第一篇：乙型肝炎病毒e抗原、e抗體檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

附件2 乙型肝炎病毒e抗原、e抗體檢測(cè)試劑注冊(cè) 技術(shù)審查指導(dǎo)原則 本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)乙型肝炎病毒e抗原、e抗體檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)審評(píng)注冊(cè)申報(bào)資料提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對(duì)乙型肝炎病毒e抗原、e抗體檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供申請(qǐng)人和審查人員使用的指導(dǎo)性文件，不涉及注冊(cè)審批等行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如有能夠滿(mǎn)足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍 （一）背景簡(jiǎn)介 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）屬嗜肝DNA 病毒科，是乙型病毒性肝炎的病原體。HBV 主要經(jīng)血（如不安全注射等）、母嬰及性接觸傳播。HBV 感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV感染的流行強(qiáng)度差異很大。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染HBV，其中2.4 億人為慢性HBV感染者，每年約有65萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌（HCC）。

通過(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)HBV標(biāo)志物是臨床最常用的HBV感染的病原學(xué)診斷方法。HBV具有三個(gè)抗原系統(tǒng)，如：乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）與乙型肝炎病毒表面抗體（抗-HBs）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）與乙型肝炎病毒e抗體（抗-HBe）、乙型肝炎病毒核心抗體（抗-HBc）及抗-HBc-IgM。HBV抗原與抗體的血清學(xué)標(biāo)志物與臨床關(guān)系復(fù)雜，必須對(duì)幾項(xiàng)標(biāo)志物綜合分析，方有助于臨床診療。

HBeAg是從病毒C基因的第一個(gè)起始密碼子開(kāi)始翻譯產(chǎn)生的包含Pre C及C序列的蛋白，該蛋白經(jīng)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶切除其N(xiāo)端19個(gè)氨基酸及C端34個(gè)氨基酸后成為可分泌的e抗原。HBeAg為可溶性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生后分泌入血，在患者癥狀出現(xiàn)后大約1周出現(xiàn)，通常在幾周后消失，但在HBV慢性感染者體內(nèi)可能持續(xù)存在。

血清HBeAg與HBV復(fù)制及疾病傳染性相關(guān)，HBV感染患者的血清中存在HBeAg是病毒活躍復(fù)制的指標(biāo)。在HBsAg陽(yáng)性人群中，HBeAg的消失以及抗-HBe的出現(xiàn)是血清學(xué)轉(zhuǎn)換的標(biāo)志，表示病毒復(fù)制活躍程度的下降。但是，臨床上存在病毒復(fù)制活躍的患者血清中HBeAg為陰性的情況，如：HBV基因組前C區(qū)1896位堿基的終止密碼變異，可導(dǎo)致HBeAg陰性。

（二）本指導(dǎo)原則適用范圍 1.本指導(dǎo)原則適用于利用酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法、時(shí)間分辨免疫熒光法等免疫學(xué)方法，對(duì)來(lái)源于血清或血漿等人體樣本中的HBeAg、抗-HBe進(jìn)行體外檢測(cè)，其臨床預(yù)期用途如下：

1.1HBeAg適用于：急性及慢性乙型肝炎病毒感染的輔助診斷；

慢性乙型肝炎病毒感染者HBeAg陽(yáng)性與陰性人群區(qū)分；

慢性乙型肝炎患者HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換的判定。該指標(biāo)定量檢測(cè)可用于抗病毒療效的監(jiān)測(cè)等。

1.2抗-HBe適用于：急性及慢性乙型肝炎病毒感染的輔助診斷及慢性乙型肝炎患者HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換的判定。目前該標(biāo)志物定量檢測(cè)的臨床意義尚不明確。

2.本指南適用于檢測(cè)HBeAg、抗-HBe的定性檢測(cè)試劑，關(guān)于HBeAg的定量檢測(cè)可參考本指南。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求 （一）綜述資料 綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)以及其他等內(nèi)容。其中，與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)癥應(yīng)重點(diǎn)描述申報(bào)產(chǎn)品臨床預(yù)期用途，包括適用人群、適應(yīng)癥及臨床使用環(huán)境；

產(chǎn)品描述應(yīng)明確申報(bào)產(chǎn)品主要組成成分及檢測(cè)原理；

同類(lèi)產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況，應(yīng)著重從預(yù)期用途、產(chǎn)品性能等方面寫(xiě)明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類(lèi)產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。綜述資料的撰寫(xiě)應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào)）的相關(guān)要求。

（二）主要原材料研究資料 1.主要原材料的范圍 體外診斷試劑產(chǎn)品主要原材料是指影響檢測(cè)反應(yīng)的靈敏度與特異性的生物活性物質(zhì)，本指導(dǎo)原則涉及產(chǎn)品的主要原材料如下：

1.1 HBeAg檢測(cè)試劑：包被用抗-HBe，標(biāo)記用抗-HBe，反應(yīng)體系中各種信號(hào)放大、顯示系統(tǒng)中涉及的生物活性物質(zhì)，試劑盒中包含的定標(biāo)液/對(duì)照品（如涉及）、質(zhì)控品（如涉及）等。

1.2抗-HBe檢測(cè)試劑：包被用抗-HBe，標(biāo)記用抗-HBe，HBeAg，反應(yīng)體系中各種信號(hào)放大、顯示系統(tǒng)中涉及的生物活性物質(zhì)，試劑盒中包含的定標(biāo)液/對(duì)照品（如涉及）、質(zhì)控品（如涉及）等。

2.主要原材料的篩選 申請(qǐng)人應(yīng)提供主要原材料的篩選過(guò)程及相關(guān)研究資料。主要原材料的篩選過(guò)程應(yīng)有科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、完整的實(shí)驗(yàn)過(guò)程、詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析過(guò)程，申請(qǐng)人應(yīng)能夠依據(jù)研究過(guò)程確定產(chǎn)品的主要原材料。

2.1如主要原材料為外購(gòu)，應(yīng)確定供應(yīng)商名稱(chēng)，供應(yīng)商應(yīng)為原材料的生產(chǎn)商，供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。同時(shí)，抗原應(yīng)明確抗原名稱(chēng)、生物學(xué)來(lái)源；

抗體明確抗體名稱(chēng)、生物學(xué)來(lái)源、刺激免疫原名稱(chēng)及其來(lái)源（天然或重組）、克隆號(hào)（如為單克隆抗體）等信息。

2.2如主要原材料為申請(qǐng)人自制，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)明確原材料的制備原理，描述制備過(guò)程。如抗原為天然抗原，應(yīng)明確抗原制備所選病毒毒株、病毒的培養(yǎng)、抗原提取及純化、抗原鑒定等方法及相關(guān)參數(shù)；

如為重組抗原，則應(yīng)寫(xiě)明目的基因的選擇及來(lái)源、基因克隆過(guò)程（如特定脫氧核糖核酸（DNA）分子的體外處理、重組連接、轉(zhuǎn)化和宿主細(xì)胞繁殖等實(shí)驗(yàn)過(guò)程）、抗原表達(dá)及抗原純化鑒定等方法及相關(guān)參數(shù)。針對(duì)主要原材料抗體，應(yīng)明確免疫刺激原的名稱(chēng)及來(lái)源。如為多克隆抗體，應(yīng)明確免疫動(dòng)物品系及抗體的收集、純化過(guò)程；

如為單克隆抗體，應(yīng)明確免疫動(dòng)物品系，雜交瘤細(xì)胞的制備、細(xì)胞的培養(yǎng)及抗體的收集、純化過(guò)程。

3.主要原材料的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn) 主要原材料的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是生產(chǎn)企業(yè)對(duì)主要原材料的質(zhì)量控制，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)依據(jù)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)原材料進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格方可用于生產(chǎn)。申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品生產(chǎn)需求，制定科學(xué)、合理的主要原材料質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，在制定標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程中建議遵循以下幾點(diǎn)：

3.1 主要原材料的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括相應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法及原材料應(yīng)達(dá)到的客觀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

3.2主要原材料的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)至少包括原材料的功能性指標(biāo)要求，功能性指標(biāo)可以為功能性實(shí)驗(yàn)指標(biāo)或其他體現(xiàn)原材料相應(yīng)生物活性的指標(biāo)。

3.3人源或其他生物源性原材料質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)包含生物安全性指標(biāo)。

3.4對(duì)于涉及標(biāo)記的主要原材料，如外購(gòu)方提供的為已標(biāo)記好的原材料，則原材料質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)除了對(duì)原材料本身的質(zhì)量控制外，還應(yīng)依據(jù)標(biāo)記物特性，針對(duì)標(biāo)記物制定相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

3.5質(zhì)控品、定標(biāo)液/對(duì)照品，主要原材料質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)除被分析物外，還應(yīng)包含基質(zhì)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，例如基質(zhì)中被分析物的濃度要求、陰陽(yáng)性要求及生物安全性指標(biāo)（如適用），質(zhì)控品應(yīng)明確賦值方法。

本指導(dǎo)原則涉及的主要原材料常見(jiàn)的質(zhì)量控制指標(biāo)見(jiàn)表1。申請(qǐng)人可根據(jù)產(chǎn)品生產(chǎn)及質(zhì)量控制需求，針對(duì)主要原材料制定合理的控制標(biāo)準(zhǔn)。申請(qǐng)人需在申報(bào)資料中提供依據(jù)主要原材料的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)對(duì)原材料進(jìn)行質(zhì)檢的資料，如主要原材料為外購(gòu)，還需提供主要原材料供應(yīng)商的出廠檢測(cè)報(bào)告。

表1.主要原材料質(zhì)量控制指標(biāo) 序號(hào) 主要原材料類(lèi)別 質(zhì)量控制指標(biāo) 1 抗原 外觀、蛋白濃度、純度、分子量及功能性實(shí)驗(yàn)等 2 抗體 外觀、蛋白濃度、純度、分子量、效價(jià)及功能性實(shí)驗(yàn)等 3 標(biāo)記用酶 酶的純度值（RZ值）以及功能性實(shí)驗(yàn) 4.企業(yè)參考品 申請(qǐng)人應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料選擇、制備、陰陽(yáng)性確認(rèn)等詳細(xì)研究資料。

企業(yè)參考品的基質(zhì)建議與申報(bào)產(chǎn)品適用的樣本類(lèi)型一致。企業(yè)參考品應(yīng)至少包括：陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品、精密度參考品。參考品設(shè)置建議參考國(guó)家參考品，陽(yáng)性參考品應(yīng)著重考慮抗原濃度/抗體滴度要求，陰性參考品則主要考慮對(duì)產(chǎn)品分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗(yàn)證情況。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料 1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡(jiǎn)要說(shuō)明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.產(chǎn)品基本反應(yīng)原理介紹，HBeAg檢測(cè)試劑一般采用雙抗體夾心法，抗-HBe檢測(cè)試劑一般為競(jìng)爭(zhēng)法。

3.申請(qǐng)人應(yīng)提供產(chǎn)品生產(chǎn)工藝確定的研究資料，如：包被工藝、標(biāo)記工藝（如涉及）、顯色（發(fā)光）系統(tǒng)等研究資料。

4.反應(yīng)條件確定：申請(qǐng)人應(yīng)考慮反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、洗滌次數(shù)等條件對(duì)產(chǎn)品性能的影響，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定上述條件的最佳組合。如涉及，申請(qǐng)人應(yīng)提供酶催化底物（發(fā)光或變色）的最適條件研究。

5.體系中樣品加樣方式及加樣量確定：申請(qǐng)人應(yīng)考慮樣品加樣方式、加樣量對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果的影響，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最佳的加樣方式及加樣量。如樣本需采取稀釋或其他必要的方法進(jìn)行處理后方可用于最終檢測(cè)，申請(qǐng)人還應(yīng)對(duì)可用于樣本稀釋的基質(zhì)或處理方法進(jìn)行研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最終選擇的用于樣本稀釋的基質(zhì)或處理方法。

6.不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別研究。

（四）分析性能評(píng)估資料 申請(qǐng)人應(yīng)提交產(chǎn)品所有性能評(píng)價(jià)的研究資料，對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括具體研究目的、實(shí)驗(yàn)方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、臨床樣本來(lái)源等。

分析性能評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)際或國(guó)內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。對(duì)于此類(lèi)產(chǎn)品，性能評(píng)估中所用樣品（除非特別說(shuō)明）可參考上述企業(yè)參考品的制備要求。各項(xiàng)性能評(píng)價(jià)應(yīng)符合以下要求。

1.陰/陽(yáng)性參考品符合率 申請(qǐng)人應(yīng)考察申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)企業(yè)陰/陽(yáng)性參考品的符合情況，陽(yáng)性參考品重在評(píng)估產(chǎn)品包容性，陰性參考品旨在評(píng)價(jià)試劑特異性。企業(yè)參考品的檢測(cè)應(yīng)符合參考品說(shuō)明書(shū)的要求。

