第一篇：染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗指南及技術(shù)總結(jié)

染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗指南及技術(shù)總結(jié)

ChIP是一項比較流行的研究轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor, TF）與啟動子（promoter）相互結(jié)合的實驗技術(shù)。由于ChIP采用甲醛固定活細胞或者組織的方法，所以能比較真實的反映細胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況。這個優(yōu)勢是EMSA這個體外研究核酸與蛋白相互結(jié)合的實驗方法所不能比擬的。當(dāng)用甲醛處理時，相互靠近的蛋白與蛋白，蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會產(chǎn)生共價鍵。細胞內(nèi)，當(dāng)TF與Promoter相互結(jié)合（生物意義上的結(jié)合）時，它們必然靠的比較近，或者契合在一起，這個時候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價鍵。

一般ChIP的流程是：甲醛處理細胞——收集細胞，超聲破碎——加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合——加入Protein A，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀——對沉淀下來的復(fù)合物進行清洗，除去一些非特異性結(jié)合——洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物——解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷——PCR分析。

在PCR分析這一塊，比較傳統(tǒng)的做法是半定量－PCR。但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向于Q－PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內(nèi)蛋白與RNA的相互結(jié)合，具體方法和ChIP差不多，只是實驗過程中要注意防止RNase，最后分析的時候需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基礎(chǔ)上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據(jù)公司的要求來準(zhǔn)備樣品）。

第一天：

（一）、細胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎。

1、取出1平皿細胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的終濃度為1％。（培養(yǎng)基共有9ml）2、37攝氏度孵育10min。

3、終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125M。

450ul 2.5M甘氨酸于平皿中?；靹蚝螅谑覝叵路胖?min即可。

4、吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細胞2次。

5、細胞刮刀收集細胞于15ml離心管中（PBS依次為5ml，3ml和3ml）。預(yù)冷后2000rpm 5min收集細胞。

6、倒去上清。按照細胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個細胞。這樣每100ul溶液含1×106個細胞。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。

假設(shè)MCF7長滿板為5×106個細胞。本次細胞長得約為80％。即為4×106個細胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800ul。

7、超聲破碎：VCX750，25％功率，4.5S沖擊，9S間隙。共14次。

（二）、除雜及抗體哺育。

8、超聲破碎結(jié)束后，10，000g 4度離心10min。去除不溶物質(zhì)。留取300ul做實驗，其余保存于－80度。

300ul中，100ul加抗體做為實驗組；100ul不加抗體做為對照組；100ul加入4ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M），65度處理4h解交聯(lián)，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。

9、在100ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度顛轉(zhuǎn)混勻1h。10、1h后，在4度靜置10min沉淀，700rpm離心1min。

11、取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul 抗體，另一管中則不加抗體。4度顛轉(zhuǎn)過夜。

（三）、檢驗超聲破碎的效果。

取100ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4ul 5M NaCl，65度處理4h解交聯(lián)。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。

第二天：

（一）、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗。

12、孵育過夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度顛轉(zhuǎn)2h。13、4度靜置10min后，700rpm離心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入溶液，在4度顛轉(zhuǎn)10min，4度靜置10min沉淀，700rpm離心1min，除去上清。

洗滌溶液：a.low salt wash buffer—-one wash b.high salt wash buffer—–one wash c.LiCl wash buffer——one wash d.TE buffer——two wash

15、清洗完畢后，開始洗脫。洗脫液的配方：100ul 10％SDS，100ul 1M NaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。

每管加入250ul洗脫buffer，室溫下顛轉(zhuǎn)15min，靜置離心后，收集上清。重復(fù)洗滌一次。最終的洗脫液為每管500ul。

16、解交聯(lián)：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）。混勻，65度解交聯(lián)過夜。第三天：

（一）、DNA樣品的回收

17、解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。

18、每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45度處理2h。

19、DNA-片段的回收―――omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100ul ddH2O。

（二）、PCR分析

二、技術(shù)總結(jié)

（一）、關(guān)于細胞

細胞的生長狀態(tài)要好。因為細胞的生長狀態(tài)直接影響細胞內(nèi)部的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也很有可能影響你所研究的TF與其靶Promoter的結(jié)合。

