第一篇：基因工程 簡(jiǎn)答題總結(jié)

基因工程原理復(fù)習(xí)題思考題

5、簡(jiǎn)單敘述同尾酶和同裂酶的差別。

同尾酶：來源不同，識(shí)別的序列不同，但能切出相同的粘性末端，連接后不能被相關(guān)的酶同時(shí)切割。

同裂酶：識(shí)別序列相同，切割位點(diǎn)有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)和切點(diǎn)完全相同。不完全同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，但切點(diǎn)不同。）

6、連接酶主要有哪些類型？有何異同點(diǎn)？影響連接酶連接效果的因素主要有哪些？ 類型：DNA連接酶和RNA連接酶 異同點(diǎn)：

相同點(diǎn)：都能以DNA為模板，從5'向3'進(jìn)行核苷酸或脫氧核苷酸的聚合反應(yīng)。

不同點(diǎn)：DNA聚合酶識(shí)別脫氧核糖核苷酸，在DNA復(fù)制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在轉(zhuǎn)錄中起作用。

7、試分析提高平端DNA連接效率的可能方法。（傳說中的網(wǎng)上答案）

1、低溫下長(zhǎng)時(shí)間的連接效率比室溫下短時(shí)間連接的好。

2、在體系中加一點(diǎn)切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點(diǎn)消失。這樣可避免載體自連，應(yīng)該可以大大提高平端連接的效率。

3、足夠多的載體和插入片段是最重要的。

4、平端的連接對(duì)于離子濃度很敏感

5、盡可能縮小連接反應(yīng)的體積

6、建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好

8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大腸桿菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶

5）修飾過的T7 DNA聚合酶 6）逆轉(zhuǎn)錄酶

7）Taq DNA聚合酶

第四章 基因克隆的載體系統(tǒng)

1、作為基因工程載體，其應(yīng)具備哪些條件？

具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）；

具有合適的篩選標(biāo)記；

具有較高的外源DNA的載裝能力；

具有多克隆位點(diǎn)（MCS）；

具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)。

3、載體的類型主要有哪些？在基因工程操作中如何選擇載體？

基因工程中常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。

4、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原理，影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？ A、化學(xué)法（CaCl2法)轉(zhuǎn)化原理：是Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（感受態(tài)細(xì)胞）。

B、電穿孔轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化原理：將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場(chǎng)，在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)粒或DNA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素: 1）載體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象：超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高； 2）插入片段的大?。翰迦肫卧酱螅D(zhuǎn)化效率越低； 3）受體細(xì)胞的類型及預(yù)處理； 4）轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。

5、重組體分子的選擇方法主要有哪些？并簡(jiǎn)單闡述其原理。

從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個(gè)類型：（1）基于載體遺傳標(biāo)記檢測(cè)法

在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時(shí)，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標(biāo)記基因，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，據(jù)此可進(jìn)行轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選。

（2）基于克隆DNA序列檢測(cè)法

Southern印跡雜交：根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過與已標(biāo)記的單鏈DNA探針的雜交作用以檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。

（3）基于外源基因產(chǎn)物檢測(cè)法

如果目的基因產(chǎn)物能降解某些藥物使菌株呈現(xiàn)出抗性標(biāo)記，或者基因產(chǎn)物與某些藥物作用是顯顏色反應(yīng)，則可根據(jù)抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。

第五章基因的克隆一般方法

1、基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理（至少3種，都是書上找的，自選哈，建議必選DD RT-PCR和SSH，原因請(qǐng)看下題）？ 1）差減雜交（SH）

通過DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)原理富集目的基因序列，并以此構(gòu)建減數(shù)文庫(kù)的方式來進(jìn)行目的基因分離克隆的。

2）抑制性差減雜交（SSH）

SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴(kuò)增。3）差異顯示PCR（DD RT-PCR）

利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3`端設(shè)計(jì)象5`-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)結(jié)合5`端的隨機(jī)引物（20條10-mer），可以使不同長(zhǎng)度的基因得到擴(kuò)增。4）DNA代表性差異分析（DNA RDA）

代表性差別分析是通過突變型（驅(qū)趕DNA，driver DNA）與野生型（檢測(cè)DNA，tester DNA）基因組之間的差異來分離和鑒定突變基因的方法。5）擴(kuò)增限制性片段長(zhǎng)度多樣性（AFLP）

基因組DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化后，產(chǎn)生粘性末端。使用人工合成的短的雙鏈接頭，該接頭一端具有同樣的內(nèi)切酶識(shí)別粘性末端，互補(bǔ)連接后成為DNA模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個(gè)堿基序列作為引物的結(jié)合位點(diǎn)。[

2、簡(jiǎn)單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)，有何應(yīng)用？

主要原理：利用真核生物mRNA結(jié)尾處有POLY（A）結(jié)構(gòu)，在其3`端設(shè)計(jì)象5`-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)結(jié)合5`端的隨機(jī)引物（20條10-mer），可以使不同長(zhǎng)度的基因得到擴(kuò)增。優(yōu)點(diǎn)：

? 簡(jiǎn)便、靈敏、高效、省時(shí)，能快速顯示mRNA的組成。? 所需的mRNA量少。

? 各樣本mRNA的差異可同時(shí)進(jìn)行比較。

? 擴(kuò)出的cDNA可直接用于測(cè)序、文庫(kù)篩選等。缺點(diǎn)：

? 假陽(yáng)性條帶多，對(duì)低豐度的基因表達(dá)不容易檢測(cè)。? 工作量大。? 無法定量研究。

? 擴(kuò)出的條帶往往是3`端比較短的UTR區(qū)的一段序列，提供的信息較少。利用該技術(shù)，目前已有越來越多的差別表達(dá)基因得以分離和鑒定，在分子生物學(xué)和基因工程研究領(lǐng)域發(fā)揮了極大的作用。（P221）

3、抑制性差減雜交的原理與應(yīng)用。

原理：SSH的核心技術(shù)是抑制性PCR，它是一種將檢測(cè)子cDNA單鏈標(biāo)準(zhǔn)化步驟和消減雜交步驟結(jié)合為一體的技術(shù)。其中標(biāo)準(zhǔn)化步驟均等了檢測(cè)子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間的共同序列，使檢測(cè)子和驅(qū)趕子之間不同的序列得到擴(kuò)增。應(yīng)用： ? 基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)； ? 基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉； ? 不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。

4、酵母雙雜交技術(shù)、噬菌體表面展示技術(shù)的原理。

A．酵母雙雜交技術(shù)原理：大部分真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分隔開的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是DNA特異結(jié)合域（DNA-binging domain,BD），一個(gè)是轉(zhuǎn)錄激活域(transcriptional activation domain,AD)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響，但一個(gè)完整的、具有激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，否則無法完成其激活功能。不同來源的激活因子的BD區(qū)與AD區(qū)結(jié)合后則能特異地激活BD結(jié)合基因的表達(dá)。

B．噬菌體表面展示技術(shù)原理：當(dāng)外源DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個(gè)外被蛋白基因中時(shí)，如果兩者讀碼框結(jié)構(gòu)保持一致，這個(gè)外源DNA片段所編碼的產(chǎn)物可與此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表達(dá)，并顯示在噬菌體的表面。利用抗此外源基因編碼產(chǎn)物（多肽或蛋白）的抗體，通過親和純化，就能從大量的噬菌體中富集、分離出含有所要的基因的融合噬菌體。然后，通過基因擴(kuò)增，得到大量所要的目的基因。

5、T-DNA標(biāo)簽法克隆基因的一般技術(shù)路線。

? 農(nóng)桿菌侵染植物得到轉(zhuǎn)化苗，篩選出表現(xiàn)某種突變性狀的個(gè)體。? 建立突變體基因組文庫(kù)及野生型基因組文庫(kù).? 用T-DNA片段做probe篩選突變體文庫(kù)，獲得陽(yáng)性克隆。

? 用獲得的陽(yáng)性克隆篩選野生型基因組文庫(kù)，獲得野生型的陽(yáng)性克隆。? 把陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化突變體進(jìn)行功能互補(bǔ)及進(jìn)行測(cè)序分析。

第七章克隆基因的表達(dá)

1、通過比較，分析大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)各有何優(yōu)缺點(diǎn)。大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)：

?全基因組測(cè)序，共有4405個(gè)開放型閱讀框架； ?基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟、完善；

?繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定； ?被FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢(shì)：

?缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能； ?缺乏對(duì)真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)；

?內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白； ?周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)：

? 具有強(qiáng)的受嚴(yán)格調(diào)控的AOX1啟動(dòng)子 ? 表達(dá)蛋白的翻譯后的加工和修飾 ? 營(yíng)養(yǎng)要求低，工業(yè)化生產(chǎn)成本低 ? 可高密度發(fā)酵

? 表達(dá)蛋白可存在于胞內(nèi)和胞外

酵母表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)：酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問題（這個(gè)找不到，百度的）

2、如何提高克隆基因的表達(dá)水平？ 1）、表達(dá)載體的優(yōu)化設(shè)計(jì)； 2）、提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性； 3）、密碼子偏愛性； 4）、表達(dá)環(huán)境條件的優(yōu)化。

3、克隆基因目的蛋白的表達(dá)的形式主要有哪些類型？ 表達(dá)蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白兩類，具體包括如下幾種結(jié)構(gòu)形態(tài)：包涵體型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白

