第一篇：PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)總結(jié)

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)總結(jié)點(diǎn)擊次數(shù)：422 作者：佚名 發(fā)表于：2008-06-15 20:53 轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來自丁香園

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PCR技術(shù)簡(jiǎn)史

一、PCR的最早設(shè)想

核酸研究已有100多年的歷史，本世紀(jì)60年代末、70年代初人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)，Korana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。

二、PCR的實(shí)現(xiàn)

1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時(shí)間。

三、PCR的改進(jìn)與完善

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點(diǎn)，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實(shí)性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環(huán)一次，仍需加入新酶。

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn)：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR廣泛的被應(yīng)用。

PCR技術(shù)的基本原理

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

（一）模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

（二）模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

（三）引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。(Plateau)。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” 這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR 擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩亍４蠖鄶?shù)情況下，平臺(tái)期的到來是不可避免的。

PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

一、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10×擴(kuò)增緩沖液10ul 4種dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug Taq DNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加雙或三蒸水至100ul

二、PCR反應(yīng)五要素

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

（一）引物

引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：

1、引物長(zhǎng)度： 15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。

3、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

5、引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

6、引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

7、引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

（二）酶及其濃度

目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。

（三）dNTP的質(zhì)量與濃度

dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。

（四）模板(靶基因)核酸

模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

（五）Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

三、PCR反應(yīng)條件的選擇

PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。

（一）溫度與時(shí)間的設(shè)置

基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100～300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

1、變性溫度與時(shí)間

變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。

2、退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。

3、延伸溫度與時(shí)間

Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。

（二）循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

PCR反應(yīng)特點(diǎn)

一、特異性強(qiáng)

PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：

（一）引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；

（二）堿基配對(duì)原則；

（三）Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；

（四）靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能

保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。

二、靈敏度高

PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(ug=-6)水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。

三、簡(jiǎn)便、快速 PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。

四、對(duì)標(biāo)本的純度要求低

不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等粗制的DNA擴(kuò)增檢測(cè)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5'端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在第一個(gè)反應(yīng)周期中，以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3'端開始延伸，其5'端是固定的，3' 端則沒有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)時(shí)，由于新鏈模板的5'端序列是固定的，這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點(diǎn)，保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加，而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加，幾乎可以忽略不計(jì)，這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測(cè)用。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

PCR產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增，其結(jié)果是否準(zhǔn)確可靠，必須對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的分析與鑒定，才能得出正確的結(jié)論。PCR產(chǎn)物的分析，可依據(jù)研究對(duì)象和目的不同而采用不同的分析方法。

一、凝膠電泳分析 PCR產(chǎn)物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。PCR產(chǎn)物片段的大小應(yīng)與預(yù)計(jì)的一致，特別是多重PCR，應(yīng)用多對(duì)引物，其產(chǎn)物片斷都應(yīng)符合預(yù)訐的大小，這是起碼條件。

（一）瓊脂糖凝膠電泳： 通常應(yīng)用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測(cè)用。

（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用于科研及檢測(cè)分析。

二、酶切分析： 根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對(duì)靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。

三、分子雜交： 分子雜交是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測(cè)PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。

（一）Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內(nèi)部寡核苷酸)標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測(cè)PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。

（二）斑點(diǎn)雜交： 將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無(wú)著色斑點(diǎn)，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。

四、核酸序列分析： 是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的最可靠方法。

PCR產(chǎn)物克隆方法

一、平端連接

通常情況下，PCR產(chǎn)物可直接與平端載體DNA進(jìn)行連接，但其連接效率效低。因?yàn)門aqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉(zhuǎn)移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個(gè)多余的堿基，使合成的PCR產(chǎn)物成為3'突出一個(gè)堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR產(chǎn)物的效率通過較高。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時(shí)，可顯著提高其連接效率。對(duì)于較短PCR產(chǎn)物，用PUS19的HincⅡ位點(diǎn)進(jìn)行克隆，以X－gal和IPTG篩選，常可得到足量重組子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出堿基將PCR產(chǎn)物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產(chǎn)物。

二、粘端連接

（一）引物中設(shè)計(jì)入限制酶位點(diǎn)

由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互補(bǔ)堿基，因此可以在兩引物的5'末端設(shè)計(jì)單限制酶或雙限制酶切位點(diǎn)。這樣得到的PCR產(chǎn)物用限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與有互補(bǔ)粘端的載體DNA重組。這種克隆方法效率較高，且當(dāng)兩引物中設(shè)計(jì)不同酶切位點(diǎn)時(shí)，可有效地定向克隆PCR產(chǎn)物。其缺點(diǎn)是需要加長(zhǎng)PCR引物，除限制酶識(shí)別序列外，還需要在其5'端多合成3-4個(gè)堿基以利于限制性內(nèi)切酶與PCR產(chǎn)物末端的穩(wěn)定結(jié)合。即使如此，其酶切效率也不夠高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等較為難切。采用突變PCR方法可克服上述缺點(diǎn)。該方法是通過在兩PCR引物序列中改變1至數(shù)個(gè)核苷酸創(chuàng)造出一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。鑒于PCR引物的3'末端序列的互補(bǔ)性是PCR成功的關(guān)鍵，在PCR引物的中部或近5'端改變1個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)PCR擴(kuò)增效果影響不大。這種方法不需要增加PCR引物的長(zhǎng)度，而且酶切效果優(yōu)于5'加端法。對(duì)于特定DNA片段的克隆，此方法較為經(jīng)濟(jì)、實(shí)用。但對(duì)于基因診斷PCR產(chǎn)物的克隆，似乎5'加端法更為適宜。