2.最低檢測(cè)限（分析靈敏度）申報(bào)產(chǎn)品最低檢測(cè)限的性能評(píng)估資料應(yīng)包含最低檢測(cè)限的確定及驗(yàn)證過(guò)程。

2.1選取至少3份高濃度臨床樣本，采用臨床參考方法或國(guó)家/國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其檢測(cè)靶物質(zhì)濃度進(jìn)行確定，之后將臨床樣本做系列倍比稀釋?zhuān)瑢z測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性率在90%～95%（n≥20）的最大稀釋倍數(shù)作為試劑盒的最低檢測(cè)限。

2.2申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)企業(yè)最低檢測(cè)限參考品，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)滿(mǎn)足相應(yīng)要求。

3.準(zhǔn)確性 采用多份陰性及陽(yáng)性臨床樣本，將試驗(yàn)用體外診斷試劑與已上市同類(lèi)產(chǎn)品等進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果一致性。臨床樣本收集過(guò)程中應(yīng)考慮不同濃度及患者感染病毒的基因型（我國(guó)主要流行的B、C、D型）。

4.精密度 企業(yè)應(yīng)對(duì)申報(bào)產(chǎn)品精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)作出合理要求。因模擬樣本并不能體現(xiàn)臨床樣本可能帶來(lái)的所有變異因素，因此精密度評(píng)價(jià)中所用樣本應(yīng)至少包含精密度參考品及若干臨床樣本。針對(duì)本類(lèi)產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求：

4.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑本身的影響外，還應(yīng)對(duì)分析儀、操作者、實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)、檢測(cè)批次等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。

4.2設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少20天的檢測(cè)，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測(cè)，從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

4.3用于精密度評(píng)價(jià)的臨床樣本均應(yīng)至少包含3個(gè)水平：臨界陽(yáng)性樣品、中及強(qiáng)陽(yáng)性樣品，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫蟆?/span>

5.分析特異性 5.1交叉反應(yīng)：

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)可能出現(xiàn)在檢測(cè)樣本中的病原體進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證，用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的樣品，除乙型肝炎病毒相關(guān)標(biāo)志物外，評(píng)估 HBeAg檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)的樣本應(yīng)盡量采用滅活病原體培養(yǎng)物或臨床相關(guān)病原體抗原陽(yáng)性樣本；

評(píng)估抗-HBe檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)的樣本應(yīng)盡量采用臨床相關(guān)病原體抗體陽(yáng)性樣本。病原體種類(lèi)應(yīng)包括人類(lèi)EB病毒（EBV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（表面抗原/抗體、核心抗體）、丙型肝炎病毒（HCV）等。建議在病毒感染的醫(yī)學(xué)決定水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證，申請(qǐng)人應(yīng)詳細(xì)說(shuō)明交叉反應(yīng)樣本來(lái)源、病原體鑒定和滴度確定的方法和結(jié)果等。

5.2干擾物質(zhì) 應(yīng)根據(jù)所采集樣本類(lèi)型，針對(duì)可能存在的干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度條件（“最差條件”）下進(jìn)行評(píng)價(jià)，干擾物質(zhì)的選取應(yīng)至少包括：血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯、類(lèi)風(fēng)濕因子、自身抗體及常見(jiàn)治療性藥物等。建議采用弱陽(yáng)性水平樣本對(duì)每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測(cè)。

5.3其他 抗凝劑研究，如申請(qǐng)人聲稱(chēng)產(chǎn)品適用樣本類(lèi)型為血漿或血清，建議申請(qǐng)人采用血清血漿同源比對(duì)的方式對(duì)抗凝劑干擾進(jìn)行研究，研究應(yīng)能夠覆蓋所有聲稱(chēng)的抗凝劑種類(lèi)。

6.鉤狀（HOOK）效應(yīng) 須采用多份高濃度樣本進(jìn)行梯度稀釋后由低濃度至高濃度開(kāi)始檢測(cè)，每個(gè)梯度的稀釋液重復(fù)3～5份，對(duì)鉤狀效應(yīng)進(jìn)行合理的驗(yàn)證。用于該項(xiàng)研究的樣本可為人工構(gòu)建樣本，建議在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上明示對(duì)鉤狀效應(yīng)的研究結(jié)果。申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的反應(yīng)原理選擇是否進(jìn)行此項(xiàng)研究。

7.血清學(xué)轉(zhuǎn)換研究 如果申報(bào)產(chǎn)品聲稱(chēng)檢測(cè)試劑還適用于血清學(xué)轉(zhuǎn)換的檢測(cè)，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)性能研究。可采用申報(bào)產(chǎn)品與已上市同類(lèi)產(chǎn)品同時(shí)檢測(cè)不少于五套經(jīng)充分確認(rèn)的乙型肝炎患者系列采集樣本，也可采用申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)不少于五套的商業(yè)化的血清轉(zhuǎn)換盤(pán)。研究應(yīng)當(dāng)顯示出患者發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換過(guò)程中HBeAg消失、抗-HBe出現(xiàn)的趨勢(shì)，同時(shí)，申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果應(yīng)與已上市同類(lèi)產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果一致，或滿(mǎn)足商業(yè)化的血清轉(zhuǎn)換盤(pán)的使用要求。

（五）陽(yáng)性判斷值確定資料 此類(lèi)產(chǎn)品臨界值通常采用定標(biāo)液/對(duì)照品檢測(cè)結(jié)果經(jīng)特定的計(jì)算公式得出，樣本檢測(cè)結(jié)果通過(guò)與臨界值進(jìn)行比較以判斷檢測(cè)結(jié)果的陰陽(yáng)性。建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)的方式進(jìn)行臨界值的研究，明確臨界值的計(jì)算公式。研究過(guò)程中應(yīng)選取適當(dāng)?shù)呐R床樣本，應(yīng)包括經(jīng)確認(rèn)的標(biāo)志物為陽(yáng)性的樣本及經(jīng)確認(rèn)標(biāo)志物為陰性的樣本。研究所需的樣本量應(yīng)滿(mǎn)足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

如申報(bào)產(chǎn)品陽(yáng)性判斷值包含灰區(qū)，應(yīng)明確灰區(qū)的確定依據(jù)，并提供相應(yīng)支持性資料。

在陽(yáng)性判斷值設(shè)定后，申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)選取一定數(shù)量陰、陽(yáng)性真實(shí)臨床樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

（六）穩(wěn)定性研究資料 穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開(kāi)瓶穩(wěn)定性等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括冷藏和冷凍兩種條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)，每間隔一定的時(shí)間段對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行性能分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類(lèi)型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性?xún)刹糠謨?nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說(shuō)明書(shū)【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】?jī)身?xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

（七）臨床試驗(yàn) 臨床試驗(yàn)的開(kāi)展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫(xiě)等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求。

1.研究方法 該類(lèi)產(chǎn)品臨床試驗(yàn)建議采用觀察性研究。臨床試驗(yàn)可采用試驗(yàn)用體外診斷試劑與已上市同類(lèi)產(chǎn)品（對(duì)比試劑）進(jìn)行比較研究，評(píng)價(jià)兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性，評(píng)價(jià)指標(biāo)通常包括陽(yáng)性符合率、陰性符合率等。對(duì)比試劑在預(yù)期用途、適用人群、樣本類(lèi)型、檢測(cè)方法學(xué)、檢測(cè)性能等方面應(yīng)與試驗(yàn)用體外診斷試劑具有較好的可比性。

如申報(bào)產(chǎn)品在該類(lèi)產(chǎn)品現(xiàn)有的臨床預(yù)期用途下，有新的臨床預(yù)期用途（如：定量檢測(cè)產(chǎn)品的治療效果監(jiān)測(cè)等），應(yīng)采用試驗(yàn)用體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較研究，對(duì)產(chǎn)品新預(yù)期用途進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。臨床參考標(biāo)準(zhǔn)是指現(xiàn)有條件下臨床上可獲得的能夠用來(lái)確定受試者目標(biāo)狀態(tài)的最佳方法，通常來(lái)自臨床和實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)學(xué)實(shí)踐，包括患者跟蹤隨訪等。

如申報(bào)產(chǎn)品性能優(yōu)于已上市同類(lèi)產(chǎn)品，如產(chǎn)品靈敏度顯著高于已上市同類(lèi)產(chǎn)品，可將試驗(yàn)用體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較研究和試驗(yàn)用體外診斷試劑與境內(nèi)已上市同類(lèi)產(chǎn)品的比較研究相結(jié)合，對(duì)產(chǎn)品的臨床性能進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，從而支持預(yù)期用途所聲稱(chēng)的內(nèi)容。

2.受試者選擇及樣本收集 臨床試驗(yàn)方案中應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)用體外診斷試劑的預(yù)期用途、目標(biāo)人群和檢測(cè)要求等合理確定臨床試驗(yàn)受試者的選擇要求和樣本收集方法，包括：受試者入組/排除標(biāo)準(zhǔn)、樣本收集的前瞻性和回顧性設(shè)計(jì)等。

根據(jù)產(chǎn)品臨床驗(yàn)證的目的，入組人群應(yīng)包含不同年齡段、不同性別人群，以及一定數(shù)量的孕婦。入組人群還應(yīng)包括急性及慢性病毒性乙型肝炎患者，同時(shí)根據(jù)臨床驗(yàn)證需要，入組病例應(yīng)包括不同疾病進(jìn)展期（如：免疫耐受期、免疫活動(dòng)期等）的患者。如申報(bào)產(chǎn)品聲稱(chēng)可適用于“疾病監(jiān)測(cè)”，臨床試驗(yàn)應(yīng)入組符合要求的病例，進(jìn)行患者跟蹤隨訪研究。

臨床試驗(yàn)中所涉及的樣本類(lèi)型應(yīng)為實(shí)際臨床檢測(cè)中常用的樣本類(lèi)型。如申報(bào)產(chǎn)品所適用的樣本類(lèi)型同時(shí)包含血清、血漿等多個(gè)樣本類(lèi)型，應(yīng)針對(duì)不同樣本類(lèi)型進(jìn)行同源比對(duì)。

建議臨床試驗(yàn)采用前瞻性收集的樣本進(jìn)行研究，同時(shí)，在嚴(yán)格控制偏倚的前提下，允許入組部分符合要求的既往留存樣本。

3.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)數(shù)量和要求 該類(lèi)產(chǎn)品臨床試驗(yàn)應(yīng)在不少于3家（含3家）符合要求的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開(kāi)展。申辦者應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及其預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)乙型肝炎病毒流行情況等因素選擇具有代表性的機(jī)構(gòu)開(kāi)展臨床試驗(yàn)，包括受試人群的代表性等。

4.臨床評(píng)價(jià)指標(biāo) 該類(lèi)產(chǎn)品臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括試驗(yàn)用體外診斷試劑與已上市同類(lèi)產(chǎn)品相比的陽(yáng)性符合率、陰性符合率等。如試驗(yàn)用體外診斷試劑與臨床參考方法進(jìn)行對(duì)比研究，其臨床評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括臨床靈敏度、臨床特異度等。

5.臨床試驗(yàn)樣本量估算 適當(dāng)?shù)臉颖玖渴潜ＷC申報(bào)產(chǎn)品臨床性能得到準(zhǔn)確評(píng)價(jià)的必要條件。臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)滿(mǎn)足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行估算。臨床試驗(yàn)樣本量估算的方法有很多，如單組目標(biāo)值法、優(yōu)效性試驗(yàn)的樣本量估算等。

HBeAg、抗-HBe檢測(cè)試劑為定性檢測(cè)產(chǎn)品，如臨床試驗(yàn)采用申報(bào)產(chǎn)品與已上市同類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)行比對(duì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可采用單組目標(biāo)值法樣本量公式估算最低樣本量。樣本量估算過(guò)程中，評(píng)價(jià)指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）即HBeAg、抗-HBe檢測(cè)試劑臨床陰/陽(yáng)性符合率應(yīng)大于95%。

如申報(bào)產(chǎn)品性能顯著優(yōu)于已上市同類(lèi)產(chǎn)品，可將試驗(yàn)用體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較研究和試驗(yàn)用體外診斷試劑與境內(nèi)已上市同類(lèi)產(chǎn)品的比較研究相結(jié)合，進(jìn)行臨床研究，可采用優(yōu)效性試驗(yàn)樣本量估算的方法估算樣本量。

樣本量估算過(guò)程中需要考慮臨床試驗(yàn)中病例的剔除率，一般而言，病例剔除率不應(yīng)高于10%。

臨床試驗(yàn)樣本量除需滿(mǎn)足上述統(tǒng)計(jì)學(xué)估算的最低樣本量要求外，還應(yīng)保證入組病例覆蓋受試者的各種特征；

如臨床試驗(yàn)研究有更合理的樣本量估算方式，在說(shuō)明其合理性后亦可采用。

6.統(tǒng)計(jì)分析 臨床試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)與臨床試驗(yàn)?zāi)康囊恢?，如臨床試驗(yàn)?zāi)康臑轵?yàn)證申報(bào)產(chǎn)品與已上市產(chǎn)品的一致性，統(tǒng)計(jì)分析一般以2×2表的形式總結(jié)兩種分析方法的檢測(cè)結(jié)果，并據(jù)此計(jì)算陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率、Kappa值等指標(biāo)及其可信區(qū)間。除此之外，還應(yīng)同時(shí)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種分析方法的一致性。

