第一篇：2.2. 動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)教學設計
專題二 細胞工程
3.2.2.1動物細胞培養(yǎng)與核移植技術(shù)
【內(nèi)容與解析】
內(nèi)容: 本節(jié)課要學的內(nèi)容動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)指的是動物細胞培養(yǎng)的原理過程條件和體細胞核移植克隆動物的過程，其核心是動物細胞培養(yǎng)過程和核移植技術(shù)克隆動物的過程理解它關(guān)鍵就是要從大膽的想法到理論的可行再到實踐的過程。解析:學生已經(jīng)學過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，本節(jié)課的內(nèi)容動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)就是在此基礎(chǔ)上的發(fā)展。是本專題的重要內(nèi)容。教學的重點是動物細胞培養(yǎng)過程和核移植技術(shù)克隆動物的過程，解決重點的關(guān)鍵是從理論的分析遷移到具體的實施過程?！窘虒W目標與解析】 1．教學目標
（1）簡述動物細胞培養(yǎng)的過程和條件。
（2）簡述通過動物體細胞核移植技術(shù)克隆動物的過程和前景。2．目標解析（1）簡述動物細胞培養(yǎng)的過程和條件及簡述通過動物體細胞核移植技術(shù)克隆動物的過程和前景就是指了解兩個過程的基礎(chǔ)上通過理解來記住相應技術(shù)的條件或前景?！締栴}診斷分析】
在本節(jié)課的教學中，學生可能遇到的問題是無法分析出動物細胞培養(yǎng)的條件，產(chǎn)生這一問題的原因是前面所學內(nèi)環(huán)境的知識不能很好的遷移和運用。要解決這一問題，就要通過復習回顧內(nèi)環(huán)境的相關(guān)成分和穩(wěn)態(tài)的意義，其中關(guān)鍵是對內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)意義的理解?！窘虒W支持條件分析】
在本節(jié)課的兩個過程的教學中，準備使用幻燈片，有利于更形象的以圖文并茂形式板書出來。
【教學過程】
問題1：動物細胞工程的常用技術(shù)手段有哪些？最基礎(chǔ)的技術(shù)手段是什么？
設計意圖：（1）、對預習的檢測并引入新課.師生活動：（1）什么是動物細胞培養(yǎng)?(2)什么是細胞貼壁？什么是接觸抑制？(3)如何打破接觸抑制？
(4)細胞傳代培養(yǎng)代數(shù)有什么特點？動物細胞培養(yǎng)技術(shù)能應用于那些方面?(5)動物細胞培養(yǎng)需要什么條件?(6)如何保證無菌、無毒環(huán)境？
[例題]1.為了使用于培養(yǎng)的動物組織細胞分散開以便配制成一定濃度的細胞懸浮液，選取來的動物組織應選用下列哪種物質(zhì)處理
A.胃蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.鹽酸
D.胰脂肪酶
[例題]2.下列屬于動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)主要區(qū)別的是
A.培養(yǎng)基成分不同
B.動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行 C.動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能
D.動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞只能培養(yǎng)成植株
專題二 細胞工程
問題2：克隆動物采用的是什么技術(shù)? 為什么不能直接利用動物細胞培育動物體？
設計意圖：（1）、讓學生理解為什么要進行動物核移植.師生活動：（1）什么是動物體細胞核移植技術(shù)?(2)受體細胞為什么選用卵母細胞？？(3)細胞核移植技術(shù)的意義是什么？(4)體細胞核移植技術(shù)存在的問題？(5)體細胞核移植技術(shù)有那些應用?
[例題]3.在克隆多利羊的過程中，下列哪項技術(shù)沒有運用到
A.細胞培養(yǎng)技術(shù) B.細胞核移植 C.胚胎移植技術(shù) D.基因工程技術(shù)
【課堂小結(jié)】
動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù) 1）動物細胞培養(yǎng):
1、概念：
2、過程：
3、條件：
2）動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物
1、概念：
2、過程：
3、細胞核移植技術(shù)的應用前景：
4、體細胞核移植技術(shù)存在的問題： 【目標檢測】
1．下列與動物細胞培養(yǎng)有關(guān)的表述中，不正確的是
（）
A．培養(yǎng)液通常含有葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清
B．原代培養(yǎng)的細胞一般傳至10代左右便會出現(xiàn)生長停滯
C．動物細胞培養(yǎng)一般能夠傳到40～50代，但其遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變
D．動物細胞培養(yǎng)可用于檢測有毒物質(zhì)和獲得大量自身健康細胞
2．一只羊的卵細胞核被另一只羊的體細胞核置換后，這個卵細胞經(jīng)過多次分裂，再植入第三只羊的子宮內(nèi)發(fā)育，結(jié)果產(chǎn)下一只羊羔。這種克隆技術(shù)具有多種用途，但是不能
（）
A．有選擇地繁殖某一性別的家畜
B．繁殖家畜中的優(yōu)秀個體
C．用于保存物種
D．改變動物的基因型 3．下列哪—項屬于克隆
（）
A．將雞的某個DNA片段整合到小鼠的DNA分子中
B．將抗藥菌的某基因引入草履蟲的細胞內(nèi)
C．將鼠骨髓瘤細胞與經(jīng)過免疫的脾細胞融合成雜交瘤細胞
D．將某腫瘤細胞在體外培養(yǎng)繁殖成一個細胞系 4．下列屬于組織培養(yǎng)但不是克隆的是
（）
A．將花粉離體培養(yǎng)成單倍體植株
B．芽發(fā)育成枝條
C．根尖分生區(qū)發(fā)育成成熟區(qū)
D．上皮細胞無性繁殖產(chǎn)生的細胞群 5．動物細胞培養(yǎng)液和植物組織培養(yǎng)液的共有成分是
（）
A．葡萄糖
B．蔗糖
C．動物血清
D．維生素
6．單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導融合后，要用特定培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細胞。
專題二 細胞工程
在這種培養(yǎng)基上不能存活、增殖的細胞是
（）
①B淋巴細胞②小鼠骨髓瘤細胞③B淋巴細胞自身融合細胞④小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞⑤雜交瘤細胞
A．①②③④
B．①③⑤
C．②④
D．①③ 7．動物細胞培養(yǎng)的細胞來自于
（）
A．任何個體的細胞
B．只能取自動物胚胎細胞 C．只能取自幼齡動物的組織細胞
D．胚胎或幼齡動物的器官和組織細胞 8．動物細胞工程常用的技術(shù)手段中，最基礎(chǔ)的是
（）
A.動物細胞培養(yǎng) B．動物細胞融合 C．單克隆杭體 D．胚胎、核移植 9．細胞株的特點是
（）
A．遺傳物質(zhì)沒有改變，可以無限傳代
B．遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，不可無限傳代
C．遺傳物質(zhì)沒有改變，不可無限傳代
D．遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，且有癌變特點，可以無限傳代 10．關(guān)于雜交瘤細胞的不正確敘述是
（）
A．有雙親細胞的遺傳物質(zhì)
B．不能無限增殖
C.可分泌特異性抗體
D．體外培養(yǎng)條件下可大量增殖 11.動物細胞融合技術(shù)最重要的用途是
（）
A.克服遠源雜交不親和 B.制各單克隆抗體C.培育新品種