（二）T4DNA聚合回切產(chǎn)生粘端

如PCR兩引物的5'末端是A或T，則可在其5'端分別加上CG和CCGG。用此二引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物在dATP和dTTP存在的情況下，用T4DNA聚合酶進(jìn)行處理，則T4DNA聚合酶因具有3'→5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，產(chǎn)生AccI和XmaI粘性末端。此DNA片段直接與用AccI和XmaI切開的載體進(jìn)行連接。這種方法只需在PCR引物的5'端加2-4個(gè)堿基，但其可選擇的限制酶類有限。

三、T－vector法

TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3'末端加一個(gè)堿基，所加堿基幾乎全是腺苷。據(jù)此，Marchuk等人采用3'端突出一個(gè)胸苷的質(zhì)粒DNA來克隆PCR產(chǎn)物，其克隆效率比平端的連接至少高出100倍。他們用EcoRV將pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的兩個(gè)3'末端各加一處胸苷。因?yàn)樵?種dNTP都存在時(shí)，Taq聚合酶選擇性參入dATP，而當(dāng)僅一種dNTP存在時(shí)，它只能參入該種堿基。因此，在只加入ddTTP時(shí)，用TaqDNA聚合酶可使平端載體DNA轉(zhuǎn)變成3'末端突出一個(gè)胸苷的T尾載體，稱為T－vector。用這種T－vectorsk可以較有效地直接克隆PCR產(chǎn)物。Hotton等人也報(bào)道了另一種制備T－vector的方法。他們使用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶在切成平端的載體DNA的3'末端加上一個(gè)胸苷。由于末端轉(zhuǎn)移酶可以催化多個(gè)堿基（ddTTP）作為底物，使平端載體DNA分子的兩個(gè)3'末端各加上一個(gè)T。用這種方法制備的T－vector的不同之處在于前者3'末端不能與待克隆PCR產(chǎn)物的5'末端連接，僅5'末端可與PCR產(chǎn)物的3'末端形成磷酸二脂鍵。

四、共環(huán)消解法

最近，Jung等人報(bào)道了一種有效的PCR產(chǎn)物克隆方法。用磷酸化的PCR引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，先用T4DNA連接酶催化連接反應(yīng)，使5'端帶有限制酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增DNA片段連接成共環(huán)結(jié)構(gòu)。然后再用相應(yīng)的限制酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生粘端DNA片段。對(duì)于對(duì)稱性限制酶位點(diǎn)，只需在引蛾的5'末端加上一關(guān)識(shí)別序列，因?yàn)樵诖映晒箔h(huán)后能恢復(fù)限制酶切位點(diǎn)難于切開的缺點(diǎn)，且可用于雙限制酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，只不過有PCR產(chǎn)物共環(huán)化后，僅約1/4的限制酶切點(diǎn)得以恢復(fù)。故此法較適用于單限制酶位點(diǎn)的克隆。

五、無(wú)連接酶亞克隆法

無(wú)連接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5'末端附加堿基修飾法，修飾堿基不是酶切位點(diǎn)，而是與某一質(zhì)粒兩端分別互補(bǔ)的堿基。兩引物的3'端約20-25個(gè)核苷酸分別與待擴(kuò)增DNA兩翼互補(bǔ)，5'端各有約24個(gè)核苷酸分別與線性化質(zhì)粒的3'端相同的附加序列。由于線性化質(zhì)粒的3'端序列各不相同，PCR片段可以通過選擇各引物的合適5'附加序列與引物3'端定向雜交。由此物a和b產(chǎn)生的兩端有附加序列的PCR產(chǎn)物與未反應(yīng)引物分離后，分別加入兩只含有線性化質(zhì)粒的反應(yīng)管中進(jìn)行第二次PCR。第1管中用引物a和c，引物a即為第一PCR擴(kuò)增的上游引物a，引物c為下游引物，與緊鄰5'端附加序列內(nèi)測(cè)的質(zhì)粒（+）鏈互補(bǔ)。同樣，第2管的引物為b和d，引物b與第一次PCR擴(kuò)增的下游引物b相同，引物d為上游引物，與緊鄰5'附加序列內(nèi)側(cè)的質(zhì)粒（-）鏈互補(bǔ)。