一般細胞長到75％－80％比較好。

（二）、關(guān)于抗體！

抗體是實驗成敗的致命因素之一！必須是IP級別的抗體，另外如果經(jīng)濟條件許可的話，盡量買大廠的抗體。不推薦國產(chǎn)抗體和santa cruz的抗體，即使是IP級別的。

單抗與多抗的選擇也需要仔細考慮。兩種抗體各有利弊。單抗特異性強，背景低。但是單抗有一個致命的弱點，就是識別位點單一，而在ChIP甲醛交聯(lián)的過程中，很有可能該位點被其它蛋白或核酸結(jié)合而被封閉，導(dǎo)致單抗不能識別靶蛋白。多抗雖然沒有這個問題，但是多抗特異性較差，背景可能會偏高。

一般而言，如果沒有十足把握（單抗的識別位點遠離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域），選擇多抗比較穩(wěn)妥一些。

（三）、關(guān)于交聯(lián)與超聲破碎！

這一塊的確是ChIP實驗中比較難把握的部分。交聯(lián)的程度會影響到超聲破碎的效果，交聯(lián)的程度越高，超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段。

交聯(lián)不充分，只有一部分靶蛋白與其Promoter相結(jié)合，富集得到的Promoter的量不高，實驗假陰性。交聯(lián)過充分，基因組上結(jié)合了太多的蛋白，對超聲破碎造成障礙。另外也會增加背景。

一般來講，按照我的經(jīng)驗，交聯(lián)條件取決于細胞類型。不同的細胞系，交聯(lián)的條件也不一樣。例如：NIH－3T3的交聯(lián)條件是室溫（25攝氏度）下15min，1％的甲醛濃度，而別的細胞系則可能完全不一樣。而超聲破碎的條件，機器不一樣，條件也不一樣。當(dāng)然如果你有bioruptor這樣的神器，那么超聲破碎對你而言就是小菜一碟了。

一般，理想的超聲破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。但是200bp－2000bp的范圍也是可以接受的。

（四）、關(guān)于操作

希望盡可能的保持低溫（4度）。

沉淀的時候可以先在4度放置一會，等它自然沉降一些，再超低轉(zhuǎn)速（500rpm等）離心使其完全沉降。

雖然說明書上說ChIP實驗的過程中有幾個可以停頓的地方，我還是希望你能夠連續(xù)把它做完，直到PCR結(jié)果出來為止。盡量避免實驗中不可預(yù)知的影響因素。

（五）、關(guān)于解交聯(lián)

雖然說明書上說4小時已經(jīng)足夠，但是我還是希望你可以解交聯(lián)過夜。因為在那樣的環(huán)境里，DNA不會降解，過夜解交聯(lián)更充分些。只是不要忘記在EP管口封上封口膜。

（六）、關(guān)于DNA-片段的回收

需要注意的是：樣品中SDS樣品較高，普通的PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，很有可能會在最終的樣品中混入SDS，影響PCR實驗結(jié)果。

小Tip：過柱前，在樣品中加入一定量的異丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗中應(yīng)注意的細節(jié)問題

本文來自互聯(lián)網(wǎng)搜索，僅供參考使用，最好實驗條件需要自己摸索：

1、cell counting：盡量做到準(zhǔn)確，會影響input結(jié)果。

2、cross link：甲醛的終濃度是1%，這個基本所有的protocol上都會強調(diào)。

3、resuspend cells with SDS:一定要選用小的tip頭，在液面下吹打，否則很容易產(chǎn)生氣泡，后面的sonication就麻煩了。

4、sonication：ChIP中最重要的一部分，合適的條件要自己摸索，可以一次嘗試不同次數(shù)的sonication，然后建議采用EZ-ChIP上推薦的方法看看sonication的效果如何。

5、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混勻，因為salmon sperm DNA是很粘稠的物質(zhì)，若不混勻，后面你會發(fā)現(xiàn)beads的量不一樣，自然也會影響實驗的結(jié)果。

