第一篇：細(xì)胞毒性試驗(yàn)總結(jié)

（一）實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確的問(wèn)題

1.選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過(guò)滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

2.藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。

3.時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定OD值，輸入excel表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫(huà)出變化的曲線，曲線什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺(tái)期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時(shí)間點(diǎn)（因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。

4.培養(yǎng)時(shí)間。200ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的4～5次方的增殖期細(xì)胞來(lái)說(shuō)，很難維持68h，如果營(yíng)養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。

5.MTT法只能測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。做MTT時(shí)，盡量無(wú)菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。6.理論未必都是對(duì)的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。

7.實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。

8.避免血清干擾。用含15％胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

貼壁細(xì)胞：

1.收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。

2.5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況.3.5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。

7.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）懸浮細(xì)胞：

1）收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無(wú)血清）培養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 lug/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測(cè)物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100ul(儲(chǔ)存液100 1640）。2）置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）

4）離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。

5）同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。

（三）MTT的配制

MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過(guò)濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒(méi)必要一下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無(wú)菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒(méi)有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉。配制MTT時(shí)用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。

PBS配方:Nacl 8g，Kcl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，調(diào)ph 7.4，定容1L。

（四）關(guān)于細(xì)胞的接種(鋪板)

細(xì)胞過(guò)了30代以后就不要用了,因?yàn)闋顟B(tài)不好了;培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn)。接種時(shí)最好按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出的密度接種, 因?yàn)榧?xì)胞密度在10000/ml左右時(shí)，所測(cè)得的OD值的區(qū)間即細(xì)胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關(guān)系最好，結(jié)果最可信。如果鋪的太稀細(xì)胞的殺傷不會(huì)很明顯，太密細(xì)胞可能都會(huì)凋亡，因?yàn)榧?xì)胞長(zhǎng)的太快營(yíng)養(yǎng)會(huì)不夠，最后導(dǎo)致死亡。且而細(xì)胞過(guò)密或者過(guò)少，增殖都會(huì)過(guò)快或者過(guò)慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。

細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)來(lái)定.如果你做的藥品對(duì)細(xì)胞具有刺激作用那么取小點(diǎn)的細(xì)胞濃度，如果你做的藥品對(duì)細(xì)胞具有抑制作用那么取大點(diǎn)的細(xì)胞濃度，這樣與對(duì)照的區(qū)別更明顯，數(shù)據(jù)更好。懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到105,貼壁細(xì)胞可為103-104.（五）加入MTT

個(gè)人認(rèn)為MTT最關(guān)鍵的是你的細(xì)胞數(shù)目和你加入真正起作用的的MTT的適當(dāng)比例，具體細(xì)胞數(shù)目和真正起作用的的MTT之間的關(guān)系確實(shí)不好確定，我認(rèn)為MTT多加一些比少加好一些 MTT的量各家報(bào)道不同，一般是過(guò)量的，所以10ul即夠了。如果不使用96孔板，培養(yǎng)基超過(guò)100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振蕩一下讓MTT與培養(yǎng)基混勻，不過(guò)這個(gè)應(yīng)該關(guān)系不大。

如加入MTT后都有個(gè)別孔立即變?yōu)樗{(lán)黑色，則污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細(xì)胞前還是需要以過(guò)濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。因?yàn)檠逯邪椎鞍讓?duì)大部分的藥物都有結(jié)合效應(yīng)，所以可以單獨(dú)將藥物和MTT加在一起，看會(huì)不會(huì)起反應(yīng)。如果不起反應(yīng)，就不用去除含藥物的培液，直接加MTT即可。首先說(shuō)說(shuō)我的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)：

1.吹打時(shí)懸液總量不能太多，達(dá)到吸管吸液量的3到4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管里面最好裝3~4ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細(xì)胞懸液。。2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量過(guò)多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過(guò)少，吹打的力度就不夠，吹打就會(huì)不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益

3.吸的時(shí)候要在懸液底部，然后提起來(lái)一點(diǎn)，但是吹下去的時(shí)候不要離開(kāi)液面，否則容易吹打出氣泡。

4.吹打次數(shù)100左右，就可以吹打均勻了（有人認(rèn)為加細(xì)胞前吹打30－50次基本就差不多均勻了。加細(xì)胞的時(shí)候每接種2孔反復(fù)吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細(xì)胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）

5.向每孔中用槍頭加入細(xì)胞時(shí)不要太快，否則你會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在加入的瞬間會(huì)由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會(huì)產(chǎn)生接觸抑制，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。所以速度不能太快也不能太慢。我習(xí)慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復(fù)3下移動(dòng)，目的是使得細(xì)胞能分散的均勻些。（鋪板技術(shù)是MTT實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，也是基礎(chǔ)，一定要練好。曾經(jīng)有同學(xué)用漩渦振蕩器混勻細(xì)胞，最后細(xì)胞全死了，建議不要采用這種方法混勻細(xì)胞。其它的聲音：

1.首先細(xì)胞的接種密度一定不能過(guò)大，一般每孔1000個(gè)左右就夠了，我認(rèn)為寧少勿多。尤其是對(duì)于腫瘤細(xì)胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，最佳點(diǎn)板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會(huì)很大。

2.MTT本身就是比較粗的實(shí)驗(yàn)，增殖率10%左右的波動(dòng)都不算奇怪。特別是新手，20％的波動(dòng)也是常見(jiàn)的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過(guò)關(guān)。

