jié)果。

10.4分析特異性

10.4.1交叉反應(yīng)驗(yàn)證：同源性序列等交叉反應(yīng)驗(yàn)證。

10.4.2干擾物質(zhì)驗(yàn)證：樣本中常見干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

10.5對(duì)比試驗(yàn)研究（如有）：簡(jiǎn)要介紹對(duì)比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

11.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》現(xiàn)行有效版本等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

三、起草單位

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。

第三篇：酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

附件1

酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

一、前言

本指導(dǎo)原則主要針對(duì)酶聯(lián)免疫類檢測(cè)試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)提出指導(dǎo)性技術(shù)要求。

本指導(dǎo)原則系對(duì)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細(xì)闡述其理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。

二、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于有關(guān)病原微生物檢測(cè)的第三類體外診斷試劑的注冊(cè)技術(shù)審查。其他酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑（如作為二類管理的體外診斷試劑）可參考本指導(dǎo)原則執(zhí)行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求?！? 2 — 2.試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專業(yè)技術(shù)人員、儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》；同時(shí)，應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則（試行）》的要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實(shí)施并保持有效運(yùn)行；還應(yīng)通過(guò)《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核。企業(yè)應(yīng)對(duì)試劑的使用范圍做出明確規(guī)定，并經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。

3.診斷試劑的研制應(yīng)當(dāng)按照科學(xué)、規(guī)范的原則，各反應(yīng)條件的選擇和確定應(yīng)符合基本的科學(xué)原理。

4.試劑在研制、生產(chǎn)過(guò)程中所用的各種材料及工藝，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標(biāo)：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn)定、工藝可控、檢測(cè)有效。

（二）原材料質(zhì)量控制 1.主要生物原料

與產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關(guān)的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。這類原料可用于包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)記相關(guān)酶（如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應(yīng)用抗原或抗體、制備校準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品）等。使用前應(yīng)按照工藝要求對(duì)這類生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對(duì)穩(wěn)定；若購(gòu)買，其供應(yīng)商要求相對(duì)固定，不能隨意變更供應(yīng)商，如果主要原料（包括工藝）或其供應(yīng)商有變更，應(yīng)依據(jù)國(guó)家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請(qǐng)。

主要生物原料的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目一般包括：（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質(zhì)；特殊生

— 3 — 物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn)。

（2）純度和分子量

主要經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進(jìn)行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據(jù)所檢測(cè)生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進(jìn)行電泳，一般每個(gè)電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍(lán)染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分子量大小應(yīng)在正確的條帶位臵。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過(guò)Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進(jìn)行檢測(cè)。

（4）效價(jià)

效價(jià)的測(cè)定一般根據(jù)蛋白含量測(cè)定結(jié)果，通過(guò)倍比稀釋法進(jìn)行。效價(jià)應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求。

（5）功能性實(shí)驗(yàn)

功能性實(shí)驗(yàn)是指生物原料用于試劑盒實(shí)際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產(chǎn)過(guò)程中作為蛋白保護(hù)劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合2000年版的《中國(guó)生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。建議作以下檢驗(yàn)：

（1）牛血清或羊血清

外 觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無(wú)溶血或異物。無(wú)菌試驗(yàn)：將血清直接37℃放臵7天，明亮處觀察，不得出現(xiàn)混濁或— 4 — 沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測(cè)定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待測(cè)血清1ml，采用飽和硫酸銨法進(jìn)行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化鈉溶液，至1ml，用Lowry方法測(cè)定，蛋白含量應(yīng)≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 觀：應(yīng)為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無(wú)吸潮，無(wú)結(jié)塊，無(wú)肉眼可見的其它雜質(zhì)顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18?26℃時(shí)，溶解時(shí)間應(yīng)≤15分鐘，pH值應(yīng)為6.5?7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥95％。

總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標(biāo)準(zhǔn)為≥90%。（3）酪蛋白：

應(yīng)符合生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。（4）標(biāo)記用酶

應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱（如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時(shí)應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢驗(yàn)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應(yīng)大于3.0。

對(duì)于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應(yīng)進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)定，均不能出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

生物輔料的供應(yīng)商同樣要求相對(duì)固定，不得隨意變更供應(yīng)商。3.化學(xué)原材料

化學(xué)原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括外觀、一般鹽類檢測(cè)、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘?jiān)?，均?yīng)符合《中國(guó)生物制品主要原輔材

— 5 — 料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》分析純級(jí)別的要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。