6、wash 的時候前面幾個步驟可以不用洗的太干凈，但最后一個要盡量吸干凈，必要時可用gel loading tips吸。

7、含beads的samples離心時，有的protocol上推薦是1000rpm，45秒，但可以根據(jù)情況調(diào)整，但要注意轉(zhuǎn)速不能太快防止beads破碎。（當(dāng)然如果采用的是magnetic的beads就不存在這個問題）

8、reverse crosslink可以是65°4個小時，也可以overnight。

9、reverse crosslink后的在進行下面步驟之前建議先離心，把蒸發(fā)到離心管蓋子上的部分離下來。

10、每次行real time PCR之前都要把sample離心保證取樣的準(zhǔn)確。11、1~10ul的槍取3ul以上才比較準(zhǔn)確，所以考慮好自己PCR反應(yīng)體系的配置。

Upstate生物技術(shù)公司chip試劑盒英文Protocol ChIP assay: Chromatin immunoprecipitation assay was performed according to the protocol of ChIP assay kit(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).1, For cells cultured in 2D, about 1—2×107 S1 cells were growth in 100mm dish, and were cross-linked by adding formaldehyde to final concentration of 1% and incubated in room temperature for 10 minutes.For cells growth in 3D, cells were isolated from EHS using PBS/EDTA, and also cross-linked as cells growth in 2D.2, Wash cells twice using ice cold PBS containing protease inhibitors(1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A).Note: Add protease inhibitors to PBS just prior to use.PMSF has a half-life of approximately 30 minutes in aqueous solutions.3, Scrape cells into conical tube, Pellet cells for 4 minutes at 2000 rpm at 4℃.4, Cells were washed with PBS and resuspended in ChIP lysis buffer(1% SDS, 10mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH8.0)add protease inhibitors(inhibitors: 1mM PMSF, 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A)..After incubated 10 minutes on ice, cells were sonicated to shear DNA to lengths between 200 and 1000 basepairs being sure to keep samples ice cold.5, Centrifuge samples(part A, step 7)for 10 minutes at 13,000 rpm at 4℃, and detected the OD260 of the lysates.6, Sonicated lysates were then diluted to OD260 2 with ChIP dilution buffer().60 ul protein A-agarose beads(Upstate Catalog # 16-157)was added to sonicated lysates and rotated at 4 for one hour to reduce the non-specific dinding.7, Pellet agarose by brief centrifugation and collect the supernatant fraction, 20ul of lystates were taken out as input control.9, Add the immunoprecipitating antibody(the amount will vary per antibody)to the 2ml supernatant fraction and incubate 2h at 4℃ with rotation.For a negative control, perform a no-antibody immunoprecipitation by incubating the supernatant fraction with 60 microliters of Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose Slurry for one hour at 4℃ with rotation.10, Pellet agarose by gentle centrifugation(700 to 1000 rpm at 4℃, ~1min).Carefully remove the supernatant that contains unbound, non-specific DNA.Wash the protein A agarose/antibody/histone complex for 3-5 minutes on a rotating platform with 1ml of each of the buffers listed in the order as given below: Low salt wash buffer(0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl);High salt wash buffer(0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl);LiCl buffer(0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% SDC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH8.0);TE buffer(20 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA pH8.0).11, Elute the histone complex from the antibody by adding 250 microliter elution buffer(1%SDS, 0.1M NaHCO3)to the pelleted protein A agarose/antibody/histone complex from step 10 above.Vortex briefly to mix and incubate at room temperature for 15 minutes with rotation.Spin down agarose, and carefully transfer the supernatant fraction(eluate)to another tube and repeat elution.Combine eluates(total volume=approximately 500 microliters.)12, Add 20 microliters 5M NaCl to the combined eluates(500 microliters)and reverse histone-DNA crosslinks by heating at 65℃ for 4 hours.Note: Include the input DNA from this step.13, Add 10 microliters of 0.5M EDTA, 20 microliters 1M Tris-HCl, pH 6.5 and 2 microliters of 10mg/ml Proteinase K to the combined eluates and incubate for one hour at 45℃.14, Recover DNA by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation.Addition of an inert carrier, such as 20 micrograms glycogen, helps visualize the DNA pellet.Wash pellets with 70% ethanol and air dry.15, Resuspend pellets in an appropriate buffer for PCR or slot-blot reactions.PCR or slot-blot conditions must be determined empirically.