3.我做的是腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn),這種細(xì)胞長(zhǎng)的很快一開(kāi)始我是用100000/ML的濃度來(lái)接種的,結(jié)果細(xì)胞長(zhǎng)的太滿結(jié)果是沒(méi)有梯度也沒(méi)有線性關(guān)系.后來(lái)調(diào)整濃度,用過(guò)40000~80000/ML的濃度都做過(guò)MTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)做的結(jié)果比較好點(diǎn)的是60000~70000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組,由于細(xì)胞少,藥物作用的梯度還是有,只是沒(méi)有很好的線性關(guān)系.還有根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度以及藥物的特性(有時(shí)間依賴性和濃度依賴性的藥物)來(lái)確定培養(yǎng)時(shí)間是48小時(shí)還是72小時(shí).注意細(xì)胞懸液一定要混勻，已避免細(xì)胞沉淀下來(lái)，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接幾個(gè)就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會(huì)在8%左右。另外，吹散次數(shù)過(guò)多也會(huì)影響細(xì)胞活力。所以要熟練些、快些上板。

第二篇：有機(jī)溶劑毒性總結(jié)

有機(jī)溶劑毒性總結(jié) 1.有機(jī)溶劑之毒性

人若長(zhǎng)時(shí)間吸入有機(jī)溶劑之蒸氣將會(huì)引起慢性中毒的現(xiàn)象，但短時(shí)間暴露高濃度有機(jī)溶劑蒸氣之下，也會(huì)有急性中毒致命的危險(xiǎn)。在工業(yè)衛(wèi)生上，有機(jī)溶劑對(duì)人體之危害與溶劑的揮發(fā)性具有密切的關(guān)系。在常溫下，低揮發(fā)性溶劑在空氣中不易造成危險(xiǎn)。其他對(duì)人體危害有關(guān)系者尚有溶劑之脂溶性，反應(yīng)性、含雜質(zhì)情形、人體吸收之方式及途徑、人體之代謝速率、累積情形、個(gè)體感受及敏感性、暴露時(shí)間之長(zhǎng)短等。

2.對(duì)人體危害之途徑

(1)經(jīng)由皮膚接觸引起之危害：

有機(jī)溶劑蒸氣會(huì)刺激眼睛粘膜而使人流淚；與皮膚接觸會(huì)溶解皮膚油脂而滲入組織，干擾生理機(jī)能、脫水；且因皮膚干裂而感染污物及細(xì)菌。表皮膚角質(zhì)溶解引起表皮角質(zhì)化，刺激表皮引起紅腫及氣泡部份。溶劑滲入人體內(nèi)破壞血球及骨髓等。(2)經(jīng)由呼吸器官引起之危害：

有機(jī)溶劑蒸氣經(jīng)由呼吸器官吸入人體后，人往往會(huì)產(chǎn)生麻醉作用。蒸氣吸入后大部份經(jīng)企管而達(dá)肺部，然后經(jīng)血液或淋巴液傳送至其他器官，造成不同程度之中毒現(xiàn)象。因人體肺泡面積為體表面積數(shù)十倍以上，且血液循環(huán)擴(kuò)散速率甚快，常會(huì)對(duì)呼吸道、神經(jīng)系統(tǒng)、肺、腎、血液及造血系統(tǒng)產(chǎn)生重大毒害，固有機(jī)溶劑經(jīng)由呼吸器官引起之中毒現(xiàn)象，最受人重視。(3)經(jīng)由消化器官引起之危害：

有機(jī)溶劑經(jīng)由消化企管主要引起之原因，為在污染溶劑蒸氣場(chǎng)所進(jìn)食、抽煙或手指沾口等，其引起之危害，首先受害為口腔，進(jìn)入食道及胃腸，引起惡心、嘔吐現(xiàn)象，然后在由消化系統(tǒng)，危害到其他器官。

3.對(duì)人體危害之生理作用

有機(jī)溶劑中毒之一般癥狀為頭痛、疲怠、食欲不振、頭昏等。高濃度之急性中毒抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使人喪失意識(shí)，而產(chǎn)生麻醉現(xiàn)象，初期引起興奮、昏睡、頭痛、目眩、疲怠趕、食欲不振、意識(shí)消失等；低濃度蒸氣引起之慢性中毒則影響血小板、紅血球等造血系統(tǒng)，鼻孔、齒齦及皮下組織出血，造CHENGREN體貧血現(xiàn)象。一般有機(jī)溶劑對(duì)人體危害生理之影響有下列幾種：(1)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)破壞：

因抑制神經(jīng)系統(tǒng)的傳導(dǎo)沖動(dòng)功能，產(chǎn)生麻醉，神經(jīng)系統(tǒng)障礙或引起神經(jīng)炎等。如二硫化碳引起的神經(jīng)炎；甲醇中毒影響視神經(jīng)等。此類溶劑尚有酒精、苯、氯化乙醇、二氯乙烷、汽油、甲酸戊酯、醋酸戊酯、二甲苯、三氯乙烯、丁醇、松節(jié)油、煤油、丙酮、酚、三氯甲烷、異丙苯等。

(2)對(duì)肝臟機(jī)能損傷：

因損傷肝臟機(jī)能，引起惡心、嘔吐、發(fā)燒、黃疸炎及中毒性肝炎；一般氯化烴類均會(huì)引起肝臟中毒現(xiàn)象。此類溶劑有四氯化碳、氯仿、三氯乙烯、四氯乙烷、苯及其衍生物等。(3)對(duì)腎臟機(jī)能破壞： 腎臟為毒物排泄器官，故最易中毒，且因血氧量減少，亦足以使腎臟受害，發(fā)生腎炎及腎病。此類溶劑包括烴類之鹵化物、苯及其衍生物、二元醇及其單醚類、四氯化碳、乙醇等。(4)對(duì)造血系統(tǒng)破壞：

因破壞骨髓造成貧血現(xiàn)象。此類溶劑包括苯及其衍生物如甲苯、氯化苯、二元醇等。(5)對(duì)粘膜及皮膚刺激：

因刺激粘膜，使鼻粘膜出血，喉頭發(fā)炎，嗅覺(jué)喪失或因皮膚敏感產(chǎn)生紅腫、發(fā)癢、紅斑及壞疽病等。此類溶劑包括氯仿、三氯甲烷、醚、苯、醋酸甲酯、煤油、丙酮、甲醇、石油、氯酚、二氯乙烯、四氯化碳等。