5、表達(dá)載體和基因工程一般克隆載體在元件構(gòu)成上有何差別？ 表達(dá)載體：?jiǎn)?dòng)子；終止子；核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）；篩選標(biāo)記；復(fù)制子（質(zhì)?？截悢?shù)）；多克隆位點(diǎn)

克隆載體：篩選標(biāo)記；復(fù)制子（質(zhì)?？截悢?shù)）；多克隆位點(diǎn)

第八章植物基因工程

2、外源基因?qū)胫参锏姆椒ㄖ饕心男?? 物理方法：電擊法、基因槍法(biolistic)、顯微注射法、微激光束法 ? 化學(xué)方法：PEG介導(dǎo)法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法 ? 生物學(xué)方法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、花粉管通道法 四．問答題

（一）簡(jiǎn)答 4．某學(xué)生在用EcoR I 切割外源DNA 片段時(shí)，出現(xiàn)了星號(hào)活性，請(qǐng)分析可能的原因。答：鹽離子濃度不對(duì)，溫度不對(duì)，甘油濃度過高。

5．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一個(gè)6bp 的II 類限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，該位點(diǎn)的序列可能是什么？

答：回文序列是5’-CATATG-3’。

6．下面幾種序列中你認(rèn)為哪一個(gè)（哪些）最有可能是II 類酶的識(shí)別序列：GAATCG、AAATTT、GATATC、ACGGCA？為什么？

答：GATATC 和AAATTT，因?yàn)樗鼈兪腔匚男蛄小?/p>

7．用Klenow酶填補(bǔ)的辦法可使5' 黏性末端轉(zhuǎn)變成平末端。這種方法常使DNA 上的某些限制酶的識(shí)別位點(diǎn)消失。請(qǐng)問，對(duì)于下列限制酶，用這種方法處理會(huì)不會(huì)使它們的識(shí)別序列都消失？BamH I(G↓GATCC)、Taq I(T↓CGA)、BssH II(G↓CGCGC)。答：BssH II 不會(huì)。

四、問答題

2．DNA 連接酶的作用特點(diǎn)有哪些？ ①連接反應(yīng)需要在一條DNA 鏈的3’末端具有一個(gè)游離的-OH, 而另一條DNA 鏈的5’末端具有一個(gè)磷酸基團(tuán)(-P)的情況下，才能發(fā)揮其連接DNA 分子的功能作用，而在末端帶有5’-羥基和3’-羥基；5’-磷酸和3’-二脫氧核苷基團(tuán)的兩個(gè)DNA 片段之間不起連接作用。②連接反應(yīng)中需要 ATP 或NAD+ 和Mg2+ 為輔助因子和激活因子； ③ DNA 連接酶不能夠連接兩條單鏈的DNA 分子，被連接的DNA 鏈必須是雙螺旋的一部分。④ DNA 連接酶只封閉雙螺旋DNA 骨架上的缺口(Nick)，即在雙鏈DNA 的某一條鏈上兩個(gè)相鄰核苷酸之間失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂，而不能封閉雙鏈DNA 的某一條鏈上失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的裂口（Gap）。

3．影響DNA 連接酶連接反應(yīng)的因素主要有哪些？

答：1)反應(yīng)溫度：最佳反應(yīng)溫度37℃，但黏性末端之間退火形成的氫鍵結(jié)合不穩(wěn)定，連接黏性末

端的最佳溫度，一般認(rèn)為4～20℃比較合適。2)DNA 片段末端：不僅要考慮反應(yīng)體系中DNA 末端的總濃度，還要考慮載體與插入片段的末端濃度的比例。原則上應(yīng)保證一個(gè)DNA 分子的末端有較高的幾率與另一 DNA 分子連接，減少同一個(gè)分子兩個(gè)末端之間的自身連接。載體與插入片段 3：1 ~ 1：3。

3)連接酶濃度：平末端DNA 分子的連接反應(yīng)，最適酶量大約是1～2 單位；而黏末端DNA 片段間的連接，在同樣的條件下，僅為 0.1 單位時(shí)，便能得到最佳連接效率。

四、問答題

1．YAC 載體具有什么樣的？為什么在克隆大片段時(shí)，YAC 具有優(yōu)越性？ 答：（1）功能性DNA 序列: ①來自于酵母的125bp DNA 片段的著絲點(diǎn)序列(CEN4)。

②來自酵母的自主復(fù)制序列(ARS1)，起始在酵母中的DNA 復(fù)制。

③來自酵母的端粒序列，它是(5-TGTGGGTGTGGTG-3)的多拷貝重復(fù)，它對(duì)染色體的復(fù)制和維持是必需的。

④在酵母中進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因，URA3（尿嘧啶生物合成基因）和TRP1（色氨酸合成基因）。寄主是這些基因的營(yíng)養(yǎng)缺陷性，只有帶有這些基因的轉(zhuǎn)化體才能在選擇培養(yǎng)基上生活

⑤具有細(xì)菌的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記基因。YAC 載體通常含有ColE1 的ori和氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因，可以在大腸桿菌中復(fù)制和繁殖，所以它也是一種穿梭載體。

（2）優(yōu)越性：YAC 能夠容納長(zhǎng)達(dá)上千kb 的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時(shí)能夠減少完整基因組文庫(kù)所需的克隆數(shù)目。

3．舉例說明什么是穿梭載體？

答：穿梭載體是含有細(xì)菌質(zhì)粒和克隆的真核生物DNA 片段的雜種質(zhì)粒，有兩個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和能在兩種不同細(xì)胞中進(jìn)行選擇的選擇標(biāo)記，所以，很容易從一宿主轉(zhuǎn)到另一個(gè)宿主(來回穿梭)。

5.什么是YAC？YAC 克隆載體常出現(xiàn)哪些問題？

答：YAC 即酵母人工染色體（Yeast Artificial Chromosome）的縮寫，是人工構(gòu)建的染色體樣大容量克隆載體，基本組成有著絲點(diǎn)、能在細(xì)菌和酵母中進(jìn)行復(fù)制的復(fù)制起始點(diǎn)和選擇標(biāo)記及端粒。最大DNA 克隆片段可達(dá)到2000kb。

問題有：(1)YAC 有嵌合現(xiàn)象，一個(gè)YAC 中克隆的DNA 片段可能來自兩個(gè)或多個(gè)不同的染色體。在基因組文庫(kù)中，嵌合體占克隆總數(shù)的10％～60％。

(2)YAC 內(nèi)部有重組現(xiàn)象，插入的DNA 較大，序列發(fā)生重排，導(dǎo)致和原來染色體的序列不一致，重組很難檢出。

(3)YAC 還有缺失現(xiàn)象，影響YAC 文庫(kù)的代表性。(4)YAC 結(jié)構(gòu)和酵母天然染色體結(jié)構(gòu)相似，使用常規(guī)方法不易將YAC 和酵母天然染色體分開。(5)構(gòu)建好的YAC 轉(zhuǎn)化原生質(zhì)化的酵母菌，轉(zhuǎn)化效率低。(6)建好庫(kù)后保存方便，但要篩選某個(gè)基因時(shí)工作量大

6．什么是 BAC？BAC 載體的組成與優(yōu)缺點(diǎn)有哪些？

①細(xì)菌人工染色體（BAC）是從大腸桿菌F 因子改造構(gòu)建而來的，能夠攜帶大約300kb 的DNA 插入片段。

②載體具有 F 因子的復(fù)制起始點(diǎn)（oriS），可使載體維持每個(gè)細(xì)胞一個(gè)拷貝的水平。③載體包括有 4 個(gè)維持DNA 復(fù)制和拷貝數(shù)目的基因，repE, parA, parB and parC。

④具有一個(gè)抗生素選擇標(biāo)記基因，和lacZ’基因。在lacZ’基因中組裝有一多克隆位點(diǎn)，便于外源片段的插入和藍(lán)白反應(yīng)篩選克隆子。

⑤插入的 DNA 片段非常穩(wěn)定，可以在大腸桿菌細(xì)胞中維持?jǐn)?shù)百代，而且不易發(fā)生重組和從寄主細(xì)胞中丟失。

⑥主要缺點(diǎn)是每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)少（1~2 個(gè)），使得分離和篩選較為困難。

7．利用pBR322 質(zhì)粒插入失活分離帶有外源DNA 片段的重組克隆的原理是什么？

①外源 DNA 片段插入在pBR322 質(zhì)粒tetr基因的編碼序列內(nèi)（BamHI）位點(diǎn)，使該基因失活；

②體外重組反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ampstets菌株，并涂布在amp 瓊脂平板上，凡獲得了pBR322質(zhì)粒和重組質(zhì)粒(AmprTets)的寄主細(xì)胞都可長(zhǎng)成菌落； ③將 amp 瓊脂上的菌落原位影印在tet瓊脂平板上生長(zhǎng)，對(duì)比這兩個(gè)平板的菌落生長(zhǎng)情況，凡在amp平板上能夠生長(zhǎng)而在tet平板上不能生長(zhǎng)的菌落，便是屬于帶有重組體質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子克隆；挑出這樣的陽(yáng)性克隆，擴(kuò)增分離帶有外源DNA 插入片段的重組體質(zhì)粒。