主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對(duì)固定，不得隨意發(fā)生變更。化學(xué)原材料在購(gòu)入時(shí)，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。

4.其他物料（1）酶標(biāo)板 ①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質(zhì)量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應(yīng)剔除。②吸附能力和精密性 采用合適的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

一般用一定濃度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結(jié)合物吸附，通過(guò)顯色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀讀數(shù)，計(jì)算CV值。CV值結(jié)果應(yīng)符合相關(guān)產(chǎn)品的功能性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，一般批內(nèi)CV≤5％，批間CV≤10％。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽(yáng)性對(duì)照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應(yīng)有相應(yīng)的裝量瓶，并建立相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規(guī)格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標(biāo)簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說(shuō)明書、干燥劑和包裝外盒等，應(yīng)參照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》和《醫(yī)療器械說(shuō)明書、標(biāo)簽和包裝標(biāo)識(shí)管理規(guī)定》建立相應(yīng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。— 6 — 5.企業(yè)質(zhì)控品

企業(yè)質(zhì)控品一般包括陰/陽(yáng)性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、鉤狀效應(yīng)（hook效應(yīng)）等質(zhì)控樣品，對(duì)于定量檢測(cè)試劑，還包括線性質(zhì)控品樣品。如該產(chǎn)品具有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）進(jìn)行標(biāo)化；若該診斷試劑沒有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

企業(yè)質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng)與診斷試劑的待測(cè)樣品的基質(zhì)基本一致，如待測(cè)樣品為血清/血漿，質(zhì)控品基質(zhì)也應(yīng)為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產(chǎn)

酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑主要組分的生產(chǎn)包括酶標(biāo)記物的制備及滴配過(guò)程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標(biāo)反應(yīng)板、分裝及包裝等步驟；并通過(guò)產(chǎn)品的半成品檢驗(yàn)和成品檢驗(yàn)兩個(gè)質(zhì)控過(guò)程來(lái)保證其質(zhì)量符合規(guī)定。

1.各種工作液的配制

酶聯(lián)免疫診斷試劑研制生產(chǎn)過(guò)程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽(yáng)性對(duì)照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對(duì)定量檢測(cè)試劑，還包括標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液。若陰性、陽(yáng)性對(duì)照或其他液體組分涉及生物安全性問(wèn)題，制備時(shí)應(yīng)在相應(yīng)的生物安全實(shí)驗(yàn)室完成。

各種工作液在配制過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的配方進(jìn)行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量檢驗(yàn)并達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，方可使用或分裝。對(duì)于定量檢測(cè)試劑，其標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液應(yīng)具有量值溯源性。

應(yīng)對(duì)配制過(guò)程及配制的液體進(jìn)行的質(zhì)量控制，主要包括酶結(jié)合物的

— 7 — 功能性實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應(yīng)測(cè)定在無(wú)相應(yīng)酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標(biāo)；終止液應(yīng)對(duì)其終止酶促反應(yīng)的能力進(jìn)行測(cè)定。

2.包被酶標(biāo)反應(yīng)板

包被前應(yīng)對(duì)酶標(biāo)反應(yīng)板進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標(biāo)反應(yīng)板的批號(hào)、數(shù)量、標(biāo)識(shí)。酶標(biāo)反應(yīng)板經(jīng)檢驗(yàn)合格后方能用于包被。不同批號(hào)的板條不能混用。

選擇經(jīng)檢驗(yàn)合格的包被原料（如抗原、抗體等），經(jīng)一定的方法確定最佳包被濃度和酶結(jié)合物工作濃度，按照診斷試劑的生產(chǎn)規(guī)程，配制包被緩沖液、封閉液，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，經(jīng)干燥后，已包被的酶標(biāo)反應(yīng)板用鋁箔紙封閉（內(nèi)臵干燥劑），保存于2?8℃。

應(yīng)對(duì)包被過(guò)程進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質(zhì)量檢驗(yàn)、包被液和封閉液的質(zhì)控（如配方、外觀、pH值）、包被過(guò)程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積、溫度、時(shí)間等）、包被均一性檢驗(yàn)、干燥過(guò)程的監(jiān)控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應(yīng)嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的量進(jìn)行過(guò)濾后再分裝，分裝量的誤差應(yīng)小于5%。

分裝及包裝均應(yīng)按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程要求進(jìn)行。包裝前，應(yīng)嚴(yán)格檢查試劑盒的品名、批號(hào)等，核對(duì)各試劑盒各組分的數(shù)量，并在關(guān)盒前進(jìn)行復(fù)核。