溶劑名稱沸點(diǎn)（1ATM）溶解性毒性

液氨 33.35℃特殊溶解性：能溶解堿金屬和堿土金屬劇毒性、腐蝕性

液態(tài)二氧化硫 10.08 溶解胺、醚、醇苯酚、有機(jī)酸、芳香烴、溴、二硫化碳，多數(shù)飽和烴不溶劇毒

甲胺 6.3 是多數(shù)有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的優(yōu)良溶劑，液態(tài)甲胺與水、醚、苯、丙酮、低級(jí)醇混溶，其鹽酸鹽易溶于水，不溶于醇、醚、酮、氯仿、乙酸乙酯中等毒性，易燃

二甲胺 7.4 是有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的優(yōu)良溶劑，溶于水、低級(jí)醇、醚、低極性溶劑強(qiáng)烈刺激性 石油醚不溶于水，與丙酮、乙醚、乙酸乙酯、苯、氯仿及甲醇以上高級(jí)醇混溶與低級(jí)烷相似 乙醚 34.6 微溶于水，易溶與鹽酸.與醇、醚、石油醚、苯、氯仿等多數(shù)有機(jī)溶劑混溶麻醉性 戊烷 36.1 與乙醇、乙醚等多數(shù)有機(jī)溶劑混溶低毒性

二氯甲烷 39.75 與醇、醚、氯仿、苯、二硫化碳等有機(jī)溶劑混溶低毒，麻醉性強(qiáng) 二硫化碳 46.23 微溶與水，與多種有機(jī)溶劑混溶麻醉性，強(qiáng)刺激性 溶劑石油腦與乙醇、丙酮、戊醇混溶較其他石油系溶劑大

丙酮 56.12 與水、醇、醚、烴混溶低毒，類乙醇，但刺激性較大 溶劑名稱沸點(diǎn)（1ATM）溶解性毒性

1，1-二氯乙烷 57.28 與醇、醚等大多數(shù)有機(jī)溶劑混溶低毒、局部刺激性

氯仿 61.15 與乙醇、乙醚、石油醚、鹵代烴、四氯化碳、二硫化碳等混溶中等毒性，強(qiáng)麻醉性

甲醇 64.5 與水、乙醚、醇、酯、鹵代烴、苯、酮混溶中等毒性，麻醉性

四氫呋喃 66 優(yōu)良溶劑，與水混溶，很好的溶解乙醇、乙醚、脂肪烴、芳香烴、氯化烴吸入微毒，經(jīng)口低毒

己烷 68.7 甲醇部分溶解，比乙醇高的醇、醚丙酮、氯仿混溶低毒。麻醉性，刺激性

三氟代乙酸 71.78 與水乙醇、乙醚、丙酮苯、四氯化碳、己烷混溶,溶解多種脂肪族、芳香族化合物

1，1，1-三氯乙烷 74.0 與丙酮、、甲醇、乙醚、苯、四氯化碳等有機(jī)溶劑混溶低毒類溶劑 四氯化碳 76.75 與醇、醚、石油醚、石油腦、冰醋酸、二硫化碳、氯代烴混溶氯代甲烷中毒性最強(qiáng)

乙酸乙酯 77.112 與醇、醚、氯仿、丙酮、苯等大多數(shù)有機(jī)溶劑溶解，能溶解某些金屬鹽低毒，麻醉性

乙醇 78.3 與水、乙醚、氯仿、酯、烴類衍生物等有機(jī)溶劑混溶微毒類，麻醉性 丁酮 79.64 與丙酮相似，與醇、醚、苯等大多數(shù)有機(jī)溶劑混溶低毒，毒性強(qiáng)于丙酮 苯 80.10 難溶于水，與甘油、乙二醇、乙醇、氯仿、乙醚、、四氯化碳、二硫化碳、丙酮、甲苯、二甲苯、冰醋酸、脂肪烴等大多有機(jī)物混溶強(qiáng)烈毒性

環(huán)己烷 80.72 與乙醇、高級(jí)醇、醚、丙酮、烴、氯代烴、高級(jí)脂肪酸、胺類混溶低毒，中樞抑制作用

乙睛 81.60 與水、甲醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酮、醚、氯仿、四氯化碳、氯乙烯及各種不飽和烴混溶，但是不與飽和烴混溶中等毒性，大量吸入蒸氣，引起急性中毒 異丙醇 82.40 與乙醇、乙醚、氯仿、水混溶微毒，類似乙醇 1，2-二氯乙烷 83.48 與乙醇、乙醚、氯仿、四氯化碳等多種有機(jī)溶劑混溶高毒性、致癌 乙二醇二甲醚 85.2 溶于水，與醇、醚、酮、酯、烴、氯代烴等多種有機(jī)溶劑混溶。能溶解各種樹(shù)脂，還是二氧化硫、氯代甲烷、乙烯等氣體的優(yōu)良溶劑吸入和經(jīng)口低毒

三氯乙烯 87.19 不溶于水，與乙醇.乙醚、丙酮、苯、乙酸乙酯、脂肪族氯代烴、汽油混溶有機(jī)有毒品

三乙胺 89.6 水:18.7以下混溶，以上微溶。易溶于氯仿、丙酮，溶于乙醇、乙醚易爆，皮膚黏膜刺激性強(qiáng)

丙睛 97.35 溶解醇、醚、DMF、乙二胺等有機(jī)物，與多種金屬鹽形成加成有機(jī)物高毒性，與氫氰酸相似

溶劑名稱沸點(diǎn)（1ATM）溶解性毒性

庚烷 98.4 與己烷類似低毒，刺激性、麻醉性 水 100 略略

硝基甲烷 101.2 與醇、醚、四氯化碳、DMF、等混溶麻醉性，刺激性

1，4-二氧六環(huán) 101.32 能與水及多數(shù)有機(jī)溶劑混溶，仍溶解能力很強(qiáng)微毒，強(qiáng)于乙醚2~3倍

甲苯 110.63 不溶于水與甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙醚、冰醋酸、苯等有機(jī)溶劑混溶低毒類，麻醉作用

