第一篇：生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)心得

姓名：吳伙福

學(xué)號(hào)：11120222

班級(jí)：11（生）2

實(shí)驗(yàn)心得體會(huì)

我覺(jué)得生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)它的目的在于鍛煉我們的實(shí)際動(dòng)手能力，讓我們熟悉各種儀器的使用及實(shí)驗(yàn)的各種規(guī)范操作。我認(rèn)為要想學(xué)好這門(mén)實(shí)驗(yàn)課，首先，在做實(shí)驗(yàn)前，一定要事先對(duì)將要做的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行預(yù)習(xí)，記下有疑問(wèn)或不懂得地方，因?yàn)檫@是做實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，否則，在老師講解時(shí)就會(huì)聽(tīng)不懂，這將使你在做實(shí)驗(yàn)時(shí)的難度加大,浪費(fèi)做實(shí)驗(yàn)的寶貴時(shí)間。比如做蛋白質(zhì)的水解和氨基酸的紙層析法分離的實(shí)驗(yàn)，你要清楚水解蛋白質(zhì)的方法和紙層析的基本技術(shù)，如果你不清楚，在做實(shí)驗(yàn)時(shí)才去摸索，這將使你極大地浪費(fèi)時(shí)間,使你事倍功半。做實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要親力親為，務(wù)必要將每個(gè)步驟，每個(gè)細(xì)節(jié)弄清楚，弄明白實(shí)驗(yàn)后，還要復(fù)習(xí)思考，這樣你的印象才深刻，記得才牢固，否則，過(guò)后不久你就會(huì)忘得一干二凈，這還不如不做。做實(shí)驗(yàn)時(shí)，老師還會(huì)根據(jù)自己的親身體會(huì)，將一些課本上沒(méi)有的知識(shí)教給我們，拓寬我們的眼界，使我們認(rèn)識(shí)到這門(mén)課程在生活中的應(yīng)用是那么的廣泛。

通過(guò)那些實(shí)驗(yàn)，使我學(xué)到了不少實(shí)用的知識(shí)，更重要的是，做實(shí)驗(yàn)的過(guò)程，思考問(wèn)題的方法，這與做其他的實(shí)驗(yàn)是通用的，真正使我們受益匪淺。在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中我培養(yǎng)自己的獨(dú)立分析問(wèn)題，和解決問(wèn)題的能力。不在像以前做實(shí)驗(yàn)?zāi)菢雍茈S便，總是抱著等老師教你怎么做，拿同學(xué)的報(bào)告去抄。盡管你成績(jī)也許會(huì)很高，但對(duì)將來(lái)是不利的。我覺(jué)得實(shí)驗(yàn)課還是有必要認(rèn)真去學(xué)的，很多東西也許你現(xiàn)在覺(jué)得沒(méi)用，但是它可能潛移默化的影響著你。

最后我覺(jué)得老師的指導(dǎo)也是很有必要的，學(xué)生們必然會(huì)有問(wèn)題，老師偶爾的啟發(fā)就可能讓同學(xué)豁然開(kāi)朗。但是更多的還是得靠我們自己，我們也要注意與老師互動(dòng)，這樣才會(huì)使我們不僅能學(xué)好實(shí)驗(yàn)課也能增進(jìn)與老師的感情。

第二篇：生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)心得體會(huì)

生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)心得體會(huì)

基因克隆技術(shù)是分子生物學(xué)的核心技術(shù)，其目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝，用于深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，并可達(dá)到人為改造細(xì)胞以及物種遺傳性狀的目的。本論文主要從以下幾個(gè)方面來(lái)介紹基因克隆技術(shù)：目的基因的獲得、目的基因和載體的連接、重組分子的擴(kuò)增和鑒定。

可概括為∶分、切、連、轉(zhuǎn)、選?！胺帧笔侵阜蛛x制備合格的待操作的DNA，包括作為運(yùn)載體的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特異的限制性內(nèi)切酶切開(kāi)載體DNA，或者切出目的基因；“連”是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來(lái)，形成重組的DNA分子；“轉(zhuǎn)”是指通過(guò)特殊的方法將重組的DNA分子送入宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增；“選”則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個(gè)體。基因克隆技術(shù)包括把來(lái)自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達(dá)，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。

一.目的基因的獲得

目的基因是指所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因。獲得目的基因是分子克隆過(guò)程中最重要的一步?；蚬こ塘鞒痰牡谝徊骄褪谦@得目的DNA片段,。所需目的基因的來(lái)源, 不外乎是分離自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化學(xué)合成法、cDNA法及建立基因文庫(kù)的方法來(lái)篩選