第二次PCR的第一循環(huán)中，PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒均變性與復(fù)性。除自身復(fù)性產(chǎn)物（這種復(fù)性產(chǎn)物不被擴(kuò)增）外，PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒可通過各自3'端互補(bǔ)序列雜交成部分異源雙鏈，延伸時(shí)，重疊的3'端互為此物沿各自互補(bǔ)鏈延伸，結(jié)果可產(chǎn)生PCR片段與線性質(zhì)粒的“連接”。然后兩管中PCR擴(kuò)增各進(jìn)行15-20個(gè)循環(huán)。這便可產(chǎn)生大量一端管1）或另一端連接有PCR插入片段的質(zhì)粒。第二次PCR后將第1管與第2管反應(yīng)液混合，用堿變性雙鏈，中和后稀釋變性的DNA。反應(yīng)管中的單鏈DNA可以復(fù)性或幾種不同的產(chǎn)物，除各自本身復(fù)性產(chǎn)物外，管1產(chǎn)物ssDNA與管2中ssDNA可形成部分異源雙鏈DNA，并各自有一較長(zhǎng)的5'或3'懸端，這種長(zhǎng)的5'或3'懸端相互互補(bǔ)，在低DNA濃度時(shí)可復(fù)性產(chǎn)生環(huán)化DNA。

盡管這種環(huán)化的DNA有兩個(gè)缺口，但它們可以直接用來轉(zhuǎn)化受體大腸直桿菌。一旦進(jìn)入體內(nèi)，兩個(gè)缺口便共價(jià)連接，修復(fù)的質(zhì)粒即可復(fù)制，下面以從λ噬菌體DNA中擴(kuò)增-500bp片段，并克隆入pGem4Z載體中為例說明LFS法。

這種方法同樣適于復(fù)雜基因組中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR時(shí)兩引物的5'附加序列不應(yīng)太短以免影響第二次PCR時(shí)異源雙鏈的形成，以24個(gè)核苷酸較為合適。擴(kuò)增時(shí)若形成，引物二聚體，一定要去除，否則會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)化率。用LFS法已成功地克隆了長(zhǎng)達(dá)1.7kb的基因片段。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：①可用于常規(guī)方法無(wú)法進(jìn)行亞克隆的片段；②適于任何PCR產(chǎn)物和任何質(zhì)粒；③可亞克隆特殊目的（如含點(diǎn)突變、缺失或插入等）片段；④在某些情況下，對(duì)已構(gòu)建了啟動(dòng)子或增強(qiáng)子等序列的載體，可使待表達(dá)片段插入定向合適位置；⑤較快，可在1d內(nèi)完成，較常規(guī)方法可靠，不需DNA連接酶。

DNA克隆是分子生物學(xué)的重要內(nèi)容。特定基因的克隆常因兩端缺乏合適限制酶切點(diǎn)而受因，cDNA的克隆通常也效率不高、篩選因難。采用PCR技術(shù)行DNA和cDNA的克隆，則可大大縮短克隆時(shí)間，比之全基因合成更為經(jīng)濟(jì)和方便，因而愈來愈受重視。用PCR方法進(jìn)行傳染性疾病和遺傳性疾病的診斷常遇到產(chǎn)物的異性問題和分型問題，采用產(chǎn)物克隆和測(cè)序方法，比之寡核苷酸探針雜交方法更為準(zhǔn)確。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展和推廣，新的PCR產(chǎn)物的克隆方法也將不斷出現(xiàn)。

PCR基礎(chǔ)的檢測(cè)工具的優(yōu)缺點(diǎn)

首先，PCR反應(yīng)是快速的。整個(gè)DNA提取，擴(kuò)增和檢測(cè)的過程通常少于6小時(shí)，如果反應(yīng)利用嵌套的引物，過程可能長(zhǎng)些。對(duì)于一些樣本來說，比如來自糞便和表皮，就需要在DNA提取中增加步驟。這樣就延長(zhǎng)了整個(gè)檢測(cè)的時(shí)間到14小時(shí)。

用購(gòu)買的核苷酸提取工具就能縮短檢測(cè)時(shí)間，機(jī)械進(jìn)行提取，使PCR方案最優(yōu)化或使用加快熱循環(huán)技術(shù)。有了優(yōu)化的樣本，快速提取和光循環(huán)熱循環(huán)，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間能縮短到2小時(shí)。但通常是6-8小時(shí)。

于培養(yǎng)基基礎(chǔ)的方法2-5天的時(shí)間相比較，這是巨大的進(jìn)展了。這也比一些需要有精確計(jì)算結(jié)果的培養(yǎng)基濃縮的抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)要快。當(dāng)購(gòu)買的實(shí)用抗體基礎(chǔ)的檢測(cè)工具比PCR基礎(chǔ)的方法快時(shí)，大部分這樣的化驗(yàn)只能用于非常有限的生物體上。