D.生產(chǎn)雜種細胞 12.“生物導彈”是指
（）
A.單克隆抗體
B.雜交瘤細胞
C.產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細胞
D.在單抗上連接抗癌藥物
13.在動物細胞培養(yǎng)中有部分細胞可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去，這種傳代細胞稱之為: A．原代培養(yǎng)
B．傳代培養(yǎng)
C．細胞株
D．細胞系
二、非選擇題
1.美國科學家斯提瓦用胡蘿卜根的懸浮培養(yǎng)細胞進行人工培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)單個細胞能像受精卵發(fā)育成胚一樣的途徑，發(fā)育成完整植株。1997年英國維爾穆特等人從白面母綿羊體內(nèi)取出乳腺上皮細胞靜息培養(yǎng)，然后把它的核移入黑面母綿羊去核的卵細胞中形成重組細胞，并將重組細胞培養(yǎng)成胚胎，將胚胎植入另一母羊的子宮內(nèi)后獲得了克隆羊多利。
閱讀這段材料后，回答下列問題：
（1）文中的懸浮培養(yǎng)細胞和乳腺上皮細胞均為____________。
（2）斯提瓦的實驗證明了____________。維爾穆特的實驗證明了_____________。從細胞結(jié)構(gòu)和遺傳角度分析，兩位科學家實驗結(jié)論的得出，根本原因在于____________。（3）斯提瓦和維爾穆特實驗的差別在于____________。（4）維爾穆特的實驗技術(shù)又稱為_____________________技術(shù)。該技術(shù)的經(jīng)濟意義在于：①_____________；②____________。
第二篇：人教版高中生物動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)(第二課時)教學設計
高中生物動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)（第二課時）教學設計
二、動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物 教學目標：
知識目標：簡述通過體細胞核移植技術(shù)克隆動物的過程和應用
能力目標：運用動物細胞的基礎(chǔ)知識，分析核移植技術(shù)的理論基礎(chǔ)，搜集有關(guān)動物細胞核移植研究進展和應用方面的資料，進行整理、分析和交流
情感目標：討論動物細胞核移植的社會意義，關(guān)注動物細胞核移植的發(fā)展和應用前景。舊課復習：
我們已經(jīng)學習了植物的組織培養(yǎng)，植物體細胞雜交，知道植物細胞可以培養(yǎng)成一棵植株，這說明植物細胞具有全能性，而動物的體細胞離開了母體，卻不能培養(yǎng)成一只動物個體難道是動物細胞沒有全能性嗎？不是。而是動物細胞高度分化，全能性比較低。
導入新課：
假如生活中我們碰到這樣的問題,比如：（展示幻燈片，問題的提出）
1997年,美國威斯康星洲的一個奶牛場有一頭高產(chǎn)奶牛叫“盧新達”,年產(chǎn)奶量為30.8噸,而我國奶牛年平均產(chǎn)奶量僅為3~4噸.用什么方法能得到更多的“盧新達”呢?學生回答克隆，其實克隆的研究從1938年就開始了。（幻燈片——克隆的歷史，多利之后還有許多的動物被克隆，今天，我們要先從多利講起）
聽說過克隆羊多利吧，可以請一位同學來說說來多利的誕生過程。(學生上臺講述多利的培育過程)我們一起來看看多利的培育過程，請問多利像誰呢？母羊A，因為多利的核基因全部來自母羊A。100%象嗎？，不，因為還有來自母羊B的細胞質(zhì)基因。這里哪個細胞是供體細胞呢，乳腺細胞，它是高度分化的體細胞。
Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細胞多莉羊的培育過程卵細胞細胞質(zhì)細胞核移植細胞核融合后的卵細胞卵裂早期胚胎胚胎移植細胞核移植C母綿羊子宮妊娠分娩多莉羊 來看課本中對克隆的定義：請大家閱讀，并劃線。教師板書：
1、概念
克隆的定義：動物核移植是將動物的一個細胞的細胞核,移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中,使其重組并發(fā)育成一個新胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體.? 用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物.? 分類:體細胞核移植和胚胎細胞核移植（根據(jù)提供細胞核的供體不同而區(qū)分）
多利羊之所以轟動全世界，并非因為它是首只克隆動物，你知道為什么它能一夜成名呢？請一位同學回答：（首先，它選用的細胞是高度分化的體細胞，其次，它是哺乳動物，意味著人可以進行體細胞核移植。所以它的誕生標志著體細胞核移植成功。胚胎時期的細胞進行細胞核移植比體細胞核移植更容易成功，這是為什么呢？原來胚胎細胞分化程度低，所以全能性較高，而體細胞分化程度高,所以全能性也就比較低了。其實我國早在20世紀70年代，就在童第周教授的帶領(lǐng)下，克隆出了魚，但是，多利一夜成名，中國的克隆魚卻默默無聞20年，這是為什么呢？（因為我們的閉塞，導致中國科學的進展不為世界所知。所以要與世界進行交流，同享科技進步成果）。
那么剛才那只盧新達奶牛能用胚胎細胞克隆嗎？（請一位同學回答）。不行，本身自己已經(jīng)過了胚胎期，如果用它的下一代的胚胎細胞，那么已經(jīng)加入了另一只公牛的基因。所以用體細胞核移植技術(shù)。因此，說體細胞核移植技術(shù)比較常用于優(yōu)秀動物個體的克隆。
下面我們通過我國成功克隆高產(chǎn)奶牛的過程來學習動物體細胞核移植的過程。請大家結(jié)合課本，看以下的幻燈片
體細卵母胞取細胞去核核使物兩理細或胞化融學合方法重組細胞重組胚胎新個體 講解該圖：（看幻燈片，牛耳細胞是高度分化的體細胞，MII時期的卵母細胞，其第一極體并未與之分開，且當受精完成后，才會完成減數(shù)分裂，釋放第二極體并與第一極體分開）去核：可用顯微操作去核法中，固定細胞的作用，吸管是做什么用的，（注入或吸出核）。用化學方法或物理方法刺激促融合并分裂，構(gòu)建重組細胞后，培養(yǎng)成重組胚胎，將重組胚胎移入受體母牛體內(nèi)，生出與供體奶牛遺傳物質(zhì)基本相同的小牛。
下面我們就整個操作過程，以前后兩桌為一個小組，討論三個問題：一是將動物體細胞核移植的概念圖填完整，還有課本第49頁的第1和第2個問題，最后我們要請三組同學派代表回答，并請別的小組進行評價，討論時間是5分鐘。討論時間：
1．在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前,為什么必須先去掉受體卵母細胞的核? 為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質(zhì)全部來自有重要利用價值的動物提供的體細胞。2．用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細胞,想一想,這是為什么? 10代到50代左右時，部分細胞核可能會發(fā)生變化 請某小組回答，請另一小組評價。
除了剛才學習的克隆牛以外，克隆動物還在不斷地被研究和培育出來，我們來看看（幻燈片，克隆動物們），同學們能不能得出體細胞核移植技術(shù)有那些應用呢：畜牧業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生方面的應用，還可以保護瀕危物種。重點了解醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域看視頻。
1． 轉(zhuǎn)基因克隆動物（轉(zhuǎn)基因后的動物進行克隆，如轉(zhuǎn)基因羊進行克隆，就可以生產(chǎn)更多含醫(yī)用蛋白）
2． 治療人類疾病，轉(zhuǎn)基因克隆動物細胞、組織和器官可以作異種移植的供體（如轉(zhuǎn)入人基因的豬）
3． 人的核移植干細胞經(jīng)誘導分化后，形成相應的組織器官。用于組織或器官移植。以克隆動物為模型，去研究疾病和衰老。