（四）質(zhì)量控制 1.半成品質(zhì)量控制（1）半成品抽樣

檢驗(yàn)人員按試劑的批號(hào)，根據(jù)抽樣申請(qǐng)單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各— 8 — 組分，作號(hào)標(biāo)記、待檢。

（2）半成品檢驗(yàn)

根據(jù)試劑盒的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或者制檢規(guī)程進(jìn)行半成品的檢驗(yàn)。半成品檢驗(yàn)，一般使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的企業(yè)參考品。若某類試劑沒有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

檢驗(yàn)指標(biāo)一般包括陰/陽(yáng)性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。對(duì)于精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對(duì)定量檢測(cè)試劑，同時(shí)應(yīng)分析其線性相關(guān)系數(shù)和定量質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

企業(yè)應(yīng)該對(duì)每一批試劑的半成品進(jìn)行穩(wěn)定性研究。試劑盒各組分應(yīng)留樣，2?8℃定期作穩(wěn)定性考核，同時(shí)作37℃熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.成品質(zhì)量控制

產(chǎn)品包裝完成后，質(zhì)檢人員根據(jù)試劑的批號(hào)、實(shí)際包裝量、抽樣申請(qǐng)單的要求進(jìn)行抽樣，同時(shí)填寫抽樣數(shù)量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數(shù)量應(yīng)包括檢驗(yàn)用數(shù)量和留樣數(shù)量。質(zhì)檢人員同時(shí)應(yīng)檢查相關(guān)原始記錄。

每一批酶聯(lián)免疫類檢測(cè)試劑的試生產(chǎn)量應(yīng)滿足工藝研究、分析性能驗(yàn)證、穩(wěn)定性研究、臨床試驗(yàn)、自測(cè)及注冊(cè)檢驗(yàn)等各階段所需樣品量的要求。

（1）成品檢驗(yàn)

成品檢驗(yàn)時(shí)，一般使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的企業(yè)參考品，并達(dá)到相應(yīng)質(zhì)量要求。若該診斷試劑沒有國(guó)家

— 9 — 標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)

在批放行前，每一批試劑應(yīng)完成37℃熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

四、名詞解釋

酶聯(lián)免疫法：是指在酶標(biāo)板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測(cè)樣品中的相關(guān)抗體（和/或抗原）反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物再與相應(yīng)的酶標(biāo)記的抗體和/或抗原進(jìn)一步反應(yīng)，經(jīng)過(guò)酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，由形成的顏色的強(qiáng)弱來(lái)判斷樣本中相應(yīng)的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻(xiàn)：

1.《中國(guó)生物制品規(guī)程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社

— 10 —

第四篇：抗人球蛋白檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2018年）

附件3

抗人球蛋白檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)抗人球蛋白檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)抗人球蛋白檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。如申請(qǐng)人認(rèn)為有必要增加本指導(dǎo)原則不包含的研究?jī)?nèi)容，可自行補(bǔ)充。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、范圍

抗人球蛋白檢測(cè)試劑可進(jìn)行直接抗人球蛋白試驗(yàn)和間接抗人球蛋白試驗(yàn)，主要用于不規(guī)則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細(xì)胞的檢測(cè)等。

本指導(dǎo)原則適用于抗人球蛋白檢測(cè)試劑，同時(shí)適用于不同的檢測(cè)方法，如試管法、柱凝集法等，但不適用于血源篩查用抗人球蛋白檢測(cè)試劑。

本指導(dǎo)原則僅包括對(duì)抗人球蛋白檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料中部分項(xiàng)目的要求，適用于進(jìn)行產(chǎn)品注冊(cè)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜，應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)）（以下簡(jiǎn)稱《辦法》）等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料的撰寫應(yīng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào)）（以下簡(jiǎn)稱“44號(hào)公告”）的相關(guān)要求。內(nèi)容主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)以及同類產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從靈敏度、特異性、效價(jià)、重復(fù)性等方面寫明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的異同。

（二）主要原材料研究資料

主要原材料研究資料應(yīng)包括主要組成成分（抗體、凝膠、玻璃珠等）的選擇、制備及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究資料。

1.抗體的選擇及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

明確抗體的來(lái)源，如為單克隆抗體應(yīng)明確細(xì)胞株、克隆號(hào)等內(nèi)容。提供抗體靈敏度、特異性、效價(jià)等基本性能的驗(yàn)證資料。