8.pUC質(zhì)粒利用α-互補(bǔ)作用篩選重組子原理是什么？ 答：pUC系列質(zhì)粒載體是在pBR322 質(zhì)粒載體基礎(chǔ)上改造來的，它用lacZ’基因取代了pBR322質(zhì)粒載體上的tetr基因。lacZ’基因編碼β-半乳糖苷酶的N 末端1-63 個(gè)氨基酸(α-肽鏈)的DNA 片段, 在lacZ’基因內(nèi)組入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），但不影響lacZ’基因的功能。pUC載體的宿主（E.coli）攜帶一個(gè)編碼β-半乳糖苷酶C 端序列的基因片段, 它們本身用這個(gè)基因片段產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶片段是無活性的, 但它們可以通過α-互補(bǔ)作用在體內(nèi)相互彌補(bǔ), 即兩部分產(chǎn)物可以結(jié)合形成有活性的β-半乳糖苷酶。當(dāng)pUC質(zhì)粒引入大腸桿菌中，在含有指示劑X-gal 和 IPTG 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，菌落成藍(lán)色。如果在MCS 插入外源DNA 片段（基因），破壞了lacZ’基因的功能（插入失活），不再產(chǎn)生α-肽鏈，不能和宿主細(xì)胞產(chǎn)生的多肽片段形成有活性的β-半乳糖苷酶，形成的菌落是無(白)色的。因此，根據(jù)這種β-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，便可以檢測(cè)出含有外源DNA 插入序列的重組體克隆。

9．自然界中具備理想條件的質(zhì)粒載體為數(shù)不多，即使是ColE1 和pSCl01 這兩個(gè)自然質(zhì)粒也不盡如人意，通常需要進(jìn)行改造。請(qǐng)問質(zhì)粒改造包括哪些基本內(nèi)容? 答：

基本內(nèi)容包括：

(1)刪除一些非必要的區(qū)段及對(duì)宿主有不良影響的區(qū)段；削減載體的分子質(zhì)量，使載體具有更大的容納外源片段的能力。(2)加上易于選擇或檢測(cè)的標(biāo)記。

(3)限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點(diǎn)的改造，便于外源基因插入到載體中的特定位置。(4)加上一些調(diào)控元件，有利于克隆基因的表達(dá)。(5)安全性改造，限定載體的宿主范圍。

10．質(zhì)粒制備的基本原理？

答：帶有質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞在SDS 作用下裂解，并在堿性條件下使DNA 變性。調(diào)節(jié)pH 值至中性時(shí)質(zhì)粒DNA 首先復(fù)性，而細(xì)菌基因組DNA 不能復(fù)性而與SDS-蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，可以被離心沉淀除去。上清液中的質(zhì)粒DNA 分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀純化出來。

四、問答題

1．λ噬菌體DNA 被包裝到噬菌體的頭部需要哪些基本條件？為什么？

答：①兩個(gè)cos位點(diǎn)；②線性DNA；③分子大小在λ噬菌體基因組的75%～105%。2．為什么野生型的λ噬菌體DNA 不宜作為基因工程載體? 答：(1)噬菌體DNA 沒有容載能力，因?yàn)槭删w的頭部對(duì)DNA 包裝的量是有限制的，不能大于基因組的105％，所以要將λ噬菌體改造成載體，必須削減本身的分子大?。?2)野生型的λDNA 對(duì)于一些常用的酶都有多個(gè)識(shí)別和切割位點(diǎn)，不便于克隆；(3)沒有可供選擇的標(biāo)記；

(4)野生型的λ噬菌體具有感染性，因此不夠安全。4．λ噬菌體載體具有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足? 答：優(yōu)點(diǎn)：(1)λ基因組中有1／3 的非必需區(qū)可以被置換。改造成載體后，克隆的片段較大(可達(dá)20kb)，而質(zhì)粒載體的克隆片段只有幾個(gè)kb；

(2)用噬菌體λDNA 作為載體，即使不進(jìn)行體外包裝，轉(zhuǎn)染的頻率也比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的效率高，包裝后的效率就更高了；

(3)λ可通過溶原化反應(yīng)整合到寄主染色體上，當(dāng)不需要外源基因大量表達(dá)時(shí)，可讓它以溶原性存在，若要表達(dá)，可通過誘導(dǎo)即可進(jìn)入裂解途徑，釋放出大量的噬菌體，得到的重組DNA 的拷貝數(shù)就會(huì)很多。

缺點(diǎn)：(1)包裝比較麻煩，包裝率不穩(wěn)定，購(gòu)買包裝蛋白的費(fèi)用高；(2)沒有質(zhì)粒的用途廣泛。

5．以置換型λ噬菌體作為載體進(jìn)行克隆時(shí)，為什么說能夠形成噬菌斑的就一定是重組體? 答：改造的置換型噬菌體載體，重組入外源片段之后，總體積不能超過入基因組的105％，不能小于又基因組的75％。以置換型λ噬菌體DNA 作為載體，首先要分離左、右兩臂同外源DNA 重組。如果沒有外源片段，僅是兩臂連接，長(zhǎng)度短于久基因組的75％，不能被包λ噬菌體顆粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，總長(zhǎng)度超過λ基因組105％后，也不能包入噬菌體顆粒，自然也不能形成噬菌斑。6．M13 系列載體具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)? 答：M13 克隆系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)：

(1)克隆的片段大：M13 噬菌體的DNA 在包裝時(shí)不受體積的限制，所以容載能力大。有報(bào)道，有些噬菌體顆粒可以包裝比野生型絲狀噬菌體DNA 長(zhǎng)6～7 倍的 DNA(插入片段可達(dá)40kb)。

(2)可直接產(chǎn)生單鏈DNA，這對(duì)于DNA 測(cè)序、DNA 誘變、制備特異的單鏈DNA 探針都是十分有用的。

(3)單鏈DNA 和雙鏈DNA 都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。M13 克隆系列的不足：

(1)較大的外源片段插入后，在擴(kuò)增過程中往往不夠穩(wěn)定。一般說，克隆的片段越大，發(fā)生丟失的概率越大。

(2)單鏈載體分子感染的細(xì)胞中，往往是單鏈和雙鏈混雜，分離雙鏈比較麻煩。

7．黏粒載體具有哪些特點(diǎn)與不足? 答：主要特點(diǎn)有：

①柯斯質(zhì)粒是含有λ噬菌體 COS 位點(diǎn)的質(zhì)粒載體?？滤官|(zhì)粒具有質(zhì)粒的復(fù)制子，進(jìn)入寄主細(xì)胞后能夠像質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，并且能夠被氯霉素?cái)U(kuò)增。②具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。

③插入片段的消化、連接及后來重組克隆的純化與質(zhì)粒載體相同。

④具有λ噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞不同，重組體像λ載體一樣，需體外包裝后轉(zhuǎn)染細(xì)菌。

⑤包裝后形成的λ顆粒用來感染大腸桿菌，重組DNA 像λ DNA 一樣注入細(xì)菌細(xì)胞，并以COS位點(diǎn)環(huán)化。由于缺乏λ的其他DNA 序列，環(huán)化DNA 在細(xì)菌體內(nèi)以質(zhì)粒一樣維持。⑥簡(jiǎn)化了篩選。載體體積小，承載外源 DNA 片段大。如果載體的分子質(zhì)量在5kb 的話，得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)子幾乎排除由載體自連的可能性，因?yàn)橐怀晒Πb，至少要7 個(gè)分子的載體自連。盡管如此，也是不能被包裝的，因?yàn)镃OS 位點(diǎn)太多了。重組體只有達(dá)到32-45kb 才能有效包裝體外包裝，這就提供了對(duì)重組體的正向選擇。⑦對(duì)轉(zhuǎn)化體的選擇是基于載體上的抗生素標(biāo)記。⑧感染后形成菌落，而不是噬菌斑。黏粒載體也有如下不足：

①如果兩個(gè)黏粒之間有同源序列，可能會(huì)發(fā)生重組，結(jié)果會(huì)使被克隆的片段重排或丟失。②含不同重組 DNA 片段的菌落生長(zhǎng)速度不同，會(huì)造成同一個(gè)平板上菌落大小不一。另外由于不同大小的插入片段對(duì)宿主細(xì)胞的作用不同，會(huì)造成文庫(kù)擴(kuò)增量的比例失調(diào)。③包裝過程復(fù)雜，包裝效率不穩(wěn)定，代價(jià)高。

四、問答題

1．怎樣將一個(gè)平末端的DNA 片段插入到EcoR I 的限制位點(diǎn)中去？ 答：可以化學(xué)合成一個(gè)連接子（linker），即一段長(zhǎng)為lObp含有EcoR I 識(shí)別位點(diǎn)的短的DNA 片段，然后與待克隆片段兩端連接起來，如果用EcoR I 切割這種連接片段，就會(huì)產(chǎn)生EcoR I 的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何EcoR I 的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)中。

2．構(gòu)建基因組文庫(kù)時(shí)為什么要對(duì)基因組DNA 進(jìn)行部分酶切？（列舉至少兩條理由）答：①部分酶切可獲得長(zhǎng)度適宜的片段（如獲得中等長(zhǎng)度的酶切片段）；②部分酶切可保證切出的DNA 片段內(nèi)部依然保留了部分限制酶位點(diǎn)，便于后續(xù)的克隆分析。3．什么是基因組文庫(kù)(genomic library)？它同遺傳學(xué)上的基因庫(kù)有什么不同? 答：基因組文庫(kù)是用基因工程的方法，人工構(gòu)建的含有某一生物基因組DNA 的各種片段的克隆群。