PCR方法

PCR 是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火（復(fù)性）及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。它不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷或任何有DNA,RNA的地方。

化學(xué)合成法制備基因片段

采用DNA合成儀，對(duì)目的基因進(jìn)行分段合成，然后進(jìn)行連接，可以得到所需的目的基因。

二、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

DNA體外重組是將目的基因在DNA連接酶作用下，連接到合適的載體DNA上，以便下一步轉(zhuǎn)化之用。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12～16℃，連接12～16h（過(guò)夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

三、重組分子的擴(kuò)增和鑒定

重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞

目的基因和載體在體外連接形成重組DNA分子后，需要被導(dǎo)入受體細(xì)胞中才能進(jìn)行增殖和（或）表達(dá)。受體細(xì)胞是重組基因增殖的場(chǎng)所，所以對(duì)受體細(xì)胞也應(yīng)具有幾點(diǎn)要求：①容易接納重組DNA分子；②對(duì)載體的復(fù)制擴(kuò)增無(wú)嚴(yán)格限制；③不存在特異的能降解外源DNA的內(nèi)切酶體；④不對(duì)外源DNA進(jìn)行修飾。一般將重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化，而導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)染。將重組DNA分子和感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞相混合，使重組DNA分子進(jìn)入大腸桿菌中，就可以實(shí)現(xiàn)重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。

重組DNA分子的鑒定

重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后是否得到擴(kuò)增，擴(kuò)增后的重組DNA分子是否正確，導(dǎo)入的重組DNA分子是否含有正確的插入片段，重組DNA分子能否表達(dá)插入的目的基因，一般可以采用X-gal篩選的方法對(duì)重組DNA分子進(jìn)行鑒定。

四、實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)

1、大腸桿菌液體培養(yǎng)基和固體篩選培養(yǎng)基制備：

1)接種過(guò)程中，試管或三角瓶口等，也可通過(guò)火焰灼燒滅菌。2)培養(yǎng)基、橡膠制品、塑料制品等不能使用干熱滅菌。

3)在加熱過(guò)程中應(yīng)不斷攪拌，以防瓊脂粉沉淀糊底燒焦，并應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基起泡而溢出容器。

4)注意培養(yǎng)基分裝時(shí)避免其沾污三角瓶口、試管口。

5)嚴(yán)格按照高壓蒸汽滅菌的滅菌指標(biāo)（溫度、壓力、時(shí)間）對(duì)培養(yǎng)基、器皿滅菌，確保滅菌徹底。

2、大腸桿菌工程菌平板培養(yǎng)：

1)劃線分離時(shí)，挑菌量要小，嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免環(huán)境中的雜菌污染。2)畫(huà)線時(shí)接中環(huán)圈內(nèi)不能有菌膜產(chǎn)生，會(huì)造成接種數(shù)過(guò)多，結(jié)果不明顯。

3、PCR擴(kuò)增目的基因片段：

1)PCR體系所加成分的實(shí)際用量，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進(jìn)行核算。2)加樣時(shí)要認(rèn)真,吸頭垂直進(jìn)入試劑管，每加完一樣要換一個(gè)吸頭，同時(shí)在已加的樣品前做個(gè)記號(hào)以防止錯(cuò)加或漏加，避免污染。

3)Taq聚合酶（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機(jī)會(huì)。加酶時(shí)吸頭深入不可過(guò)深，酶量不能過(guò)多。

4、回收目的基因與載體連接：

1)注意調(diào)轉(zhuǎn)速 2)敞開(kāi)管蓋放置

3)向吸附膜中間位置懸空滴加30ul洗脫緩沖液TE（洗脫緩沖液TE需使用前60℃水浴預(yù)熱）

4)蓋好管蓋，靜置10min

5、大腸桿菌液體培養(yǎng):

1)接種環(huán)節(jié)應(yīng)嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作。

2)實(shí)驗(yàn)中要注意細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。密度過(guò)高或不足均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。菌體密度與震蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速密切相關(guān)，根據(jù)測(cè)定的菌液OD值調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間。

3)接種的試管、三角瓶等應(yīng)做好標(biāo)記，注明菌種、日期、組別、姓名等。

6、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化: 1)所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件和冰上進(jìn)行。

2)所使用的器皿必須經(jīng)過(guò)滅菌。并且要防止跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)、雜菌、DNA酶或雜DNA所污染，否則會(huì)大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率。

3)注意轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量和濃度。當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

4)實(shí)驗(yàn)所用的溶液最好用3次蒸餾水配制。

7、篩選重組轉(zhuǎn)化菌落:

1)在含有X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37℃培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。不是一開(kāi)始就4℃，是等菌長(zhǎng)出來(lái)之后。一般菌長(zhǎng)出來(lái)就會(huì)有藍(lán)色的了，4℃之后會(huì)進(jìn)一步顯色。2)當(dāng)出現(xiàn)藍(lán)斑較大，白斑很小附在周圍，還有藍(lán)白鑲嵌的斑即衛(wèi)星菌落的時(shí)候，可以小心挑取中間的那個(gè)菌落，有可能是陽(yáng)性克隆。

3)要注意培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，出現(xiàn)陽(yáng)性菌落就及時(shí)處理，以12-16小時(shí)為宜。4)培養(yǎng)基中加抗生素的時(shí)候，溫度不能高了，不燙手為宜，防止抗生素失效。

8、菌液PCR分析: 注意移液槍正確的使用方法，各種量程的調(diào)試，一般以接近最大量程的為準(zhǔn)。

9、取大腸桿菌重組質(zhì)粒DNA和酶切分析

1)《質(zhì)粒小量提取試劑盒》進(jìn)行質(zhì)粒的提取的第三步和第四步之間的時(shí)間，操作要流暢快速，決定了實(shí)驗(yàn)成敗

2)禁止吸出沉淀

五、總結(jié)

在分子生物學(xué)中，基因克隆是一種常用的技術(shù)。其中關(guān)鍵技術(shù)是DNA重組技術(shù)，它利用酶學(xué)方法將不同來(lái)源的DNA分子進(jìn)行體外特異性切割，重新拼接組裝成一個(gè)新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上將雜合DNA分子轉(zhuǎn)入一定宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代分子，此過(guò)程稱基因克隆。有目的地通過(guò)基因克隆技術(shù)，人為操作改造基因，改變生物遺傳性狀的系列過(guò)程總稱為基因工程。

基因工程是把雙刃劍。如果不加節(jié)制的使用基因工程，讓它去為你包治百病，那樣你的整體免疫系統(tǒng)也將發(fā)生錯(cuò)亂，讓你完全可以抵擋的疾病訪問(wèn)造成你的死亡。如果人們想造什么動(dòng)物就造什么動(dòng)物，讓這些動(dòng)物急速的泛濫，動(dòng)物的天敵關(guān)系，人類的生態(tài)平衡都將被破壞，動(dòng)物也將超過(guò)人類，霸占我們賴以生存的地球。而且，若是誰(shuí)都想起死回生，我想終有一天我們將因?yàn)槿丝诜簽E而滅亡。

基因工程知識(shí)一種讓科技發(fā)展的手段，而不是我們的目的，我們要遵循自然規(guī)律，正確的對(duì)待基因工程，正確的對(duì)待生活。

第三篇：《園藝植物生物技術(shù)》實(shí)驗(yàn)教案

實(shí)驗(yàn)一 現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)儀器

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)儀器是開(kāi)展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺(tái)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識(shí)結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)參觀和老師講解加深同學(xué)們對(duì)現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)劃與布局及常用儀器設(shè)備的主要功能的認(rèn)識(shí)，掌握高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等關(guān)鍵儀器的使用方法。

二、實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所選擇及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

園藝學(xué)院植物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與開(kāi)展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室分工與布局和主要相關(guān)儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學(xué)有關(guān)的高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。

三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、相關(guān)背景知識(shí)回顧：對(duì)課堂講述的各種生物技術(shù)如分子標(biāo)記、細(xì)胞和組織培養(yǎng)等操作過(guò)程進(jìn)行回顧，重要指出每個(gè)環(huán)節(jié)要用到的必備儀器的作用、性能指標(biāo)、操作注意事項(xiàng)及儀器選購(gòu)中應(yīng)注意的問(wèn)題等。

2、每班分為兩小組簡(jiǎn)要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的布局及功能分區(qū)情況；針對(duì)每個(gè)分區(qū)的重要儀器進(jìn)行講述，結(jié)束時(shí)對(duì)所有參觀內(nèi)容進(jìn)行簡(jiǎn)要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問(wèn)。

四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時(shí)要求同學(xué)們認(rèn)真記錄，不要隨意動(dòng)手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項(xiàng)。

2、一個(gè)現(xiàn)代化生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備的基本功能的必備儀器有哪些？實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測(cè)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取時(shí)最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過(guò)程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實(shí)驗(yàn)原理 在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開(kāi)，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機(jī)、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。

液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過(guò)濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時(shí)配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無(wú)水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時(shí)帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