如產(chǎn)品臨床試驗(yàn)采用其他統(tǒng)計(jì)學(xué)模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如優(yōu)效性試驗(yàn)等，應(yīng)充分說(shuō)明其合理性。

7.倫理學(xué)要求 臨床試驗(yàn)必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則，必須獲得臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的同意。研究者應(yīng)充分考慮臨床試驗(yàn)用樣本的獲得和試驗(yàn)結(jié)果對(duì)受試者的風(fēng)險(xiǎn)性，應(yīng)提交倫理委員會(huì)的審查意見(jiàn)。

8.質(zhì)量控制 臨床試驗(yàn)開(kāi)始前，建議進(jìn)行臨床試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)，以熟悉并掌握相關(guān)試驗(yàn)方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗(yàn)誤差。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

9.接受境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)要求 如進(jìn)口產(chǎn)品提交境外臨床試驗(yàn)資料作為臨床評(píng)價(jià)資料時(shí)，其境外臨床試驗(yàn)資料在滿(mǎn)足《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》要求的基礎(chǔ)上，應(yīng)至少有一家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)在中國(guó)境內(nèi)，檢測(cè)病例數(shù)不低于總病例數(shù)的1/3。評(píng)價(jià)過(guò)程應(yīng)評(píng)估境外和境內(nèi)人群中HBV的流行情況存在的差異。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求 申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請(qǐng)人產(chǎn)品研制、臨床評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的有關(guān)要求，編寫(xiě)產(chǎn)品技術(shù)要求。

HBeAg、抗-HBe檢測(cè)試劑的產(chǎn)品性能指標(biāo)應(yīng)主要包括：物理性狀、陰/陽(yáng)性參考品符合率、精密度、最低檢測(cè)限等。申報(bào)試劑已有適用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品發(fā)布，申請(qǐng)人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢測(cè)要求。

按照《辦法》的規(guī)定，此類(lèi)產(chǎn)品為第三類(lèi)體外診斷試劑，申請(qǐng)人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求，附錄的編制應(yīng)符合相關(guān)編寫(xiě)規(guī)范的要求。

（九）產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告 根據(jù)《辦法》的要求，首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類(lèi)體外診斷試劑產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的產(chǎn)品檢驗(yàn)。產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告應(yīng)符合相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品的要求。

（十）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 說(shuō)明書(shū)承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、樣本采集及處理、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果的解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)最重要的文件之一。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，進(jìn)口體外診斷試劑的中文說(shuō)明書(shū)除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書(shū)的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》的要求，HBeAg、抗-HBe檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下內(nèi)容。

1.預(yù)期用途 產(chǎn)品預(yù)期用途的描述應(yīng)符合現(xiàn)行的疾病診療規(guī)范、防治指南、專(zhuān)家共識(shí)，其臨床試驗(yàn)入組病例應(yīng)能夠覆蓋產(chǎn)品適用人群。如申報(bào)產(chǎn)品存在新的預(yù)期用途，應(yīng)有充分的臨床試驗(yàn)證據(jù)作為支持。

2.檢驗(yàn)結(jié)果的解釋 結(jié)合對(duì)照品（質(zhì)控品）以及樣本的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。檢驗(yàn)結(jié)果的解釋?xiě)?yīng)以陽(yáng)性判斷值的研究結(jié)論為依據(jù)。如有適用的臨床診療指南，則應(yīng)在此項(xiàng)下引用，相應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果的解釋?xiě)?yīng)符合相關(guān)指南的要求。

3.檢驗(yàn)方法的局限性 說(shuō)明書(shū)應(yīng)對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)的局限性進(jìn)行說(shuō)明，主要包括以下內(nèi)容：

3.1本試劑檢測(cè)結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者臨床癥狀及其他相關(guān)醫(yī)學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合分析，不得單獨(dú)作為患者管理的依據(jù)。

3.2不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理以及不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。

3.3申報(bào)產(chǎn)品應(yīng)明確不同病程不同階段樣本的陽(yáng)性率不一致。

三、參考文獻(xiàn) 1.《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)），2014年7月30.2.《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》，（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第16號(hào)），2014年9月11日.3.《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》，（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第17號(hào)），2014年9月11日.4.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告（國(guó)家食品藥品監(jiān)管總局公告2014年第44號(hào)），2014年9月5日.5.中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）.實(shí)用肝XVI臟病雜志，第19卷第3期2016年5月：V-XVI.6.徐道振.病毒性肝炎臨床實(shí)踐，人民衛(wèi)生出版社，2006.7.European Association for the Study of the Liver.EASL 2017 clinical Practice Guidelines on the management of hepatitis B virus infection.Journal of Hepatology 2017，67：370-398.8.Norah A.Terrault，et al.Update on Prevention，Diagnosis，and Treatment of Chronic Hepatitis B：AASLD 2018 Hepatitis B Guidance.HEPATOLOGY，2018，67（4）：1560-1599.9.FDA.Review criteaia for assessment of Hepatitis B “e” antigen and antibody to Hepatitis B “e” antigen in vitro diagnostic devices.1991.12.四、起草單位 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。

第二篇：地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2020年）

附件3

地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑

注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)地中海貧血相關(guān)基因檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，也不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

地中海貧血（簡(jiǎn)稱(chēng)地貧）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于珠蛋白基因發(fā)生突變（包括點(diǎn)突變和缺失等），致使珠蛋白肽鏈合成減少或完全不能合成而導(dǎo)致的一組單基因遺傳性溶血性疾病，輕者可無(wú)臨床表現(xiàn)，重者以進(jìn)行性溶血性貧血為主要特征。根據(jù)珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類(lèi)型，地貧分為α-，β-和γ-地貧等，臨床上最常見(jiàn)的是α-和β-地貧。地貧主要分布在地中海沿岸、東南亞和少數(shù)非洲地區(qū)，具有明顯的種族特性和地域分布差異。地貧是我國(guó)南方地區(qū)最常見(jiàn)、危害最大的遺傳病之一，尤以廣西、云南、廣東、海南、四川和貴州等省份為甚，云南、海南和廣東的地貧基因人群攜帶率可達(dá)10%以上，廣西更是達(dá)到了20%以上。

α-地貧主要是由于α-珠蛋白基因發(fā)生突變而引起。α-珠蛋白基因簇位于16p13.3，包括胎兒期和成人期表達(dá)的2個(gè)基因（α2和α1），基因的排列順序?yàn)?’-α2-α1-3’。根據(jù)單倍型的情況，可將α地貧分為3類(lèi)：（1）缺失型α+地貧（-α/），缺失1個(gè)α基因；（2）缺失型α0地貧（--/），2個(gè)α基因同時(shí)缺失；（3）非缺失型α+地貧（αTα/或ααT/），1個(gè)α1或α2基因發(fā)生點(diǎn)突變或少數(shù)幾個(gè)堿基的缺失。中國(guó)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少19種α-珠蛋白基因大片段缺失和38種α-珠蛋白基因點(diǎn)突變。其中，6

種α-珠蛋白基因的突變：--SEA/、-α3.7/、-α4.2/、αWSα/（HBA2：c.369C>G）、αQSα/（HBA2：c.377

T>C）；αCSα/（HBA2：c.427T>C）占患病人群總數(shù)的98%。

α-地貧基因型和臨床分型的關(guān)系已經(jīng)基本闡明。α-地貧的表型嚴(yán)重程度隨著功能性α-珠蛋白基因的減少而加重：（1）1個(gè)α-基因缺失或點(diǎn)突變（-α/αα或ααT/αα或αTα/αα），稱(chēng)為靜止型α-地貧，通常不貧血，血液學(xué)表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素；（2）2個(gè)α-基因缺失或復(fù)合-α基因點(diǎn)突變，或點(diǎn)突變，其基因型為--/αα或-α/-α或-α/ααT或αTα/-α或αTα/αTα，稱(chēng)為輕型α-地貧，臨床表現(xiàn)為不貧血或輕度貧血，血液學(xué)檢查有小細(xì)胞低色素特征；（3）3個(gè)α-基因缺失或復(fù)合α基因點(diǎn)突變，基因型為--/-α或--/αTα，稱(chēng)為中間型α-地貧，又稱(chēng)Hb

H病，患者有輕至重度貧血。某些基因型為αTα/αTα的病例（如αCSα/αCSα、αQSα/αQSα和αCSα/αQSα）也表現(xiàn)為Hb

H病。通常，--/αTα的非缺失型

Hb

H病較單純?nèi)笔虷b

H?。?-/-α）的臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重，特別是基因型為--/αCSα或--/αQSα的Hb

H病患者，貧血程度較為嚴(yán)重；（4）4個(gè)α-基因缺失，其基因型為--/--，稱(chēng)為重型α-地貧，又稱(chēng)Hb

Bart’s胎兒水腫綜合征，此類(lèi)個(gè)體一般無(wú)法存活到出生或分娩后半小時(shí)內(nèi)死亡。

β-地貧是由于β-珠蛋白基因發(fā)生突變而引起，以點(diǎn)突變?yōu)橹鳎贁?shù)為缺失型。β-珠蛋白基因簇位于11p15.3，包括2個(gè)成人期表達(dá)基因（β和δ），基因的排列順序?yàn)?’-δ-β-3’。根據(jù)β-珠蛋白鏈合成量的程度，可將β-地貧分為3類(lèi)：（1）β0地貧，β-珠蛋白鏈完全不能合成，其所在的等位基因稱(chēng)為β0地貧等位基因；（2）β+地貧，β-珠蛋白鏈合成減少，其所在的等位基因稱(chēng)為β+地貧等位基因；（3）β++地貧，又稱(chēng)沉默型β-地貧，β-珠蛋白鏈合成輕微減少。中國(guó)已至少報(bào)道84種β-珠蛋白基因點(diǎn)突變和11種β-珠蛋白基因缺失。其中，6種點(diǎn)突變：HBB：c.126_129delCTTT，HBB：c.52A>T，HBB：c.-78A>G，HBB：

c.79G>A，HBB：

c.316-197C>T和HBB：

c.216_217insA占了全部突變類(lèi)型的90%以上。

β-地貧的臨床表型可分為4種：（1）靜止型β-地貧，基因型為β++/βN，血液學(xué)表型正?；蚺R界，一般只能通過(guò)分子診斷識(shí)別；（2）輕型β-地貧，基因型為β0/βN或β+/βN，臨床表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素和HbA2值升高；（3）中間型β-地貧，基因型為β+/β+或β+/β0，表型變異范圍大，可從輕度貧血到中度貧血，多于幼兒期出現(xiàn)中度貧血；（4）重型β-地貧，基因型為β+/β0或β0/β0，通常伴有嚴(yán)重貧血，需要定期輸血才能存活?；純撼錾鷷r(shí)無(wú)癥狀，常于嬰兒期（3-12月齡）發(fā)病。如不治療，患兒多于5歲前死亡。此外，中間型的分子基礎(chǔ)較為復(fù)雜，顯性β-地貧突變的雜合子（βD/βN），合并α-地貧突變的β-地貧突變純合子（β0/β0），或合并α-珠蛋白三聯(lián)體的β-地貧突變雜合子（β0/βN或β+/βN），也會(huì)顯示中間型的表型。

2018年發(fā)布的《重型β-地中海貧血的診斷和治療指南》明確規(guī)定：對(duì)于重型β-地中海貧血的診斷，有條件者均應(yīng)進(jìn)行基因診斷，基因型為純合子或雙重雜合子為確診本病的指標(biāo)。2018年發(fā)布的《兒童非輸血依賴(lài)型地中海貧血的診治和管理專(zhuān)家共識(shí)》也明確規(guī)定：地貧基因檢測(cè)為非輸血依賴(lài)型地貧的診斷依據(jù)之一。

另外，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的相關(guān)文件要求：為減少重型地貧患兒出生，在我國(guó)地貧高發(fā)省份實(shí)施地貧防控試點(diǎn)項(xiàng)目。主要流程包括：（1）對(duì)新婚夫婦和計(jì)劃懷孕夫婦在懷孕前或孕期進(jìn)行血常規(guī)初篩；（2）對(duì)夫婦一方或雙方血常規(guī)檢查結(jié)果陽(yáng)性的夫婦進(jìn)行血紅蛋白分析復(fù)篩；（3）對(duì)血紅蛋白分析復(fù)篩結(jié)果均為陽(yáng)性的夫婦，取其抗凝靜脈全血進(jìn)行相應(yīng)的α+β地貧基因檢測(cè)；（4）綜合夫婦雙方病史詢(xún)問(wèn)、地貧篩查和基因檢測(cè)結(jié)果，判定為高風(fēng)險(xiǎn)夫婦。對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)夫婦進(jìn)行追蹤，及時(shí)了解受檢婦女懷孕情況，指導(dǎo)女方在懷孕后適宜時(shí)期接受產(chǎn)前診斷。產(chǎn)前診斷的對(duì)象為胎兒，樣本類(lèi)型為胎兒的絨毛、羊水和臍帶血，檢測(cè)項(xiàng)目為相應(yīng)的地貧基因檢測(cè)。