背景知識：胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）是指當受精卵分裂發(fā)育成囊胚時內(nèi)細胞團（Inner Cell Mass）的細胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ES細胞都能被誘導分化為機體幾乎所有的細胞類型。
其實克隆技術(shù)還存在著許多的問題，請大家一起來分析以下資料，看看存在什么問題： 科學家當時一共培育了277個胚胎，最后只有多利成功出生。（分析：這說明克隆成功率低）
獸醫(yī)檢查發(fā)現(xiàn)多利患有進行性肺病，研究 人員對它實施了“安樂死”。醫(yī)學專家介紹，進行性疾病指癥狀不斷加重、患者狀況不斷惡化的疾病。
羅斯林研究所所長哈里·格里芬說，綿羊通常能活11到12年，年老的綿羊肺部感染的現(xiàn)象很普遍，特別是那些在室內(nèi)生活的羊。他說，研究人員正在對多利的尸體進行詳細檢查，任何重要發(fā)現(xiàn)都會公布出來。多利的尸體將被制成標本，存放在蘇格蘭國家博物館。另外，多利今年6歲多，按綿羊的標準還是中年。（這說明克隆動物存在遺傳缺陷和生理缺陷如早衰）
觀看克隆食品上餐桌視頻，（說明克隆食品安全性有爭議）,總結(jié)出以上三個存在的問題。萬一產(chǎn)生克隆人,是否有違倫理道德? 比如美國的影片《逃離克隆島》播放片段?？寺∪艘彩侨耍荒軆H被做為器官的供體，不應該克隆人，但可以克隆需要的器官。
美國科學家2001年11月25日宣布，他們首次成功克隆了人類胚胎。但是這些科學家同時聲稱，他們這樣做的目的，不是為了克隆人，而是為了制造胚胎干細胞治療多種疾病之用，但假如某些別有用心的人去制造出克隆人的話，那后果將不堪設想。
其實科學技術(shù)是一把雙刃劍，只要能用好克隆技術(shù)，科學還是能為人類造福的 布置作業(yè)：《全線突破》P29~31。教學反思：
本節(jié)課學生的參與度教大，有一定的社會教育意義，學生自覺舉手發(fā)言，體現(xiàn)了一定的師生互動，生生互動。板書：
2.2動物細胞工程
2.2.1動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù) 一.動物細胞培養(yǎng)
二.動物體細胞核移植技術(shù)和克隆動物 1.動物核移植的概念 2.體細胞核移植(1)過程(2)應用前景(3)存在的問題
第三篇：《動物細胞培養(yǎng)》教學反思
動物細胞培養(yǎng)教學反思
楊建波
賽課已經(jīng)結(jié)束，但我的表現(xiàn)并不好。首先，引入新課不夠精彩，沒有激發(fā)學生的求知欲。我覺得應該以演員SELINA演習時皮膚大面積燒傷,治療通常是取健康皮膚進行自體移植，但對于大面積燒傷病人來講，健康皮膚很有限，如何來治療該病人作為問題引起同學們討論，引出這節(jié)課的主要內(nèi)容——動物細胞培養(yǎng)。在此之前學生已經(jīng)學過了植物組織培養(yǎng)，因此我先回顧植物組織培養(yǎng)的原理并提出了一個問題：動物細胞培養(yǎng)能否像植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？引導同學們思考兩者之間的異同。在講述培養(yǎng)過程時，學生閱讀課本自主總結(jié)和借助課件展示過程，幫助學生理解培養(yǎng)的過程及把握注意事項。本堂課上完后，我發(fā)現(xiàn)了自己有不少缺點和不足，需要在以后的教學中加以改正：1．沒有充分發(fā)揮學生的主體地位。新課程的理念是要轉(zhuǎn)變教師和學生的角色，讓學生成為課堂的主導者，而本節(jié)課仍然以傳統(tǒng)的教學模式為主，仍然是教師為主體。在實際教學過程中，主觀的想引導學生探究問題，思考問題，得出結(jié)論，而事實上學生回答問題答不到點子上，我就匆匆的把答案公布了，沒有真正做好引導工作。2．沒有充分調(diào)動學生的積極性。課堂教學的氣氛對整堂課的教學質(zhì)量是至關(guān)重要的，縱觀整節(jié)課，學生對問題的思考、回答等積極性不高。3．時間安排不夠緊湊。導致最后講動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應用時時間緊，講得比較匆忙。當然本節(jié)課的成功之處是采用了多媒體教學，使課堂的知識容量比較大，對前面學過的內(nèi)容可以比較快的復習，真正做到溫故而知新。
第四篇：高中生物專題2細胞工程2.2動物細胞工程2.2.1動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)檢測選修3教案
專題2 細胞工程
2.2 動物細胞工程 2.2.1 動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)
1．對某種動物的肝腫瘤細胞進行細胞培養(yǎng)，下列說法正確的是()A．取單個肝腫瘤細胞進行培養(yǎng)，獲得細胞群的方法不屬于克隆培養(yǎng)法 B．細胞培養(yǎng)過程中不需考慮細菌的污染問題 C．該培養(yǎng)液也能用來培養(yǎng)乙肝病毒
D．在原代培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)的細胞最終也會出現(xiàn)停止增殖的現(xiàn)象
解析：A選項的描述屬于細胞層次的克隆，A項錯誤。培養(yǎng)液受細菌污染后，其中營養(yǎng)成分要發(fā)生改變，不利于細胞的培養(yǎng)，B項錯誤。病毒的生存離不開細胞，用培養(yǎng)液不能培養(yǎng)病毒，C項錯誤。一般的細胞繁殖10代后，將停止增殖，D項正確。
答案：D 2．動物細胞培養(yǎng)過程的順序是()①原代培養(yǎng) ②傳代培養(yǎng) ③用胰蛋白酶處理組織，形成分散的細胞懸液 A．①②③
C．②①③
B．①③② D．③①②
解析：動物細胞培養(yǎng)過程的程序為選取幼齡動物或早期胚胎組織作培養(yǎng)材料→用胰蛋白酶處理組織，制備細胞懸液→原代培養(yǎng)→傳代培養(yǎng)。
答案：D 3．用于動物細胞培養(yǎng)的組織和細胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織或細胞()A．容易產(chǎn)生各種變異 C．取材十分方便
B．具有更高的全能性 D．分裂增殖的能力強
解析：用于培養(yǎng)的細胞大都取自胚胎或幼齡動物的器官或組織，主要因為胚胎或幼齡動物的器官或組織分裂能力旺盛。
答案：D 4．某研究小組為測定藥物對體外培養(yǎng)細胞的毒性，準備對某種動物的肝腫瘤細胞(甲)和正常肝細胞(乙)進行動物細胞培養(yǎng)。下列敘述正確的是()A．制備肝細胞懸液時，可用胃蛋白酶處理肝組織塊 B．恒溫培養(yǎng)箱中的CO2濃度維持在5%左右，以促進細胞呼吸 C．為了保證細胞培養(yǎng)所需的無毒環(huán)境，需大量添加各種抗生素 D．本實驗應設置對照實驗，以檢測藥物對甲、乙的毒性大小
解析：在利用肝組織塊制備肝細胞懸液時，常用胰蛋白酶，不能使用胃蛋白酶，因為胃蛋白酶需要在強酸環(huán)境下才能起作用，但這樣的環(huán)境不適于細胞生存，A項錯誤；細胞培養(yǎng)應在含CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行，CO2的作用是維持培養(yǎng)液的pH值，B項錯誤；抗生素是用來殺菌的，不是殺病毒的，C項錯誤；本實驗應設置對照實驗，用添加甲藥物、乙藥物的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)細胞，根據(jù)變異細胞占培養(yǎng)細胞的比例，以檢測藥物對甲、乙的毒性大小，D項正確。
答案：D 5．如圖表示動物細胞培養(yǎng)程序圖，請據(jù)圖回答下列問題。
①取動物組織塊
↓ ②________
③處理組織分散成單個細胞
↓ ④制成________
↓
⑤轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)
↓
⑥處理貼壁細胞分散成單個細胞，制成________
↓
⑦轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)
(1)過程②表示________________________________________。