硝基乙烷 114.0 與醇、醚、氯仿混溶，溶解多種樹(shù)脂和纖維素衍生物局部刺激性較強(qiáng)

吡啶 115.3 與水、醇、醚、石油醚、苯、油類混溶。能溶多種有機(jī)物和無(wú)機(jī)物低毒，皮膚黏膜刺激性

4-甲基-2-戊酮 115.9 能與乙醇、乙醚、苯等大多數(shù)有機(jī)溶劑和動(dòng)植物油相混溶毒性和局部刺激性較強(qiáng)

乙二胺 117.26 溶于水、乙醇、苯和乙醚，微溶于庚烷刺激皮膚、眼睛 丁醇 117.7 與醇、醚、苯混溶低毒，大于乙醇3倍 乙酸 118.1 與水、乙醇、乙醚、四氯化碳混溶不溶于二硫化碳及C12以上高級(jí)脂肪烴低毒，濃溶液毒性強(qiáng)

乙二醇一甲醚 124.6 與水、醛、醚、苯、乙二醇、丙酮、四氯化碳、DMF等混溶低毒類 辛烷 125.67 幾乎不溶于水，微溶于乙醇，與醚、丙酮、石油醚、苯、氯仿、汽油混溶低毒性，麻醉性

乙酸丁酯 126.11 優(yōu)良有機(jī)溶劑，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，還可以用做萃取劑一般條件毒性不大

嗎啉 128.94 溶解能力強(qiáng)，超過(guò)二氧六環(huán)、苯、和吡啶，與水混溶，溶解丙酮、苯、乙醚、甲醇、乙醇、乙二醇、2己酮、蓖麻油、松節(jié)油、松脂等腐蝕皮膚，刺激眼和結(jié)膜，蒸汽引起肝腎病變

氯苯 131.69 能與醇、醚、脂肪烴、芳香烴、和有機(jī)氯化物等多種有機(jī)溶劑混溶 低于苯，損害中樞系統(tǒng)

乙二醇一乙醚 135.6 與乙二醇一甲醚相似，但是極性小，與水、醇、醚、四氯化碳、丙酮混溶低毒類，二級(jí)易燃液體

對(duì)二甲苯 138.35 不溶于水，與醇、醚和其他有機(jī)溶劑混溶一級(jí)易燃液體

二甲苯 138.5~141.5 不溶于水，與乙醇、乙醚、苯、烴等有機(jī)溶劑混溶，乙二醇、甲醇、2氯乙醇等極性溶劑部分溶解一級(jí)易燃液體，低毒類

間二甲苯 139.10 不溶于水，與醇、醚、氯仿混溶，室溫下溶解乙睛、DMF等一級(jí)易燃液體 醋酸酐 140.0 鄰二甲苯 144.41 不溶于水，與乙醇、乙醚、氯仿等混溶一級(jí)易燃液體 溶劑名稱沸點(diǎn)（1ATM）溶解性毒性

N，N-二甲基甲酰胺 153.0 與水、醇、醚、酮、不飽和烴、芳香烴烴等混溶，溶解能力強(qiáng)低毒

環(huán)己酮 155.65 與甲醇、乙醇、苯、丙酮、己烷、乙醚、硝基苯、石油腦、二甲苯、乙二醇、乙酸異戊酯、二乙胺及其他多種有機(jī)溶劑混溶低毒類，有麻醉性，中毒幾率比較小

環(huán)己醇 161 與醇、醚、二硫化碳、丙酮、氯仿、苯、脂肪烴、芳香烴、鹵代烴混溶低毒無(wú)血液毒性刺激性

N，N-二甲基乙酰胺 166.1 溶解不飽和脂肪烴，與水、醚、酯、酮、芳香族化合物混溶微毒類

糠醛 161.8 與醇、醚、氯仿、丙酮、苯等混溶部分溶解低沸點(diǎn)脂肪烴，無(wú)機(jī)物一般不溶有毒品，刺激眼睛，催淚

N-甲基甲酰胺 180~185 與苯混溶，溶于水和醇，不溶于醚一級(jí)易燃液體

第三篇：細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

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細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)-CCK-8 法

實(shí)驗(yàn)原理：Cell Counting Kit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

一、用途：

藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏試驗(yàn)等。

二、優(yōu)點(diǎn)：

1.使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑； 2.CCK-8法能快速檢測(cè)；

3.CCK-8法的檢測(cè)靈敏度很高，甚至可以測(cè)定較低細(xì)胞密度； 4.CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT 法，MTT 實(shí)驗(yàn)生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有機(jī)溶劑溶解；

5.而本方法產(chǎn)生的formazan是水溶性的，不僅省去了溶解步驟，更因此而減少了該操作步驟帶來(lái)的誤差；

6.CCK-8法對(duì)細(xì)胞毒性小，可以多次測(cè)定選取最佳測(cè)定時(shí)間，與MTT 方法相比線性范圍更寬，靈敏度更高；

7.CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開(kāi)即用。

三、所需設(shè)備及儀器：

1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）3.96孔培養(yǎng)板

4.二氧化碳培養(yǎng)箱

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四、方法及步驟：

實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞增殖分析

1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約1-2×104），每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復(fù)。3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議將槍頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)配），以換液的形式加入。

5、培養(yǎng)0.5-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件（建議預(yù)實(shí)驗(yàn)先摸清楚時(shí)間點(diǎn)）。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

6、測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm，參比波長(zhǎng)600-650nm。

實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞毒性分析

1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)