綜上，結(jié)合該類(lèi)產(chǎn)品臨床使用的實(shí)際情況，本指導(dǎo)原則的預(yù)期用途可為：用于體外定性檢測(cè)人外周靜脈全血或胎兒羊水等樣本中基因組DNA的α-和/或β-地貧相關(guān)基因，用于α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估，或胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷等。

結(jié)合該類(lèi)產(chǎn)品在中國(guó)注冊(cè)的實(shí)際情況以及當(dāng)前的認(rèn)知，本指導(dǎo)原則僅對(duì)“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預(yù)期用途的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了詳細(xì)闡述。針對(duì)其他預(yù)期用途，本指導(dǎo)原則僅對(duì)部分內(nèi)容進(jìn)行了闡述，申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性，對(duì)本指導(dǎo)原則未涉及的內(nèi)容進(jìn)行補(bǔ)充并做出相應(yīng)評(píng)價(jià)。

本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于PCR探針?lè)ǚ椒ń⒌?，?duì)于其他分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)（如：PCR-反向點(diǎn)雜交法和gap-PCR法等），可能部分要求不完全適用或本文所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，申請(qǐng)人可以根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)不適用部分進(jìn)行或補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證替代方法的科學(xué)合理性。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及國(guó)內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。其中，同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)、檢驗(yàn)原理、檢測(cè)的突變類(lèi)型以及臨床意義等方面詳細(xì)說(shuō)明申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類(lèi)產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。

綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（原總局令第5號(hào)，以下簡(jiǎn)稱(chēng)《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（原總局公告2014年第44號(hào)），以下簡(jiǎn)稱(chēng)《44號(hào)公告》的要求。

（二）主要原材料的研究資料

主要原材料研究資料包括主要反應(yīng)成分、對(duì)照品（質(zhì)控品）及企業(yè)參考品的研究資料。

1.此類(lèi)產(chǎn)品的主要反應(yīng)成分一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測(cè)所需引物、探針、酶、dNTPs、反應(yīng)緩沖液等。申請(qǐng)人應(yīng)提交相關(guān)原材料的選擇、制備和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的研究資料。如為申請(qǐng)人自制，應(yīng)提交詳細(xì)的工藝穩(wěn)定性研究資料；如為外購(gòu)，還應(yīng)提交供應(yīng)商篩選資料以及供應(yīng)商提供的原材料質(zhì)量檢定報(bào)告。

1.1

核酸提取/純化試劑（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。

1.2

引物、探針

申請(qǐng)人應(yīng)詳述引物、探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議設(shè)計(jì)多套引物探針以供篩選，針對(duì)待測(cè)位點(diǎn)的特異性等進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇最佳設(shè)計(jì)，并提交詳細(xì)的篩選研究數(shù)據(jù)。

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)選定的引物、探針原材料進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，一般包括：分子量、純度（HPLC等）、濃度、探針熒光標(biāo)記基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，以及功能性試驗(yàn)等，并依據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1.3酶

酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)各種酶的活性進(jìn)行驗(yàn)證，提交功能性試驗(yàn)資料，并確定酶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

DNA聚合酶應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應(yīng)具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

1.4脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）

包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP；應(yīng)提交對(duì)其純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料，以及功能性試驗(yàn)資料，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.對(duì)照品（質(zhì)控品）

試劑盒的質(zhì)控體系通過(guò)設(shè)置各種試劑盒對(duì)照品（質(zhì)控品）來(lái)實(shí)現(xiàn)。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)至少包括代表性的突變位點(diǎn)和突變類(lèi)型。陰性對(duì)照可以是含有野生型序列的核酸溶液?？瞻讓?duì)照為不含核酸的溶液。

如該類(lèi)產(chǎn)品所采用的方法學(xué)和檢驗(yàn)原理顯示：無(wú)論檢測(cè)何種樣本（野生型、雜合突變和純合突變），其反應(yīng)體系均可報(bào)出核酸序列結(jié)果，均可對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，則無(wú)需另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)；否則，試劑盒應(yīng)另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)。

對(duì)照品可采用人基因組DNA、細(xì)胞系或質(zhì)粒等?？瞻讓?duì)照應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。申請(qǐng)人應(yīng)提供對(duì)照品原料選擇、制備、定值過(guò)程等的詳細(xì)研究數(shù)據(jù)，并對(duì)其檢測(cè)結(jié)果做出明確的范圍要求。

3.企業(yè)參考品

企業(yè)參考品主要包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品和精密度參考品等。申請(qǐng)人應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料選擇、制備方法、基因序列確認(rèn)及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的詳細(xì)研究資料等。

3.1

陽(yáng)性參考品：可采用臨床樣本或其核酸溶液，如采用臨床樣本，則樣本類(lèi)型應(yīng)與待測(cè)樣本一致。應(yīng)至少包含所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合型樣本，同時(shí)盡量納入純合突變型樣本。對(duì)于某些稀有基因型，也可采用細(xì)胞系或質(zhì)粒。

3.2

陰性參考品：應(yīng)包括野生型臨床樣本或其核酸溶液，以及易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的同源序列樣本，同時(shí)應(yīng)盡量包含檢測(cè)范圍外其他檢測(cè)位點(diǎn)的樣本等。

3.3檢測(cè)限參考品可選擇最低檢測(cè)限濃度（例如：95%檢出率水平）或接近最低檢測(cè)限濃度（例如100%檢出率水平）的臨床樣本或其核酸溶液，至少包含所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合型樣本。

3.4

精密度參考品應(yīng)至少包括低濃度雜合突變型臨床樣本或其核酸溶液，應(yīng)至少包括代表性的突變位點(diǎn)和突變類(lèi)型，且在每一反應(yīng)體系均有分布。

目前，該類(lèi)產(chǎn)品已有國(guó)家參考品，對(duì)于申報(bào)產(chǎn)品所聲稱(chēng)的檢測(cè)位點(diǎn)，企業(yè)參考品的要求應(yīng)不低于國(guó)家參考品。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

主要生產(chǎn)工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTPs濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標(biāo)記（如有）等工藝過(guò)程的描述及確定依據(jù)。生產(chǎn)過(guò)程應(yīng)對(duì)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標(biāo)明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細(xì)說(shuō)明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

反應(yīng)體系研究指反應(yīng)條件的選擇確定過(guò)程，包括樣本采集、預(yù)處理（如有）、樣本用量、試劑用量、核酸提取純化步驟、PCR反應(yīng)條件、閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）等的確定。

不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如有差異應(yīng)分別提交。

（四）分析性能評(píng)估資料

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)下述各項(xiàng)分析性能提交詳細(xì)的評(píng)估資料，包括試驗(yàn)地點(diǎn)、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)樣本（類(lèi)型、來(lái)源、數(shù)量、處理方法、基因型和濃度確認(rèn)等）、可接受標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)計(jì)方法、試驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)論等。分析性能評(píng)估的實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)內(nèi)外有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則。

每項(xiàng)性能評(píng)估應(yīng)盡量采用與適用樣本類(lèi)型一致的臨床樣本，對(duì)于某些稀有基因型，也可采用細(xì)胞系等。

1.核酸提取/純化性能（如有）

在進(jìn)行靶核酸檢測(cè)前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)暮怂崽崛?純化步驟。該步驟應(yīng)最大量分離和純化目的核酸并盡可能去除PCR抑制物。無(wú)論檢測(cè)試劑是否含有核酸提取/純化組分，申請(qǐng)人都應(yīng)對(duì)配套使用的核酸提取/純化方法的提取效率和提取核酸純度、濃度等做充分的驗(yàn)證，并評(píng)價(jià)該方法能否滿(mǎn)足該類(lèi)產(chǎn)品的要求。

2.檢測(cè)準(zhǔn)確性

建議采用若干份臨床樣本驗(yàn)證該類(lèi)產(chǎn)品的檢測(cè)準(zhǔn)確性，樣本類(lèi)型與說(shuō)明書(shū)聲稱(chēng)的樣本類(lèi)型一致。樣本應(yīng)涵蓋野生型、所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合突變型，同時(shí)盡量納入純合突變型。對(duì)于某些稀有基因型，也可采用細(xì)胞系或質(zhì)粒。

3.最低檢測(cè)限

該類(lèi)產(chǎn)品的最低檢測(cè)限可定義為：在滿(mǎn)足一定的檢測(cè)準(zhǔn)確性和精密度的條件下，能夠檢出目標(biāo)序列的最低人基因組DNA的濃度?？刹捎锰荻葷舛鹊娜嘶蚪MDNA樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)，確定適當(dāng)檢出率水平（如：95%）下的最低人基因組DNA濃度。檢測(cè)限評(píng)價(jià)建議采用臨床樣本或細(xì)胞系，并至少包含所有檢測(cè)位點(diǎn)的雜合突變型。應(yīng)明確臨床樣本或細(xì)胞系與人基因組DNA濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

4.分析特異性

4.1

應(yīng)針對(duì)同源序列或檢測(cè)范圍外基因和位點(diǎn)進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證，說(shuō)明交叉反應(yīng)樣本的制備方法、核酸序列確認(rèn)方法，提交詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

4.2

應(yīng)針對(duì)可能的內(nèi)源和外源性干擾物進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究。內(nèi)源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白、母體細(xì)胞的干擾等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑和常用藥物等。

干擾試驗(yàn)可通過(guò)在臨床樣本中人工添加干擾物質(zhì)的方式，評(píng)價(jià)干擾物質(zhì)對(duì)目標(biāo)序列檢測(cè)的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進(jìn)行干擾試驗(yàn)評(píng)價(jià)。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)；如有干擾，應(yīng)確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

5.精密度

精密度評(píng)價(jià)應(yīng)采用臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)操作完全按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行，包含核酸提取/純化等步驟（如有）。應(yīng)對(duì)每一反應(yīng)體系進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，并至少覆蓋代表性的突變位點(diǎn)和突變類(lèi)型。

精密度評(píng)價(jià)需滿(mǎn)足如下要求：

5.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要因素進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑本身外，還包括分析儀器、操作者、地點(diǎn)、時(shí)間、檢測(cè)輪次和試劑批次等。

5.2設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

5.3用于精密度評(píng)價(jià)的臨床樣本至少設(shè)置低濃度和中/高濃度水平。

5.4精密度指標(biāo)可設(shè)置為CV等（如有），申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。

（五）陽(yáng)性判斷值確定資料

建議納入一定數(shù)量的臨床樣本，應(yīng)包括所有檢測(cè)位點(diǎn)的各種基因型（野生型、雜合突變型，同時(shí)盡量納入純合突變型），采用受試者工作特征（ROC）曲線(xiàn)或其他合理方法確定陽(yáng)性判斷值。

如試劑判讀存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說(shuō)明灰區(qū)范圍的確定方法。

對(duì)于某些檢測(cè)方法學(xué)，陽(yáng)性判斷值研究可能不適用，申請(qǐng)人應(yīng)說(shuō)明理由。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要包括申報(bào)產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究和適用樣本的穩(wěn)定性研究?jī)刹糠帧Ｇ罢咧饕ㄉ陥?bào)產(chǎn)品的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、開(kāi)瓶/復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制的研究等；后者則是指適用樣本的保存條件和保存時(shí)間等的研究。

實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究應(yīng)采用至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后，選取多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)品性能評(píng)價(jià)，從而確定產(chǎn)品保存條件和有效期。

如核酸提取液可保存，還需對(duì)核酸提取液的保存條件和保存時(shí)間進(jìn)行研究。

（七）臨床試驗(yàn)

應(yīng)滿(mǎn)足《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。下面僅說(shuō)明該類(lèi)產(chǎn)品臨床試驗(yàn)中應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題。

1．針對(duì)“α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷）”預(yù)期用途

1.1

臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)及人員

申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學(xué)背景等因素，選擇不少于3家（含3家）符合法規(guī)要求的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開(kāi)展臨床試驗(yàn)。

1.2

臨床試驗(yàn)適用人群和臨床樣本

具有地貧癥狀和/或體征，或血液學(xué)表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素的疑似地貧患者和攜帶者；需與地貧進(jìn)行鑒別診斷的其他疾病患者，如：缺鐵性貧血、鐵粒細(xì)胞性貧血或先天性紅細(xì)胞生成異常性貧血等。