第二篇：關(guān)于染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP實驗原理及實驗總結(jié)

關(guān)于染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP實驗原理及實驗總結(jié)

ChIP實驗原理

在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。

可以利用ChIP研究轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor, TF）與啟動子（promoter）的關(guān)聯(lián)性。由于ChIP采用甲醛固定活細胞或者組織的方法，所以能比較真實的反映細胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況。這個優(yōu)勢是EMSA這個體外研究核酸與蛋白相互結(jié)合的實驗方法所不能比擬的。當(dāng)用甲醛處理時，相互靠近的蛋白與蛋白，蛋白與核酸（DNA或RNA）之間會產(chǎn)生共價鍵。細胞內(nèi)，當(dāng)TF與Promoter相互結(jié)合（生物意義上的結(jié)合）時，它們必然靠的比較近，或者契合在一起，這個時候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價鍵。

一般ChIP的流程是：甲醛處理細胞——收集細胞，超聲破碎——加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復(fù)合物相互結(jié)合——加入Protein A，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物，并沉淀——對沉淀下來的復(fù)合物進行清洗，除去一些非特異性結(jié)合——洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復(fù)合物——解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷——PCR分析。

ChIP實驗步驟

第一天：

（一）、細胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎。

1、取出1平皿細胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的終濃度為1％。（培養(yǎng)基共有9ml）2、37攝氏度孵育10min。

3、終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125M。

450ul 2.5M甘氨酸于平皿中?；靹蚝?，在室溫下放置5min即可。

4、吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細胞2次。

5、細胞刮刀收集細胞于15ml離心管中（PBS依次為5ml，3ml和3ml）。預(yù)冷后2000rpm 5min收集細胞。

6、倒去上清。按照細胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個細胞。這樣每100ul溶液含1×106個細胞。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。假設(shè)MCF7長滿板為5×106個細胞。本次細胞長得約為80％。即為4×106個細胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800ul。

7、超聲破碎：VCX750，25％功率，4.5S沖擊，9S間隙。共14次。當(dāng)然，如果實驗室有Bioruptor這種神器的話那就輕松了。

（二）、除雜及抗體哺育。

8、超聲破碎結(jié)束后，10，000g 4度離心10min。去除不溶物質(zhì)。留取300ul做實驗，其余保存于－80度。

300ul中，100ul加抗體做為實驗組；100ul不加抗體做為對照組；100ul加入4ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M），65度處理3h解交聯(lián)，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。

9、在100ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度顛轉(zhuǎn)混勻1h。10、1h后，在4度靜置10min沉淀，700rpm離心1min。

11、取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul 抗體，另一管中則不加抗體。4度顛轉(zhuǎn)過夜。

（三）、檢驗超聲破碎的效果。

取100ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4ul 5M NaCl，65度處理2h解交聯(lián)。分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。

第二天：

（一）、免疫復(fù)合物的沉淀及清洗。

12、孵育過夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度顛轉(zhuǎn)2h。13、4度靜置10min后，700rpm離心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入溶液，在4度顛轉(zhuǎn)10min，4度靜置10min沉淀，700rpm離心1min，除去上清。洗滌溶液：a.low salt wash buffer----one wash b.high salt wash buffer-----one wash c.LiCl wash buffer------one wash d.TE buffer------two wash

15、清洗完畢后，開始洗脫。洗脫液的配方：100ul 10％SDS，100ul 1M NaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。

每管加入250ul洗脫buffer，室溫下顛轉(zhuǎn)15min，靜置離心后，收集上清。重復(fù)洗滌一次。最終的洗脫液為每管500ul。

16、解交聯(lián)：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2M）?；靹?，65度解交聯(lián)過夜。

第三天：

（一）、DNA樣品的回收

17、解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。

18、每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45度處理2h。

19、DNA片段的回收―――omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100ul ddH2O。

（二）、PCR分析

ChIP技術(shù)總結(jié)