2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約≥5×104），每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復(fù)。3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時(shí)，如果不需要貼壁，這步可以省去。

4、加入不同濃度的毒性物質(zhì)。5、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入毒性物質(zhì)的培養(yǎng)時(shí)間，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來(lái)決定，起碼要一代以上的時(shí)間（例如：6、12、24、48、60、72小時(shí)）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議將槍頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。

7、培養(yǎng)0.5-4小時(shí):細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長(zhǎng)的顯色時(shí)間（5-6小時(shí)）。

8、測(cè)定450nm吸光度：建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450-490nm，參比波長(zhǎng)600-650nm。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：

·若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。

·如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

·當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000 個(gè)/孔(100 μl 培養(yǎng)基)。檢 一站式科研技術(shù)服務(wù)商—武漢金開(kāi)瑞生物004km.cn

測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔(100 μl 培養(yǎng)基)。

·酚紅和血清對(duì)CCK8法的檢測(cè)不會(huì)造成干擾，可以通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

· CCK8可以檢測(cè)大腸桿菌，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每次測(cè)定的過(guò)程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。

· CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月，在-20℃下避光可以保存1年。

·當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔加培養(yǎng)基或者PBS，不作為測(cè)定孔用。

·在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照。

·金屬對(duì)CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、90%的顯色反應(yīng)，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 mM的話，將會(huì)100%抑制。

·懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。

·加入CCK-8 時(shí)，如果細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色或pH 值已變化，建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

·用酶標(biāo)儀檢測(cè)前需確保每個(gè)孔內(nèi)沒(méi)有氣泡，否則會(huì)干擾測(cè)定，且要擦拭干凈樣品板了。

六、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)及分享：

CCK8的說(shuō)明書(shū)大家一定要認(rèn)真閱讀，里面很多細(xì)節(jié)的問(wèn)題都有提到。而且說(shuō)明書(shū)里提供的一些關(guān)于各種細(xì)胞的種板數(shù)都很有參考價(jià)值，因?yàn)槟鞘欠磸?fù)驗(yàn)證過(guò)的最佳數(shù)值。但無(wú)論如何，做這個(gè)試驗(yàn)一定要摸條件。你就算再懶，這個(gè)懶不得，否則你都只是在做無(wú)用功。以下言論全部以細(xì)胞毒性試驗(yàn)為前提，如果你做的是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物的藥效實(shí)驗(yàn)?zāi)蔷土懋?dāng)別論了。

摸條件包括

1、種板數(shù)；

2、種板后細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)時(shí)間；

3、加藥后的孵育時(shí)間；

4、cck8試劑加入量；

5、cck8試劑加入后細(xì)胞孵育時(shí)間?？雌饋?lái)很多，其實(shí)這就是一個(gè)實(shí)驗(yàn)。而且都是種的空白板，也就是不加藥物，只加細(xì)胞和CCK8。

1、種板數(shù)：這個(gè)要查文獻(xiàn)，看你所用細(xì)胞別人有無(wú)做過(guò)，把范圍大致找出。記住還要參考說(shuō)明書(shū)，這個(gè)很重要。然后稀釋一系列濃度種板。首先你要觀察多長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞可貼壁完全，一般貼壁生長(zhǎng)24小時(shí)。然后還有在你的實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，不同細(xì)胞數(shù)下孔內(nèi)生長(zhǎng)情況。比如我擬定考察4天的時(shí)間，那么在4天內(nèi)，細(xì)胞是剛好鋪滿還是堆積生長(zhǎng)？因?yàn)槊繅K板都會(huì)設(shè)置對(duì)照孔，也就是含有細(xì)胞的培養(yǎng)基+CCK8，這個(gè)數(shù)值是板上的最大數(shù)值，CCK8試驗(yàn)最佳OD 一站式科研技術(shù)服務(wù)商—武漢金開(kāi)瑞生物004km.cn

值在1.0附近，所以這個(gè)最大數(shù)值最好能控制在1.0左右。我的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)是不要讓細(xì)胞長(zhǎng)滿，一旦長(zhǎng)滿了很難去判斷是否堆積生長(zhǎng)了，對(duì)藥物能否順利進(jìn)入細(xì)胞有影響此為其一，其二生長(zhǎng)不均勻易導(dǎo)致孔間OD值數(shù)據(jù)偏差大，而且OD值也很大。

2、貼壁生長(zhǎng)的時(shí)間我一般就直接讓它貼壁長(zhǎng)24h了，這個(gè)時(shí)間細(xì)胞已經(jīng)貼壁完全，而且這樣設(shè)置時(shí)間對(duì)自己安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間也方便。沒(méi)人愿意大半夜爬起來(lái)做實(shí)驗(yàn)吧。

3、加藥后的孵育時(shí)間，我的實(shí)驗(yàn)摸了3個(gè)時(shí)間，24h，48h，72h。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來(lái)選擇最好的時(shí)間。太長(zhǎng)了就沒(méi)有必要了，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可想而知了。

4、CCK8試劑加入量，說(shuō)明書(shū)中明確寫(xiě)出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10%。這里有一個(gè)問(wèn)題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系，即細(xì)胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢，還是細(xì)胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內(nèi)呢。關(guān)于這一點(diǎn)文獻(xiàn)報(bào)道不一致。本人最終采用的是后者。

5、cck8試劑加入后孵育時(shí)間，隨著時(shí)間的增加，OD值就會(huì)增大。總之原則就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再說(shuō)一下關(guān)于種板設(shè)置問(wèn)題。眾所周知周圍一圈孔因?yàn)檫吘壭?yīng)都是不用來(lái)做實(shí)驗(yàn)的。一般每組樣品我會(huì)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，得到的OD值去掉最大值與最小值，其余取平均值。我用的是排槍，會(huì)省很多力氣，但是也會(huì)增大組內(nèi)誤差。這個(gè)只有通過(guò)校正移液槍和選用最適槍頭了。