臨床試驗(yàn)所用樣本應(yīng)為抗凝外周血樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)分別滿(mǎn)足申報(bào)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)、對(duì)比試劑說(shuō)明書(shū)（如適用）及第三方試劑說(shuō)明書(shū)（如適用）的相關(guān)要求。

1.3臨床試驗(yàn)方法

1.3.1已有同類(lèi)產(chǎn)品上市的申報(bào)產(chǎn)品

對(duì)于已批準(zhǔn)的α-地貧突變和β-地貧突變，原則上選擇已上市同類(lèi)產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，評(píng)價(jià)申報(bào)產(chǎn)品的臨床檢測(cè)性能。

1.3.2無(wú)同類(lèi)產(chǎn)品上市的申報(bào)產(chǎn)品

1.3.2.1

如新突變位點(diǎn)的臨床意義已獲行業(yè)認(rèn)可（如：國(guó)內(nèi)相關(guān)指南或?qū)＜夜沧R(shí)），且上述認(rèn)可基于充分的中國(guó)人群的臨床數(shù)據(jù)，則臨床試驗(yàn)可選擇Sanger基因測(cè)序（針對(duì)新的點(diǎn)突變）或臨床普遍使用的其他公認(rèn)方法（針對(duì)其他類(lèi)型的新突變位點(diǎn)，如缺失）作為對(duì)比方法，評(píng)價(jià)新突變位點(diǎn)的臨床檢測(cè)性能。除此之外，還應(yīng)提交新位點(diǎn)臨床意義已獲行業(yè)認(rèn)可的相關(guān)證據(jù)，該部分資料可不納入臨床方案和報(bào)告。

1.3.2.2

如新突變位點(diǎn)的臨床意義未獲行業(yè)認(rèn)可，則臨床試驗(yàn)應(yīng)包括兩個(gè)目的，新突變位點(diǎn)的臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)和臨床意義評(píng)價(jià)。新突變位點(diǎn)的臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)可參考1.3.2.1；新突變位點(diǎn)的臨床意義評(píng)價(jià)應(yīng)提交基于中國(guó)人群的充分的臨床證據(jù)，證明基因型與表型的關(guān)系，如：隨訪或其他可證明基因型與表型關(guān)系的臨床驗(yàn)證資料。

1.4最低樣本量和陽(yáng)性例數(shù)

臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行估算，并詳細(xì)描述所使用統(tǒng)計(jì)方法及各參數(shù)的確定依據(jù)。

1.4.1

臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)的樣本量估算

臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)的樣本量估算可分為以下幾種情況。

對(duì)于常見(jiàn)突變位點(diǎn)，建議采用單組目標(biāo)值法分別估算每個(gè)突變位點(diǎn)臨床試驗(yàn)的最低樣本量，通過(guò)陽(yáng)性符合率計(jì)算所需陽(yáng)性樣本的例數(shù)，通過(guò)陰性符合率計(jì)算所需陰性樣本的例數(shù)，同時(shí)考慮脫落情況，估算最低樣本總量。陽(yáng)性符合率和陰性符合率的目標(biāo)值（臨床可接受的最低標(biāo)準(zhǔn)）建議均不低于95%。

對(duì)于罕見(jiàn)突變位點(diǎn)，陰性樣本的例數(shù)可根據(jù)上述方法進(jìn)行估算，陽(yáng)性樣本則應(yīng)保證一定的例數(shù)。

對(duì)于極其罕見(jiàn)的、且有確切臨床證據(jù)證明其臨床意義的突變位點(diǎn)，陰性樣本的例數(shù)可根據(jù)上述方法進(jìn)行估算，陽(yáng)性樣本的例數(shù)則應(yīng)結(jié)合臨床證據(jù)確定。

1.4.2

新位點(diǎn)臨床意義評(píng)價(jià)的樣本量估算

新位點(diǎn)臨床意義評(píng)價(jià)的樣本量估算，建議采用抽樣調(diào)查公式或其他合理方法進(jìn)行估算。

2.針對(duì)“地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估”和“胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷”預(yù)期用途

針對(duì)上述兩個(gè)預(yù)期用途，本指導(dǎo)原則僅對(duì)部分內(nèi)容進(jìn)行了闡述，申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特性，充分考慮本指導(dǎo)原則未涉及的內(nèi)容，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.1臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)和人員

如申報(bào)產(chǎn)品的預(yù)期用途為胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷，除滿(mǎn)足法規(guī)要求外，臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)還應(yīng)取得產(chǎn)前診斷技術(shù)服務(wù)資質(zhì)。臨床試驗(yàn)人員應(yīng)為經(jīng)過(guò)專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)的取得資質(zhì)的人員。機(jī)構(gòu)和人員應(yīng)遵循《產(chǎn)前診斷技術(shù)管理辦法》《母嬰保健專(zhuān)項(xiàng)技術(shù)服務(wù)許可及人員資格管理辦法》，機(jī)構(gòu)應(yīng)取得《母嬰保健技術(shù)服務(wù)執(zhí)業(yè)許可證》，人員應(yīng)取得《母嬰保健技術(shù)考核合格證書(shū)》。

2.2

臨床試驗(yàn)適用人群和臨床樣本

如預(yù)期用途為地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估，則適用人群為：地貧表型篩查陽(yáng)性的育齡人群。地貧表型篩查陽(yáng)性的育齡人群可根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)和地貧高發(fā)地區(qū)相關(guān)政策確定。

如預(yù)期用途為胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷，則適用人群為：地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的胎兒。地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的確定可參考國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)等相關(guān)文件。

臨床試驗(yàn)所用樣本應(yīng)為胎兒羊水等臨床樣本（基因組DNA非臨床樣本）。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)符合國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)等相關(guān)文件的要求，并滿(mǎn)足產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的要求。

2.3

最低樣本量和陽(yáng)性例數(shù)

針對(duì)每種不同的預(yù)期用途，應(yīng)分別采用合理方法估算最低樣本量。同一預(yù)期用途的不同樣本類(lèi)型（羊水和臍帶血等），也應(yīng)分別采用合理方法估算最低樣本量。

3.如有其他預(yù)期用途，也應(yīng)設(shè)計(jì)科學(xué)的臨床試驗(yàn)，提供充分的證據(jù)，證明其預(yù)期用途。

4.不同預(yù)期用途的通用要求

4.1

臨床試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析

4.1.1應(yīng)在臨床試驗(yàn)方案或報(bào)告中明確申報(bào)產(chǎn)品、對(duì)比試劑和第三方試劑的試驗(yàn)方法。

4.1.2臨床試驗(yàn)病例總結(jié)表應(yīng)以列表方式表示，包括申報(bào)產(chǎn)品的結(jié)果、對(duì)比試劑的結(jié)果、第三方試劑的檢測(cè)結(jié)果（如有）、臨床診斷、年齡和性別等。

4.1.3以交叉表分別總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以驗(yàn)證兩種試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性。

4.1.4

結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中，對(duì)于兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，采用合理方法進(jìn)行復(fù)核，并對(duì)差異原因進(jìn)行分析。如無(wú)需復(fù)核，應(yīng)說(shuō)明理由。

4.2

臨床試驗(yàn)方案

各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過(guò)程中遵循預(yù)定的方案，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由該實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

試驗(yàn)方案應(yīng)確定嚴(yán)格的入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說(shuō)明原因。在試驗(yàn)操作過(guò)程和結(jié)果判定時(shí)，應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比試劑/方法應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外，申報(bào)產(chǎn)品的樣本類(lèi)型不應(yīng)超越對(duì)比試劑/方法對(duì)樣本類(lèi)型的要求。

4.3臨床試驗(yàn)報(bào)告

應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過(guò)程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。

（八）產(chǎn)品技術(shù)要求

產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》、《44號(hào)公告》和《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的相關(guān)要求。該類(lèi)產(chǎn)品作為三類(lèi)體外診斷試劑，應(yīng)將主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求等內(nèi)容作為附錄附于技術(shù)要求正文后。

目前，該類(lèi)產(chǎn)品已有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

（九）產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告

根據(jù)《辦法》的要求，第三類(lèi)體外診斷試劑申請(qǐng)注冊(cè)時(shí)應(yīng)提交連續(xù)三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的檢驗(yàn)報(bào)告。目前，該產(chǎn)品已有國(guó)家參考品，產(chǎn)品檢驗(yàn)應(yīng)滿(mǎn)足國(guó)家參考品的要求。

（十）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)應(yīng)滿(mǎn)足《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料的相關(guān)研究結(jié)果保持一致。下面對(duì)該類(lèi)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行闡述。

1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于定性檢測(cè)人xx樣本基因組DNA中的α-和/或β-地貧xx突變，用于：α-和/或β-地貧的輔助診斷（遺傳診斷），地貧高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的評(píng)估，或胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷。

1.2介紹地貧相關(guān)的臨床背景信息及實(shí)驗(yàn)室診斷方法等，介紹被測(cè)靶標(biāo)（突變位點(diǎn)）的相關(guān)情況。

2.【主要組成成分】

2.1說(shuō)明試劑盒包含組分的名稱(chēng)或數(shù)量等信息，說(shuō)明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。

2.2試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測(cè)必須的組分，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱(chēng)及其他相關(guān)信息。

2.3如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱(chēng)以和醫(yī)療器械備案號(hào)（如有）等詳細(xì)信息。

3.【檢驗(yàn)原理】

3.1對(duì)試劑盒的被測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行詳細(xì)描述（基因位置、突變位點(diǎn)及相關(guān)特征等），對(duì)試劑盒所用探針、引物或突變的判定等進(jìn)行詳細(xì)介紹；對(duì)不同樣本反應(yīng)管組合、對(duì)照品設(shè)置及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行介紹。

3.2試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說(shuō)明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行適當(dāng)介紹。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

說(shuō)明試劑盒的效期穩(wěn)定性等，應(yīng)明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期等信息。

5.【樣本要求】

樣本的采集、處理、運(yùn)送和保存：明確樣本采集、核酸提取純化前的處理（如離心和洗滌等）、保存條件及期限以及運(yùn)送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測(cè)前是否需要恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的限制等。

6.【適用儀器】

所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶(hù)操作。

7.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

7.1實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。

7.2試劑配制方法和注意事項(xiàng)。

7.3詳述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)（如適用），對(duì)核酸提取純化環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)控，明確提取核酸的濃度純度等質(zhì)量要求。

7.4擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.5

PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動(dòng)化檢測(cè)程序及相關(guān)注意事項(xiàng)。

7.6儀器設(shè)置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標(biāo)記情況、對(duì)待測(cè)樣本及其他對(duì)照品的熒光通道選擇等。

8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合對(duì)照品、樣本管檢測(cè)結(jié)果以及檢測(cè)類(lèi)型，以列表形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。如存在檢測(cè)灰區(qū)，應(yīng)詳述對(duì)于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

9.【檢驗(yàn)方法的局限性】

9.1申報(bào)產(chǎn)品僅對(duì)下述檢測(cè)類(lèi)型xx進(jìn)行了驗(yàn)證。

9.2有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運(yùn)送及處理或核酸過(guò)度降解均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

9.2.2未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】簡(jiǎn)述以下性能指標(biāo)：

10.1最低檢測(cè)限：簡(jiǎn)單介紹最低檢測(cè)限的確定方法，并明確最低檢測(cè)限結(jié)果。

10.2陽(yáng)性/陰性參考品符合率。

10.3精密度：簡(jiǎn)單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結(jié)果。

10.4分析特異性

10.4.1交叉反應(yīng)驗(yàn)證：同源性序列等交叉反應(yīng)驗(yàn)證。

10.4.2干擾物質(zhì)驗(yàn)證：樣本中常見(jiàn)干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

10.5對(duì)比試驗(yàn)研究（如有）：簡(jiǎn)要介紹對(duì)比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。

11.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

11.1如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

11.2臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》現(xiàn)行有效版本等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

三、起草單位

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。

第三篇：酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

附件1

酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

一、前言

本指導(dǎo)原則主要針對(duì)酶聯(lián)免疫類(lèi)檢測(cè)試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)提出指導(dǎo)性技術(shù)要求。

本指導(dǎo)原則系對(duì)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細(xì)闡述其理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。

二、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于有關(guān)病原微生物檢測(cè)的第三類(lèi)體外診斷試劑的注冊(cè)技術(shù)審查。其他酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑（如作為二類(lèi)管理的體外診斷試劑）可參考本指導(dǎo)原則執(zhí)行。

三、基本要求

（一）基本原則

1.研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求?！? 2 — 2.試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具備相應(yīng)的專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員、儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》；同時(shí)，應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則（試行）》的要求建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，形成文件和記錄，加以實(shí)施并保持有效運(yùn)行；還應(yīng)通過(guò)《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核。企業(yè)應(yīng)對(duì)試劑的使用范圍做出明確規(guī)定，并經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門(mén)批準(zhǔn)。