包括下列過程：高分子質(zhì)量染色體DNA 的制備；體外重組連接；將重組DNA 導(dǎo)入寄主細(xì)胞并擴(kuò)增；篩選。

基因組文庫(kù)同遺傳學(xué)上所講的基因庫(kù)是完全不同的概念?；驇?kù)(gene poo1)是指在進(jìn)行有性生殖的某一群體中，能進(jìn)行生殖的個(gè)體所含總的遺傳信息。在基因組文庫(kù)的構(gòu)建中，由于使用的載體不同，分為噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建的基因組文庫(kù)、YAC 文庫(kù)、BAC 文庫(kù)等。

4．什么是cDNA文庫(kù)？同基因組文庫(kù)有何差別? 答：同mRNA 互補(bǔ)的DNA 稱為cDNA。cDNA文庫(kù)是以某一生物的總mRNA 為模板，在無細(xì)胞系統(tǒng)中，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，首先合成一互補(bǔ)的DNA，即第一鏈，破壞RNA 模板后，再以第一鏈為模板合成第二鏈，得到的雙鏈DNA 稱為cDNA。選用適合的載體，將合成的cDNA重組導(dǎo)入寄主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到的cDNA克隆群稱為cDNA文庫(kù)。由于cDNA技術(shù)合成的是不含內(nèi)含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。由于細(xì)胞內(nèi)的基因在表達(dá)的時(shí)間上并非是統(tǒng)一的，具有發(fā)育的階段性和時(shí)間性，有些則需要特殊的環(huán)境條件。所以，cDNA文庫(kù)是不可能構(gòu)建得十分完全的，也就是說，任何一個(gè)cDNA文庫(kù)都不可能包含某一生物的全部編碼基因。cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)的主要差別是：

(1)基因組文庫(kù)克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA 序列；cDNA文庫(kù)克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因。

(2)基因組文庫(kù)克隆的是全部遺傳信息，不受時(shí)空影響；cDNA文庫(kù)克隆的是不完全的編碼 DNA 序列，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響。

(3)基因組文庫(kù)中的編碼基因是真實(shí)基因，含有內(nèi)含子和外顯子；而cDNA克隆的是不含內(nèi)含子的基因。

6．如何使用甲基化酶對(duì)克隆DNA 進(jìn)行保護(hù)？有什么意義？

答：在構(gòu)建基因文庫(kù)時(shí)，可用與接頭中限制性內(nèi)切核酸酶相應(yīng)的甲基化酶對(duì)克隆DNA 先進(jìn)行甲基化修飾，將插入片段上該酶可能的識(shí)別序列先行保護(hù)起來。

意義：用這種方法，不僅保護(hù)了插入片段的大小不會(huì)改變，又有利于插入片段的回收，因?yàn)椴迦肫沃刑囟ㄏ拗菩詢?nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)被保護(hù)起來，重組后可以用特定的限制性內(nèi)切核酸酶將插入片段回收。

8．某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因內(nèi)有一Bgl I 的酶切位點(diǎn)?，F(xiàn)用Bgl I 切割該載體進(jìn)行基因克隆，問：①轉(zhuǎn)化后涂皿時(shí)應(yīng)加什么樣的抗生素? ②培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌落具有什么樣的抗性基因型? ③如何利用抗性變化篩選到含有插入片段的重組體? 提示：①加四環(huán)素； ②TetrKans和TetrKanr；

③重新點(diǎn)種在含Tet、Kan和只加Tet的平板上，選擇只在Tet平板上生長(zhǎng)的菌落，即為所 需的重組體。

9．限制性內(nèi)切核酸酶BamH I 和Pst I 切割某一DNA 序列，結(jié)果如下所示。5’------G↓GATCC-------3’BamH I------G GATCC------3’------CCTAG↑G------5’------CCTAG G------5’------CTGCA↓G------3’Pst I------CTGCA G------3’------G↑ACGTC------5’------G ACGTC------(1)指出被切割DNA 分子的5’端和3’端；

(2)如果你將切割后的DNA 同DNA 聚合酶、4 種dNTP在一起溫育，這些DNA 末端會(huì)有什么樣的變化?(3)經(jīng)過(2)中的反應(yīng)后，你還能夠用T4 DNA 連接酶將BamH I 末端連接起來嗎？Pst I 末端呢？(T4 DNA 連接酶能夠連接平末端和黏性末端。)(4)在(3)中的連接后，能夠重新形成BamH I 位點(diǎn)嗎？Pst I 位點(diǎn)呢？為什么？ 答：(1)切割后分子的5’和3’端(如圖示)：

(2)如圖所示，BamH I 的末端能夠被DNA 聚合酶填補(bǔ)，而Pst I 的末端卻不能。這種差異是由DNA聚合酶的作用條件所決定的：dNTP只加到具有3'-OH 的引物上，并且要有一條保證正確添加的模板鏈。BamH I 的末端可以滿足這些條件，但Pst I 的末端卻不能，因其具有隱蔽的5’端，這種末端是不能作為引物的，故不能被填補(bǔ)。

(3)如圖所示，平末端化的BamH I 末端和未被修飾的Pst I 末端二者都能被T4 DNA 連接酶連接。

(4)連接處理過的末端可以再產(chǎn)生Pst I 的位點(diǎn)，但不會(huì)產(chǎn)生BamH I 的位點(diǎn)（畫圖說明）。切割、填補(bǔ)末端并重新連接，常會(huì)產(chǎn)生新的限制酶酶切位點(diǎn)，這些位點(diǎn)對(duì)于進(jìn)一步的操作有時(shí)是有用的。

10．從基因組DNA 文庫(kù)中分離的一段DNA（如下圖所示），其中有一編碼基因（黑框），圖中給出了幾種限制性內(nèi)切核酸酶的作用位點(diǎn)。該圖同時(shí)給出了用作表達(dá)該基因的表達(dá)載體，彎曲箭頭是啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向，并給出了幾種酶的作用部位。請(qǐng)根據(jù)此圖，回答下列問題：

(1)給出限制性內(nèi)切核酸酶Pst I、BamH I、EcoR I、HindH I 和Cla I 所在部位的遺傳學(xué)名稱。(2)如果你打算用該表達(dá)載體表達(dá)DNA 片段中的基因，該片段應(yīng)如何插入表達(dá)載體？(3)如果只想表達(dá)該基因的一部分，以獲得部分表達(dá)的蛋白質(zhì)用于制備抗體，應(yīng)如何操作?(4)如果你需要將整個(gè)基因在表達(dá)載體中表達(dá)，應(yīng)如何操作？是用單酶切還是雙酶切？ 答：(1)多接頭區(qū)域（MCS）,也叫多克隆位點(diǎn)。(2)主要是插入的方向問題。因?yàn)閱?dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向必須與基因的方向一致，所以該DNA 必須倒轉(zhuǎn)180°插入，即5’端必須緊挨啟動(dòng)子。

(3)用EcoR I 切割載體和基因組DNA，用連接酶重組后篩選重組體，通過測(cè)序確定正確方向的重組體進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。

(4)可用Pst I 和Hind III 雙酶切割基因組DNA 和表達(dá)載體DNA，這種切割可將基因組DNA 片段定向克隆入表達(dá)載體?！?/p>

四、問答題

1．構(gòu)建表達(dá)載體應(yīng)注意些什么？

答：(1)構(gòu)建表達(dá)載體的關(guān)鍵是用于表達(dá)克隆序列的啟動(dòng)子類型，如果目的是基因的高效表達(dá)，就要選用強(qiáng)的啟動(dòng)子；如果表達(dá)產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞有毒性，可選擇弱的啟動(dòng)子，最好使用可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，使在一定的條件下表達(dá)。(2)表達(dá)載體還應(yīng)具有以下組成元件：

①攜帶能在寄主細(xì)胞中維持的復(fù)制的起始點(diǎn)。②具有抗生素選擇標(biāo)記或其他選擇機(jī)制。

③在緊接啟動(dòng)子的下游安排限制性位點(diǎn)，用于插入需表達(dá)的基因。

④具有單一的酶切位點(diǎn)來克隆基因，克隆位點(diǎn)應(yīng)位于準(zhǔn)確的位置，以使克隆基因有效表達(dá)。

3．插入失活法和插入表達(dá)法篩選重組體的主要差別是什么？ 答：主要差別是：

(1)插入失活法是直接根據(jù)失活基因的表型變化來篩選重組體。

(2)插入表達(dá)法是根據(jù)一個(gè)基因的失活引起另一個(gè)基因的表達(dá)表型來選擇。

4．一個(gè)攜帶有氨芐和卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒被僅在卡那霉素基因中有識(shí)別位點(diǎn)的EcoR I 消化。消化物與酵母DNA 連接后轉(zhuǎn)化對(duì)兩種抗生素都敏感的E.coli 菌株。(1)利用哪一種抗生素抗性選擇接受了質(zhì)粒的細(xì)胞？(2)怎樣區(qū)分接受了插入酵母DNA 的質(zhì)粒的克隆？ 提示：(1)選擇Ampr的轉(zhuǎn)化子；

(2)所需的克隆是Ampr和Kans。任何能夠抗這兩種藥物的克隆都是自連的非重組質(zhì)粒。

5．用EcoR I 和Hind III 分別切割同一來源的染色體DNA，并進(jìn)行克隆。在前者的克隆中篩選到A 基因，但在后者的克隆中未篩選到A 基因，請(qǐng)說明原因。提示：因?yàn)镠indH I 的切點(diǎn)位于A 基因內(nèi)。