(2)過程③和⑥用________處理組織或貼壁細胞分散成單個細胞，這樣做的目的是_______________________________________ ________________________________。
(3)④和⑥的過程都要把分散的細胞制成__________________。(4)過程⑤進行的細胞培養(yǎng)是________，細胞適于____生長增殖。
(5)過程⑦進行的細胞培養(yǎng)是________，一般傳至______代后就不易傳下去了，傳至________繼續(xù)培養(yǎng)時，增殖會逐漸緩慢，以至于完全停止，部分細胞的________會發(fā)生改變。繼續(xù)培養(yǎng)時，少部分細胞發(fā)生了________，朝著等同于________的方向發(fā)展。
解析：進行動物細胞培養(yǎng)時，首先將組織塊剪碎，用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理，使其分散成許多單個細胞，然后，用培養(yǎng)液將分散的細胞稀釋制成細胞懸液，再將細胞懸液放入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于適宜環(huán)境中培養(yǎng)。懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。以后，細胞進行有絲分裂，數(shù)目不斷增多。當貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就 會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。人們通常將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。貼滿瓶壁的細胞需要重新用胰蛋白酶等處理，然后分別繼續(xù)培養(yǎng)，讓細胞繼續(xù)增殖，這樣的培養(yǎng)過程通常被稱為傳代培養(yǎng)。
答案：(1)剪碎組織(2)胰蛋白酶 解除由于接觸對細胞生長和繁殖的抑制(3)細胞懸液(4)原代培養(yǎng) 貼壁(5)傳代培養(yǎng) 10 10～50代 細胞核型 突變 癌細胞
A級 基礎(chǔ)鞏固
1．動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)的重要區(qū)別在于()A．培養(yǎng)基不同
B．動物細胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進行 C．動物細胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細胞不能
D．動物細胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細胞只能培養(yǎng)成植株
解析：此題考查的是動物細胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)的區(qū)別與聯(lián)系。動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基與植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基不同，動物細胞一般用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，而植物組織培養(yǎng)一般用固體培養(yǎng)基，與植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基相比，動物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中還要加動物血清等，A項正確。它們都是在無菌條件下進行的，都可以傳代培養(yǎng)，且都能夠大量培養(yǎng)。B、C、D項的敘述有誤。
答案：A 2．下列關(guān)于動物細胞培養(yǎng)的說法正確的是()A．連續(xù)細胞系不具有異倍體核型
B．動物組織細胞間的膠原纖維可用纖維素酶水解
C．原代培養(yǎng)細胞、有限細胞系比無限細胞系、腫瘤細胞更容易克隆 D．提高動物細胞克隆形成率需要以滋養(yǎng)細胞支持生長及激素刺激等條件
解析：連續(xù)細胞系大多數(shù)具有異倍體核型；動物組織細胞間的膠原纖維的主要成分是膠原蛋白，可以用胰蛋白酶酶解，不能用纖維素酶水解；在進行細胞克隆時，原代細胞、有限細胞系通常不如無限細胞系、腫瘤細胞。
答案：D 3．一只羊的卵細胞被另一只羊的體細胞核移植后，這個卵細胞經(jīng)過多次分裂，再植入第三只羊的子宮內(nèi)發(fā)育，結(jié)果產(chǎn)下了一只羊羔，這種克隆技術(shù)具有多種用途，但是不能()A．有選擇地繁殖某一性別的家畜 B．繁殖家畜中的優(yōu)秀個體 C．用于保存物種 D．改變動物的基因型
解析：目前的克隆技術(shù)是將動物的一個細胞的細胞核植入一個去核的卵細胞，經(jīng)過試管 培養(yǎng)一段時間后，再移入另一個體的子宮內(nèi)發(fā)育、分娩的技術(shù)。通過該技術(shù)能夠保持親本的優(yōu)良性狀，保持性別不變，也能夠用于保存物種，但不能改變動物的基因型。
答案：D 4．據(jù)英國《衛(wèi)報》披露，紐卡斯爾大學研究人員不久前成功實現(xiàn)一項生殖醫(yī)學技術(shù)，將患有線粒體疾病婦女的受精卵中的細胞核移植到健康婦女捐獻的去核卵子中，最終產(chǎn)下了健康的嬰兒。下列敘述錯誤的是()A．此項技術(shù)的基礎(chǔ)是動物的細胞和組織培養(yǎng) B．此項技術(shù)的原理與克隆羊“多莉”完全相同
C．健康婦女捐獻的卵子的細胞質(zhì)具有調(diào)控移入細胞核發(fā)育的作用 D．嬰兒出生后具有患病夫婦以及捐獻健康卵子的婦女三方的遺傳特征
解析：動物克隆技術(shù)的基礎(chǔ)是動物細胞和組織培養(yǎng)，A項正確；此項技術(shù)用的受精卵的細胞核，而克隆羊用的是高度分化的乳腺細胞，分化程度不同，B項錯誤；卵細胞的細胞質(zhì)具有調(diào)控移入細胞核發(fā)育的作用，C項正確；該嬰兒細胞的核基因由形成受精卵的夫婦提供，質(zhì)基因由提供去核卵子的婦女提供，D項正確。
答案：B 5．2015年2月3日，英國國會表決同意允許醫(yī)學界利用3個人的基因共同育子，成為全世界第一個準許“三親育子”的國家?！叭H育子”技術(shù)是將父母細胞核基因與一位婦女捐贈者的健康線粒體結(jié)合在一起，引入的基因只占嬰兒總基因的0.1%。這項技術(shù)旨在防止因線粒體基因缺陷引起的嚴重遺傳疾病。下列相關(guān)描述正確的是()A．線粒體基因缺陷引起的遺傳病是母系遺傳病，傳女不傳男 B．“三親育子”可能會用到人工授精技術(shù)、胚胎移植技術(shù)等
C．通過“三親育子”技術(shù)得到的“三親嬰兒”的健康線粒體基因不一定能傳給其后代 D．若父親患有線粒體基因缺陷病，需要通過“三親育子”技術(shù)避免將有缺陷的基因傳給下一代
解析：線粒體基因缺陷引起的遺傳病是母系遺傳病，是由母親的卵細胞傳給子代的，表現(xiàn)為母親患病子女都患病，A項錯誤；“三親育子”技術(shù)主要利用的是胚胎工程技術(shù)，目前在生產(chǎn)實踐中應用較多的是體外受精、早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植，B項錯誤；通過“三親育子”技術(shù)得到的“三親嬰兒”如果是個女孩，其健康線粒體基因可以通過卵細胞傳給其后代，如果是個男孩，其健康線粒體基因一般不能通過精子傳給子代，C項正確；精子的線粒體都集中在尾部，且受精時只有精子的頭部進入卵細胞，故男子的線粒體基因一般不能通過精子傳給子代，若父親患有線粒體基因缺陷病，子代一般不會患病，D項錯誤。
答案：C
B級 能力訓練
6．回答下列有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的問題：(1)在動物細胞培養(yǎng)過程中，當貼壁細胞分裂生長到細胞表面相互接觸時，細胞會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的________。此時，瓶壁上形成單層細胞，這種單層培養(yǎng)法的出現(xiàn)，對細胞培養(yǎng)的發(fā)展起了很大的推動作用。