第二，PCR不需要培養(yǎng)。這是與PCR基礎(chǔ)的檢測(cè)的速度密切相關(guān)的。既然PCR是十分靈敏的（少到10 cfus的樣本就能被檢測(cè)），培養(yǎng)通常是沒必要的。大多數(shù)最新的實(shí)用PCR檢測(cè)工具需要有選擇性的濃縮，特別是當(dāng)樣本包括大量的PCR抑制劑時(shí)。用核苷酸提取方法能夠避免培養(yǎng)，核苷酸提取方法產(chǎn)生了PCR質(zhì)量的DNA并且優(yōu)化了PCR反應(yīng)。如果在大量樣本中檢測(cè)少量的病原體或者病源有機(jī)體在PCR靈敏度的極限以下的情況下，將需要使用培養(yǎng)。在一般情況下，使用培養(yǎng)的情況是很少的，去除了培養(yǎng)的步驟，時(shí)間將被節(jié)省下來。

比節(jié)省時(shí)間更重要的是，去除了培養(yǎng)，那些難以或不能培養(yǎng)的生物體就可以進(jìn)行檢測(cè)。這些生物體包括某種病毒、真菌、厭氧性生物和支原體。

第三，PCR的花費(fèi)合理。與培養(yǎng)或抗體基礎(chǔ)的化驗(yàn)相比，PCR基礎(chǔ)的診斷是十分經(jīng)濟(jì)的?？紤]到細(xì)菌的培養(yǎng)，有較昂貴的花費(fèi)。大多數(shù)樣本為了正確的鑒定需要培養(yǎng)和重復(fù)培養(yǎng)。這需要大量的手工時(shí)間（加上化驗(yàn)的花費(fèi)），也增加了污染的危險(xiǎn)。

作為比較，大多數(shù)抗體化驗(yàn)所需的手工時(shí)間很少但化驗(yàn)本身很昂貴。

PCR反應(yīng)的成分（引物，酶，dNTPs和緩沖液）的花費(fèi)比每次化驗(yàn)的花費(fèi)少40%，而反應(yīng)的時(shí)間包括核苷酸分離，通常在一小時(shí)以內(nèi)。當(dāng)然這依賴于樣本、技術(shù)員和用于分離核苷酸的技術(shù)。既然PCR所用的時(shí)間少，它的花費(fèi)也少。

但是，PCR需要熱循環(huán)，UV來源和一些類型的圖象捕獲裝置，因此PCR實(shí)驗(yàn)室的最初花費(fèi)是很高的。

這里討論另外一些在臨床領(lǐng)域的PCR使用的基本原理

第一，PCR不是抗原基礎(chǔ)的。

抗體基礎(chǔ)的檢測(cè)工具（ELISA和其他）不僅檢測(cè)直接抗病原體的人類抗體，而且能檢測(cè)病原體上的表面抗原。人類抗體檢測(cè)工具因此需要免疫反應(yīng)的存在，以及在正確檢測(cè)抗原存在之前抗體濃度的測(cè)定。在新近感染的情況下，這種測(cè)試不能檢測(cè)針對(duì)病原體的人類抗體，可能不能正確反映是否有感染。事實(shí)上，被感染的病人，沒有充足的時(shí)間來提高用于檢測(cè)的濃度。這是HIV抗體基礎(chǔ)檢測(cè)的通常的問題。由于相同的原因，這種類型的測(cè)試對(duì)檢測(cè)無(wú)免疫應(yīng)答患者的病原體存在困難。反過來講，抗體基礎(chǔ)的測(cè)試也會(huì)給出錯(cuò)誤相反的結(jié)果。

然而抗體基礎(chǔ)的檢測(cè)最大的問題是它不能檢測(cè)新的病原體亞型，由于表面抗原發(fā)生改變，而導(dǎo)致了錯(cuò)誤的陰性結(jié)果。（PCR基礎(chǔ)的檢驗(yàn)也可能由于DNA的變化、突變而遇到相似的問題。但PCR基礎(chǔ)的檢驗(yàn)?zāi)軌蜻M(jìn)行設(shè)計(jì)，使這些錯(cuò)誤的陰性結(jié)果最小化。）盡管有這些缺點(diǎn)，抗原基礎(chǔ)的檢測(cè)工具是十分重要的檢測(cè)方法，在大多數(shù)情況下比PCR檢測(cè)要迅速。

第二，檢驗(yàn)易按客戶的要求設(shè)置，以適合特殊的需要

通過簡(jiǎn)單使用不同的特殊目標(biāo)引物，工具能迅速設(shè)計(jì)，用于許多檢測(cè)。

第三，PCR容易使用，是由時(shí)間證實(shí)的技術(shù)

通過使用有商業(yè)價(jià)值的核苷酸提取產(chǎn)物，用于病原體檢測(cè)的樣本能在少于十分鐘的時(shí)間內(nèi)被例行操作。一旦進(jìn)行操作，樣本被加入反應(yīng)體系中，進(jìn)入熱循環(huán)。反應(yīng)完成后，樣本能被自動(dòng)系統(tǒng)或凝膠電泳所分析。