7．用一限制性內(nèi)切核酸酶切割Lac+ Tetr的質(zhì)粒載體，已知該酶識(shí)別的是4 個(gè)堿基序列，并產(chǎn)生有兩個(gè)堿基突出的單鏈末端，該酶在lac 基因內(nèi)有切割位點(diǎn)，并在第二個(gè)氨基酸密碼子內(nèi)，該位點(diǎn)可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。用該酶切割后，用DNA 聚合酶將單鏈末端補(bǔ)齊為雙鏈的平末端，然后重新連接成環(huán)，轉(zhuǎn)化Lac-Tet-受體菌，篩選Tetr轉(zhuǎn)化子，問：Lac 的基因型是什么？并說明原因。提示：基因型是lac—，原因是在該密碼子中插入了兩個(gè)堿基，造成了移碼突變，所以Lac 的基因是缺陷的。

10．在基因工程中，為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因產(chǎn)物，為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA? 為什么要在cDNA前加上細(xì)菌的啟動(dòng)子？

答：這是因?yàn)榧?xì)菌沒有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)，并且不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子的原因。

11．如何根據(jù)下面的應(yīng)用設(shè)計(jì)探針？

(1)假定你分離純化了一未知功能的蛋白質(zhì)，需要確定是何種組織和細(xì)胞表達(dá)這種蛋白質(zhì)。(2)假定你獲得了綿羊的胰島素mRNA，如何進(jìn)一步從人的cDNA文庫(kù)中獲得含人胰島素的克隆并使之在E.coli 中表達(dá)? 提示：(1)首先對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行部分測(cè)序，然后根據(jù)測(cè)得的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。(2)以該mRNA 為模板反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，即可進(jìn)行標(biāo)記用作探針。

13．單鏈RNA 作為探針，具有哪些單鏈DNA 探針?biāo)鶝]有的優(yōu)點(diǎn)？ 答：?jiǎn)捂淩NA 探針的下列優(yōu)點(diǎn)是單鏈DNA 探針?biāo)鶝]有的：

(1)RNA／RNA 和RNA／DNA 比DNA／DNA 雜交體具有更高的穩(wěn)定性。因此，雜交可以在更嚴(yán)格的各件下講行．雜交后的信號(hào)也比較強(qiáng)。

(2)單鏈RNA 由于不存在互補(bǔ)雙鏈的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，所以雜交效率比較高。(3)RNA 中不存在重復(fù)序列，所以特異性比較高。

(4)雜交后可用RNase消化掉未雜交的RNA，因此降低了本底。

四、簡(jiǎn)答題（每題 6 分,共 24 分）

1.酵母作為真核基因的高效表達(dá)系統(tǒng)有什么優(yōu)缺點(diǎn)？克服大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的不足，能繁殖快，高密度發(fā)酵，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯后的修飾合加工。缺點(diǎn)：缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子，分泌效率差，表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定，表達(dá)質(zhì)粒易于丟失等例如甲醇酵母系統(tǒng)，利用甲醇作為唯一碳源。乙醇氧化酶將甲醇氧化為甲醛，乙醇氧化酶的啟動(dòng)子是強(qiáng)啟動(dòng)子，編碼乙醇氧化酶的基因是 AOX1 合 AOX2.AOX1 基因的表達(dá)受甲醇嚴(yán)格調(diào)控，誘導(dǎo)表達(dá)水平可達(dá) 30％以上。

五、問答題（每題 8 分，共 16 分）。

2.基因組文庫(kù)構(gòu)建的基本步驟是什么？構(gòu)建基因組文庫(kù)需要用到哪些載體？ 步驟①載體的制備；

②高純度大分子量基因組 DNA（High molecular weight DNA, HMW DNA）的提??；③ HMW DNA 的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離（PFGE size selection）；

④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；⑤重組克隆的挑取和保存。載體的選擇：λ噬菌體，YAC,BAC,粘粒等。

基因文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟：（1）染色體DNA大片段的制備 ①酶切法 ②物理切割法

（2）載體與基因組DNA大片段的連接 ①粘性末端直接連接 ②人工接頭法（3）轉(zhuǎn)導(dǎo)受體（4）篩選重組子

cDNA：以mRNA為模板合成的互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸序列。

cDNA文庫(kù)：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA分別與克隆載體重組，貯存在一個(gè)受體菌的群體中，這個(gè)群體就稱為cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)與基因組文庫(kù)的區(qū)別在于cDNA文庫(kù)是有時(shí)效性的。cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：分離的目的基因可直接用于表達(dá)；比DNA文庫(kù)小的多，容易構(gòu)建

缺點(diǎn)：只與編碼序列有關(guān)；不能反映內(nèi)含子；不能反映啟動(dòng)子、終止子以及與核糖體識(shí)別的序列

構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟：（1）總RNA（total RNA）提?。?）mRNA的分離純化

①原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。

② mRNA的分離純化 Column（柱）（3）cDNA的合成 ①cDNA第一鏈合成 ②降解mRNA模板

③cDNA第二鏈合成（cDNA第二鏈合成的方法有四種，自身引導(dǎo)合成法，置換合成法，引導(dǎo)合成法和引物－銜接頭合成法。）（4）cDNA與載體連接：

（5）噬菌體顆粒的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（導(dǎo)入宿主中繁殖）

基因的化學(xué)合成：寡核苷酸單鏈的化學(xué)合成；探針的化學(xué)合成；連接子和接頭的合成；基因的半合成；全長(zhǎng)基因化學(xué)合成 目的基因的分離：

目的序列已知：一般采用PCR技術(shù)或分子雜交技術(shù)分離克隆目的基因

目的序列未知：差異表達(dá)序列；無差異表達(dá)的目的序列，可采用文庫(kù)篩選法、功能蛋白分離法、序列克隆法

第七章高等動(dòng)物基因工程

1、基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的方法

物理方法：裸DNA直接注射、電穿孔、顯微注射

化學(xué)方法：磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖法、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法、陽(yáng)離子-質(zhì)粒復(fù)合物法

生物學(xué)方法——?jiǎng)游锊《据d體：腺病毒、SV40、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、人牛痘病毒、皰疹病毒等。

反轉(zhuǎn)錄病毒（單鏈RNA病毒）優(yōu)點(diǎn)：

A、宿主范圍廣（幾乎所有類型哺乳動(dòng)物細(xì)胞）

B、效率高，可以感染大量的細(xì)胞，通常一次可以感染106～107細(xì)胞

C、外源DNA在整合時(shí)不發(fā)生重排，單位點(diǎn)、低拷貝整合（一般不超過5個(gè)）缺點(diǎn)：

A、只感染分裂細(xì)胞

B、攜帶外源基因的長(zhǎng)度有限(8kb)C、載體病毒基因有潛在的致病性，如存在載體與人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（HERV）序列間發(fā)生 D、重組而產(chǎn)生有感染能力的人逆轉(zhuǎn)錄病毒的潛在危險(xiǎn)

第二篇：基因工程

寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院考核答題紙

（2011--2012學(xué)年第 學(xué)期）

課號(hào)：:EK5G04A00

課程名稱：現(xiàn)代生物技術(shù)概論

閱卷教師：

班級(jí)：10級(jí)生物工程

學(xué)號(hào)：104177306

姓名：郭兆峰

成績(jī)：

基因工程

摘要：基因工程是20世紀(jì)70年代在分子遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是一種可以按照人們的意愿設(shè)計(jì)、改造和組建生物品種的新技術(shù)。包括它通過基因操作，將目的基因活DNA片段與合適的載體連接轉(zhuǎn)入目標(biāo)生物細(xì)胞，通過復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯外源目的基因以及蛋白質(zhì)的活性表達(dá)，使轉(zhuǎn)基因生物獲得新的遺傳性狀。

關(guān)鍵詞：生物技術(shù)；基因工程

一、基因工程的誕生：

從20世紀(jì)40年代開始，受分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)發(fā)展的影響，基因分子生物學(xué)取得巨大進(jìn)步，為基因工程的誕生奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)在人們公認(rèn)的誕生日期是1973年，其中現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域上的三大發(fā)現(xiàn)及技術(shù)上的三大發(fā)明起了決定性作用。

理論上的三大發(fā)現(xiàn)包括：第一，20世紀(jì)40年代，Avery 在美國(guó)的一次學(xué)術(shù)會(huì)上報(bào)道了肺炎球菌的轉(zhuǎn)化，證明了遺傳信息的攜帶者是DNA而不是蛋白質(zhì)；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)以及半保留復(fù)制機(jī)理，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞問題；第三，20世紀(jì)50年代末的“中心法則”，60年代由Monod 和 Jacob 提出的操縱分子學(xué)說，并成功的由一批科學(xué)家破譯了遺傳密碼從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。