做這個(gè)實(shí)驗(yàn)我想大家遇到的最大問(wèn)題應(yīng)該是數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，組內(nèi)數(shù)據(jù)偏差大。講了很多怎樣摸條件，其實(shí)就一個(gè)原則，把OD值控制在1.0左右。數(shù)據(jù)不穩(wěn)定也只能通過(guò)增大樣品數(shù)，借助數(shù)據(jù)處理來(lái)彌補(bǔ)。還有實(shí)驗(yàn)操作一定要仔細(xì)小心，盡量平行操作。

補(bǔ)充

突然想起用酶標(biāo)儀檢測(cè)的時(shí)候還有一些細(xì)節(jié)問(wèn)題。比如孔里不能有氣泡，如果有氣泡，就用吸耳球吹掉，氣泡會(huì)很影響檢測(cè)結(jié)果。樣品板要擦拭干凈，當(dāng)然了，蓋子一定要記得拿掉啊Big Smile補(bǔ)充說(shuō)明：這幾天有同學(xué)提出了一個(gè)問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題非常好也非常關(guān)鍵：將OD值控制在1.0這個(gè)說(shuō)法是否有依據(jù)？

這里我還是想提醒大家一定要認(rèn)真閱讀試劑盒的說(shuō)明書(shū)，試想一個(gè)試劑盒的上市并且作為技術(shù)手段得到認(rèn)可需要經(jīng)過(guò)多少試驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證。我購(gòu)買(mǎi)的是同仁化學(xué)研究所的CCK8試劑盒，說(shuō)明書(shū)的P7Q23：OD值在什么范圍比較合適？答：一般情況下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比較好。

再說(shuō)到自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，酶標(biāo)儀的原理其實(shí)和紫外分光光度計(jì)是一樣的，所以UV上很多減小誤差的注意事項(xiàng)在酶標(biāo)儀上同樣受用。這就能夠理解為什么不能有氣泡，為什么要擦拭干凈樣品板了。再者熟悉UV原理的同學(xué)會(huì)了解利用紫外檢測(cè)有一個(gè)最佳檢測(cè)范圍，超過(guò)了這個(gè)范圍，數(shù)值就會(huì)呈現(xiàn)出不穩(wěn)定，無(wú)規(guī)律。（大家可以把自己的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析看看是不是數(shù)值控制在1.0附近更穩(wěn)定。）而更有甚者就是超出了儀器的檢測(cè)范圍，儀器讀數(shù)為—。一站式科研技術(shù)服務(wù)商—武漢金開(kāi)瑞生物004km.cn

我在摸條件的時(shí)候，cck8加入2.0h后檢測(cè)就出現(xiàn)過(guò)酶標(biāo)儀讀不出數(shù)據(jù)的情況。

第四篇：LDH乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法

LDH乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)

LDH釋放檢測(cè)

方法：

a.根據(jù)細(xì)胞的大小和生長(zhǎng)速度將適量細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使待檢測(cè)時(shí)細(xì)胞密度不超過(guò)80-90%滿。

b.吸去培養(yǎng)液，用PBS液洗滌一次。換新鮮培養(yǎng)液(推薦使用含1%血清的低血清培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)臒o(wú)血清培養(yǎng)液)，將各培養(yǎng)孔分成如下幾組：包括無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液孔(背景空白對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的對(duì)照細(xì)胞孔(樣品對(duì)照孔)，未經(jīng)藥物處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞孔(樣品最大酶活性對(duì)照孔)，以及藥物處理的細(xì)胞孔(藥物處理樣品孔)，并做好標(biāo)記。按照實(shí)驗(yàn)需要給予適當(dāng)藥物處理(如加入0-10μl左右特定的藥物刺激，可設(shè)置不同濃度，不同處理時(shí)間，對(duì)照孔中需加入適當(dāng)?shù)乃幬锶軇?duì)照)，繼續(xù)按常規(guī)培養(yǎng)。到預(yù)定的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前1小時(shí)，從細(xì)胞培養(yǎng)箱里取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在“樣品最大酶活性對(duì)照孔”中加入試劑盒提供的LDH釋放試劑，加入量為原有培養(yǎng)液體積的10%。加入LDH釋放試劑后，反復(fù)吹打數(shù)次混勻，然后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

c.到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400g離心5min。分別取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定。

準(zhǔn)備工作：

a.INT溶液(1X)的配置：根據(jù)所需的INT溶液(1X)的量，取適量INT溶液(10X)用INT稀釋液稀釋至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀釋液，混勻后即配置為200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配置后4℃保存可于當(dāng)天使用，不宜配置后凍存。

b.LDH檢測(cè)工作液的配制: 根據(jù)待測(cè)定的樣品數(shù)(含對(duì)照)，參考下表在臨檢測(cè)前新鮮配制適量的檢測(cè)工作液。注意：LDH檢測(cè)工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制和使用過(guò)程中均要注意適當(dāng)避光。樣品測(cè)定:

a.各孔分別加入60μl LDH檢測(cè)工作液。

b.混勻，室溫(約25℃)避光孵育30min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng))。然后在490nm處測(cè)定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。c.計(jì)算(測(cè)得的各組吸光度均應(yīng)減去背景空白對(duì)照孔吸光度)

細(xì)胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－樣品對(duì)照孔吸光度)/(細(xì)胞最大酶活性的吸光度－樣品對(duì)照孔吸光度)×100

d.可繪制細(xì)胞毒性曲線：縱座標(biāo)為實(shí)際吸光度，橫坐標(biāo)為藥物濃度；據(jù)此可計(jì)算該藥物作用特定時(shí)間的半致死劑量LD50。

第五篇：細(xì)胞凋亡總結(jié)