（一）、關(guān)于細胞

細胞的生長狀態(tài)要好。因為細胞的生長狀態(tài)直接影響細胞內(nèi)部的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也很有可能影響你所研究的TF與其靶Promoter的結(jié)合。一般細胞長到75％－80％比較好。

（二）、關(guān)于抗體！

抗體是實驗成敗的致命因素之一！必須是IP級別的抗體，另外如果經(jīng)濟條件許可的話，盡量買大廠的抗體。不推薦國產(chǎn)抗體和santa cruz的抗體，即使是IP級別的。

單抗與多抗的選擇也需要仔細考慮。兩種抗體各有利弊。單抗特異性強，背景低。但是單抗有一個致命的弱點，就是識別位點單一，而在ChIP甲醛交聯(lián)的過程中，很有可能該位點被其它蛋白或核酸結(jié)合而被封閉，導(dǎo)致單抗不能識別靶蛋白。多抗雖然沒有這個問題，但是多抗特異性較差，背景可能會偏高。

一般而言，如果沒有十足把握（單抗的識別位點遠離靶蛋白與核酸結(jié)合的區(qū)域），選擇多抗比較穩(wěn)妥一些。

（三）、關(guān)于交聯(lián)與超聲破碎！

這一塊的確是ChIP實驗中比較難把握的部分。交聯(lián)的程度會影響到超聲破碎的效果，交聯(lián)的程度越高，超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段。

交聯(lián)不充分，只有一部分靶蛋白與其Promoter相結(jié)合，富集得到的Promoter的量不高，實驗假陰性。交聯(lián)過充分，基因組上結(jié)合了太多的蛋白，對超聲破碎造成障礙。另外也會增加背景。一般來講，按照我的經(jīng)驗，交聯(lián)條件取決于細胞類型。不同的細胞系，交聯(lián)的條件也不一樣。例如：NIH－3T3的交聯(lián)條件是室溫（25攝氏度）下15min，1％的甲醛濃度，而別的細胞系則可能完全不一樣。而超聲破碎的條件，機器不一樣，條件也不一樣。當(dāng)然如果你有bioruptor這樣的神器，那么超聲破碎對你而言就是小菜一碟了。

一般，理想的超聲破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。但是200bp－2000bp的范圍也是可以接受的。

（四）、關(guān)于操作

希望盡可能的保持低溫（4度）。

沉淀的時候可以先在4度放置一會，等它自然沉降一些，再超低轉(zhuǎn)速（500rpm等）離心使其完全沉降。

雖然說明書上說ChIP實驗的過程中有幾個可以停頓的地方，我還是希望你能夠連續(xù)把它做完，直到PCR結(jié)果出來為止。盡量避免實驗中不可預(yù)知的影響因素。

（五）、關(guān)于解交聯(lián)

雖然說明書上說4小時已經(jīng)足夠，但是我還是希望你可以解交聯(lián)過夜。因為在那樣的環(huán)境里，DNA不會降解，過夜解交聯(lián)更充分些。只是不要忘記在EP管口封上封口膜。

（六）、關(guān)于DNA片段的回收

需要注意的是：樣品中SDS樣品較高，普通的PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收，很有可能會在最終的樣品中混入SDS，影響PCR實驗結(jié)果。

小Tip：過柱前，在樣品中加入一定量的異丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

第三篇：Millipore ChIP實驗說明書

ChIP實驗操作手冊

陽性對照抗體是兔抗乙酰化組蛋白H3抗體（可檢測人，鼠和四膜蟲）。陰性對照是正常的兔IgG。對照引物mix是檢測166 bp人體GAPDH啟動子序列的（both end-point and real-time quantitative PCR）。用啟動子特異性引物進行PCR時建議用來分析富集度較高的DNA片段。

需自己準(zhǔn)備的材料：

? 細胞，? 自己要檢測用的ChIP抗體，? 37%的甲醛，? Taq DNA聚合酶（PCR用），? dNTPs，2.5 mM each，? SYBR-Green for qPCR，? DNase and RNase-free sterile H2O。

引物設(shè)計：

? Primer Length：24 nt

? Optimum Tm：60°C? Optimum GC：50%? Amplicon size：100-700 bp Detailed Chromatin Immunoprecipitation Protocol