少數(shù)的PCR檢測(cè)將能完全自動(dòng)化。儀器將進(jìn)行所有操作，從樣品的準(zhǔn)備到分析結(jié)果。這樣的系統(tǒng)將十分昂貴，可能只能適應(yīng)制造商的平臺(tái)。這對(duì)大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室無(wú)吸引力，但當(dāng)價(jià)格下降后，將最終使PCR診斷自動(dòng)化。

第二篇：PCR實(shí)驗(yàn)常見問題

【實(shí)驗(yàn)】PCR常見問題總結(jié)

作者: gene121(站內(nèi)聯(lián)系TA)發(fā)布: 2005-07-04 PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。一.假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。1假陽(yáng)性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。

引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。2出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。3出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。二.PCR污染與對(duì)策

PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。污染原因

(一)標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。

還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.(四)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測(cè)

一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。對(duì)照試驗(yàn)

1.陽(yáng)性對(duì)照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下)，但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。

2.陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

3.重復(fù)性試驗(yàn)

4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 防止污染的方法

(一)合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

(三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。

(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。

(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。

(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

第三篇：pcr檢測(cè)技術(shù)

《食品安全學(xué)》綜述

PCR快速檢測(cè)技術(shù)綜述

1．前言

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，是肉眼能直接觀察和判斷；可從一根頭發(fā)、一滴血、甚至一個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測(cè)鑒定。過去幾天幾個(gè)星期才能做到的事情，用PCR幾個(gè)小時(shí)便可完成。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。

該酶促反應(yīng)最基本的3個(gè)環(huán)節(jié)是：[1]模板DNA的變性，即在94℃下模板雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA；[2]引物與模板鏈的特異性復(fù)性；[3]引物鏈的延伸。

2.研究的目的與意義

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)建立以來，定性技術(shù)不斷改進(jìn)和完善，可以達(dá)到檢測(cè)單個(gè)靶序列的水平、但實(shí)際工作中常需要定量檢測(cè)標(biāo)本中核酸，而不是某一特定序列存在與否，借助PCR對(duì)基因快速、敏感、特異而準(zhǔn)確定量成為目前分子生物學(xué)技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。定量PCR旨在評(píng)估樣品中靶分子數(shù)，此測(cè)定可以是絕對(duì)的，如每微克樣本中靶DNA的分子數(shù)；也可以是相對(duì)定量，即與設(shè)定的內(nèi)參照或外參照比較而言。鑒于PCR方法主要有5個(gè)，即對(duì)PCR產(chǎn)物的直接定量、極限稀釋法、靶基因與參照基因的同步擴(kuò)增、競(jìng)爭(zhēng)性PCR和熒光定量PCR[1]。這幾種放啊各有利弊，對(duì)其選擇取決于靶基因的特性、對(duì)PCR產(chǎn)量的期望值、對(duì)準(zhǔn)確度的要求、需要相對(duì)還是絕對(duì)定量。

人類對(duì)于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀(jì)60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術(shù)。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想。但是，當(dāng)時(shí)的基因序列分析方法尚未成熟，對(duì)熱具有較強(qiáng)穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動(dòng)合成階段，這種想法似乎沒有任何實(shí)際意義。

1985年，美國(guó)科學(xué)家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過兩年的努力，發(fā)明了PCR技術(shù)，并在Science雜志上發(fā)表了關(guān)于PCR技術(shù)的第一篇學(xué)術(shù)論文。從此，PCR技術(shù)得到了生命科學(xué)界的普遍認(rèn)同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

但是，最初的PCR技術(shù)相當(dāng)不成熟，在當(dāng)時(shí)是一種操作復(fù)雜、成本高昂、“中看不中用”的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)。1988年初，Keohanog通過對(duì)所使用的酶的改進(jìn)，提高了擴(kuò)增的真實(shí)性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術(shù)的擴(kuò)增效率大大提高。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術(shù)得到了廣泛地應(yīng)用，使該技術(shù)成為遺傳與分子生物學(xué) 分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進(jìn)：它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測(cè)定；從原先只能擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到目前已能擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合，成為反轉(zhuǎn)錄PCR，將PCR與抗體等相結(jié)合就成為免疫PCR等。3.國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

3.1.基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用

目前從事分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說幾乎沒有一個(gè)分子生物學(xué)家沒有使用過PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法，可用于達(dá)到以下目的：

[1] 擴(kuò)增目的基因和鑒定重組子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表達(dá)調(diào)控的研究； [4]基因組測(cè)序； [5]制備單鏈模板； [6]致突變；

3.2.PCR在臨床上的應(yīng)用[2]