細(xì)胞凋亡 凋亡（apoptosis）一般是指機(jī)體細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中或在某些因素作用下，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)基因及其產(chǎn)物的調(diào)控而發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death)。一般表現(xiàn)為單個(gè)細(xì)胞的死亡，且不伴有炎癥反應(yīng)。

1．細(xì)胞凋亡的意義 細(xì)胞凋亡普遍存在于生物界，既發(fā)生于生理狀態(tài)下，也發(fā)生于病理狀態(tài)下。由于細(xì)胞凋亡對(duì)胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生（morphogenesis）、組織內(nèi)正常細(xì)胞群的穩(wěn)定、機(jī)體的防御和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時(shí)引起的細(xì)胞損傷、老化、腫瘤的發(fā)生進(jìn)展起著重要作用，并具有潛在的治療意義，至今仍是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡過(guò)多可引起疾病發(fā)生，如：①愛(ài)滋病的發(fā)展過(guò)程中，CD4+T細(xì)胞數(shù)目的減少；②移植排斥反應(yīng)中，細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞死亡；③缺血及再灌注損傷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡增多；④神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾?。ˋlzheimer病、Parkinson's?。┑闹匾蚴羌?xì)胞凋亡的異常增加。神經(jīng)細(xì)胞的凋亡參與老化及Alzheimer病的發(fā)生。Alzheimer氏病是一種常見(jiàn)的老年病，患者在臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性的智力減退。⑤暴露于電離輻射可引起多種組織細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡過(guò)少也可引起疾病發(fā)生：在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，誘導(dǎo)凋亡的基因如p53等失活、突變，而抑制凋亡的基因如bCL-2等過(guò)度表達(dá)，都會(huì)引起細(xì)胞凋亡顯著減少，在腫瘤發(fā)病學(xué)中具有重要意義；針對(duì)自身抗原的淋巴細(xì)胞的凋亡障礙可導(dǎo)致自身免疫性疾??；某些病毒能抑制其感染細(xì)胞的凋亡而使病毒存活。

2．細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化 電鏡下細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化是多階段的，可分為 ①細(xì)胞漿濃縮，核糖體、線粒體等聚集，細(xì)胞體積縮小，結(jié)構(gòu)更加緊密； ②染色質(zhì)逐漸凝聚成新月?tīng)罡接诤四ぶ苓?，嗜堿性增強(qiáng)。細(xì)胞核固縮呈均一的致密物，進(jìn)而斷裂為大小不一的片段：

③胞膜不斷出芽、脫落，細(xì)胞變成數(shù)個(gè)大小不等的由胞膜包裹的凋亡小體(apoptotic bodies)。凋亡小體內(nèi)可含細(xì)胞漿、細(xì)胞器和核碎片，有的不含核碎片；④凋亡小體被具有吞噬功能的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等吞噬、降解： ⑤凋亡發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞膜保持完整，細(xì)胞內(nèi)容物不釋放出來(lái)，所以不引起炎癥反應(yīng)。左圖 典型凋亡小體：染色質(zhì)呈新月?tīng)睿⒖梢?jiàn)細(xì)胞器 右圖 凋亡細(xì)胞：凋亡細(xì)胞(↑)與鄰近細(xì)胞分離 細(xì)胞凋亡 光鏡下凋亡一般累及單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)細(xì)胞，凋亡細(xì)胞呈圓形，胞漿紅染，細(xì)胞核染色質(zhì)聚集成團(tuán)塊狀。由于凋亡細(xì)胞迅速被吞噬，又無(wú)炎癥反應(yīng)，因此，在常規(guī)切片檢查時(shí)，一般不易發(fā)現(xiàn)，但在某些組織如反應(yīng)性增生的次級(jí)淋巴濾泡生發(fā)中心則易見(jiàn)到。病毒性肝炎時(shí)，嗜酸性小體形成即是細(xì)胞凋亡。

3．細(xì)胞凋亡的機(jī)制 細(xì)胞凋亡是一系列依賴能量的分子水平變化的終點(diǎn)，細(xì)胞凋亡過(guò)程包括以下4個(gè)階段，即：誘導(dǎo)啟動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)調(diào)控、實(shí)施和凋亡細(xì)胞的吞噬搬運(yùn)階段。

（1）誘導(dǎo)啟動(dòng) 引起凋亡的信號(hào)可以來(lái)自細(xì)胞外，通過(guò)跨膜傳導(dǎo)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控分子起作用；也可以直接作用于細(xì)胞內(nèi)的靶分子。一些跨膜作用的抑制因子(如生長(zhǎng)因子、某些激素、細(xì)胞因子、某些病毒蛋白等)具有抑制凋亡的作用，有利于細(xì)胞的生存。當(dāng)這些因子缺乏時(shí)，會(huì)激發(fā)細(xì)胞凋亡。另外一些跨膜作用的刺激因子通過(guò)受體與配體的結(jié)合而激活細(xì)胞凋亡程序，其中最重要的是腫瘤壞死因子受體家族。此外，尚有多種其它凋亡誘導(dǎo)因子。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，形態(tài)發(fā)生蛋白、生長(zhǎng)因子、分化因子對(duì)細(xì)胞凋亡可起促進(jìn)作用，又可起抑制作用。

（2）細(xì)胞內(nèi)調(diào)控 細(xì)胞內(nèi)的某些特異蛋白與細(xì)胞死亡信號(hào)相連接，這些特異蛋白對(duì)細(xì)胞的死亡與否起決定作用。BCL-2蛋白家族(BCL-2 family of proteins)是調(diào)節(jié)線粒體通透性的主要成分，通過(guò)形成同源(BCL-2/BCL-2, Bax/Bax)和異源(BCL-2/Bax)二聚體對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控。BCL-2同源二聚體抑制細(xì)胞凋亡，Bax同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，細(xì)胞表面受體Fas(CD95)，屬TNFR家族，當(dāng)免疫細(xì)胞產(chǎn)生的Fas的配體與T細(xì)胞表面的Fas結(jié)合時(shí)，也啟動(dòng)了死亡程序。這種Fas-Fas配體介導(dǎo)的凋亡在清除免疫反應(yīng)(如自身免疫病)中被激活的淋巴細(xì)胞非常重要。細(xì)胞凋亡后的梯狀DNA 足葉乙甙誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡后的梯狀DNA