抗體如為自行生產(chǎn)，提供抗體的詳細(xì)生產(chǎn)及鑒定過(guò)程。

1.1靈敏度：已知抗體效價(jià)的臨床有意義的血型系統(tǒng)至少7種血型抗體（IgG）的最高稀釋倍數(shù)的凝集強(qiáng)度不小于1+。

1.2特異性：臨床有意義的已知血型系統(tǒng)至少7種，每種選1個(gè)抗體（IgG），與對(duì)應(yīng)的抗原陽(yáng)性細(xì)胞均應(yīng)檢測(cè)陽(yáng)性。

與不規(guī)則抗體陰性樣本檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。

1.3效價(jià)：如采用倍比稀釋的方法驗(yàn)證抗人球蛋白試劑的效價(jià)，分別采用IgG和/或C3d致敏的細(xì)胞或根據(jù)廠家確立的研究方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2.填充物的選擇：說(shuō)明填充物如凝膠、玻璃珠的特性，如組成、粒徑及其質(zhì)量控制要求。應(yīng)提交選擇比較過(guò)程，提交驗(yàn)證試驗(yàn)資料。

3.填充緩沖液：應(yīng)說(shuō)明組成成分，并對(duì)外觀、性狀、pH值等物理指標(biāo)及功能性進(jìn)行研究驗(yàn)證。

4.液體試劑稀釋液：應(yīng)說(shuō)明組成成分，并對(duì)外觀、性狀、pH值等物理指標(biāo)及功能性進(jìn)行研究驗(yàn)證。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡(jiǎn)要說(shuō)明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.產(chǎn)品基本反應(yīng)原理介紹。

3.主要生產(chǎn)工藝過(guò)程的研究資料、每一步生產(chǎn)工藝的確認(rèn)資料及試驗(yàn)數(shù)據(jù)。如抗體濃度的選擇確定過(guò)程、凝膠溶脹條件的確定、填充量及填充過(guò)程的研究資料，填充應(yīng)確保均勻無(wú)氣泡，以及質(zhì)量控制的要求。

4.主要反應(yīng)體系的研究資料、每一步反應(yīng)體系的確認(rèn)資料及試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

反應(yīng)體系的設(shè)置應(yīng)符合《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》等公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范、指南或標(biāo)準(zhǔn)的要求。如紅細(xì)胞懸液制備要求及紅細(xì)胞濃度的確定、用量的要求、孵育時(shí)間等；應(yīng)提交離心條件的研究資料，建議以離心力或固定離心機(jī)型號(hào)固定轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間的方式設(shè)置離心條件。

（四）分析性能評(píng)估資料

申請(qǐng)人應(yīng)提交在產(chǎn)品研制或成品驗(yàn)證階段對(duì)試劑進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括具體研究目的、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)室）、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、臨床樣本來(lái)源等。分析性能評(píng)估的實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)內(nèi)或國(guó)際有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。

產(chǎn)品性能研究所采用的各種儀器、試劑或其他物品如可能均應(yīng)采用境內(nèi)或境外已批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品，如抗體篩查紅細(xì)胞、血型抗體等。

分析性能評(píng)估試驗(yàn)中應(yīng)明確所有試驗(yàn)每種試劑的用量、試劑紅細(xì)胞的濃度、采用的試驗(yàn)方法（試管法、柱凝集法、微孔板法等）。所有試驗(yàn)方法應(yīng)符合配合使用的血型試劑的具體操作要求。

對(duì)于抗人球蛋白檢測(cè)試劑建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究：

1.間接抗人球蛋白試驗(yàn)：

提供臨床有意義的血型系統(tǒng)至少7種不規(guī)則抗體（IgG）檢測(cè)靈敏度和特異性的驗(yàn)證資料，明確所檢出抗體的抗體效價(jià)的具體要求，可參照以下要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1靈敏度

與已知抗體效價(jià)的血型抗體的最高稀釋倍數(shù)的凝集強(qiáng)度不小于1+，并且抗體效價(jià)不低于試管間接抗人球蛋白法測(cè)定結(jié)果。

C3d凝集強(qiáng)度≥2+。

1.2特異性

與已知抗體類型的血型抗體對(duì)應(yīng)的O型相應(yīng)抗原陽(yáng)性紅細(xì)胞的反應(yīng)為陽(yáng)性。

與已知抗體類型的血型抗體對(duì)應(yīng)的O型相應(yīng)抗原陰性紅細(xì)胞的反應(yīng)為陰性。

與C3d陽(yáng)性或陰性樣本反應(yīng)為陽(yáng)性或陰性。

1.3重復(fù)性

分別采用IgG性質(zhì)抗D抗體，IgG性質(zhì)抗Jka/Jkb抗體，IgG性質(zhì)抗Fya/Fyb抗體進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證。