以上問題的解決使得人們自主改造生物遺傳性狀從理論上成為現(xiàn)實(shí)。

技術(shù)上的三大發(fā)明：第一，1967年發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶，以及1979年發(fā)現(xiàn)的具有更高活性的T4 DNA連接酶。在1970年Smith和 Wilcox從流感嗜血桿菌中分離并純化的限制性核酸內(nèi)切酶HindⅡ和1972年發(fā)現(xiàn)的EcoRⅠ核酸內(nèi)切酶。后來發(fā)現(xiàn)的大量的限制性核酸內(nèi)切酶。第二，一些病毒、質(zhì)粒和噬菌體等載體技術(shù)的發(fā)現(xiàn)使把目的基因的導(dǎo)入更加容易。第三，DNA分子序列分析及瓊脂糖凝膠電泳、Southern雜交技術(shù)的發(fā)展使得基因工程的誕生越來越近。1973年，斯坦福大學(xué)將抗四環(huán)素質(zhì)粒和抗新霉素的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶切割并連接成重組質(zhì)粒導(dǎo)入到大腸桿菌中是基因工程誕生的標(biāo)志。

二、基因工程有幾個(gè)重要特征：（1）、打破了物種的界限，實(shí)現(xiàn)跨物種的基因轉(zhuǎn)移；（2）、通過已知功能基因的遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)行物種的定向改良；（3）、創(chuàng)造出自然界中本來不存在的物種。

三、基因工程技術(shù)流程包括：（1）、目的基因克隆，即從特定生物基因組和cDNA中分離提純和擴(kuò)大繁殖目的基因；（2）、選擇合適的載體，并對(duì)載體DNA進(jìn)行克??；（3）、將目的基因與載體寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院考核答題紙

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課程名稱：現(xiàn)代生物技術(shù)概論

閱卷教師：

班級(jí)：10級(jí)生物工程

學(xué)號(hào)：104177306

姓名：郭兆峰

成績(jī)：

連接；（4）、將重組DNA導(dǎo)入到大腸桿菌或酵母菌體內(nèi)培養(yǎng)；（5）、利用載體上的標(biāo)記基因進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)目的基因的細(xì)胞或植株。

四、基因工程的應(yīng)用：

（1）基因工程應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面：農(nóng)業(yè)領(lǐng)域是目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域之一。農(nóng)作物生物技術(shù)的目的是提高作物產(chǎn)量，改善品質(zhì)，增強(qiáng)作物抗逆性、抗病蟲害的能力?；蚬こ淘谶@些領(lǐng)域已取得了令人矚目的成就。

（2）基因工程應(yīng)用于醫(yī)藥方面：目前，以基因工程藥物為主導(dǎo)的基因工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，發(fā)展前景廣闊?；蚬こ趟幬镏饕?xì)胞因子、抗體、疫苗、激素和核苷酸藥物等。它們對(duì)預(yù)防人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內(nèi)的各種傳染病、類風(fēng)濕疾病等有重要作用。在很多領(lǐng)域特別是疑難病癥上，基因工程工程藥物起到了傳統(tǒng)化學(xué)藥物難以達(dá)到的作用。我們最為熟悉的干擾素(IFN)就是一類利用基因工程技術(shù)研制成的多功能細(xì)胞因子，在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病。

（3）基因工程應(yīng)用于環(huán)保方面：基因工程技術(shù)可提高微生物凈化環(huán)境的能力。美國(guó)利用DNA重組技術(shù)把降解芳烴、萜烴、多環(huán)芳烴、脂肪烴的4種菌體基因鏈接，轉(zhuǎn)移到某一菌體中構(gòu)建出可同時(shí)降解4種有機(jī)物的“超級(jí)細(xì)菌”，用之清除石油污染，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可將水上浮油中的2/3烴類降解完，而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢桿菌、且表達(dá)成功。它能釘死蚊蟲與害蟲，而對(duì)人畜無害，不污染環(huán)境。現(xiàn)已開發(fā)出的基因工程菌有凈化農(nóng)藥的DDT的細(xì)菌、降解水中的染料、環(huán)境中有機(jī)氯苯類和氯酚類、多氯聯(lián)苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸藥的工程菌及用于吸附無機(jī)有毒化合物(鉛、汞、鎘等)的基因工程菌及植物等。90年代后期問世的DNA改組技術(shù)可以創(chuàng)新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新的功能，創(chuàng)造出全新的微生物，如可將降解某一污染物的不同細(xì)菌的基因通過PCR技術(shù)全部克隆出來，再利用基因重組技術(shù)在體外加工重組，最后導(dǎo)入合適的載體，就有可能產(chǎn)生一種或幾種具有非凡降解能力的超級(jí)菌株，從而大大地提高降解效率。

五、基因工程的安全性問題：

自基因工程誕生以來，基因工程的安全性問題就受到人們極大的關(guān)注，關(guān)于重組DNA潛在的危險(xiǎn)性問題的爭(zhēng)論，在基因工程還處于醞釀階段的時(shí)候就已經(jīng)開始。爭(zhēng)論的焦點(diǎn)是擔(dān)心基因工程寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院考核答題紙

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課號(hào)：:EK5G04A00

課程名稱：現(xiàn)代生物技術(shù)概論

閱卷教師：

班級(jí)：10級(jí)生物工程

學(xué)號(hào)：104177306

姓名：郭兆峰

成績(jī)：的雜種生物會(huì)從實(shí)驗(yàn)室溢出，在自然界造成難以抑制的災(zāi)難，有害的雜種菌或病毒與化學(xué)物質(zhì)不同，它們會(huì)在自然界不斷繁殖，造成的危害更大。

在1975年2月，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）在加利福尼亞州的Asilomar 會(huì)議中心內(nèi)，160名來自美國(guó)和16個(gè)國(guó)家的專家學(xué)者對(duì)重組DNA的危害辯論，雖然與會(huì)代表分歧挺大，但最后也達(dá)成了一些重要的共識(shí)，在1976年6月23日美國(guó)NIH制定并公布了《重組DNA研究準(zhǔn)則》。為了避免可能造成的危害，除了規(guī)定禁止若干類型的重組DNA實(shí)驗(yàn)外，還制定了許多具體的規(guī)定條文。

六、基因工程的前景展望：基因工程技術(shù)是繼工業(yè)革命、信息革命之后 對(duì)人類社會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響的一場(chǎng)革命。它在基因制藥、基因診斷、基因治療、基因芯片和基因克隆等技術(shù)方面取得的革命性成果，將極大地改變?nèi)祟惿蜕蠲婷病?/p>

參考文獻(xiàn)：

1、基因工程/樓士林，楊盛昌，龍敏南等主編.—北京：科學(xué)出版社，2002

2、基因工程技術(shù)/鐘衛(wèi)鴻主編.—北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.6

3、基因工程/何水林主編.—北京：科學(xué)出版社，2008

4、基因工程原理與技術(shù)/劉志國(guó)主編.—2版.—北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010,12

5、基因工程：原理、方法與應(yīng)用/徐煜泉等編著.—北京：北京大學(xué)出版社，2008.12

第三篇：基因工程

《基因工程論文》

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構(gòu)建

學(xué)

院：生命科學(xué)學(xué)院 班

級(jí)：生物技術(shù)12-2 學(xué)

號(hào)：7011208209 姓

名：陳 昆 任課教師：張銳

嗜熱解烴基因工程菌SL-21的構(gòu)建

摘要﹕從以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長(zhǎng)的解烴菌———地芽孢桿菌MD-2細(xì)胞中獲得了1個(gè)新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA。將基因sladA克隆到質(zhì)粒pSTE33上,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSTalk。通過電轉(zhuǎn)化將pSTalk轉(zhuǎn)化入嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3內(nèi),構(gòu)建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜熱和解烴的功能,在70℃條件下,14d后對(duì)原油的降解率達(dá)75.08%。研究結(jié)果表明,可以通過體外重組的方式向嗜熱菌中引入烴降解基因,從而構(gòu)建嗜熱解烴基因工程菌。關(guān)鍵詞:微生物采油;烴類降解菌;嗜熱解烴基因;質(zhì)粒;基因工程菌

微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要機(jī)理之一。研究結(jié)果表明,在解烴菌作用下原油的族組分發(fā)生變化,輕質(zhì)組分增加,粘度下降,改善了原油的流動(dòng)性;同時(shí),解烴菌還可以將烴類分子轉(zhuǎn)化成有機(jī)溶劑、表面活性劑、酸和氣體等驅(qū)油物質(zhì)。迄今為止,從自然界篩選的高效解烴菌絕大多數(shù)為嗜溫微生物,最適合生長(zhǎng)溫度一般為20-45℃,很難適應(yīng)油藏的高溫環(huán)境。筆者從1株解烴菌細(xì)胞中分離出1個(gè)新的烴降解基因———烷烴單加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段將此基因轉(zhuǎn)化到另外1株最適合生長(zhǎng)溫度為70℃的嗜熱菌體內(nèi),構(gòu)建了嗜熱解烴基因工程菌SL-21。該基因工程菌既具有高效的解烴功能,又能適應(yīng)油藏高溫環(huán)境,在微生物采油中具有良好的應(yīng)用前景。1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料包括限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、PCR片斷回收試劑盒;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α;pGEM-T easy載體;質(zhì)粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培養(yǎng)基按文獻(xiàn)配制。無機(jī)鹽培養(yǎng)基組成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸餾水100mL;pH值為7.2。嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3,分離自勝利油區(qū)孤島油田中一區(qū)館3區(qū)塊采出液,最適合生長(zhǎng)溫度為70℃;地芽孢桿菌MD-2,以C15—C36直鏈烷烴為惟一碳源生長(zhǎng),分離自勝利油區(qū)原油污染土壤。1.2 實(shí)驗(yàn)方法