(2)隨著細胞傳代次數(shù)的增多，絕大部分細胞分裂停止，但極少數(shù)細胞克服細胞壽命的自然極限，獲得________，朝著等同于癌細胞的方向發(fā)展，該種細胞由于細胞膜上________減少，導致細胞間的黏著性________。
(3)在動物細胞體外培養(yǎng)過程中，一般要滿足四個方面的條件：無菌無毒的環(huán)境、營養(yǎng)、溫度、pH及氣體環(huán)境，其中在培養(yǎng)液中添加________，以防培養(yǎng)過程中的污染；由于人們對細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)還沒有完全搞清楚，故在使用合成培養(yǎng)基時，通常需加入________等天然成分；氣體環(huán)境主要是提供細胞所需的O2和CO2，其中O2的作用是_____________，CO2的作用是______________________。
(4)動物細胞培養(yǎng)可用于檢測某種物質(zhì)的毒性大小，若用被檢測物質(zhì)培養(yǎng)的細胞與對照組相比，發(fā)生變異的細胞數(shù)目所占的百分比大，則該物質(zhì)的毒性大，判斷的依據(jù)是________________________。
答案：(1)接觸抑制(2)不死性 糖蛋白 降低
(3)抗生素 血清、血漿 供給細胞進行有氧呼吸 維持培養(yǎng)液的pH(4)物質(zhì)的毒性越大，越容易導致細胞發(fā)生變異
7．某生物興趣小組對一種抗癌新藥進行實驗時，以動物肝癌細胞為材料，測定抗癌藥物對體外培養(yǎng)細胞增殖的影響。請回答下列有關(guān)動物細胞培養(yǎng)的問題。
(1)在動物細胞培養(yǎng)時，將細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)按其種類和所需數(shù)量嚴格配制而成的培養(yǎng)基稱為________培養(yǎng)基。通常在培養(yǎng)基中還需要加入適量________等一些天然成分。細胞培養(yǎng)應在含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行，CO2的作用是________________。另外，還應該保證被培養(yǎng)的細胞處于________、________的環(huán)境。
(2)在細胞生長過程中，當細胞貼壁生長到一定程度時，其生長會受到抑制，這種現(xiàn)象稱為________。
(3)為了防止細胞培養(yǎng)過程中細菌的污染，可向培養(yǎng)液中加入適量的________。(4)請你幫助興趣小組的同學分析本實驗，實驗的自變量是________________，實驗組和對照組除了自變量不同外，其他處理均應該相同，這是為了遵循實驗設計的________原則。
解析：(1)將動物細胞所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)按其種類和所需數(shù)量嚴格配制而成的培養(yǎng)基，稱為合成培養(yǎng)基。由于對細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)還沒有完全搞清楚，因此，在使用合成培養(yǎng)基時，還要加入一些動物血清、血漿等天然成分。細胞培養(yǎng)所需的氣體中有CO2，作用是維持培養(yǎng)液的pH。被培養(yǎng)的細胞必須處于無菌、無毒的環(huán)境中，才能保證細胞正常地生長增殖。(2)動物細胞在分裂過程中有接觸抑制的現(xiàn)象。(3)抗生素能殺死培養(yǎng)基中的微生物，保證無菌無毒環(huán)境。(4)要測定抗癌藥物對體外培養(yǎng)細胞增殖的影響，實驗的自變量為抗癌藥物的有無。其他無關(guān)變量應該相同，否則會干擾實驗結(jié)果，這種設計遵循的是實驗的單一變量原則。
答案：(1)合成 血清、血漿 維持培養(yǎng)液的pH 無菌 無毒(2)接觸抑制(3)抗生素(4)是否加入抗癌藥物 單一變量
8．美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭奶牛，年產(chǎn)奶量達30.8 t，我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為3～4 t。某人用該高產(chǎn)奶牛的耳朵細胞，采用核移植技術(shù)獲得高產(chǎn)奶牛(如下圖)。
(1)目前完成①的方法有______________、________________、________________、化學物質(zhì)處理等。
(2)③過程中選擇去核卵母細胞作為受體細胞的原因是 _______________________________________________________ ______________________________________________________。(3)④過程所利用的技術(shù)是_____________________________。其原理是______________________________________________ __________________________。
(4)該實驗的成功說明已分化的耳朵細胞的細胞核中含有與________一樣的全套基因，這種繁殖方式屬于______________。
解析：進行動物體細胞核移植需用去核的卵母細胞作受體細胞，對構(gòu)建的重組細胞需經(jīng)歷動物細胞培養(yǎng)，并誘導形成早期胚胎。重組細胞能夠培育為動物體，表明動物細胞核具有全能性；克隆動物屬無性繁殖。
答案：(1)顯微操作去核 梯度離心 紫外光短時間照射
(2)卵母細胞體積大，易操作，營養(yǎng)物質(zhì)豐富，且細胞質(zhì)中含有激發(fā)細胞核全能性表達的物質(zhì)(3)動物細胞培養(yǎng) 細胞增殖(4)受精卵 無性繁殖
9．華南虎是原產(chǎn)中國的老虎品種，已有近30年沒有野生華南虎出現(xiàn)的報告，野生華南虎也被一些專家認為已經(jīng)瀕臨滅絕?？茖W工作者嘗試用普通老虎完成體細胞克隆華南虎的研究，下圖是其培育過程，請據(jù)圖回答：
(1)克隆華南虎的遺傳性狀與________(填字母)虎基本一致。(2)A、B、C 3只虎哪一只沒有提供遺傳物質(zhì)？________。(3)克隆華南虎的過程是否遵循孟德爾的遺傳定律？為什么？ _______________________________________________________ _______________________________________________________ ______________________________________________________。
(4)有人設想將虎的體細胞與牛的體細胞進行融合，以期獲得新物種“虎—?！?，你認為依據(jù)目前的生物技術(shù)和理論能否實現(xiàn)這一愿望？________。原因是______________________________________ _____________________________________________________。
解析：(1)由克隆華南虎的過程可知，華南虎A提供細胞核，華南虎B提供細胞質(zhì)，所以克隆虎D的遺傳性狀與供核的A更接近，即相當于克隆了A。(2)老虎C只提供胚胎發(fā)育的場所，沒有提供遺傳物質(zhì)給D。(3)核移植過程沒有經(jīng)過兩性生殖細胞的結(jié)合，屬于無性生殖，沒有減數(shù)分裂方式的出現(xiàn)，不遵循孟德爾遺傳定律。(4)無論是高度分化的動物體細胞，還是不同種動物體細胞融合后的雜交細胞，經(jīng)細胞培養(yǎng)只會細胞增殖，不會發(fā)生細胞分化，形成不了個體，動物體細胞的全能性無法體現(xiàn)。
答案：(1)A(2)老虎C(3)不遵循。克隆屬于無性生殖，而孟德爾的遺傳定律僅在有性生殖的減數(shù)分裂過程中起作用
(4)不能 高度分化的動物細胞全能性受到限制，虎和牛體細胞雜交后得到的雜交細胞不能正常發(fā)育成完整個體。
第五篇：動物細胞培養(yǎng)總結(jié)! !!!