[1]在遺傳學(xué)上的應(yīng)用：人類的遺傳性疾病是因?yàn)槟骋粔A基序列發(fā)生了突變，使之缺失或形成某一限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，通過PCR結(jié)合限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），就可以從基因的水平對(duì)遺傳性疾病進(jìn)行分析。例如，血友病甲是一種常見的遺傳性出血性疾病，患者體內(nèi)缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個(gè)外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發(fā)生了突變，產(chǎn)生了一個(gè)新的PstI酶切點(diǎn)，因此可以使用PCR-RFLP對(duì)血友病進(jìn)行診斷。PCR還可以用來檢測(cè)遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。

[2]在腫瘤研究中的應(yīng)用：PCR已日益廣泛應(yīng)用于腫瘤的病因與發(fā)病機(jī)理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。例如，差異顯示PCR技術(shù)能針對(duì)不同腫瘤尋找其特異而敏感的標(biāo)志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預(yù)后及療效評(píng)估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時(shí)可結(jié)合定量PCR技術(shù)檢測(cè)微小殘留病灶，以進(jìn)一步改進(jìn)治療方案。此外，由于癌癥的發(fā)生在一定意義上是單個(gè)細(xì)胞分子發(fā)生變化，因而可以使用單細(xì)胞PCR技術(shù)對(duì)癌癥的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究。[3]在基因分型中的應(yīng)用：當(dāng)進(jìn)行器官移植時(shí)并須先組織配型工作，此時(shí)常應(yīng)用序列特異性寡核苷酸多態(tài)性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）對(duì)人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）進(jìn)行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性也可以用于對(duì)HLA的分型。3．3.在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[3]

例如：最早應(yīng)用DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性結(jié)合PCR-RFLP來進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。目前發(fā)現(xiàn)在真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在個(gè)體間存在著差異，因此可以使用短串聯(lián)重復(fù)PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析。使用PCR技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)鑒定的優(yōu)點(diǎn)是樣品用量小并且適于對(duì)高度降解材料的檢測(cè)。除剛才提到的之外，可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。所以，綜上所述，PCR的確是一種分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)。在它30多年的發(fā)展中衍生出了諸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術(shù)方法。PCR技術(shù)可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面?？梢哉f，PCR已經(jīng)滲透到了生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。21世紀(jì)是生物工程的世紀(jì)。我相信，在今后的發(fā)展中PCR技術(shù)會(huì)不斷地得到擴(kuò)充和完善，PCR技術(shù)也將4.相關(guān)檢測(cè)技術(shù) 4.1.技術(shù)原理

DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動(dòng)子的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫下也能發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計(jì)引物做啟動(dòng)子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡(jiǎn)捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。4.2.工作原理

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR 擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍 4.3.工作步驟

標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度 5.研究方案

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對(duì)DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會(huì)，具有極高的使用價(jià)值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡(jiǎn)便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。5.1研究方法

① 早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對(duì)低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長(zhǎng)期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無(wú)法檢出，可以用PCR法檢出。

③ 療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測(cè)乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過程中通過監(jiān)測(cè)血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動(dòng)態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測(cè)定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無(wú)法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽(yáng)性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動(dòng)態(tài)變化與病人病情無(wú)線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測(cè)出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動(dòng)態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對(duì)樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡(jiǎn)化操作，而且又減少污染，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。國(guó)內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長(zhǎng)期存在于血清中。在PCR檢測(cè)時(shí)，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國(guó)胃炎發(fā)病率之高估計(jì)比乙型肝炎更嚴(yán)重，對(duì)HP的檢測(cè)應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對(duì)HP的檢測(cè)可以用生化法測(cè)試尿素酶或用免疫法測(cè)試血清中對(duì)HP特異性抗體，也可對(duì)胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測(cè)HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，5.2.技術(shù)路線

PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速、簡(jiǎn)便、可擴(kuò)增RNA或cDNA、對(duì)起始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)。5.3.所用儀器與材料

引物: PCR產(chǎn)物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。由于存在同源序列，隨意設(shè)計(jì)的引物鏈，其PCR產(chǎn)物在電泳分析時(shí)可能出現(xiàn)多條鏈，因此在設(shè)計(jì)引物鏈時(shí)應(yīng)充分考慮引物特異性。引物長(zhǎng)度一般為15-30個(gè)堿基,G+C含量為40-60%,濃度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：濃度為1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶單位用量增長(zhǎng)可能導(dǎo)致非特異DNA擴(kuò)增。模板DNA：應(yīng)避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結(jié)合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、堿變性法、SDS裂解法等多種。

4×dNTPs ： dNTP儲(chǔ)存液pH應(yīng)為7.0，在反應(yīng)體系中，4種dNTP的濃度應(yīng)相同，每種dNTP的濃度以50-200 umol/L為宜。緩沖液及其他成份：PCR反應(yīng)體系中，一般采用Tris-HCl緩沖液。適宜的Mg2+濃度為高于dNTP總濃度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究?jī)?nèi)容

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個(gè)內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫(kù)中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識(shí)別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時(shí)或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對(duì)極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。6．1.檢測(cè)對(duì)象