批內(nèi)重復(fù)性采用同一批次檢測(cè)卡重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)次數(shù)不少于10次。

日間重復(fù)性采用同一批次檢測(cè)卡每日重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)天數(shù)不少于10天。

批間重復(fù)性采用至少三批檢測(cè)卡進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。

批內(nèi)、日間、批間重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果應(yīng)基本一致，檢測(cè)結(jié)果凝集強(qiáng)度差異不超過(guò)1+。

采用陰性結(jié)果的血清重復(fù)10次檢測(cè)，均應(yīng)出現(xiàn)陰性反應(yīng)。

1.4干擾

提供溶血、脂血、黃疸干擾的評(píng)估資料，應(yīng)至少采用強(qiáng)、中、弱性質(zhì)的抗體進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5血清、血漿比對(duì)的評(píng)估資料。

1.6抗凝劑的適用性研究驗(yàn)證。

1.7采用部分臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)靈敏度和特異性的評(píng)價(jià)，應(yīng)考慮涵蓋腫瘤、血液病、自身免疫病和貧血患者、老人及兒童等病例來(lái)源，應(yīng)包括陽(yáng)性和陰性病例。

1.8分別進(jìn)行每個(gè)預(yù)期用途的完整的性能評(píng)估資料，應(yīng)至少包括50例陽(yáng)性病例。

2.直接抗人球蛋白試驗(yàn)

使用被不規(guī)則抗體和/或C3d致敏的紅細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，評(píng)價(jià)產(chǎn)品性能，適用的性能評(píng)價(jià)內(nèi)容可以參照間接抗人球蛋白試驗(yàn)。

（五）陽(yáng)性判斷值

給出不同凝集強(qiáng)度的研究方法，并明確不同凝集強(qiáng)度代表的具體意義，并應(yīng)包含溶血、混合視野雙群等情況，明確具體的試驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)步驟，提供不同凝集強(qiáng)度的圖例或相片。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、加熱穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案，實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)至少包括靈敏度、特異性、重復(fù)性等內(nèi)容。

穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點(diǎn)（溫度范圍），每間隔一定的時(shí)間段對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行全性能的分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果應(yīng)分別在說(shuō)明書【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】?jī)身?xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

（七）臨床試驗(yàn)

臨床試驗(yàn)總體要求及臨床試驗(yàn)資料的內(nèi)容應(yīng)符合《辦法》、“44號(hào)公告”及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的規(guī)定，以下僅結(jié)合抗人球蛋白檢測(cè)試劑的具體特點(diǎn)對(duì)其臨床試驗(yàn)中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容進(jìn)行闡述。

1.研究方法

該類試劑已有同類產(chǎn)品上市，按照法規(guī)要求應(yīng)選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，采用試驗(yàn)用體外診斷試劑（以下稱考核試劑）與之進(jìn)行比較研究試驗(yàn)，證明本品與已上市產(chǎn)品等效。

2.臨床試驗(yàn)單位的選擇

應(yīng)選擇符合相關(guān)法規(guī)要求的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，不得選擇血站進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

3.病例選擇

臨床總病例數(shù)應(yīng)不少于3000例。應(yīng)采用臨床患者樣本進(jìn)行臨床研究，供血者樣本不得作為臨床病例納入。應(yīng)包括對(duì)檢測(cè)易產(chǎn)生干擾的病例，盡量選擇多種疾病患者樣本（如腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者）、老人、兒童（不同年齡段）等。

4.實(shí)驗(yàn)過(guò)程

無(wú)論直接抗人球蛋白試驗(yàn)還是間接抗人球蛋白試驗(yàn)，均應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的預(yù)期用途和適用人群分別進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

在進(jìn)行間接抗人球蛋白檢測(cè)試劑臨床試驗(yàn)的過(guò)程中除與對(duì)比試劑進(jìn)行比較外，陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)給出不規(guī)則抗體的具體鑒定結(jié)果。