DNA的操作 基因組DNA小量提取,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)DNA擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的回收、酶切與連接,質(zhì)粒DNA提取和基因序列測(cè)定等均按文獻(xiàn)[13-14]方法進(jìn)行。菌株培養(yǎng) 所涉及到的菌株培養(yǎng)均在溫度為70℃,轉(zhuǎn)速為180r/min的條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)?；蚬こ叹臉?gòu)建和篩選方法 ZJ-3感受態(tài)細(xì)胞的制備按文獻(xiàn)[13-14]方法進(jìn)行。用構(gòu)建的重組質(zhì)粒pSTalk在最佳條件下電轉(zhuǎn)化ZJ-3感受態(tài)細(xì) 胞構(gòu)建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB瓊脂平板上挑選10個(gè)陽(yáng)性克隆接種到5mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)過夜,獲得種子液。將該種子液接種到200mL以液蠟為惟一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,培養(yǎng)5d后用CCl4抽提剩余的液蠟,用紅外測(cè)油儀測(cè)定烴的剩余量,根據(jù)菌株降解液蠟的速率篩選出目的基因工程菌?；蚬こ叹恼T導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)挑取陽(yáng)性克隆接種于含100μg/mL Amp的10mL的LB液體培養(yǎng)基中,180r/min下振蕩培養(yǎng)至光密度值達(dá)到0.6(檢測(cè)光波波長(zhǎng)為600nm),加誘導(dǎo)物IPTG至終濃度為1mmol/L,振蕩培養(yǎng)8h,收集表達(dá)菌體,加SDS上樣緩沖液,于100℃水浴10min后上樣,用12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)?；蚬こ叹涤湍芰y(cè)試 將基因工程菌接入20mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12h,以5 000r/min的速度離心5min收集菌體,用無菌生理鹽水洗滌菌體1次,加20mL無菌生理鹽水懸浮,作為菌株利用烷

烴生長(zhǎng)的種子液。取菌懸液按1%接種量接入200mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中,加入2%孤島油田中一區(qū)館3區(qū)塊原油或2%的液體石蠟作為惟一碳源培養(yǎng),取樣稀釋涂布計(jì)數(shù)。原油降解實(shí)驗(yàn) 在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加2%的原油,按1%接種量接入基因工程菌,培養(yǎng)14d。用正己烷萃取降解后的原油,用氣相色譜儀測(cè)定原油飽和烴組分的降解情況。原油降解率為菌株降解前、后原油量的差值與菌株降解前原油量的比值。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 MD-2基因組DNA的檢測(cè)

對(duì)MD-2基因組進(jìn)行提取和純化。提取后的染色體DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),相對(duì)分子質(zhì)量不小于23kb,說明提取的DNA完好。在檢測(cè)光波波長(zhǎng)為260280nm條件下分別測(cè)出DNA的光密度,其比值為1.95,換算出DNA的質(zhì)量濃度為1 400g/mL,表明DNA純度較好,無蛋白、RNA、酚和多糖物質(zhì)的干擾。2.2 烷烴單加氧酶基因的克隆與序列分析依據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Genbank)中的烷烴單加氧酶基因開放閱讀框兩端保守序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)兼并引物以MD-2基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將約1.3kb的PCR產(chǎn)物回收后連接到pGEM-T easy載體上,轉(zhuǎn)入E.coliDH5α,挑取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Genbank檢索,表明該DNA序列是個(gè)新的烷烴單加氧酶基因,命名為sladA。2.3 基因工程菌的構(gòu)建及篩選

通過PCR擴(kuò)增sladA后,將PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分離純化出1 329bp的片斷,與經(jīng)EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33質(zhì)粒連接,構(gòu)建成含sladA的重組質(zhì)pSTalk。經(jīng)電泳鑒定表明(圖1),重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的誘導(dǎo)表達(dá)

由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE圖譜可見(圖2),在烷烴單加氧酶基因sladA對(duì)應(yīng)蛋白大小的地方掃描到高信號(hào)強(qiáng)度,表明sladA基因在SL-21中得以表達(dá)。2.5 基因工程菌SL-21碳源生長(zhǎng)

基因工程菌SL-21在以原油和液體石蠟為惟一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng),在70℃和180r/min條件下,經(jīng)過3d的延滯期后進(jìn)入對(duì)數(shù)期,菌體數(shù)增加。17d后,菌體數(shù)為接菌初期的5倍,表明SL-21能夠利用原油或液體石蠟作為惟一碳源生長(zhǎng)。2.6 對(duì)原油的降解作用

由原油飽和烴組分的降解情況可看出(圖3),基因工程菌對(duì)原油有很明顯的降解效果,幾乎將飽和烴降解完全。經(jīng)對(duì)氣相色譜各峰面積對(duì)比,計(jì)算出各峰面積的含

量和飽和烴組分降解率(表2)。基因工程菌SL-21對(duì)原油的降解率為75.08%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,烴類降解菌地芽孢桿菌MD-2細(xì)胞提取的烷烴單加氧酶基因sladA可以在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中表達(dá)。但不同的基因工程菌株中烷烴單加氧酶基因sladA表達(dá)的效率不同,需要通過菌株對(duì)原油的降解評(píng)價(jià)進(jìn)一步篩選。獲得的對(duì)原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高溫條件下生長(zhǎng),并且對(duì)原油降解效果明顯。因此以體外重組方式向嗜熱菌中引入烴類降解基因構(gòu)建嗜熱解烴基因工程菌在技術(shù)上是可行的。3 結(jié)論

以地芽孢桿菌MD-2為目標(biāo)菌株,克隆和表達(dá)了降解長(zhǎng)鏈烷烴的單加氧酶基因sladA,并在嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌ZJ-3中正確表達(dá)了基因sladA,構(gòu)建了基因工程菌SL-21?；蚬こ叹鶶L-21在70℃條件下,能以原油或液體石蠟為惟一碳源生長(zhǎng)。14d對(duì)原油的降解率為75.08%,對(duì)原油飽和烴組分均有明顯的降解效果。該基因工程菌既可以用于微生物驅(qū)油技術(shù),又可以用于高溫油田污水的生物處理。利用基因工程的方法可以獲得既能耐受極端環(huán)境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌種選育的重要方向。參考文獻(xiàn): [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烴降解菌的篩選及性能研究[J].大慶石油地質(zhì)與開發(fā),2007,26(6):119-123.[2] 汪衛(wèi)東,汪竹,耿雪麗,等.美國(guó)微生物采油技術(shù)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用效果分析[J].油氣地質(zhì)與采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁長(zhǎng)忠,宋永亭,段傳慧.微生物采油用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在石英砂上的靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附規(guī)律[J].油氣地質(zhì)與采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龍,董漢平,俞理,等.微生物提高采收率數(shù)值模擬研究現(xiàn)狀[J].油氣地質(zhì)與采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花麗.本源微生物降解原油的飽和烴色譜分析[J].油氣地

質(zhì)與采收率,2008,15(1):77-79.[6] 宋智勇,張君,馬繼業(yè),等.微生物菌液的界面特性[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(3):73-75.[7] 蔣焱,曹功澤,趙鳳敏,等.聚合物驅(qū)后微生物提高采收率的可行性分析[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(5):63-65,68.[8] 陳愛華,方新湘,呂秀榮,等.克拉瑪依油田內(nèi)源微生物驅(qū)油機(jī)理探索[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(5):75-77.[9] 宋紹富,劉菊榮,張忠智.微生物采油替代營(yíng)養(yǎng)源的研究[J].油氣地質(zhì)與采收率,2007,14(2):96-98.[10]李希明.微生物驅(qū)替盲端類剩余油的微觀實(shí)驗(yàn)[J].油氣地質(zhì)與采收率,2008,15(3):91-92.[11]沈萍.微生物學(xué)[M].北京:高等教育出版社,2000:143.[12]唐赟,馮露,劉沐之,等.嗜熱解烴菌NG80-2的鑒定及其特[J].南開大學(xué)學(xué)報(bào),2006,39(2):46-50,70.[13] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].金冬雁,譯.北京:科學(xué)出版社,1992.[14]盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].2版.北京:高等教育出版社,1993.4

第四篇：基因工程

基因工程技術(shù)的程序與應(yīng)用

【摘要】基因工程技術(shù)是一項(xiàng)正在蓬勃發(fā)展的技術(shù)，它將給人類社會(huì)帶來一場(chǎng)深刻的變革，我們有必要了解基因工程的概念、原理、技術(shù)程序，以及基因工程在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用和進(jìn)展情況。

【關(guān)鍵詞】基因工程技術(shù)程序應(yīng)用進(jìn)展

基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行復(fù)雜的操作，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長(zhǎng)、繁殖的受體細(xì)胞中，以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙。基因工程技術(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。

一 基因工程的技術(shù)程序

基因工程的基本原理是在體外將不同來源的DNA進(jìn)行剪切和重組，形成鑲嵌DNA分子，然后將之導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其擴(kuò)增表達(dá)，從而使宿主細(xì)胞獲得新的遺傳特性，形成新的基因產(chǎn)物。它有3個(gè)基本的步驟：①?gòu)暮线m材料分離或制備目的基因或DNA片段。②目的基因或DNA片段與載體連接作成重組DNA分子。③重組DNA分子引入宿主細(xì)胞，在其中擴(kuò)增和表達(dá)。不同種類生物的生物學(xué)特性不同，其基因工程在操作上和具體技術(shù)上必然有所差異，但技術(shù)核心都是DNA的重組，即利用一系列的DNA限制性內(nèi)切酶、連接酶等分子手術(shù)工具，在某種生物DNA鏈上切下某個(gè)目標(biāo)基因或特殊的DNA片段，然后根據(jù)設(shè)計(jì)要求，將其接合到受體生物DNA鏈上。