動物細胞培養(yǎng)總結(jié) 一．實驗準備
1.實驗器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包裝
離心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，凍存管若干放進鋁飯盒，用牛皮紙包裹，系緊棉繩，用筆在飯盒上和牛皮紙上標記盒內(nèi)所裝物品名稱、數(shù)量、日期和所屬人名稱。
藍槍頭兩盒，黃槍頭白槍頭各一盒用牛皮紙包裹，用棉繩扎緊。取適量蒸餾水于4L玻璃瓶，瓶蓋擰松半圈。
過濾器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自來水毛刷洗滌劑刷洗，蒸餾水潤洗，烘干。
過濾器兩部分分別包裹，先將瓶口部位用錫紙包裹后，再罩以牛皮紙，再用棉布密包起來，用棉繩扎緊。
玻璃瓶擰下瓶蓋，瓶身浸酸。浸酸時應注意安全，須穿戴耐酸手套和白大褂，注意保護好面部和身體裸露部分，提前備好一盆水在旁以便浸酸結(jié)束后清洗耐酸手套，防止走動時酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意緩慢降低瓶身，使液體慢慢浸入瓶內(nèi)，以免產(chǎn)生氣泡濺出酸液，發(fā)生危險。浸酸時器皿要充滿酸液，勿留氣泡，浸泡過夜。取出瓶身時，須穿戴耐酸手套和白大褂，注意保護好面部和身體裸露部分，提前備好一盆水在旁，取出后將瓶身放入盆內(nèi)水中在轉(zhuǎn)移至水池邊清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。換水洗幾次，待水澄清后開始沖洗，每瓶都用自來水灌滿，倒掉，重復15次，再用蒸餾水漂洗5次，去離子水漂洗3次，烘干備用。（2）消毒滅菌
1>全自動高壓滅菌鍋：插電源，打開開關(guān)，檢查水位，若水位不足加蒸餾水補足，放入物品，瓶類物體須擰松蓋子后放最上面一筐，蓋上滅菌鍋蓋，擰緊蓋子至溫度顯示欄的左上角有一紅點亮燈，按start開始升溫。若滅有無菌水或玻璃瓶待降溫至常溫再打開，打開后立即擰緊，無菌水瓶口封上封口膜。若沒滅瓶類物品，降溫至80度左右即可打開滅菌鍋，須戴上線手套取出。
2>手提式高壓滅菌鍋：插電源，打開開關(guān)，檢查水位，若水位不足加蒸餾水補足，檢查設定是否為121度20分鐘，放入物品，蓋上滅菌鍋蓋，注意導氣管一定插到鍋底并不能堵塞，用手對稱地擰緊鍋蓋螺栓，再用扳手繼續(xù)擰緊。加溫升壓之前，先打開排氣閥門，加溫約半小時后見排氣閥處開始排殘留在鍋內(nèi)的冷空氣，排氣五分鐘，關(guān)閉排氣閥，繼而開始升壓。滅菌后不要立即打開氣閥放氣以免水汽噴出。待自然降溫至常壓才能打開氣閥。
玻璃瓶須擰緊，飯盒，槍頭滅菌后放入烘箱烘干備用。2.無菌間消毒及設備檢查
用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兌水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔細擦拭CO2培養(yǎng)箱，超凈臺，超凈臺內(nèi)物品，顯微鏡，桌面，若培養(yǎng)箱內(nèi)未培養(yǎng)細胞可以再打開高溫滅菌模式將培養(yǎng)箱滅菌一次。
用蒸餾水擦拭清洗水浴鍋內(nèi)壁，注意底座不要沾水。檢查CO2總壓力表，若讀數(shù)不足四分之一提前預定CO2瓶，換瓶時需要扳手。CO2培養(yǎng)箱最下層的增濕盤須定期觀察加水，將增濕盤內(nèi)注入1/2無菌蒸餾水，并將盤直接放置在培養(yǎng)箱中央。啟動培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱接通電源，增濕盤加水，連接好氣體供給，檢查有無漏氣，輸入系統(tǒng)設置。設置溫度和二氧化碳。
紫外照射無菌間30分鐘，注意屋內(nèi)不要有人以及培養(yǎng)基等試劑。3.細胞培養(yǎng)用液的配置及分裝
RPM1640培養(yǎng)基配制：將干粉型RPM1640培養(yǎng)基溶于總量1/3的去離子水中，再用1/3水沖洗包裝內(nèi)2次，倒入培養(yǎng)基中，以保證所有干粉都溶解成培養(yǎng)液，根據(jù)產(chǎn)品說明的要求和實驗補加谷氨酰胺和NaHCO3 ,傾斜三角瓶輕輕放入轉(zhuǎn)子，用磁力攪拌器攪拌2h。用泵使培養(yǎng)基在超凈臺內(nèi)通過滅菌的過濾器，過濾除菌，分裝后置4度冰箱保存?zhèn)溆?。使用前調(diào)pH至7.0，加雙抗于培養(yǎng)液中濃度為1%，使用時加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的處理：使用前應做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體，將胎牛血清放入56度水浴中30分鐘，其間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。分裝前提前2天放4度冰箱解凍，溶解完全后于超凈臺內(nèi)分裝為25ml每管，留2管放四度備用，余下放-20度凍存。配制含血清培養(yǎng)基或凍存液前務必提前一天取出分裝后的血清四度溶解備用，血清融化很慢。
5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸餾水，NaHCO3溶于水后，過濾除菌。0.25%胰蛋白酶液200ml在超凈臺內(nèi)分裝成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度備用。
雙抗溶液配制：80萬單位青霉素加4ml滅菌D-Hanks液，即成20萬單位/ml溶液。100萬單位鏈霉素加5ml滅菌的D-Hanks液，即成20萬單位/ml溶液。兩溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，則成含青鏈霉素各1萬單位/ml，分裝后置于4度冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
二．操作步驟 注意事項：
1、所有實驗用的器械，儀器滅菌，消毒，烘干。
2、打開溶劑，培養(yǎng)瓶瓶蓋時，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下。
3、用完溶劑，培養(yǎng)瓶時，瓶口及瓶蓋也要在酒精燈上烤一下。
4、所有物品放入超凈臺需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗內(nèi)時需要重新用酒精棉擦拭。開始工作：
1、實驗前換紫外照過的白大褂和拖鞋。
2、戴橡膠手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下臺面，點燃酒精燈。
3、取待用的細胞，旋緊瓶蓋。