產(chǎn)品如適用于不同的預(yù)期用途（如不規(guī)則抗體篩查、抗體致敏紅細(xì)胞檢測(cè)、交叉配血等），每種預(yù)期用途均應(yīng)分別進(jìn)行至少3000例的臨床試驗(yàn)，如適用于不規(guī)則抗體篩查或抗體致敏紅細(xì)胞檢測(cè)等，每種預(yù)期用途應(yīng)分別包含不少于100例陽(yáng)性病例，如適用于交叉配血相關(guān)用途，應(yīng)包含不少于100例交叉配血不合病例?？贵w致敏紅細(xì)胞檢測(cè)應(yīng)根據(jù)疾病的種類，分別進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

交叉配血使用的供血者樣本，最多只能使用兩次，交叉配血不得使用血型不合的樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

同時(shí)應(yīng)明確配合使用的試劑產(chǎn)品。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)進(jìn)行考核試劑與對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率的計(jì)算，并以四格表的形式進(jìn)行列表，并對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的一致性。

6.結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

對(duì)于兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致[考核試劑與對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果不一致、與對(duì)比試劑凝集強(qiáng)度差異較大（差異2個(gè)凝集強(qiáng)度及以上）]的樣本，應(yīng)采用臨床上公認(rèn)較好的第三種同類試劑進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)給出最終的抗體鑒定結(jié)果。

7.臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄表應(yīng)作為臨床試驗(yàn)報(bào)告附件提交。臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄表應(yīng)列明所有病例的具體臨床診斷信息、凝集強(qiáng)度和抗體鑒定結(jié)果，如有不符樣本應(yīng)列明第三方確認(rèn)的結(jié)果。

（八）產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)分析資料

產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)分析資料應(yīng)符合“44號(hào)公告”的基本要求，并參照相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析。風(fēng)險(xiǎn)分析中應(yīng)充分考慮到各種可能影響檢測(cè)結(jié)果的因素，如某些樣本（如腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者等）在進(jìn)行抗人球蛋白檢測(cè)時(shí)可能存在一定的干擾、實(shí)驗(yàn)過(guò)程不規(guī)范、有些抗體較弱導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定等，申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)這些不確定的因素分析產(chǎn)品應(yīng)用可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。

（九）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、性能評(píng)估等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》和“44號(hào)公告”的相關(guān)規(guī)定。

如果擬申報(bào)試劑已有相應(yīng)的國(guó)家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求不得低于上述標(biāo)準(zhǔn)要求。

產(chǎn)品技術(shù)要求的性能指標(biāo)應(yīng)至少包括靈敏度、特異性、重復(fù)性等。

產(chǎn)品技術(shù)要求的附錄應(yīng)包括主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定要求。主要原材料應(yīng)明確抗體來(lái)源、克隆號(hào)、純度、效價(jià)、特異性以及功能性驗(yàn)證要求，應(yīng)明確填充物來(lái)源及主要特征、質(zhì)量控制要求，緩沖液應(yīng)明確組成、pH值等特性及質(zhì)控要求。主要生產(chǎn)工藝應(yīng)以流程圖形式描述主要生產(chǎn)工藝過(guò)程，并明確主要生產(chǎn)工藝的具體條件和質(zhì)量控制點(diǎn)。半成品檢定應(yīng)明確半成品的檢驗(yàn)要求及方法。

（十）產(chǎn)品注冊(cè)檢驗(yàn)報(bào)告

根據(jù)《辦法》要求，首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類體外診斷試劑產(chǎn)品應(yīng)在國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理部門認(rèn)可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢驗(yàn)。

（十一）產(chǎn)品說(shuō)明書

說(shuō)明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、檢驗(yàn)原理、試驗(yàn)方法、檢測(cè)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說(shuō)明書是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)最重要的文件之一。產(chǎn)品說(shuō)明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，境外產(chǎn)品的中文說(shuō)明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明參考文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

以下內(nèi)容僅對(duì)抗人球蛋白檢測(cè)試劑說(shuō)明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，說(shuō)明書其他內(nèi)容應(yīng)根據(jù)《體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則》要求進(jìn)行編寫。

1.【預(yù)期用途】

1.1寫明本試劑用于直接抗人球蛋白試驗(yàn)和/或間接抗人球蛋白試驗(yàn)，主要用于不規(guī)則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細(xì)胞的檢測(cè)（明確疾病類型）等，同時(shí)明確不用于血源篩查，僅用于臨床檢驗(yàn)。

1.2說(shuō)明與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)癥背景情況，說(shuō)明相關(guān)的臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷方法。

2.【儲(chǔ)存條件及有效期】

說(shuō)明試劑的儲(chǔ)存條件及有效期、加速穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性等。