常見的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國(guó)具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。[4]乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長(zhǎng)期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測(cè)血清中的乙肝病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能 6．2檢測(cè)內(nèi)容

PCR反應(yīng)混合物經(jīng)過循環(huán)擴(kuò)增后，所需做的工作就是檢測(cè)反應(yīng)液中是否存在預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物及產(chǎn)物的特異性。目前已經(jīng)發(fā)展了許多檢測(cè)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析、核酸序列分析。

PCR技術(shù)類型[5]

免疫PCR技術(shù) 原位PCR技術(shù) 不對(duì)稱PCR技術(shù) 巢式PCR技術(shù) 反向PCR技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

復(fù)合PCR技術(shù)

彩色PCR技術(shù)

抗原捕獲PCR技術(shù) 增敏PCR技術(shù)

酶標(biāo)PCR技術(shù)

二溫式PCR技術(shù)

錨定PCR技術(shù)

定量PCR技術(shù)

毛細(xì)管PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)

巢式或套式PCR技術(shù) 7.預(yù)期目標(biāo)PCR 技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中

（1)簡(jiǎn)單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,擴(kuò)增產(chǎn)物為633bp的DNA片段。其退火溫度為60℃－63℃, 應(yīng)用煮沸法與基因釋放法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測(cè)時(shí)間為3h。Thomas等用PCR擴(kuò)增了slt基因片段。引物： 正鏈5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反鏈5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR產(chǎn)物由凝膠電泳測(cè)定,檢測(cè)時(shí)間為ld。

徐建國(guó)等根據(jù)O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設(shè)計(jì)了PCR引物,產(chǎn)物為338bp。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中（2）多重PCR:由于鑒定O157: H7血清型不能僅僅依靠簡(jiǎn)單PCR,近年來國(guó)外學(xué)者對(duì)多重PCR方法在大腸桿菌O157: H7的診斷價(jià)值方面進(jìn)行了研究。Meng等同時(shí)擴(kuò)增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長(zhǎng)度分別為633、210、484bp。此引物設(shè)計(jì)可有效區(qū)別O157: H7血清型與O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一個(gè)單一反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質(zhì)粒保守序列,其產(chǎn)物分別為1087、227、224、166bp。嚴(yán)笠選用針對(duì)大腸桿菌O157: H7志賀樣毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三對(duì)引物,在同一擴(kuò)增體系中進(jìn)行PCR,檢測(cè)12株不同來源的O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌、志賀菌15株。結(jié)果復(fù)合PCR方法較單一PCR方法具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩(wěn)定、可靠的陽(yáng)性結(jié)果。能迅速、有效地與其它致病性大腸桿菌及沙門氏菌、志賀菌相鑒別。

PCR技術(shù)在大腸桿菌O157: H7檢測(cè)中的應(yīng)用（3）原位PCR: kurokawa等不用培養(yǎng)過程,直接用原位PCR技術(shù)結(jié)合落射顯微鏡,在單細(xì)胞水平快速檢測(cè)O157: H7。

4.23SrRNA在大腸桿菌O157: H7分型、檢測(cè)中

傳統(tǒng)的細(xì)菌分類方法主要依賴于細(xì)菌的形態(tài)學(xué)、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等特征。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，微生物檢測(cè)進(jìn)入了基因時(shí)代，以核糖體核糖核酸序列為基礎(chǔ)的分類方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學(xué)方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA區(qū)間序列分析等等，它完全不同于傳統(tǒng)方法，具有快速、簡(jiǎn)便、敏感和特異等優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

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[2] 徐煥賓,賁昆龍,曾濤,李勁光;檢測(cè)HIV-1載量的熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)的建立及其應(yīng)用[J];中國(guó)病毒學(xué);2001年02期

[3] 顧鳴，韓偉.復(fù)合PCR鑒定沙門菌的方法.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志[J]，2003，13(2):154-157 [4] 冉陸.腸出血性大腸埃希菌(EHEC)流行趨勢(shì).中國(guó)食品衛(wèi)生雜志[J]，1999，3:31-35 [5] 石嵐;實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)IgH基因重排的研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2004年 [6] 王穎.食品安全學(xué)技能訓(xùn)練.2010.10

第四篇：PCR技術(shù)原理及心得.