4、胰酶消化緩慢時可以將細胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促進消化。1.細胞復蘇
提前預冷離心機，設參數(shù)為4度，1000r/min,5min。
將槍頭，裝有離心管的飯盒，垃圾盒放入超凈臺，酒精棉擦一遍超凈臺臺面和移液器尤其槍口，以防別人用槍時不慎沾染臟污堵塞槍口。超凈臺和房間照15分鐘紫外，照紫外的同時取出無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基37度水浴加熱。
關(guān)閉紫外，打開風機，升高窗高，點燃酒精燈，用鑷子從飯盒中取2個15ml離心管放至試管架，每管加入3ml無血清培養(yǎng)基，提前剪好2條封離心管的封口膜備用。
戴上橡膠手套再套上線手套，用鑷子從液氮中取出塑料凍存管，用手拿凍存管迅速浸入37度水浴中，劇烈急速搖晃凍存管，因為有防水膠布纏裹不用擔心進水染菌，使其急速融化，注意管內(nèi)凍存細胞的融化情況?；巨D(zhuǎn)為液態(tài)時將凍存管取出，摘下線手套，凍存管轉(zhuǎn)移至超凈臺內(nèi)，用酒精擦手，擦拭凍存管尤其管口，撕下膠布和封口膜，再擦拭管口，整個溶解過程盡量在30s至1min內(nèi)完成。(注意：這一步對細胞存活率至關(guān)重要。既要盡快融化以減少融化過程對細胞的損害，又要盡可能減少細胞在較高溫度停留的時間以減少DMSO對細胞的毒害，切不可將凍存管放在燒杯內(nèi)不管。)打開凍存管管蓋，逐滴加入1ml無血清培養(yǎng)基，輕柔地將凍存管內(nèi)的細胞懸液吸取出來，轉(zhuǎn)移至已備好的離心管內(nèi)，輕輕搖混勻，蓋上管蓋，輕輕地上下顛倒混勻。封上封口膜。
低俗離心1000r/min,5min。小心地吸出上清液，要求上清液盡可能吸走，同時又不觸及管底沉淀的細胞。（較高要求時可以用手指輕彈離心管管底，將細胞團分散，加入10ml無血清培養(yǎng)基混勻離心10min棄上清再洗一次，有助于減少DMSO殘留。）加3至5ml培養(yǎng)液至沉淀的細胞，輕輕搖晃使分散成細胞懸液，將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，擰緊蓋子，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中再反旋擰松半圈，以利于瓶口內(nèi)外進行氣體交換，注意取出培養(yǎng)瓶時須先擰緊瓶口。37度恒溫箱中培養(yǎng)。第二天觀察細胞生長情況。培養(yǎng)基瓶蓋過火，擰緊后封上封口膜。收好物品，擦一遍臺子，滅酒精燈。2傳代培養(yǎng)
附著型胞(adherentcell)傳代培養(yǎng)
離心法提前預冷離心機，設置好參數(shù)4度，1000r/min,5min。倒液法不需要。
將滅菌槍頭，裝有離心管的飯盒，新培養(yǎng)皿/瓶,垃圾盒放入超凈臺，酒精棉擦一遍超凈臺臺面和移液器尤其槍口，以防別人用槍時不慎沾染臟污堵塞槍口。超凈臺和房間照15分鐘紫外，照紫外的同時從冰箱取出PBS,胰酶，含血清培養(yǎng)基于37度水浴加熱。關(guān)閉紫外，打開風機和照明，升高窗高，點燃酒精燈，將所需試劑先擦瓶底，放在臺子上再擦側(cè)壁一圈，擦瓶口瓶蓋，撕下封口膜，再仔細擦一遍瓶口。用噴過酒精的塑料筐將細胞培養(yǎng)瓶擰緊蓋子拿到超凈臺旁的椅子上放平放穩(wěn)，每三瓶/皿一摞拿入超凈臺先擦最下面一個的底部，擦好后放在臺面上，擦一摞的側(cè)面一圈，在分別擦底面頂面瓶口，直到所有培養(yǎng)瓶各個面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker標記字跡的部位，酒精會擦掉字跡，若擦到字跡待酒精干后立即補寫上以防事后記不清。
輕輕倒掉舊培養(yǎng)液，注意不要使液體倒流回來沖擊細胞，掛在外壁的殘留液滴用酒精棉擦掉,培養(yǎng)瓶可以輕輕翻轉(zhuǎn)瓶子使細胞生長的面在上，頂面在下，液體留至頂面后直接倒掉液體。加1ml PBS，注意槍沖著不長細胞的培養(yǎng)皿側(cè)壁或翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶朝瓶的頂壁或側(cè)壁打入PBS，盡量不碰到瓶口或培養(yǎng)皿，若懷疑碰壁，棄掉槍頭。輕輕搖晃培養(yǎng)皿或瓶，使PBS沾到所有細胞，洗滌細胞一遍，輕輕倒掉PBS。
加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀釋（0.25%為1X胰酶），37℃作用數(shù)分鐘。等待消化期間準備好新的培養(yǎng)皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培養(yǎng)基。消化中的皿蓋好蓋子或瓶擰緊蓋子，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀，有10%細胞漂動時，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰酶作用。(若細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀且80%細胞漂動，則不移去胰酶，在胰酶作用后，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止胰酶作用，吹打成細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，封上封口膜，離心后再吸掉上清液。）
輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，以吸管上下輕輕吸放數(shù)次以打散細胞團塊，注意吹打時有系統(tǒng)性的將所有面積都打到不要集中只吹打一處而一些地方?jīng)]吹打到，吸和吹時槍頭都不要離開液面以減少氣泡，氣泡多破裂時對細胞有沖擊且會增加體積不利于操作，培養(yǎng)瓶吹打時操作角度小不方便，用倒液法（10%細胞漂動即倒掉胰酶加含血清培養(yǎng)基終止消化）時吹打細胞要用二檔多吹打幾次，用皿或離心法（80%細胞飄動不棄胰酶直接加含血清培養(yǎng)基再離心棄上清）時細胞很容易脫落，可以用一檔輕輕吹打，保證所有面積都吹打到即可?；旌途鶆蚝?，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，擰緊瓶蓋，鏡下觀察細胞數(shù)量多，培養(yǎng)液澄清，若細胞密度過低將影響生長可適當補充細胞懸液，若細胞密度過大將影響迅速生長一天后即需傳代，可根據(jù)實驗適當添加培養(yǎng)基或細胞懸液使生長速度符合預期，轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱，擰松半圈瓶蓋，37度培養(yǎng)。試劑瓶瓶蓋過火，擰緊后封上封口膜。密封收好物品。擦一遍臺子，滅酒精燈。