3.【適用儀器】明確具體的離心機(jī)和/或孵育器型號(hào)（如適用）。

4.【樣本要求】

明確溶血、脂血、黃疸樣本是否可以使用，或提供使用此類樣本的最低要求。依據(jù)穩(wěn)定性研究結(jié)果寫明樣本穩(wěn)定性。

明確適用的抗凝劑的要求。

明確具體的樣本采集、處理方法及過(guò)程。

明確紅細(xì)胞配制使用的LISS液的生產(chǎn)廠家、規(guī)格、貨號(hào)等內(nèi)容。

5.【陽(yáng)性判斷值】

明確各種試驗(yàn)方法的結(jié)果判斷方法及標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)不同凝集強(qiáng)度的圖例或照片進(jìn)行詳細(xì)解釋。

6.【檢驗(yàn)方法】

明確配合使用的抗體篩查用紅細(xì)胞的生產(chǎn)廠家、規(guī)格、貨號(hào)等內(nèi)容。

須明確具體的檢驗(yàn)步驟，反應(yīng)體系的描述應(yīng)準(zhǔn)確且應(yīng)與研究資料一致，不同的預(yù)期用途應(yīng)分別詳細(xì)描述實(shí)驗(yàn)過(guò)程。如配合其他試劑進(jìn)行試驗(yàn)，需注明試驗(yàn)方法應(yīng)完全符合配合試劑的試驗(yàn)操作要求。

7.【檢驗(yàn)方法的局限性】

未被檢出的抗IgG抗體在某些病例中可能有臨床意義。

8.【注意事項(xiàng)】

8.1上腔部分或封口處有氣泡或液滴的卡，必須在使用前離心。

8.2濃度過(guò)高或過(guò)低的紅細(xì)胞懸液會(huì)引起異常結(jié)果。

8.3在不規(guī)則抗體篩查、交叉配血試驗(yàn)中LISS液可以增強(qiáng)抗原抗體的反應(yīng)，應(yīng)嚴(yán)格按產(chǎn)品說(shuō)明書規(guī)范使用低離子液。

三、參考文獻(xiàn)

1.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）.2014年9月

2.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑說(shuō)明書編寫指導(dǎo)原則（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）.2014年9月

3.中國(guó)生物制品規(guī)程（2000年版）.化學(xué)工業(yè)出版社

四、起草單位

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。

第五篇：核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則3

附件3

核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

一、前言

本指導(dǎo)原則主要針對(duì)核酸擴(kuò)增類檢測(cè)試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)提出指導(dǎo)性技術(shù)要求。

本指導(dǎo)原則系對(duì)核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細(xì)闡述其理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。

二、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑的注冊(cè)技術(shù)審查，其他類核酸檢測(cè)試劑可參照相關(guān)內(nèi)容。

三、基本要求

（一）基本原則

1.核酸擴(kuò)增類檢測(cè)試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》。研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。

2．試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具有與其技術(shù)要求相適應(yīng)的人員、廠房、設(shè)施和

— 23 — 儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，配備滿足核酸提取和擴(kuò)增檢測(cè)以及操作人員防護(hù)所需的設(shè)備。建立專用實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格分區(qū)，人員和物品應(yīng)當(dāng)單向流動(dòng)，以最大限度地防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣品之間的污染和避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。生產(chǎn)用于病原微生物核酸檢測(cè)的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立符合生物安全要求的設(shè)施和措施。

3.試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則（試行）》的要求，建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，并應(yīng)通過(guò)《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核。

4.核酸擴(kuò)增類檢測(cè)試劑的引物設(shè)計(jì)應(yīng)當(dāng)符合核酸檢測(cè)設(shè)計(jì)的要求，擴(kuò)增體系應(yīng)設(shè)定合理的內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)，試劑需設(shè)置抗污染的特定措施，擴(kuò)增產(chǎn)物須進(jìn)行確證研究。

5.企業(yè)使用新型原材料時(shí)，應(yīng)提供與通行原材料比對(duì)研究結(jié)果及相關(guān)資料。使用未列入上述標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)試劑，應(yīng)不低于分析純。

（二）原材料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品或標(biāo)準(zhǔn)品等的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量分析和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定；如主要原材料來(lái)自市場(chǎng)（從其他單位購(gòu)買），應(yīng)提供的資料包括：對(duì)物料供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、購(gòu)買合同、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。主要原材料（包括生產(chǎn)工藝）或其供應(yīng)商發(fā)生變更，應(yīng)依據(jù)國(guó)家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請(qǐng)。