PCR技術(shù)原理與心得體會(huì)

PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)時(shí)間一般為48h以內(nèi),有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè),大于48h 后帶型不規(guī)則甚致消失。

一.假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板:①模板中含有雜蛋白質(zhì),②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時(shí)丟失過多,或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時(shí)使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。

引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增,對(duì)策為:①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無(wú)條帶,此時(shí)做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長(zhǎng)度不夠,引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。

反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul后,再做大體積時(shí),一定要模索條件,否則容易失敗。

物理原因:變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時(shí)間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測(cè)一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。

二.假陽(yáng)性,出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶 1.假陽(yáng)性

出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR 擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。

靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決:①操作時(shí)應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時(shí),在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片

段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽(yáng)性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。

2.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR 循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有:①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸。

3.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有:①減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當(dāng)降低Mg2+濃度。④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。

三.PCR污染與對(duì)策

PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛 的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。污染原因

(一標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。

(二PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.(三PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題,因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染,就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。

還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝,因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題.(四實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室,這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力,其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測(cè)

一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室,要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè),考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。

四.對(duì)照試驗(yàn)

1.陽(yáng)性對(duì)照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照,它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本,如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照,其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下,但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本,其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí),在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。

2.陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對(duì)照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。②試劑對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

3.重復(fù)性試驗(yàn)

4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 五.防止污染的方法

(一合理分隔實(shí)驗(yàn)室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行,特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開。最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實(shí)驗(yàn)用品及吸樣槍應(yīng)專用,實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

(二吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板

核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免 交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。(三預(yù)混和分裝 PCR 試劑:所有的 PCR 試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR 反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR 試劑，PCR 反應(yīng)液應(yīng)與樣品及 PCR 產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。(四防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使 用。(五設(shè)立適當(dāng)?shù)年?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最 低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一 管不加模板的試劑對(duì)照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對(duì)照。(六減少 PCR 循環(huán)次數(shù)，只要 PCR 產(chǎn)物達(dá)到檢測(cè)水平就適可而止。(七選擇質(zhì)量好的 Eppendorf 管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。呵呵 其實(shí) DNA（或 RNA）的提取方法及 DNA 的質(zhì)量也很關(guān)鍵 例如：SDS 法和 CTAB 法提取的 DNA 與 RNA 的 PCR 結(jié)果有很大的差異的。呵呵。

第五篇：PCR實(shí)驗(yàn)中的幾點(diǎn)體會(huì)

PCR實(shí)驗(yàn)中的幾點(diǎn)體會(huì)

PCR實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)對(duì)儀器設(shè)備、環(huán)境設(shè)施及操作步驟要求非常嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中檢測(cè)目的成份會(huì)被擴(kuò)增放大到千百萬(wàn)倍。因而實(shí)驗(yàn)過程中很小的一點(diǎn)誤差、非常微量的污染都可能導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤甚至實(shí)驗(yàn)失敗。我們?cè)趯?shí)際工作中，從環(huán)境控制到儀器維護(hù)及工作流程的每一步做到嚴(yán)格要求細(xì)致入微，樣本檢測(cè)、室內(nèi)質(zhì)控及室間質(zhì)評(píng)都取得了滿意成績(jī)，在此次PCR實(shí)驗(yàn)室復(fù)審中得到專家老師的肯定，現(xiàn)將我們?cè)诠ぷ髦姓J(rèn)為需地注意的地方提出來，以供商榷：

一、環(huán)境控制 為控制溫度而使用空調(diào)時(shí)必須特別注意避免污染。我們的做法是清潔空調(diào)過濾網(wǎng)，待干，紫外線消毒30分鐘，正反面相同。開機(jī)之前用1：100“84”消毒液浸濕的紗布包住出風(fēng)口，運(yùn)行30分鐘，使吸附空調(diào)機(jī)內(nèi)的灰塵。

二、試劑配制

所有的試劑都盡可能平衡到室溫后再使用。HBV-DNA檢測(cè)中的濃縮液及質(zhì)控物，融化后定量分裝離心管中，一次用不完的凍存到下次使用，避免反復(fù)凍融。

三、樣本制備

吸取上清液 吸頭不要接觸到離心管內(nèi)壁，盡量在離心管中央，懸停在液面下隨液面下降而逐漸下移，盡量吸凈上清液。

沉淀處理 HBV-DNA濃縮過程中的沉淀，用振蕩器很難完全分散也可能影響核酸的提取，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低。我們的做法是用一只小鑷子輕敲離心管底部使沉淀盡可能分散，充分混勻，然后點(diǎn)離一下。

提取 提取液是一種混懸液，易沉淀，加取過程中要不斷抽吸混勻。加樣 核酸的提取液2ul加入反應(yīng)管中，這一步移液器使用非常關(guān)鍵。首先保證移液器和吸頭是配套的，再就是吸頭是垂直于液面吸取樣本，移液時(shí)用力要均勻，盡可能一次性移出全部樣本。2ul移液器校正困難，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不好時(shí)，可以考慮是否是移液器使用時(shí)間過久，應(yīng)該及時(shí)更換。

四、擴(kuò)增分析 擴(kuò)增儀最好先預(yù)熱一下，再使用。擴(kuò)增開始后應(yīng)注意觀察溫度曲線。不符合溫度變化規(guī)律的曲線如升溫曲線變得平坦提示儀器部分或全部加熱模塊功能損壞，從而導(dǎo)致結(jié)果錯(cuò)誤。在結(jié)果判定時(shí)應(yīng)注意分析擴(kuò)增曲線，曲線出現(xiàn)倒“S”形，常提示病毒含量較高，必須稀釋后復(fù)查。