3細胞換液
取待用的細胞，旋緊瓶蓋。
棄去舊的培養(yǎng)液，把培養(yǎng)瓶放回原處。
用微量槍加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細胞，然后將PBS緩沖液棄掉。
用微量槍加入適量的細胞培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中。旋緊瓶蓋。將細胞置于5%CO2、37度培養(yǎng)箱，反旋擰松瓶蓋半圈，培養(yǎng)。
4細胞凍存 1>準備工作：
提前一天將血清FBS從-20度取出放在4度冰箱解凍。選取對生增生期細胞（鏡下密密麻麻，胞體突觸明顯），在收集細胞24h前換液一次。
進入細胞室前，首先用75%酒精擦試工作臺，接著紫外滅菌30，過后，關(guān)閉紫外燈，通風10min。從冰箱中取出胰酶、PBS緩沖液、培養(yǎng)基，血清37度水浴。取出室溫放置的DMSO。找到防水的醫(yī)用膠布，濾菌膜，針管和所需槍頭飯盒等物品，噴一遍酒精，放入臺子照紫外。2>開始工作：
實驗前在更衣間換上紫外照過的白大褂和拖鞋。戴上橡膠手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下臺面，點燃酒精燈。酒精擦拭胰酶、PBS緩沖液、培養(yǎng)基放入超凈臺。過火鑷子取出離心管于試管架，剪好封口膜備用。用濾菌膜和針管過濾DMSO以除菌。
75%無血清培養(yǎng)基，20%的血清，5%過濾除菌的DMSO，混勻配制成所需的凍存液。
取待用的細胞，旋緊瓶蓋。
棄去舊的培養(yǎng)液，掛壁殘液注意用酒精棉擦去，用微量槍朝不長細胞的側(cè)壁或頂部打槍，加入適量的PBS緩沖液，緩慢蕩洗一下細胞，然后將PBS緩沖液棄掉。用微量槍朝不長細胞的側(cè)壁或頂部打槍，加入適量胰酶約2ml，棄掉槍頭。消化數(shù)分鐘，等待期間，用過火鑷子從飯盒中取出凍存管和管蓋標記好細胞名稱和凍存日期，直立于臺面?zhèn)溆谩?/p>
用微量槍加入適量的完全培養(yǎng)液沖洗（吹散細胞）細胞，將瓶底粘著的細胞吹散下來，再將細胞懸液移入的離心管中，封口，標簽。離心5min，1000轉(zhuǎn)/min。
細胞離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液。用微量槍將凍存液平均加入離心管中，混勻離心管中細胞凍存液。用微量槍將含細胞的凍存液移入凍存管中，封口膜封口，防水醫(yī)用膠布再纏一圈，標簽時間，細胞名稱。
凍存，需緩慢凍存，先放置4度冰箱20min，然后放置-20度冰箱30min，再置于-80度冰箱過夜，最后置于液氮灌-196度中保存。5 鋪板和細胞計數(shù)
用傳代方法制成細胞懸液。倒掉培養(yǎng)基，用PBS液洗滌后，0.25%的胰蛋白酶液消化，加入培養(yǎng)液吹打制成待測細胞懸液轉(zhuǎn)至離心管，封上封口膜，離心1000r/min,5min。
等待離心其間，取細胞計數(shù)板，蓋玻片酒精擦拭，均在酒精燈上烤一下，將蓋玻片蓋在細胞計數(shù)槽上，使覆蓋細胞計數(shù)板上的上下兩個“十字”區(qū)域。取一只新的15ml離心管，做好標記，擺放好。離心畢，拆封，瓶口及瓶蓋在酒精燈上烤一下，棄去上清液，加入全培養(yǎng)液吹散沉淀細胞成細胞懸液，擰緊管蓋，上下顛倒混勻。用槍吹打混勻離心管中含完全培養(yǎng)液的細胞，再從離心管中取1ml細胞懸液移入新的15ml離心管，加入4ml完全培養(yǎng)液，即稀釋五倍，吹打混勻細胞懸液，上下顛倒混勻細胞懸液。
上下顛倒混勻新15ml離心管內(nèi)細胞懸液，計數(shù)前將待測液吹打均勻，用微量槍從新15ml離心管中取出細胞懸液（約10μl），滴入計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)縫隙旁，虹吸作用液體會吸入蓋玻片下（不能有氣泡，不然會影響細胞計數(shù)，注意滴入懸液量不能太大致使細胞懸液流入旁邊的槽中），鏡下觀察細胞，數(shù)出計數(shù)板四角大方格中的細胞數(shù)（16個小格×4個大格），用計數(shù)器計數(shù)（約200個）
細胞數(shù) 萬個/mL原液=（4大方格細胞數(shù)之和/4）×稀釋倍數(shù)（常稀釋5倍，若細胞過多不能數(shù)清則加大稀釋倍數(shù)，不斷調(diào)整新離心管中細胞懸液的細胞濃度，直至鏡下觀察細胞數(shù)目符合要求。）每皿/瓶需鋪板50-100萬個細胞，根據(jù)細胞計數(shù)算出每皿所細胞懸液需毫升數(shù)，加入懸液時注意混勻，不得有氣泡，吸時注意每次槍尖是否都吸滿液體。每皿加入細胞懸液后，用含血清培養(yǎng)基補足至2ml/皿/瓶。24h后觀察細胞長至八成滿時即可加藥處理。
6檢驗判斷細胞狀態(tài)與加藥處理
細胞復蘇或傳代后24內(nèi)不可傳代，傳代4小時后開始貼壁。1>培養(yǎng)基顏色澄清度：
正常生長的細胞培養(yǎng)基澄清透明，傾斜使培養(yǎng)基聚集，對著燈看可透光，若出現(xiàn)絲狀沉淀或傾斜培養(yǎng)基對著燈看出現(xiàn)渾濁不透光且鏡下細胞之外的部分有密密麻麻的小黑點，很可能是染菌，應棄掉。若鏡檢在細胞之外部分有一些渾濁，可能因為細胞代謝旺盛分泌物堆積，或者因為消化時間不夠以至于過度強硬吹打細胞，造成細胞損傷產(chǎn)生大量細胞碎片，應換液。
新鮮培養(yǎng)基呈粉紅色，代謝代謝旺盛的細胞的培養(yǎng)基會變黃，此時若細胞貼壁應換液，若此時細胞已長滿，應傳代。2>密度：
細胞密度過低，鏡下觀察稀稀疏疏，則生長緩慢，甚至死亡。較大的細胞密度可促進細胞之間相互作用，促進細胞增殖生長。密度過大，密密麻麻，部分細胞不能伸展成圓形，必須傳代，此時不傳代，一兩天后細胞狀態(tài)持續(xù)不好，開始死亡，鏡檢漂浮細胞增多。3>狀態(tài)：
鏡下觀察細胞，當左右上下移動鏡頭時漂動的是未貼壁細胞或死細胞，固定不動的是貼壁細胞，貼壁細胞是活細胞。
狀態(tài)良好的貼壁SY5Y細胞有圓形的胞體和細細分支的突觸，突觸分明。狀態(tài)不好的SY5Y細胞，突觸不明顯，看不到什么細細的分支，甚至成圓形。
消化時快離壁的細胞呈亮亮的圓形。
加藥前應提前計算好藥品濃度體積，根據(jù)實驗處理要求的濃度換算出每皿應加藥品稀釋液體積和無血清培養(yǎng)基體積，列成表格以備加藥時明確操作。將藥品儲備液稀釋成稀釋液，再與相應體積的無血清培養(yǎng)基在離心管中混合好。加COS時，倒掉含血清培養(yǎng)基，PBS蕩洗一遍，加以混合好的藥品。加COS 3小時后加Ab，Ab須提前37度水浴5小時，加藥時采用半數(shù)放液法，棄去1ml原培養(yǎng)基，加入1ml已混合好的藥品。
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