1、取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

2、用無(wú)菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床-250r/min過(guò)夜培養(yǎng)。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預(yù)冷的溶液I，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見(jiàn)白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質(zhì)充分沉淀（溶液III為中和液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺(tái)上風(fēng)干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10、取制備的質(zhì)粒DNA 1-2ul，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進(jìn)行檢測(cè)。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)，盡量減少臺(tái)面污染。

2、DAN電泳時(shí)只能由負(fù)極到正極，電泳時(shí)要注意電極是否正確。

3、質(zhì)粒電泳檢測(cè)一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開(kāi)環(huán)、線型三種構(gòu)型。

六、思考題

簡(jiǎn)述質(zhì)粒DAN提取的步驟。

實(shí)驗(yàn)三 PCR技術(shù)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過(guò)程。

二、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環(huán)境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)，介于兩個(gè)引物之間的特異DNA片段得到大量擴(kuò)增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)基因蘋(píng)果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、調(diào)整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測(cè)：加2ul溴酚藍(lán)，混勻，短暫離心，取15ul反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、引物設(shè)計(jì)應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；

2、PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；

3、根據(jù)引物的Tm值和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度以及PCR儀的特性來(lái)設(shè)定PCR循環(huán)條件；

4、注意分析電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶、無(wú)DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的原理和步驟。

第四篇：《園藝植物生物技術(shù)》實(shí)驗(yàn)教案

《園藝植物生物技術(shù)》實(shí)驗(yàn)教案

實(shí)驗(yàn)一 現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)儀器

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)儀器是開(kāi)展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺(tái)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識(shí)結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)參觀和老師講解加深同學(xué)們對(duì)現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)劃與布局及常用儀器設(shè)備的主要功能的認(rèn)識(shí)，掌握高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等關(guān)鍵儀器的使用方法。

二、實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所選擇及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

園藝學(xué)院植物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與開(kāi)展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室分工與布局和主要相關(guān)儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學(xué)有關(guān)的高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。

三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、相關(guān)背景知識(shí)回顧：對(duì)課堂講述的各種生物技術(shù)如分子標(biāo)記、細(xì)胞和組織培養(yǎng)等操作過(guò)程進(jìn)行回顧，重要指出每個(gè)環(huán)節(jié)要用到的必備儀器的作用、性能指標(biāo)、操作注意事項(xiàng)及儀器選購(gòu)中應(yīng)注意的問(wèn)題等。

2、每班分為兩小組簡(jiǎn)要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的布局及功能分區(qū)情況；針對(duì)每個(gè)分區(qū)的重要儀器進(jìn)行講述，結(jié)束時(shí)對(duì)所有參觀內(nèi)容進(jìn)行簡(jiǎn)要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問(wèn)。

四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時(shí)要求同學(xué)們認(rèn)真記錄，不要隨意動(dòng)手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項(xiàng)。

2、一個(gè)現(xiàn)代化生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備的基本功能的必備儀器有哪些？

實(shí)驗(yàn)二 植物組織培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

植物組織培養(yǎng)是現(xiàn)代生物技術(shù)研究的重要技術(shù)手段，在原生質(zhì)體融合、病毒脫除、離體快繁及遺傳轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。胡蘿卜以其培養(yǎng)體系成熟、再生容易而被視為組織培養(yǎng)的理想外植體材料，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)胡蘿卜的組織培養(yǎng)使同學(xué)們掌握基本培養(yǎng)基的配制、滅菌及培養(yǎng)的基本技能。

二、實(shí)驗(yàn)原理

基于1902年德國(guó)科學(xué)家哈勃蘭特（Haberlandt）提出植物細(xì)胞的全能性理論，即指已分化的細(xì)胞仍然具有分化發(fā)育成新個(gè)體的潛能。在適宜的培養(yǎng)條件下，植物的細(xì)胞、組織或器官都具備再生成完整植物的能力。

三、主要儀器及試材

儀器：pH計(jì)、微波爐、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)室、三角瓶、封口膜、無(wú)菌濾紙、手術(shù)刀片、鑷子、酒精燈、記號(hào)筆等

試材：新鮮胡蘿卜，培養(yǎng)基配制所需相關(guān)試劑

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

（一）培養(yǎng)基母液的配制（小規(guī)模實(shí)驗(yàn)應(yīng)按比例減少，避免造成很大的浪費(fèi)）：

1、大量元素(10倍液)：稱取下列藥品分別溶解定容到1升后，加到5升存儲(chǔ)瓶中。

KNO

395 g NH4NO3

82.5 g KH2PO

48.5 g MgSO4?7H2O

18.5 g CaCl2?2H2O

22.0 g 注意事項(xiàng)：

（1）配置母液前要仔細(xì)清洗存儲(chǔ)容器

（2）應(yīng)按照順序分別徹底溶解后混合，每加完一種藥品，搖動(dòng)存儲(chǔ)瓶使其混合均勻；（3）溶解時(shí)最好加熱，以便充分溶解，避免沉淀的產(chǎn)生；