A.In vivo Crosslinking and Lysis

開始前準(zhǔn)備：

? 150 mm培養(yǎng)皿中裝20 ml培養(yǎng)基，讓細胞鋪板率達到80~90%。

? HeLa細胞數(shù)大約有107個，可用來制備10次獨立的免疫沉淀反應(yīng)。

? 細胞數(shù)量可以根據(jù)抗體的性能進行縮放。例如提供的對照抗體能夠用105個細

胞來進行ChIP實驗。為了確?？贵w的性能，此protocol用了106個細胞來進行ChIP實驗。

? 將PBS和培養(yǎng)皿放在冰上（步驟3和6）。

? 每塊150 mm培養(yǎng)皿準(zhǔn)備42 ml 1×PBS（4.2 ml 10×PBS加37.8 ml水）并放

在冰上。

? 將Nuclear Lysis Buffer放在室溫下使SDS充分溶解。

? 取出Protease Inhibitor Cocktail II在室溫下解凍（步驟3和13使用）。該溶液

中含有DMSO在18.4℃以下就會凍結(jié)。

1、加550 μl 37%的甲醛（或1100 μl新鮮的18.5%甲醛）到20 ml細胞培養(yǎng)基中進行交聯(lián)反應(yīng)，輕輕地晃動混勻。

? 甲醛的終濃度為1%。盡量使用新鮮的甲醛（配置方法見附錄B）。

2、室溫下孵育10 min，不要振蕩細胞。

3、取出2 ml冰冷的PBS，每ml PBS中加5 μl Protease Inhibitor Cocktail II。

4、加2 ml 10×Glycine到培養(yǎng)皿中將未反應(yīng)的甲醛消除。

5、晃動混勻并在室溫下孵育5 min。

6、將培養(yǎng)皿放在冰上。

7、吸出培養(yǎng)基，盡可能的將培養(yǎng)基去除干凈，小心不要擾亂細胞。

8、加20 ml冰冷的PBS來洗滌細胞。

9、除去PBS，再用PBS洗滌一次。

10、加2 ml含1×Protease Inhibitor Cocktail II的冷PBS到培養(yǎng)皿中。

11、將細胞從培養(yǎng)皿刮下來放到離心管中。

12、4℃ 800 g（900~1000 rpm）離心5 min沉淀細胞。

13、準(zhǔn)備好0.5 ml cell Lysis Buffer（含2.5 μl Protease Inhibitor Cocktail II）。

14、除去上清液（此步中的細胞沉淀可以放在-80℃中保存）。

15、用準(zhǔn)備好的0.5 ml cell Lysis Buffer重懸細胞。

16、冰上孵育15 min，每5 min漩渦振蕩一下細胞懸液。

? 可選：孵育之后，用Dounce勻漿器將細胞懸液勻漿化10次以促進核釋放。17、4℃ 800 g（900~1000 rpm）離心5 min。

18、準(zhǔn)備0.5 ml Nuclear Lysis Buffer（含2.5 μl Protease Inhibitor Cocktail II）。

19、離心后除去上清，用0.5 ml Nuclear Lysis Buffer重懸細胞。

? 107個HeLa細胞建議加0.5 ml Nuclear Lysis Buffer。如果細胞濃度不同可以相

應(yīng)的改變用量，因為裂解液和細胞的比例會影響細胞的裂解效果。

20、如果已經(jīng)確定了最適的超聲處理條件，繼續(xù)B部分，否則，看附錄A。

B、Sonication to Shear DNA

選擇最佳的超聲條件來打斷交聯(lián)的DNA，使其長度為200~1000 bp。

1、需要的話，從步驟A-17中取5 μl細胞裂解液進行電泳檢測未打斷的DNA。

2、在冰上超聲處理細胞裂解液。（條件摸索）

3、4℃ 10000~15000 g（~12000 rpm）離心10 min除去不溶解的沉淀。

4、有需要的話，可以取出5 μl打斷的DNA電泳檢測超聲效果。

5、將上清液吸到一個新的離心管中，分為50 μl一份。

? 每50 μl包含106個細胞的裂解產(chǎn)物，可以用來做一次免疫沉淀反應(yīng)。? 打斷的交聯(lián)染色質(zhì)可以在-80℃中保存3個月。