核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

1.脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應(yīng)為高效液相色譜（HPLC）純、PCR級(jí)，無(wú)DNase和RNase污染?！?0℃保存。— 24 — 2.引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用脫氧核糖核酸（DNA）合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。

凍干粉，序列正確，合成量應(yīng)達(dá)到試劑生產(chǎn)要求。純度應(yīng)達(dá)到電泳級(jí)（PAGE）或HPLC級(jí)，不含雜帶。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。

應(yīng)作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260nm/OD280nm的比值在1.6—2.0之間，可視為合格引物。-20℃保存。

3.探針

是指特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)。通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5'-端(和/或3'-端)進(jìn)行標(biāo)記，如熒光素報(bào)告基團(tuán)或其他發(fā)光標(biāo)記物，在3'-端標(biāo)記熒光素淬滅基團(tuán)，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化。

凍干粉，純度應(yīng)達(dá)到HPLC純。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜；應(yīng)對(duì)探針的核酸序列及標(biāo)記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物進(jìn)行核實(shí)，并作HPLC分析。應(yīng)以可見—紫外分光光度計(jì)進(jìn)行200—800nm掃描，在260nm處應(yīng)有吸收峰。另外，根據(jù)標(biāo)記熒光素的不同，還應(yīng)該在熒光素的激發(fā)波長(zhǎng)處有吸收峰，如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA熒光素在560nm處有特異的吸收峰，雜交探針在493nm、625nm、685nm處有特異的吸收峰，檢定合格后入庫(kù)。避光、-20℃保存。

4.DNA聚合酶

如Taq DNA聚合酶。應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性。-20℃保存。

5.尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，IU UNG

— 25 — 在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模板應(yīng)完全降解，不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。-20℃保存。

6.逆轉(zhuǎn)錄酶

具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性。—20℃保存。

（三）生產(chǎn)工藝

核酸擴(kuò)增類檢測(cè)試劑的基本生產(chǎn)工藝通常包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過(guò)程應(yīng)對(duì)電導(dǎo)率pH、等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。

工藝研究的資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本類型、樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、校準(zhǔn)方法、質(zhì)控方法、臨界值的確定、穩(wěn)定性和有效期，提供確切的依據(jù)。

（四）質(zhì)量控制 1.半成品質(zhì)量控制

（1）按批號(hào)抽取規(guī)定數(shù)量的半成品。

（2）以參考品/對(duì)照品進(jìn)行半成品質(zhì)量控制。如果產(chǎn)品具有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)以其進(jìn)行檢定。如果產(chǎn)品不具有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)根據(jù)規(guī)定制備相應(yīng)的企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。

（3）半成品檢定內(nèi)容包括：陰/陽(yáng)性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度。檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

（4）半成品檢定合格后，按試劑盒組成及時(shí)進(jìn)行分裝和包裝。2.成品質(zhì)量控制

（1）每一批核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑的試生產(chǎn)量應(yīng)滿足工藝研究、分析性能驗(yàn)證、穩(wěn)定性研究、臨床試驗(yàn)、自測(cè)及注冊(cè)檢驗(yàn)等各階段所需樣品量的要求。— 26 —（2）產(chǎn)品完成包裝后，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)量進(jìn)行抽樣和生產(chǎn)記錄審核。（3）以參考品/對(duì)照品進(jìn)行成品質(zhì)量檢驗(yàn)。結(jié)果應(yīng)符合要求。（4）成品檢驗(yàn)的內(nèi)容應(yīng)包括：陰/陽(yáng)性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度、線性范圍（定量產(chǎn)品）和穩(wěn)定性。

5．試劑批放行前，應(yīng)對(duì)需要進(jìn)行穩(wěn)定性考核的試劑成分，在特定溫度或條件下進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。穩(wěn)定性試驗(yàn)可采用加速破壞試驗(yàn)。

四、名詞解釋

核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑：核酸擴(kuò)增技術(shù)泛指以擴(kuò)增脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）為手段，檢測(cè)特定核酸序列或篩查特定基因的檢測(cè)技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、連接酶鏈反應(yīng)（LCR）、轉(zhuǎn)錄依賴的擴(kuò)增反應(yīng)（TMA）等。核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑是基于核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的體外診斷試劑，目前已經(jīng)用于病原體檢測(cè)、特定疾病的早期診斷和體內(nèi)物質(zhì)的型別鑒定等不同領(lǐng)域。

五、參考文獻(xiàn)

1.《中國(guó)生物制品規(guī)程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社