3.診斷試劑的研制應(yīng)當(dāng)按照科學(xué)、規(guī)范的原則，各反應(yīng)條件的選擇和確定應(yīng)符合基本的科學(xué)原理。

4.試劑在研制、生產(chǎn)過(guò)程中所用的各種材料及工藝，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產(chǎn)和質(zhì)量控制的總體目標(biāo)：保證試劑使用安全、質(zhì)量穩(wěn)定、工藝可控、檢測(cè)有效。

（二）原材料質(zhì)量控制 1.主要生物原料

與產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關(guān)的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類(lèi)、激素類(lèi)等生物原科。這類(lèi)原料可用于包被酶標(biāo)反應(yīng)板、標(biāo)記相關(guān)酶（如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等）、中和反應(yīng)用抗原或抗體、制備校準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品）等。使用前應(yīng)按照工藝要求對(duì)這類(lèi)生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。主要生物原料若為企業(yè)自己生產(chǎn)，其工藝必須相對(duì)穩(wěn)定；若購(gòu)買(mǎi)，其供應(yīng)商要求相對(duì)固定，不能隨意變更供應(yīng)商，如果主要原料（包括工藝）或其供應(yīng)商有變更，應(yīng)依據(jù)國(guó)家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請(qǐng)。

主要生物原料的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目一般包括：（1）外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質(zhì)；特殊生

— 3 — 物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn)。

（2）純度和分子量

主要經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進(jìn)行分析，也可用其他適宜的方法，如高效液相法等。根據(jù)所檢測(cè)生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進(jìn)行電泳，一般每個(gè)電泳道加樣量為5μg，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍(lán)染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分子量大小應(yīng)在正確的條帶位臵。

（3）蛋白濃度

蛋白濃度可通過(guò)Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進(jìn)行檢測(cè)。

（4）效價(jià)

效價(jià)的測(cè)定一般根據(jù)蛋白含量測(cè)定結(jié)果，通過(guò)倍比稀釋法進(jìn)行。效價(jià)應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求。

（5）功能性實(shí)驗(yàn)

功能性實(shí)驗(yàn)是指生物原料用于試劑盒實(shí)際生產(chǎn)中的情況，一般考查使用該原料的試劑盒的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等，并比較其與上批次原料的相關(guān)性。

2.生物輔料

生物輔料一般指在生產(chǎn)過(guò)程中作為蛋白保護(hù)劑用途的一類(lèi)生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)符合2000年版的《中國(guó)生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。建議作以下檢驗(yàn)：

（1）牛血清或羊血清

外 觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無(wú)溶血或異物。無(wú)菌試驗(yàn)：將血清直接37℃放臵7天，明亮處觀察，不得出現(xiàn)混濁或— 4 — 沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測(cè)定，蛋白含量≥32mg/ml。

球蛋白含量：取待測(cè)血清1ml，采用飽和硫酸銨法進(jìn)行沉淀，沉淀溶于0.85%氯化鈉溶液，至1ml，用Lowry方法測(cè)定，蛋白含量應(yīng)≤2mg/ml。

（2）牛血清白蛋白：

外 觀：應(yīng)為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無(wú)吸潮，無(wú)結(jié)塊，無(wú)肉眼可見(jiàn)的其它雜質(zhì)顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，在18?26℃時(shí)，溶解時(shí)間應(yīng)≤15分鐘，pH值應(yīng)為6.5?7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥95％。

總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標(biāo)準(zhǔn)為≥90%。（3）酪蛋白：

應(yīng)符合生產(chǎn)所需的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。（4）標(biāo)記用酶

應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱(chēng)（如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時(shí)應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的檢驗(yàn)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，酶的純度RZ值（OD403nm/OD280nm）應(yīng)大于3.0。

對(duì)于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應(yīng)進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進(jìn)行酶聯(lián)免疫測(cè)定，均不能出現(xiàn)非特異性反應(yīng)。

生物輔料的供應(yīng)商同樣要求相對(duì)固定，不得隨意變更供應(yīng)商。3.化學(xué)原材料

化學(xué)原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括外觀、一般鹽類(lèi)檢測(cè)、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘?jiān)?，均?yīng)符合《中國(guó)生物制品主要原輔材

— 5 — 料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）》分析純級(jí)別的要求，并且要適合于本企業(yè)的生產(chǎn)。

主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對(duì)固定，不得隨意發(fā)生變更?；瘜W(xué)原材料在購(gòu)入時(shí)，原材料的生產(chǎn)商必須提供該批次化學(xué)原材料的質(zhì)量保證材料和質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。

4.其他物料（1）酶標(biāo)板 ①外觀

明亮處用肉眼觀察板條的外觀質(zhì)量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應(yīng)剔除。②吸附能力和精密性 采用合適的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

一般用一定濃度的正常人免疫球蛋白G(IgG)包被板條，再用一定濃度的抗人IgG酶結(jié)合物吸附，通過(guò)顯色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀讀數(shù)，計(jì)算CV值。CV值結(jié)果應(yīng)符合相關(guān)產(chǎn)品的功能性質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，一般批內(nèi)CV≤5％，批間CV≤10％。

（2）液體試劑裝量瓶

包括陰陽(yáng)性對(duì)照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應(yīng)有相應(yīng)的裝量瓶，并建立相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規(guī)格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。

（3）其他材料

包括試劑瓶標(biāo)簽、粘膠紙、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說(shuō)明書(shū)、干燥劑和包裝外盒等，應(yīng)參照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》和《醫(yī)療器械說(shuō)明書(shū)、標(biāo)簽和包裝標(biāo)識(shí)管理規(guī)定》建立相應(yīng)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。— 6 — 5.企業(yè)質(zhì)控品

企業(yè)質(zhì)控品一般包括陰/陽(yáng)性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、鉤狀效應(yīng)（hook效應(yīng)）等質(zhì)控樣品，對(duì)于定量檢測(cè)試劑，還包括線(xiàn)性質(zhì)控品樣品。如該產(chǎn)品具有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）進(jìn)行標(biāo)化；若該診斷試劑沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量。

企業(yè)質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng)與診斷試劑的待測(cè)樣品的基質(zhì)基本一致，如待測(cè)樣品為血清/血漿，質(zhì)控品基質(zhì)也應(yīng)為血清/血漿。

（三）試劑盒各組分的生產(chǎn)

酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑主要組分的生產(chǎn)包括酶標(biāo)記物的制備及滴配過(guò)程（酶工作液濃度確定）、各種工作溶液的配制、包被酶標(biāo)反應(yīng)板、分裝及包裝等步驟；并通過(guò)產(chǎn)品的半成品檢驗(yàn)和成品檢驗(yàn)兩個(gè)質(zhì)控過(guò)程來(lái)保證其質(zhì)量符合規(guī)定。

1.各種工作液的配制

酶聯(lián)免疫診斷試劑研制生產(chǎn)過(guò)程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽(yáng)性對(duì)照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液、終止液等，對(duì)定量檢測(cè)試劑，還包括標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液。若陰性、陽(yáng)性對(duì)照或其他液體組分涉及生物安全性問(wèn)題，制備時(shí)應(yīng)在相應(yīng)的生物安全實(shí)驗(yàn)室完成。

各種工作液在配制過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的配方進(jìn)行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量檢驗(yàn)并達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，方可使用或分裝。對(duì)于定量檢測(cè)試劑，其標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液應(yīng)具有量值溯源性。

應(yīng)對(duì)配制過(guò)程及配制的液體進(jìn)行的質(zhì)量控制，主要包括酶結(jié)合物的

— 7 — 功能性實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定性；各種溶液的外觀、pH值等；酶作用底物應(yīng)測(cè)定在無(wú)相應(yīng)酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標(biāo)；終止液應(yīng)對(duì)其終止酶促反應(yīng)的能力進(jìn)行測(cè)定。

2.包被酶標(biāo)反應(yīng)板

包被前應(yīng)對(duì)酶標(biāo)反應(yīng)板進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，如尺寸、外觀、包裝、吸附性能、精密性等，并記錄酶標(biāo)反應(yīng)板的批號(hào)、數(shù)量、標(biāo)識(shí)。酶標(biāo)反應(yīng)板經(jīng)檢驗(yàn)合格后方能用于包被。不同批號(hào)的板條不能混用。

選擇經(jīng)檢驗(yàn)合格的包被原料（如抗原、抗體等），經(jīng)一定的方法確定最佳包被濃度和酶結(jié)合物工作濃度，按照診斷試劑的生產(chǎn)規(guī)程，配制包被緩沖液、封閉液，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，經(jīng)干燥后，已包被的酶標(biāo)反應(yīng)板用鋁箔紙封閉（內(nèi)臵干燥劑），保存于2?8℃。

應(yīng)對(duì)包被過(guò)程進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量控制，如包被用原料（抗原或者抗體等生物活性原料）的質(zhì)量檢驗(yàn)、包被液和封閉液的質(zhì)控（如配方、外觀、pH值）、包被過(guò)程的監(jiān)控（包括包被和封閉的體積、溫度、時(shí)間等）、包被均一性檢驗(yàn)、干燥過(guò)程的監(jiān)控等。

3.分裝和包裝

樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應(yīng)嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的量進(jìn)行過(guò)濾后再分裝，分裝量的誤差應(yīng)小于5%。

分裝及包裝均應(yīng)按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程要求進(jìn)行。包裝前，應(yīng)嚴(yán)格檢查試劑盒的品名、批號(hào)等，核對(duì)各試劑盒各組分的數(shù)量，并在關(guān)盒前進(jìn)行復(fù)核。

（四）質(zhì)量控制 1.半成品質(zhì)量控制（1）半成品抽樣

檢驗(yàn)人員按試劑的批號(hào)，根據(jù)抽樣申請(qǐng)單抽取規(guī)定數(shù)量的半成品各— 8 — 組分，作號(hào)標(biāo)記、待檢。

（2）半成品檢驗(yàn)

根據(jù)試劑盒的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或者制檢規(guī)程進(jìn)行半成品的檢驗(yàn)。半成品檢驗(yàn)，一般使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的企業(yè)參考品。若某類(lèi)試劑沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量。

檢驗(yàn)指標(biāo)一般包括陰/陽(yáng)性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。對(duì)于精密性，一般情況下CV不得高于15％（采用競(jìng)爭(zhēng)抑制法的診斷試劑CV不得高于20％）。對(duì)定量檢測(cè)試劑，同時(shí)應(yīng)分析其線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)和定量質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

企業(yè)應(yīng)該對(duì)每一批試劑的半成品進(jìn)行穩(wěn)定性研究。試劑盒各組分應(yīng)留樣，2?8℃定期作穩(wěn)定性考核，同時(shí)作37℃熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

2.成品質(zhì)量控制

產(chǎn)品包裝完成后，質(zhì)檢人員根據(jù)試劑的批號(hào)、實(shí)際包裝量、抽樣申請(qǐng)單的要求進(jìn)行抽樣，同時(shí)填寫(xiě)抽樣數(shù)量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數(shù)量應(yīng)包括檢驗(yàn)用數(shù)量和留樣數(shù)量。質(zhì)檢人員同時(shí)應(yīng)檢查相關(guān)原始記錄。

每一批酶聯(lián)免疫類(lèi)檢測(cè)試劑的試生產(chǎn)量應(yīng)滿(mǎn)足工藝研究、分析性能驗(yàn)證、穩(wěn)定性研究、臨床試驗(yàn)、自測(cè)及注冊(cè)檢驗(yàn)等各階段所需樣品量的要求。

（1）成品檢驗(yàn)

成品檢驗(yàn)時(shí)，一般使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）標(biāo)化后的企業(yè)參考品，并達(dá)到相應(yīng)質(zhì)量要求。若該診斷試劑沒(méi)有國(guó)家

— 9 — 標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)

在批放行前，每一批試劑應(yīng)完成37℃熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

四、名詞解釋

酶聯(lián)免疫法：是指在酶標(biāo)板上包被特定的抗原（和/或抗體）后，利用直接或間接的方法與待測(cè)樣品中的相關(guān)抗體（和/或抗原）反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物再與相應(yīng)的酶標(biāo)記的抗體和/或抗原進(jìn)一步反應(yīng)，經(jīng)過(guò)酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，由形成的顏色的強(qiáng)弱來(lái)判斷樣本中相應(yīng)的抗體和/或抗原的存在。

五、參考文獻(xiàn)：

1.《中國(guó)生物制品規(guī)程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社

— 10 —

第四篇：抗人球蛋白檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2018年）

附件3

抗人球蛋白檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)抗人球蛋白檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫(xiě)，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門(mén)對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)抗人球蛋白檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。如申請(qǐng)人認(rèn)為有必要增加本指導(dǎo)原則不包含的研究?jī)?nèi)容，可自行補(bǔ)充。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、范圍

抗人球蛋白檢測(cè)試劑可進(jìn)行直接抗人球蛋白試驗(yàn)和間接抗人球蛋白試驗(yàn)，主要用于不規(guī)則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細(xì)胞的檢測(cè)等。