（4）夏季要用新制的蒸餾水，并加熱，這樣可以避免因?yàn)樗袔Ь窟^(guò)大而產(chǎn)生沉淀，同時(shí)可以減緩綠藻的生成；

（5）沉淀的產(chǎn)生一是由于溶解不充分就混合造成的渾濁型沉淀，所以配置時(shí)一定不要急；二是由于長(zhǎng)菌而產(chǎn)生絮狀沉淀，所以要用新制的蒸餾水并加熱。

2、微量元素母液的配制(100倍液)：取少量(200-300ml)溫水依次加入下列藥品，每加一種藥品后攪拌溶解，最后定容到1L：

KI

0.083 g H3BO0.62 g ZnSO4*7H2O

0.86 g NaMoO4*2H2O

0.025 g CuSO4*5H2O

0.0025 g CoCl2*6H2O

0.0025 g

MnSO4*4H2O

2.23 g(MnSO4*H2O 1.69 g)注意：配好后在室溫下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易產(chǎn)生結(jié)晶沉淀。配制過(guò)程中產(chǎn)生沉淀的原因有：1.前一個(gè)沒(méi)徹底溶解就加入了后一個(gè)藥品；2.蒸餾水pH 值過(guò)高，可加幾滴鹽酸校正。

3、甘氨酸和肌醇的配制(100倍液)：

甘氨酸：0.2 g溶解定容到1L；肌醇：10 g溶解定容到1L

4、鐵鹽的配制（100倍液）：

稱取EDTA 3.73 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.78 g，分別溶解后混合定容到1L，放入棕色細(xì)口瓶中，室溫放置10 h以上（防止結(jié)晶沉淀），然后放入4℃冰箱。

5、維生素B的配制（100倍液）：

VB組分 VB1(鹽酸硫氨素)VB6(鹽酸吡哆素)VB5(煙

酸)

改良MT 1g 1g 0.5g

MS 10 mg 50 mg 50 mg 分別稱取順序溶解在溫?zé)岬恼麴s水中，定容到1L。

注: 需要溶解完一個(gè)再加另一個(gè)；VB5不易溶解，需要攪拌，必要時(shí)可以加熱。

6、Vc的配制（100倍液）：

稱取Vc 0.5g 溶解在蒸餾水中，定容到1L即可。

7、其它溶液配制：

BA，NAA，IBA，GA3等激素類試劑可先用少量1N NaOH徹底溶解，再加水定容。配好后室溫放置一段時(shí)間，再放入冰箱中冷藏保存。有些試劑在乙醇或鹽酸中也可溶解，但比較而言，用堿溶解比較穩(wěn)定，不易產(chǎn)生沉淀。

注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量較大，短時(shí)間內(nèi)用不完，最好分裝一部分到小的細(xì)口瓶中，在制作培養(yǎng)基時(shí)使用。這樣不容易產(chǎn)生沉淀。

（二）培養(yǎng)基配制

母液配好后，按以下體種（或質(zhì)量）量取，最后用蒸餾水定溶到1L,調(diào)節(jié)pH至5.8，用塑料燒杯放入微波爐中充分溶解后分裝滅菌。

大量元素(10倍液)

ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)

ml 鐵鹽（100倍）

ml 維生素B（100倍）ml Vc（100倍）

ml 蔗糖

g 瓊脂

7.5 g

（三）接種與培養(yǎng)

在超凈臺(tái)上接種后，用記號(hào)筆做好標(biāo)簽，放置到光照培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)中涉及到酒精及砷汞等危險(xiǎn)品，注意人身安全的環(huán)境安全，廢液不要隨意亂倒。

2、外植體消毒及接種操作要規(guī)范，注意超凈臺(tái)的衛(wèi)生，養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。

六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理

一星期后，統(tǒng)計(jì)污染率，并對(duì)未污染材料的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察，并分析產(chǎn)生污染的可能原因。

七、思考題

影響植物組織培養(yǎng)的因素有哪些？

主要參考文獻(xiàn)

1.張婭，曾君祉，周志勇，陳毓荃，黃華樑。胡蘿卜組織培養(yǎng)和高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。植物學(xué)通報(bào),2005，22:37-42。