C、Immunoprecipitation(IP)of Crosslinked Protein/DNA

開始該步驟之前：取出Protease Inhibitor Cocktail II在室溫融化（步驟3用）。

1、準(zhǔn)備足夠的稀釋液（含蛋白酶抑制劑），放在冰上。

? 每個IP實驗需要450 μl Dilution Buffer和2.25 μl Protease Inhibitor Cocktail II。? 測試樣品包括：陽性對照Anti-Acetyl Histone H3，陰性對照Normal Rabbit IgG，和自己實驗用的抗體。建議增加一個與自己所用抗體同源的陰性對照IgG。2、50 μl打斷的交聯(lián)好的染色質(zhì)放在冰上。

? 若用同一樣品進行多個免疫沉淀反應(yīng)，可將0.5 m樣品放在一管中進行實驗。

3、加450 μl稀釋液（含Protease Inhibitor Cocktail II）到50 μl染色質(zhì)樣品中。

4、取出5 μl（1%）上清液作為“Input”并放在4℃直到步驟D-1。

5、加入免疫沉淀抗體和20 μl混勻的protein A magnetic beads。

? 陽性對照anti-Acetyl Histone H3，5.0 μg抗體每管。

? 陰性對照Normal Rabbit IgG，5.0 μg抗體每管。

? 用戶使用的抗體和對照，每管加1~10 μg抗體每管（根據(jù)抗體效價進行調(diào)整）。6、4℃旋轉(zhuǎn)孵育1~ 4 h或過夜。

7、用magnetic separator將Protein A magnetic beads沉淀下來并除去上清。

8、用0.5 ml下列冷的緩沖液洗脫Protein A bead-antibody/chromatin complex，每次在旋轉(zhuǎn)臺上孵育3~5 min以清楚磁性，并小心的除去上清。

a、Low Salt Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-154), one washb、High Salt Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-155), one washc、LiCl Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-156), one wash

d、TE Buffer(Cat.# 20-157), one wash

D、洗脫Protein/DNA復(fù)合物和反交聯(lián)Protein/DNA復(fù)合物為單獨的DNA。

1、在室溫下解凍Proteinase K和ChIP Elution Buffer(w/o Proteinase K)，確保SDS完全溶解了。為所有的IP管和Input管準(zhǔn)備最終的的洗脫液。

? 每管用的洗脫液：100 μl ChIP Elution Buffer(不含蛋白酶K)，1 μl Proteinase K。2、62℃振蕩孵育2 h3、95℃孵育10 min。

4、將樣品冷卻至室溫。

5、用磁鐵分離beads并將上清液移到一個新的管子中。

E、DNA Purification Using Spin Columns1、取出Spin Filter到Collection Tube中。

2、加0.5 ml Bind Reagent “A”到每個100 μl的DNA樣品管中并混勻。

? 5倍體積的Bind Reagent “A”用于1倍體積的樣品，可能有沉淀，但不影響。

3、將sample/Bind Reagent “A”混合液轉(zhuǎn)移到Spin Filter中。

4、10000~15000 g（~12000 rpm）離心30 s。

5、將Collection Tube中的離心液除去。

6、將Spin Filter放回Collection Tube。

7、加500 μl Wash Reagent “B”到Spin Filter中。

8、10000~15000 g（~12000 rpm）離心30 s。

9、除去Collection Tube中的離心液。

10、把Spin Filter放回Collection Tube中。

11、10000~15000 g（~12000 rpm）離心30 s。

12、除去Collection Tube中的液體。

13、將Spin Filter放到一個干凈的Collection Tube中。

14、將50 μl Elution Buffer “C”加到Spin Filte的膜上。

15、10000~15000 g（~12000 rpm）離心30 s。

16、除去Spin Filte，洗脫液就是純化的DNA，可以用于檢測或存于-20℃。

第四篇：ChIP實驗中的細節(jié)