本指導(dǎo)原則適用于抗人球蛋白檢測(cè)試劑，同時(shí)適用于不同的檢測(cè)方法，如試管法、柱凝集法等，但不適用于血源篩查用抗人球蛋白檢測(cè)試劑。

本指導(dǎo)原則僅包括對(duì)抗人球蛋白檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料中部分項(xiàng)目的要求，適用于進(jìn)行產(chǎn)品注冊(cè)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜，應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號(hào)）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《辦法》）等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊(cè)申報(bào)資料要求

（一）綜述資料

綜述資料的撰寫(xiě)應(yīng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號(hào)）（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“44號(hào)公告”）的相關(guān)要求。內(nèi)容主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評(píng)價(jià)以及同類(lèi)產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況介紹等內(nèi)容，其中同類(lèi)產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從靈敏度、特異性、效價(jià)、重復(fù)性等方面寫(xiě)明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類(lèi)產(chǎn)品之間的異同。

（二）主要原材料研究資料

主要原材料研究資料應(yīng)包括主要組成成分（抗體、凝膠、玻璃珠等）的選擇、制備及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究資料。

1.抗體的選擇及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

明確抗體的來(lái)源，如為單克隆抗體應(yīng)明確細(xì)胞株、克隆號(hào)等內(nèi)容。提供抗體靈敏度、特異性、效價(jià)等基本性能的驗(yàn)證資料。

抗體如為自行生產(chǎn)，提供抗體的詳細(xì)生產(chǎn)及鑒定過(guò)程。

1.1靈敏度：已知抗體效價(jià)的臨床有意義的血型系統(tǒng)至少7種血型抗體（IgG）的最高稀釋倍數(shù)的凝集強(qiáng)度不小于1+。

1.2特異性：臨床有意義的已知血型系統(tǒng)至少7種，每種選1個(gè)抗體（IgG），與對(duì)應(yīng)的抗原陽(yáng)性細(xì)胞均應(yīng)檢測(cè)陽(yáng)性。

與不規(guī)則抗體陰性樣本檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。

1.3效價(jià)：如采用倍比稀釋的方法驗(yàn)證抗人球蛋白試劑的效價(jià)，分別采用IgG和/或C3d致敏的細(xì)胞或根據(jù)廠家確立的研究方法進(jìn)行驗(yàn)證。

2.填充物的選擇：說(shuō)明填充物如凝膠、玻璃珠的特性，如組成、粒徑及其質(zhì)量控制要求。應(yīng)提交選擇比較過(guò)程，提交驗(yàn)證試驗(yàn)資料。

3.填充緩沖液：應(yīng)說(shuō)明組成成分，并對(duì)外觀、性狀、pH值等物理指標(biāo)及功能性進(jìn)行研究驗(yàn)證。

4.液體試劑稀釋液：應(yīng)說(shuō)明組成成分，并對(duì)外觀、性狀、pH值等物理指標(biāo)及功能性進(jìn)行研究驗(yàn)證。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡(jiǎn)要說(shuō)明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.產(chǎn)品基本反應(yīng)原理介紹。

3.主要生產(chǎn)工藝過(guò)程的研究資料、每一步生產(chǎn)工藝的確認(rèn)資料及試驗(yàn)數(shù)據(jù)。如抗體濃度的選擇確定過(guò)程、凝膠溶脹條件的確定、填充量及填充過(guò)程的研究資料，填充應(yīng)確保均勻無(wú)氣泡，以及質(zhì)量控制的要求。

4.主要反應(yīng)體系的研究資料、每一步反應(yīng)體系的確認(rèn)資料及試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

反應(yīng)體系的設(shè)置應(yīng)符合《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》等公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范、指南或標(biāo)準(zhǔn)的要求。如紅細(xì)胞懸液制備要求及紅細(xì)胞濃度的確定、用量的要求、孵育時(shí)間等；應(yīng)提交離心條件的研究資料，建議以離心力或固定離心機(jī)型號(hào)固定轉(zhuǎn)數(shù)和時(shí)間的方式設(shè)置離心條件。

（四）分析性能評(píng)估資料

申請(qǐng)人應(yīng)提交在產(chǎn)品研制或成品驗(yàn)證階段對(duì)試劑進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，對(duì)于每項(xiàng)分析性能的評(píng)價(jià)都應(yīng)包括具體研究目的、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗(yàn)證的背景信息也應(yīng)在申報(bào)資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)（實(shí)驗(yàn)室）、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)、臨床樣本來(lái)源等。分析性能評(píng)估的實(shí)驗(yàn)方法可以參考國(guó)內(nèi)或國(guó)際有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評(píng)估的指導(dǎo)原則進(jìn)行。

產(chǎn)品性能研究所采用的各種儀器、試劑或其他物品如可能均應(yīng)采用境內(nèi)或境外已批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品，如抗體篩查紅細(xì)胞、血型抗體等。

分析性能評(píng)估試驗(yàn)中應(yīng)明確所有試驗(yàn)每種試劑的用量、試劑紅細(xì)胞的濃度、采用的試驗(yàn)方法（試管法、柱凝集法、微孔板法等）。所有試驗(yàn)方法應(yīng)符合配合使用的血型試劑的具體操作要求。

對(duì)于抗人球蛋白檢測(cè)試劑建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究：

1.間接抗人球蛋白試驗(yàn)：

提供臨床有意義的血型系統(tǒng)至少7種不規(guī)則抗體（IgG）檢測(cè)靈敏度和特異性的驗(yàn)證資料，明確所檢出抗體的抗體效價(jià)的具體要求，可參照以下要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1靈敏度

與已知抗體效價(jià)的血型抗體的最高稀釋倍數(shù)的凝集強(qiáng)度不小于1+，并且抗體效價(jià)不低于試管間接抗人球蛋白法測(cè)定結(jié)果。

C3d凝集強(qiáng)度≥2+。

1.2特異性

與已知抗體類(lèi)型的血型抗體對(duì)應(yīng)的O型相應(yīng)抗原陽(yáng)性紅細(xì)胞的反應(yīng)為陽(yáng)性。

與已知抗體類(lèi)型的血型抗體對(duì)應(yīng)的O型相應(yīng)抗原陰性紅細(xì)胞的反應(yīng)為陰性。

與C3d陽(yáng)性或陰性樣本反應(yīng)為陽(yáng)性或陰性。

1.3重復(fù)性

分別采用IgG性質(zhì)抗D抗體，IgG性質(zhì)抗Jka/Jkb抗體，IgG性質(zhì)抗Fya/Fyb抗體進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證。

批內(nèi)重復(fù)性采用同一批次檢測(cè)卡重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)次數(shù)不少于10次。

日間重復(fù)性采用同一批次檢測(cè)卡每日重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)天數(shù)不少于10天。

批間重復(fù)性采用至少三批檢測(cè)卡進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。

批內(nèi)、日間、批間重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果應(yīng)基本一致，檢測(cè)結(jié)果凝集強(qiáng)度差異不超過(guò)1+。

采用陰性結(jié)果的血清重復(fù)10次檢測(cè)，均應(yīng)出現(xiàn)陰性反應(yīng)。

1.4干擾

提供溶血、脂血、黃疸干擾的評(píng)估資料，應(yīng)至少采用強(qiáng)、中、弱性質(zhì)的抗體進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5血清、血漿比對(duì)的評(píng)估資料。

1.6抗凝劑的適用性研究驗(yàn)證。

1.7采用部分臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)靈敏度和特異性的評(píng)價(jià)，應(yīng)考慮涵蓋腫瘤、血液病、自身免疫病和貧血患者、老人及兒童等病例來(lái)源，應(yīng)包括陽(yáng)性和陰性病例。

1.8分別進(jìn)行每個(gè)預(yù)期用途的完整的性能評(píng)估資料，應(yīng)至少包括50例陽(yáng)性病例。

2.直接抗人球蛋白試驗(yàn)

使用被不規(guī)則抗體和/或C3d致敏的紅細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，評(píng)價(jià)產(chǎn)品性能，適用的性能評(píng)價(jià)內(nèi)容可以參照間接抗人球蛋白試驗(yàn)。

（五）陽(yáng)性判斷值

給出不同凝集強(qiáng)度的研究方法，并明確不同凝集強(qiáng)度代表的具體意義，并應(yīng)包含溶血、混合視野雙群等情況，明確具體的試驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)步驟，提供不同凝集強(qiáng)度的圖例或相片。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、加熱穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案，實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目應(yīng)至少包括靈敏度、特異性、重復(fù)性等內(nèi)容。

穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗(yàn)證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點(diǎn)（溫度范圍），每間隔一定的時(shí)間段對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行全性能的分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類(lèi)型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性?xún)刹糠謨?nèi)容的研究結(jié)果應(yīng)分別在說(shuō)明書(shū)【儲(chǔ)存條件及有效期】和【樣本要求】?jī)身?xiàng)中進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

（七）臨床試驗(yàn)

臨床試驗(yàn)總體要求及臨床試驗(yàn)資料的內(nèi)容應(yīng)符合《辦法》、“44號(hào)公告”及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）的規(guī)定，以下僅結(jié)合抗人球蛋白檢測(cè)試劑的具體特點(diǎn)對(duì)其臨床試驗(yàn)中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容進(jìn)行闡述。

1.研究方法

該類(lèi)試劑已有同類(lèi)產(chǎn)品上市，按照法規(guī)要求應(yīng)選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類(lèi)產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，采用試驗(yàn)用體外診斷試劑（以下稱(chēng)考核試劑）與之進(jìn)行比較研究試驗(yàn)，證明本品與已上市產(chǎn)品等效。

2.臨床試驗(yàn)單位的選擇

應(yīng)選擇符合相關(guān)法規(guī)要求的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，不得選擇血站進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

3.病例選擇

臨床總病例數(shù)應(yīng)不少于3000例。應(yīng)采用臨床患者樣本進(jìn)行臨床研究，供血者樣本不得作為臨床病例納入。應(yīng)包括對(duì)檢測(cè)易產(chǎn)生干擾的病例，盡量選擇多種疾病患者樣本（如腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者）、老人、兒童（不同年齡段）等。

4.實(shí)驗(yàn)過(guò)程

無(wú)論直接抗人球蛋白試驗(yàn)還是間接抗人球蛋白試驗(yàn)，均應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的預(yù)期用途和適用人群分別進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

在進(jìn)行間接抗人球蛋白檢測(cè)試劑臨床試驗(yàn)的過(guò)程中除與對(duì)比試劑進(jìn)行比較外，陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)給出不規(guī)則抗體的具體鑒定結(jié)果。

產(chǎn)品如適用于不同的預(yù)期用途（如不規(guī)則抗體篩查、抗體致敏紅細(xì)胞檢測(cè)、交叉配血等），每種預(yù)期用途均應(yīng)分別進(jìn)行至少3000例的臨床試驗(yàn)，如適用于不規(guī)則抗體篩查或抗體致敏紅細(xì)胞檢測(cè)等，每種預(yù)期用途應(yīng)分別包含不少于100例陽(yáng)性病例，如適用于交叉配血相關(guān)用途，應(yīng)包含不少于100例交叉配血不合病例。抗體致敏紅細(xì)胞檢測(cè)應(yīng)根據(jù)疾病的種類(lèi)，分別進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

交叉配血使用的供血者樣本，最多只能使用兩次，交叉配血不得使用血型不合的樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

同時(shí)應(yīng)明確配合使用的試劑產(chǎn)品。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)進(jìn)行考核試劑與對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率的計(jì)算，并以四格表的形式進(jìn)行列表，并對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的一致性。

6.結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證

對(duì)于兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致[考核試劑與對(duì)比試劑檢測(cè)結(jié)果不一致、與對(duì)比試劑凝集強(qiáng)度差異較大（差異2個(gè)凝集強(qiáng)度及以上）]的樣本，應(yīng)采用臨床上公認(rèn)較好的第三種同類(lèi)試劑進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)給出最終的抗體鑒定結(jié)果。

7.臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄表應(yīng)作為臨床試驗(yàn)報(bào)告附件提交。臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄表應(yīng)列明所有病例的具體臨床診斷信息、凝集強(qiáng)度和抗體鑒定結(jié)果，如有不符樣本應(yīng)列明第三方確認(rèn)的結(jié)果。

（八）產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)分析資料

產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)分析資料應(yīng)符合“44號(hào)公告”的基本要求，并參照相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析。風(fēng)險(xiǎn)分析中應(yīng)充分考慮到各種可能影響檢測(cè)結(jié)果的因素，如某些樣本（如腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者等）在進(jìn)行抗人球蛋白檢測(cè)時(shí)可能存在一定的干擾、實(shí)驗(yàn)過(guò)程不規(guī)范、有些抗體較弱導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定等，申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)這些不確定的因素分析產(chǎn)品應(yīng)用可能存在的風(fēng)險(xiǎn)。