（3）凋亡的實(shí)施 細(xì)胞凋亡的實(shí)施是通過(guò)蛋白水解的一系列連鎖反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。各種組織的細(xì)胞凋亡都要激活caspase家族。Caspase成員作為酶原的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)裂解激活后，迅速啟動(dòng)序列性酶解死亡程序，裂解細(xì)胞骨架和細(xì)胞核蛋白基質(zhì)并激活了核酸內(nèi)切酶。在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用下，DNA進(jìn)行有控降解，產(chǎn)生長(zhǎng)度為180～200 bp整倍數(shù)的DNA片段，這正好是纏繞組蛋白多聚體的長(zhǎng)度，提示染色質(zhì)DNA恰好是在核小體與核小體連接部被切斷。DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)ladder也成為檢測(cè)凋亡發(fā)生的重要標(biāo)志。

（4）凋亡細(xì)胞的吞噬搬運(yùn) 凋亡細(xì)胞碎片的表面有標(biāo)志分子(血小板反應(yīng)素、粘附糖蛋白)有利于臨近的巨噬細(xì)胞以及其他細(xì)胞的識(shí)別、吞噬和處理。凋亡細(xì)胞的吞噬搬運(yùn)過(guò)程非常有效而迅速，凋亡細(xì)胞很快消失，不留痕跡，也無(wú)炎癥反應(yīng)。

4．細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別 凋亡 壞死

1機(jī)制 基因調(diào)控的程序化（programmed）細(xì)胞死亡，主動(dòng)進(jìn)行（自殺性）意外事故性（accident）細(xì)胞死亡，被動(dòng)進(jìn)行（他殺性）

2誘因 生理性或輕微病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如生長(zhǎng)因子缺乏 病理性刺激因子誘導(dǎo)發(fā)生，如缺氧、感染、中毒 死亡范圍 多為散在的單個(gè)細(xì)胞 多為聚集的大片細(xì)胞

3形態(tài)特征 細(xì)胞固縮，核染色質(zhì)邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜完整，膜可發(fā)泡成芽，形成凋亡小體 細(xì)胞腫脹，核染色質(zhì)絮狀或邊集，細(xì)胞膜及各細(xì)胞器膜溶解破壞，溶酶體酶釋放，細(xì)胞自溶

4生化特征 耗能的主動(dòng)過(guò)程，有新蛋白合成，DNA早期規(guī)律降解為180-200bp片段，瓊脂凝膠電泳呈特征性梯帶狀 不耗能的被動(dòng)過(guò)程，無(wú)新蛋白合成，DNA降解不規(guī)律，片段大小不一，瓊脂凝膠電泳不呈梯帶狀

5周圍反應(yīng) 不引起周圍組織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生，但凋亡小體可被鄰近細(xì)胞吞噬 引起周圍組織炎癥反應(yīng)和修復(fù)再生

細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬的生理功能

1及時(shí)清除細(xì)胞中隨時(shí)產(chǎn)生的“垃圾”（如破損或衰老的細(xì)胞器、長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)、合成錯(cuò)誤或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)等），2維持細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài).無(wú)論是腫瘤細(xì)胞還是正常細(xì)胞，保持一種基礎(chǔ)、低水平的自噬活性是至關(guān)重要的

3.同時(shí)，自噬的產(chǎn)物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)，又可為細(xì)胞提供一定的能量和合成底物.可以說(shuō)，細(xì)胞自噬就是一個(gè)“備用倉(cāng)庫(kù)”.鑒于上述作用，在正常生理情況下，細(xì)胞自噬可以幫助細(xì)胞在缺乏營(yíng)養(yǎng)的惡劣環(huán)境中生存.自噬也可為腫瘤細(xì)胞帶來(lái)幾大好處：

（1）首先，腫瘤細(xì)胞本身就具有高代謝的特點(diǎn)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和能量的需求比正常細(xì)胞更高，但腫瘤微環(huán)境往往不能如意，如腫瘤發(fā)生初始期到血管發(fā)生之前、腫瘤長(zhǎng)大發(fā)生血管崩塌時(shí)、腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶游走時(shí)等都會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不足或供應(yīng)中斷，而此時(shí)提高自噬活性可以有助于度過(guò)這一危機(jī)

（2）（2）當(dāng)化療、放療后，腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的破損細(xì)胞器、損壞的蛋白質(zhì)等有害成分，此時(shí)提高自噬活性可及時(shí)清除這些有害物質(zhì)，并提供應(yīng)急的底物和能量為修復(fù)受損DNA贏得時(shí)間和條件.(3)另外，抑制細(xì)胞自噬可以導(dǎo)致細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡，然而，細(xì)胞自噬在腫瘤的生成和癌癥的發(fā)展中到底扮演怎樣的角色，目前還沒(méi)有取得廣泛一致的意見(jiàn).細(xì)胞自噬可以抑制細(xì)胞發(fā)生癌變，可能產(chǎn)生于以下幾種機(jī)制

(1)細(xì)胞自噬的抑制會(huì)加重壞死細(xì)胞的局部炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致腫瘤的生長(zhǎng)(2)而細(xì)胞自噬可以清除壞死的細(xì)胞器，調(diào)整內(nèi)源性的壓力，從而穩(wěn)定基因組,減少細(xì)胞向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)變.(3)細(xì)胞自噬既可以加強(qiáng)細(xì)胞檢驗(yàn)點(diǎn)的檢查作用，又起到了穩(wěn)定基因組的作用，從而減少了細(xì)胞的癌變