1、cell counting：盡量做到準(zhǔn)確，會影響input結(jié)果。

2、cross link：甲醛的終濃度是1%，這個基本所有的protocol上都會強調(diào)。

3、resuspend cells with SDS:一定要選用小的tip頭，在液面下吹打，否則很容易產(chǎn)生氣泡，后面的sonication就麻煩了。

4、sonication：ChIP中最重要的一部分，合適的條件要自己摸索，可以一次嘗試不同次數(shù)的sonication，然后建議采用EZ-ChIP上推薦的方法看看sonication的效果如何。

5、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混勻，因為salmon sperm DNA是很粘稠的物質(zhì)，若不混勻，后面你會發(fā)現(xiàn)beads的量不一樣，自然也會影響實驗的結(jié)果。

6、wash 的時候前面幾個步驟可以不用洗的太干凈，但最后一個要盡量吸干凈，必要時可用gel loading tips吸。

7、含beads的samples離心時，有的protocol上推薦是1000rpm，45秒，但可以根據(jù)情況調(diào)整，但要注意轉(zhuǎn)速不能太快防止beads破碎。（當(dāng)然如果采用的是magnetic的beads就不存在這個問題）

8、reverse crosslink可以是65°4個小時，也可以overnight。

9、reverse crosslink后的在進行下面步驟之前建議先離心，把蒸發(fā)到離心管蓋子上的部分離下來。

10、每次行real time PCR之前都要把sample離心保證取樣的準(zhǔn)確。

11、1~10ul的槍取3ul以上才比較準(zhǔn)確，所以考慮好自己PCR反應(yīng)體系的配置。

第五篇：現(xiàn)代教育技術(shù) 實驗總結(jié)

實驗報告

課題名稱：資源檢索

參與人員：12小組全體人員---指導(dǎo)老師：趙老師

實驗過程：我們小組的每個成員都按照趙老師的要求，分別查找并訪問與英語教學(xué)及師范教育相關(guān)的資源庫，且利用其提供的數(shù)字化資源學(xué)習(xí)和檢索了與本專業(yè)內(nèi)容相關(guān)的資料。我們每個成員還分別訪問了中國知網(wǎng)，并在中國知網(wǎng)上找了一些與英語教學(xué)相關(guān)的學(xué)術(shù)論文。實驗?zāi)康模菏炀氝\用數(shù)字化圖書資源

心得體會：本實驗名為信息及信息檢索，在本實驗的完成過程中，首先，我們小組的每個成員都按照要求進行了操作，基本達到了實驗?zāi)康?熟練運用數(shù)字化圖書資源)隨著因特網(wǎng)和計算機的普及，教師這個職業(yè)也不再像人們傳統(tǒng)印象中的那樣，只需要教師，黑板和粉筆等就能很好的完成教學(xué)任務(wù)，達到教學(xué)目標(biāo)?，F(xiàn)代教育對教師的要求更高。其中，運用網(wǎng)絡(luò)快速檢索有效信息變得尤為重要。

在本實驗中，我們小組每個成員利用我校數(shù)字圖書館網(wǎng)站中提供的數(shù)字資源對與英語教學(xué)有關(guān)資源在資源庫里進行了檢索。（泰克貝思師范教育專題數(shù)據(jù)庫、環(huán)球英語多媒體數(shù)據(jù)庫、超星數(shù)字圖書館）。這些數(shù)據(jù)庫提供的資源非常豐富，類別很全。我們利用這些數(shù)據(jù)庫進行查找或者檢索一些信息就非常方便快捷了。隨后，我們登錄了中國知網(wǎng)，在知網(wǎng)上檢索了一些與教育相關(guān)的學(xué)術(shù)論文，以便于日后能夠在此網(wǎng)站快速查找到所需資源。面對互聯(lián)網(wǎng)時代，信息資源的豐富化、多樣化和復(fù)雜化，從繁瑣的信息資源中獲取我們需要的信息變得尤為重要。尤其是在教師專業(yè)化的背景下，教育技術(shù)能力已經(jīng)成為教師專業(yè)能力結(jié)構(gòu)的重要組成之一。所以，掌握并熟練運用數(shù)字化圖書資源是非常重要。以上就是本小組對此次實驗的心得體會。