（九）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、性能評(píng)估等結(jié)果，依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號(hào)）的有關(guān)要求，編寫(xiě)產(chǎn)品技術(shù)要求。產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》和“44號(hào)公告”的相關(guān)規(guī)定。

如果擬申報(bào)試劑已有相應(yīng)的國(guó)家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求不得低于上述標(biāo)準(zhǔn)要求。

產(chǎn)品技術(shù)要求的性能指標(biāo)應(yīng)至少包括靈敏度、特異性、重復(fù)性等。

產(chǎn)品技術(shù)要求的附錄應(yīng)包括主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定要求。主要原材料應(yīng)明確抗體來(lái)源、克隆號(hào)、純度、效價(jià)、特異性以及功能性驗(yàn)證要求，應(yīng)明確填充物來(lái)源及主要特征、質(zhì)量控制要求，緩沖液應(yīng)明確組成、pH值等特性及質(zhì)控要求。主要生產(chǎn)工藝應(yīng)以流程圖形式描述主要生產(chǎn)工藝過(guò)程，并明確主要生產(chǎn)工藝的具體條件和質(zhì)量控制點(diǎn)。半成品檢定應(yīng)明確半成品的檢驗(yàn)要求及方法。

（十）產(chǎn)品注冊(cè)檢驗(yàn)報(bào)告

根據(jù)《辦法》要求，首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類(lèi)體外診斷試劑產(chǎn)品應(yīng)在國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理部門(mén)認(rèn)可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù)三個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢驗(yàn)。

（十一）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

說(shuō)明書(shū)承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、檢驗(yàn)原理、試驗(yàn)方法、檢測(cè)結(jié)果解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)是體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)最重要的文件之一。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）的要求，境外產(chǎn)品的中文說(shuō)明書(shū)除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說(shuō)明書(shū)的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明參考文獻(xiàn)的相關(guān)信息。

以下內(nèi)容僅對(duì)抗人球蛋白檢測(cè)試劑說(shuō)明書(shū)的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，說(shuō)明書(shū)其他內(nèi)容應(yīng)根據(jù)《體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則》要求進(jìn)行編寫(xiě)。

1.【預(yù)期用途】

1.1寫(xiě)明本試劑用于直接抗人球蛋白試驗(yàn)和/或間接抗人球蛋白試驗(yàn)，主要用于不規(guī)則抗體篩查、交叉配血、抗體致敏紅細(xì)胞的檢測(cè)（明確疾病類(lèi)型）等，同時(shí)明確不用于血源篩查，僅用于臨床檢驗(yàn)。

1.2說(shuō)明與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)癥背景情況，說(shuō)明相關(guān)的臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷方法。

2.【儲(chǔ)存條件及有效期】

說(shuō)明試劑的儲(chǔ)存條件及有效期、加速穩(wěn)定性、開(kāi)瓶穩(wěn)定性等。

3.【適用儀器】明確具體的離心機(jī)和/或孵育器型號(hào)（如適用）。

4.【樣本要求】

明確溶血、脂血、黃疸樣本是否可以使用，或提供使用此類(lèi)樣本的最低要求。依據(jù)穩(wěn)定性研究結(jié)果寫(xiě)明樣本穩(wěn)定性。

明確適用的抗凝劑的要求。

明確具體的樣本采集、處理方法及過(guò)程。

明確紅細(xì)胞配制使用的LISS液的生產(chǎn)廠家、規(guī)格、貨號(hào)等內(nèi)容。

5.【陽(yáng)性判斷值】

明確各種試驗(yàn)方法的結(jié)果判斷方法及標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)不同凝集強(qiáng)度的圖例或照片進(jìn)行詳細(xì)解釋。

6.【檢驗(yàn)方法】

明確配合使用的抗體篩查用紅細(xì)胞的生產(chǎn)廠家、規(guī)格、貨號(hào)等內(nèi)容。

須明確具體的檢驗(yàn)步驟，反應(yīng)體系的描述應(yīng)準(zhǔn)確且應(yīng)與研究資料一致，不同的預(yù)期用途應(yīng)分別詳細(xì)描述實(shí)驗(yàn)過(guò)程。如配合其他試劑進(jìn)行試驗(yàn)，需注明試驗(yàn)方法應(yīng)完全符合配合試劑的試驗(yàn)操作要求。

7.【檢驗(yàn)方法的局限性】

未被檢出的抗IgG抗體在某些病例中可能有臨床意義。

8.【注意事項(xiàng)】

8.1上腔部分或封口處有氣泡或液滴的卡，必須在使用前離心。

8.2濃度過(guò)高或過(guò)低的紅細(xì)胞懸液會(huì)引起異常結(jié)果。

8.3在不規(guī)則抗體篩查、交叉配血試驗(yàn)中LISS液可以增強(qiáng)抗原抗體的反應(yīng)，應(yīng)嚴(yán)格按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)規(guī)范使用低離子液。

三、參考文獻(xiàn)

1.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號(hào)）.2014年9月

2.國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑說(shuō)明書(shū)編寫(xiě)指導(dǎo)原則（國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號(hào)）.2014年9月

3.中國(guó)生物制品規(guī)程（2000年版）.化學(xué)工業(yè)出版社

四、起草單位

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。

第五篇：核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則3

附件3

核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

一、前言

本指導(dǎo)原則主要針對(duì)核酸擴(kuò)增類(lèi)檢測(cè)試劑的主要原材料、生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系、產(chǎn)品質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)提出指導(dǎo)性技術(shù)要求。

本指導(dǎo)原則系對(duì)核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細(xì)闡述其理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿(mǎn)足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制訂的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善、科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。

二、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑的注冊(cè)技術(shù)審查，其他類(lèi)核酸檢測(cè)試劑可參照相關(guān)內(nèi)容。

三、基本要求

（一）基本原則

1.核酸擴(kuò)增類(lèi)檢測(cè)試劑的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)獲得《醫(yī)療器械生產(chǎn)許可證》。研制、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。

2．試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)具有與其技術(shù)要求相適應(yīng)的人員、廠房、設(shè)施和

— 23 — 儀器設(shè)備以及適宜的生產(chǎn)環(huán)境，配備滿(mǎn)足核酸提取和擴(kuò)增檢測(cè)以及操作人員防護(hù)所需的設(shè)備。建立專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格分區(qū)，人員和物品應(yīng)當(dāng)單向流動(dòng)，以最大限度地防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣品之間的污染和避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。生產(chǎn)用于病原微生物核酸檢測(cè)的生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立符合生物安全要求的設(shè)施和措施。

3.試劑生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)按照《體外診斷試劑生產(chǎn)實(shí)施細(xì)則（試行）》的要求，建立相應(yīng)的質(zhì)量管理體系，并應(yīng)通過(guò)《體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量管理體系考核評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（試行）》的考核。

4.核酸擴(kuò)增類(lèi)檢測(cè)試劑的引物設(shè)計(jì)應(yīng)當(dāng)符合核酸檢測(cè)設(shè)計(jì)的要求，擴(kuò)增體系應(yīng)設(shè)定合理的內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)，試劑需設(shè)置抗污染的特定措施，擴(kuò)增產(chǎn)物須進(jìn)行確證研究。

5.企業(yè)使用新型原材料時(shí)，應(yīng)提供與通行原材料比對(duì)研究結(jié)果及相關(guān)資料。使用未列入上述標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)試劑，應(yīng)不低于分析純。

（二）原材料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品或標(biāo)準(zhǔn)品等的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量分析和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等的相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定；如主要原材料來(lái)自市場(chǎng)（從其他單位購(gòu)買(mǎi)），應(yīng)提供的資料包括：對(duì)物料供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、購(gòu)買(mǎi)合同、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。主要原材料（包括生產(chǎn)工藝）或其供應(yīng)商發(fā)生變更，應(yīng)依據(jù)國(guó)家相關(guān)法規(guī)的要求進(jìn)行變更申請(qǐng)。

核酸類(lèi)檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

1.脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。應(yīng)為高效液相色譜（HPLC）純、PCR級(jí)，無(wú)DNase和RNase污染。—20℃保存。— 24 — 2.引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用脫氧核糖核酸（DNA）合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。

凍干粉，序列正確，合成量應(yīng)達(dá)到試劑生產(chǎn)要求。純度應(yīng)達(dá)到電泳級(jí)（PAGE）或HPLC級(jí)，不含雜帶。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。

應(yīng)作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260nm/OD280nm的比值在1.6—2.0之間，可視為合格引物。-20℃保存。

3.探針

是指特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測(cè)。通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5'-端(和/或3'-端)進(jìn)行標(biāo)記，如熒光素報(bào)告基團(tuán)或其他發(fā)光標(biāo)記物，在3'-端標(biāo)記熒光素淬滅基團(tuán)，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化。

凍干粉，純度應(yīng)達(dá)到HPLC純。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如HPLC分析圖譜；應(yīng)對(duì)探針的核酸序列及標(biāo)記的熒光素或化學(xué)發(fā)光物進(jìn)行核實(shí)，并作HPLC分析。應(yīng)以可見(jiàn)—紫外分光光度計(jì)進(jìn)行200—800nm掃描，在260nm處應(yīng)有吸收峰。另外，根據(jù)標(biāo)記熒光素的不同，還應(yīng)該在熒光素的激發(fā)波長(zhǎng)處有吸收峰，如FAM熒光素在494nm、TET熒光素在521nm、TAMRA熒光素在560nm處有特異的吸收峰，雜交探針在493nm、625nm、685nm處有特異的吸收峰，檢定合格后入庫(kù)。避光、-20℃保存。

4.DNA聚合酶

如Taq DNA聚合酶。應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性；具熱穩(wěn)定性，94℃保溫1小時(shí)后仍保持50%活性。-20℃保存。

5.尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，無(wú)核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，IU UNG

— 25 — 在 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模板應(yīng)完全降解，不能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。-20℃保存。

6.逆轉(zhuǎn)錄酶

具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無(wú)核酸內(nèi)切酶活性。—20℃保存。

（三）生產(chǎn)工藝

核酸擴(kuò)增類(lèi)檢測(cè)試劑的基本生產(chǎn)工藝通常包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過(guò)程應(yīng)對(duì)電導(dǎo)率pH、等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。

工藝研究的資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如樣本類(lèi)型、樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、校準(zhǔn)方法、質(zhì)控方法、臨界值的確定、穩(wěn)定性和有效期，提供確切的依據(jù)。

（四）質(zhì)量控制 1.半成品質(zhì)量控制

（1）按批號(hào)抽取規(guī)定數(shù)量的半成品。

（2）以參考品/對(duì)照品進(jìn)行半成品質(zhì)量控制。如果產(chǎn)品具有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)以其進(jìn)行檢定。如果產(chǎn)品不具有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，應(yīng)根據(jù)規(guī)定制備相應(yīng)的企業(yè)參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類(lèi)產(chǎn)品的質(zhì)量。

（3）半成品檢定內(nèi)容包括：陰/陽(yáng)性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度。檢測(cè)結(jié)果應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。

（4）半成品檢定合格后，按試劑盒組成及時(shí)進(jìn)行分裝和包裝。2.成品質(zhì)量控制

（1）每一批核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑的試生產(chǎn)量應(yīng)滿(mǎn)足工藝研究、分析性能驗(yàn)證、穩(wěn)定性研究、臨床試驗(yàn)、自測(cè)及注冊(cè)檢驗(yàn)等各階段所需樣品量的要求?！? 26 —（2）產(chǎn)品完成包裝后，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)量進(jìn)行抽樣和生產(chǎn)記錄審核。（3）以參考品/對(duì)照品進(jìn)行成品質(zhì)量檢驗(yàn)。結(jié)果應(yīng)符合要求。（4）成品檢驗(yàn)的內(nèi)容應(yīng)包括：陰/陽(yáng)性參考品符合率、靈敏度、特異性、精密度、線(xiàn)性范圍（定量產(chǎn)品）和穩(wěn)定性。

5．試劑批放行前，應(yīng)對(duì)需要進(jìn)行穩(wěn)定性考核的試劑成分，在特定溫度或條件下進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。穩(wěn)定性試驗(yàn)可采用加速破壞試驗(yàn)。

四、名詞解釋

核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑：核酸擴(kuò)增技術(shù)泛指以擴(kuò)增脫氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）為手段，檢測(cè)特定核酸序列或篩查特定基因的檢測(cè)技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、連接酶鏈反應(yīng)（LCR）、轉(zhuǎn)錄依賴(lài)的擴(kuò)增反應(yīng)（TMA）等。核酸擴(kuò)增法檢測(cè)試劑是基于核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的體外診斷試劑，目前已經(jīng)用于病原體檢測(cè)、特定疾病的早期診斷和體內(nèi)物質(zhì)的型別鑒定等不同領(lǐng)域。

五、參考文獻(xiàn)

1.《中國(guó)生物制品規(guī)程》（2000年版），化學(xué)工業(yè)出版社