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。實(shí)驗(yàn)三 植物DNA的提取、純化及檢測(cè)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

DNA 提取是開(kāi)展分子生物學(xué)的重要前提之一，高質(zhì)量的DNA直接關(guān)系到分子標(biāo)記、基因克隆、圖譜構(gòu)建及功能基因組研究等工作的成敗。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)了解常用DNA提取方法的原理和技術(shù)，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA檢測(cè)技術(shù)，為將來(lái)從事園藝植物生物技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

植物的遺傳物質(zhì)是DNA，植物細(xì)胞內(nèi)含有豐富的遺傳物質(zhì)。在機(jī)械研磨、高溫和去污劑的共同作用下，植物細(xì)胞破裂，DNA從細(xì)胞核釋放到提取緩沖液中。經(jīng)蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑處理結(jié)合離心，除去蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)，再用乙醇沉淀便可獲得高純度的DNA。

DNA電泳是依據(jù)DNA帶負(fù)電荷，而不同濃度的瓊脂糖凝膠孔徑大小不同，在外加電場(chǎng)的作用下DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)，分子量小的移動(dòng)快而分子量大的移動(dòng)慢，最終達(dá)到不同分子量大小的DNA分離的目的。

三、主要儀器及試材

水浴鍋、離心機(jī)、移液槍、研缽、離心管、核酸電泳系統(tǒng)等；新鮮健康植物葉片，液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1.藥品的配制: CTAB提取液：

(1)100 mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5 M NaCl，50 mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少許(1)加到(2)中，攪拌成糊狀,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解備用。使用前要在65℃溫浴一會(huì)兒，然后加入1-4%巰基乙醇，混均勻。苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）：

重蒸酚65℃水浴溶解，在燒杯中加入80ml溫?zé)岬恼麴s水，加入少許8-羥基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：異戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力攪拌器上攪拌1.5 h左右至停止攪拌后很快分層，然后裝入棕色瓶中，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.DNA的粗提

在裝有葉片的離心管中加入石英砂少許（約0.07克），用尖頭玻棒將材料研細(xì)后加入600 ul CTAB提取液，再繼續(xù)研磨一會(huì)兒使其懸浮均勻，然后在65℃水浴鍋中溫浴60分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒幾次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下晃動(dòng)10分鐘以上，其間置于37℃水浴鍋中溫浴一會(huì)（冬季），使之充分混勻，然后10000-12000 rpm離心5-10分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰凍無(wú)水乙醇1 ml，輕輕顛倒數(shù)次，混合均勻后冰凍30分鐘沉淀DNA，然后8000-10000 rpm離心5分鐘，棄上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小時(shí)或過(guò)夜，8000 rpm離心5分鐘,棄酒精之后在工作臺(tái)上風(fēng)干DNA，注意不要過(guò)干，否則會(huì)使以后溶解困難。3.DNA的純化：

向風(fēng)干后的DNA中加入500 ul 1×TE，37℃水浴15-30分鐘至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小時(shí)，然后加入700 μl苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下顛倒離心管約10分鐘，至充分混勻，10000-12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入700 μl氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），10000 –12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 μl 5M NaCl，再加入1 ml冷凍的無(wú)水乙醇，輕輕顛倒，然后在-20℃冰箱中置30分鐘沉淀DNA，8000-10000 rpm離心2-3分鐘，使DNA分散狀緊貼在管壁上，棄酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小時(shí)后換一次，后浸泡過(guò)夜，8000 rpm離心3分鐘后棄酒精，風(fēng)干，加50-100 μl TE充分溶解備用。

4、DNA檢測(cè)

（1）取DNA原液15 μl稀釋至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度計(jì)測(cè)定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。高質(zhì)量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7

（3）向一定量的DNA中加入限制性內(nèi)切酶EcoR I至4-5 U/μg DNA，37℃消化過(guò)夜，用0.5×TBE，0.8%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳3 h進(jìn)行檢測(cè)。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危險(xiǎn)或有毒物質(zhì)，操作時(shí)要戴手套，并在專門(mén)區(qū)域操作。

2、DAN電泳時(shí)只能由負(fù)極到正極，電泳時(shí)要注意電極是否正確。

六、思考題

簡(jiǎn)述DAN提取的步驟及主要試劑的作用。

主要參考文獻(xiàn)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。實(shí)驗(yàn)四 質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測(cè)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取時(shí)最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過(guò)程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實(shí)驗(yàn)原理 在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開(kāi)，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機(jī)、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。

液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過(guò)濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時(shí)配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無(wú)水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時(shí)帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

1、取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

2、用無(wú)菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床-250r/min過(guò)夜培養(yǎng)。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預(yù)冷的溶液I，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見(jiàn)白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質(zhì)充分沉淀（溶液III為中和液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺(tái)上風(fēng)干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10、取制備的質(zhì)粒DNA 1-2ul，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進(jìn)行檢測(cè)。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)，盡量減少臺(tái)面污染。

2、DAN電泳時(shí)只能由負(fù)極到正極，電泳時(shí)要注意電極是否正確。

3、質(zhì)粒電泳檢測(cè)一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開(kāi)環(huán)、線型三種構(gòu)型。

六、思考題

簡(jiǎn)述質(zhì)粒DAN提取的步驟。

主要參考文獻(xiàn)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。

實(shí)驗(yàn)五 PCR技術(shù)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過(guò)程。

二、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環(huán)境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過(guò)一定的循環(huán)，介于兩個(gè)引物之間的特異DNA片段得到大量擴(kuò)增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)基因蘋(píng)果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、調(diào)整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測(cè)：加2ul溴酚藍(lán)，混勻，短暫離心，取15ul反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、引物設(shè)計(jì)應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；

2、PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；

3、根據(jù)引物的Tm值和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度以及PCR儀的特性來(lái)設(shè)定PCR循環(huán)條件；

4、注意分析電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶、無(wú)DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的原理和步驟。

主要參考文獻(xiàn)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料

實(shí)驗(yàn)六 PCR產(chǎn)物的TA克隆

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

采用同源序列法克隆特定基因或DNA片段是果樹(shù)上常用的分子克隆方法。相對(duì)于粘性末端來(lái)說(shuō)，克隆具有平末端的雙鏈PCR產(chǎn)物效率較低。目前，有兩種方法可以采用，一種是在特異引物設(shè)計(jì)時(shí)引入酶切位點(diǎn)，另一種是TA克隆。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)掌握PCR產(chǎn)物TA克隆的原理，學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物純化及回收，以及PCR產(chǎn)物與TA克隆載體的連接。

二、實(shí)驗(yàn)原理

TA克隆是利用耐熱聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，而不具有3’一5’外切酶的校準(zhǔn)活性，即在PCR產(chǎn)物的兩個(gè)3’末端加上未配對(duì)的單一A凸出尾，質(zhì)粒載體提供線性3’末端單一的T凸出尾，使該載體能夠直接與PCR產(chǎn)物高效連接。TA克隆技術(shù)比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

三、主要儀器及試材

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Promega公司）、pMD18-T載體（TaKaRa公司）以及感受態(tài)大腸桿菌、高速冷凍離心機(jī)、移液槍、瓊脂糖凝膠電泳等相關(guān)儀器及試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、PCR擴(kuò)增片段純化回收

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，割膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒收集PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2、連接反應(yīng) 反應(yīng)體系組成

pMD18-T

0.5-1.0 ul PCR fragment

1.0-4.5 ul ddH2O

0-3.0 ul Ligation Solution I

5.0 ul 混合后，置于室溫下放置數(shù)小時(shí)或過(guò)夜連接。

3、重組子轉(zhuǎn)化（熱激法）

1）在含適當(dāng)濃度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul x-gal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；

2）冰上冷凍新滅菌的1.5 ml 離心管； 3）取出感受態(tài)大腸桿菌，冰上放置凍融；

4）取新滅菌的1.5 ml 離心管，加入50 ul感受態(tài)細(xì)胞和10 ul連接反應(yīng)液，用移液槍輕輕吸打均勻，在冰上放置30 min；

5）熱激：將離心管在42 ℃下水浴90秒鐘。請(qǐng)勿搖動(dòng)離心管； 6）冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，1-2分鐘；

7）復(fù)蘇：每管加400 ul液體LB培養(yǎng)基，在37 ℃搖床溫和搖動(dòng)45 min-60 min； 8）涂皿：取150 ul均勻涂布于“1）”已制備好的LB平板上；

9）培養(yǎng)：在37 ℃下倒置培養(yǎng)12-16 h，即可觀察到藍(lán)白相間的菌落。白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍(lán)色是載體自連的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子可以在4 ℃下保持1個(gè)月；

10）單菌落培養(yǎng)：用滅菌的牙簽，挑選白色的單菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液體LB培養(yǎng)基的50 ml離心管中，在37 ℃搖床上培養(yǎng)過(guò)夜（12-16 h）。

4、質(zhì)粒DNA的分離 參考有關(guān)文獻(xiàn)。

5、檢測(cè)

采用相同的引物對(duì)進(jìn)行PCR再擴(kuò)增，或質(zhì)粒上根據(jù)插入片段兩端的酶切位點(diǎn)而進(jìn)行限制性酶切，通過(guò)電泳可以檢測(cè)出片段是否克隆成功。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、連接溫度不宜太高，連接溫度過(guò)高（>28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。降低連接溫度可以提高白斑率；

2、熱激過(guò)程注意勿搖動(dòng)離心管。

六、思考題

簡(jiǎn)述PCR產(chǎn)物TA克隆的原理和步驟。

主要參考文獻(xiàn)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料。

第五篇：生物技術(shù)有限公司實(shí)習(xí)心得

20XX年3月1日我們懷著欣喜的心情來(lái)到了裕通生物技術(shù)有限公司并進(jìn)行為期3個(gè)月的實(shí)習(xí)生活，這次實(shí)習(xí)讓我們感受到了集團(tuán)的企業(yè)文化。工作中有苦也有樂(lè)，但更多的是收獲，這次實(shí)習(xí)我們受益匪淺。古人云：“紙上得來(lái)終覺(jué)淺，要知此事必躬行”。這是一次理論與實(shí)踐相結(jié)合的實(shí)習(xí)，把理論應(yīng)用到實(shí)踐當(dāng)中并在實(shí)踐中積累更加豐富的理論知識(shí)。在公司領(lǐng)導(dǎo)和指導(dǎo)老師的幫助下我們圓滿的結(jié)束了實(shí)習(xí)。就3個(gè)月的實(shí)習(xí)我總結(jié)了如下幾點(diǎn)：

1、心態(tài)轉(zhuǎn)變。學(xué)校的生活養(yǎng)尊處憂，無(wú)需我們擔(dān)憂某些問(wèn)題，學(xué)校三點(diǎn)一線的生活，學(xué)習(xí)跟得上就可以，而在工作當(dāng)中就不然，工作中，我們要考慮如何提高工作效率，怎樣處理與上級(jí)領(lǐng)導(dǎo)、同事的關(guān)系，還有在工作當(dāng)中的不盡人意等事情，這些都要我們以一顆平常心去對(duì)待，及時(shí)的轉(zhuǎn)變心態(tài)會(huì)讓我們工作更加順利。

2、計(jì)劃做事。有了明確的計(jì)劃，目標(biāo)才清晰，以至于在工作中不會(huì)茫然。在合成部實(shí)習(xí)的三個(gè)多月中，我每天都寫(xiě)工作日志，記錄下我要做的事情，然后再總結(jié)一下完成狀況，日志看似平常，但在無(wú)形中提高你做事的效率和工的有序程度。

3、不以事小而不為。做大事小事有不同的階段，要想做大事，小事情必須做好。我們正是實(shí)習(xí)的階段，做一些繁瑣的小事情，很有必要。工作中我們每個(gè)人干的最多的就是打水、拖地和擦桌子，但我并沒(méi)有感到煩，而是把它當(dāng)作我素質(zhì)培養(yǎng)的大講堂，正因?yàn)檫@些小事情改變了辦公室的環(huán)境。這些小事情值得我去做。事情雖小，可過(guò)程至關(guān)重要。

4、以上是我在實(shí)習(xí)中的一些體會(huì)，同時(shí)在實(shí)習(xí)的過(guò)程中我也發(fā)現(xiàn)自己還存在一些缺點(diǎn)，如：性子急、愿意推托等毛病，正確的對(duì)待自己的缺點(diǎn)和錯(cuò)誤，才會(huì)使自己的能力提升的更快。

5、三個(gè)月的實(shí)習(xí)生活就要結(jié)束了，在理論與實(shí)踐的磨合中我們顯得比來(lái)時(shí)更加成熟和穩(wěn)重，我們又多了一些實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。在一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)激烈，就業(yè)困難的環(huán)境中，我們先行的這一步已經(jīng)為我們奠定了一定的基礎(chǔ)，在以后的職業(yè)實(shí)戰(zhàn)中，我們會(huì)打的更響、更漂亮!

6、一個(gè)多月的實(shí)習(xí)期很快就過(guò)去了，美好的東西總是稍縱即失。在此，我要感謝所有為我的實(shí)習(xí)提供幫助和指導(dǎo)的領(lǐng)導(dǎo)老師們，感謝你們這么多天的照顧和幫助。相信這次珍貴的實(shí)習(xí)經(jīng)歷會(huì)一直伴隨著我以后的工作生活。千里之行，始于足下，我會(huì)通過(guò)這次實(shí)習(xí)，更加懂得知識(shí)和實(shí)踐的積累，不斷充實(shí)自己。