一個(gè)完整的用于生產(chǎn)生產(chǎn)目的的基因工程技術(shù)程序包括的基本內(nèi)容有：①外源目標(biāo)基因的分離、克隆以及目標(biāo)基因的結(jié)構(gòu)與功能研究。②適合轉(zhuǎn)移、表達(dá)載體的構(gòu)建或目標(biāo)基因的表達(dá)調(diào)控結(jié)構(gòu)重組。③外源基因的導(dǎo)入。④外源基因在宿主基因組上的整合、表達(dá)及檢測(cè)與轉(zhuǎn)基因生物的篩選。⑤外源基因表達(dá)產(chǎn)物的生理功能的檢定。⑥轉(zhuǎn)基因新品系的選育和建立以及轉(zhuǎn)基因新品系的效益分析。⑦生態(tài)與進(jìn)化安全保障機(jī)制的建立。⑧消費(fèi)安全評(píng)價(jià)。

（一）外源目標(biāo)基因的分離、克隆及功能結(jié)構(gòu)分析

獲合乎人類某種需要的取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步，也是開展一項(xiàng)基因工程的前提和全部工作的核心。目前人們已經(jīng)能夠通過多種途徑和方法來獲取目標(biāo)基因，其中主要有兩條途徑：一條是從供體細(xì)胞的DNA中直接分離基因；另一條是人工合成基因。

直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。鳥槍法的具體做法是：用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分別在各個(gè)受體細(xì)胞中大量復(fù)制（在遺傳學(xué)中叫做擴(kuò)增），1

從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。如許多抗蟲抗病毒的基因都可以用上述方法獲得。用鳥槍法獲得目的基因的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，缺點(diǎn)是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核細(xì)胞的基因含有不表達(dá)的DNA片段，一般使用人工合成的方法。

目前人工合成基因的方法主要有兩條。一條途徑是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需要的基因。另一條途徑是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，推測(cè)出它的基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就可以通過人工合成基因的方法獲得。

（二）構(gòu)建能在受體生物細(xì)胞中表達(dá)的重組目標(biāo)基因

要使一個(gè)外源目標(biāo)基因能整合到受體細(xì)胞的基因組中并能在整合后在受體基因組的調(diào)控下有效地轉(zhuǎn)錄和翻譯，就必須事先對(duì)目標(biāo)基因的功能結(jié)構(gòu)用DNA重組技術(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎棧簿褪菍⒛繕?biāo)基因與一種特別的DNA分子重組，這種特別的DNA分子稱為基因載體，目前所用的載體主要有以下幾類：質(zhì)粒、λ噬菌體、柯斯質(zhì)粒、病毒載體、YAC載體等，各類載體具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，可用于不同的目標(biāo)基因。

（三）外源重組目標(biāo)基因的導(dǎo)入

將重組的外源目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入到宿主細(xì)胞中的過程稱為基因?qū)牖蚧蜣D(zhuǎn)移。接受外源基因的細(xì)胞稱為受體細(xì)胞。由于受體生物學(xué)特征的不同以及基因工程目的不同，外源基因?qū)氲姆椒ㄒ膊煌械氖怯幂d體導(dǎo)入，有的是直接用物理的方法導(dǎo)入。目前使用的有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔導(dǎo)入法、基因槍射入法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法等，向細(xì)菌等微生物中導(dǎo)入外源目標(biāo)基因常用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和噬菌體轉(zhuǎn)染方法；向植物細(xì)胞中導(dǎo)入外源基因常用基因槍注入法和Ti質(zhì)粒導(dǎo)入法；能由原生質(zhì)體再生出植株的植物細(xì)胞還可以用電穿孔導(dǎo)入法及脂質(zhì)體融合法；動(dòng)物的受精卵一般通過人工顯微鏡注射法導(dǎo)入外源基因；動(dòng)物的體細(xì)胞可用電穿孔法和病毒轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入外源基因，但對(duì)用于生產(chǎn)目的的基因工程常常避免用病毒轉(zhuǎn)染法。

（四）轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或個(gè)體的鑒別和篩選

在對(duì)宿主的細(xì)胞進(jìn)行了外源目標(biāo)基因?qū)胩幚硪院?，有些?xì)胞可能并沒有外源基因的進(jìn)入，另有一些細(xì)胞可能在外源基因進(jìn)入后因各種原因而不能使外源基因表達(dá)，因此必須對(duì)被進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)移處理的細(xì)胞或個(gè)體進(jìn)行鑒別，以篩選出導(dǎo)入外源目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或個(gè)體。鑒別和篩選轉(zhuǎn)基因生物一般在兩個(gè)層面上進(jìn)行：一是檢測(cè)目標(biāo)基因是否表達(dá)，二是檢測(cè)目標(biāo)基因是否整合到了宿主的染色體上和能否穩(wěn)定傳代。表達(dá)檢測(cè)的方法主要有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的印跡雜交法、免疫印跡檢測(cè)法、免疫組織化學(xué)檢測(cè)法等。整合檢測(cè)可通過DNA分子雜交來確定。

（五）轉(zhuǎn)基因品系的效益分析。

一個(gè)生產(chǎn)性能優(yōu)越的轉(zhuǎn)基因品系，首要的條件是目標(biāo)基因的表達(dá)產(chǎn)物必須有正常的生理功能，另一個(gè)必要標(biāo)志是其目標(biāo)基因必須有適度的高效表達(dá)特性和可持續(xù)生產(chǎn)能力。

（六）生態(tài)與進(jìn)化安全保障

由于轉(zhuǎn)基因生物與其他生物一樣具有可遺傳、易擴(kuò)散及自主的特性，而且人類對(duì)生命、生態(tài)系統(tǒng)、生物的演化實(shí)際上還知之甚少，對(duì)不同物種間基因的人工組合，外源基因?qū)κ荏w生物進(jìn)化的可能影響，轉(zhuǎn)基因生物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的長(zhǎng)期影響

等都無法進(jìn)行評(píng)估，因此如果人們不事先采取控制措施，轉(zhuǎn)基因生物一旦進(jìn)入到自然環(huán)境中就可能打破生態(tài)平衡，破壞生態(tài)環(huán)境和自然種質(zhì)資源。對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法：物理的方法就是通過各種嚴(yán)格的管理措施和物理屏障盡量使轉(zhuǎn)基因生物不能從實(shí)驗(yàn)室逃逸進(jìn)入到自然環(huán)境里去；生物的方法一般就是造成轉(zhuǎn)基因生物與非轉(zhuǎn)基因生物之間的生殖隔離，如利用三倍體不育的特性將用于生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物變成三倍體等。

（七）消費(fèi)安全評(píng)價(jià)

消費(fèi)安全評(píng)價(jià)一般要考慮以下一些主要的方面：①導(dǎo)入外源目標(biāo)基因本身編碼的產(chǎn)物是否安全。②外源目標(biāo)基因是否穩(wěn)定。③使用的載體是否安全。④使用的報(bào)道基因（就是能產(chǎn)生很容易觀察的性狀的基因）是否會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)。⑤外源基因?qū)牒笫欠駮?huì)誘導(dǎo)受體生物產(chǎn)生新的有害遺傳性狀或不利于健康的成分。為了保護(hù)人類的健康，許多國(guó)家都已通過立法或其他形式對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行消費(fèi)安全評(píng)價(jià)和嚴(yán)格的管理，對(duì)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因食品嚴(yán)格限制。

二 基因工程的應(yīng)用

基因工程在醫(yī)藥業(yè)中的應(yīng)用。許多藥品的生產(chǎn)是從生物組織中提取的。受材料來源限制產(chǎn)量有限，其價(jià)格往往十分昂貴。微生物生長(zhǎng)迅速，容易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。若將生物合成相應(yīng)藥物成分的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞內(nèi)，讓它們產(chǎn)生相應(yīng)的藥物，不但能解決產(chǎn)量問題，還能大大降低生產(chǎn)成本。如基因工程胰島素、干擾素、人造血液、白細(xì)胞介素、乙肝疫苗等通過基因工程實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，均為解除人類的病苦，提高人類的健康水平發(fā)揮了重大的作用。

基因診斷與基因治療。遺傳病是長(zhǎng)期困擾人類的一類不治之癥，迄今已發(fā)現(xiàn)的有3000多種。其根源于遺傳基因存在缺陷，主要特征是可隨生育而傳代?；蛑委熓前颜；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療疾病的目的，這是治療遺傳病的最有效的手段?；痉椒ㄊ牵夯蛑脫Q、基因修復(fù)、基因增補(bǔ)和基因失活等。如運(yùn)用基因工程設(shè)計(jì)制造的“DNA探針”檢測(cè)肝炎病毒等病毒感染及遺傳缺陷，不但準(zhǔn)確而且迅速。通過基因工程給患有遺傳病的人體內(nèi)導(dǎo)入正?；蚩伞耙淮涡浴苯獬∪说募部?。

基因工程在農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)上的應(yīng)用。運(yùn)用基因工程技術(shù)，不但可以培養(yǎng)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗性好的農(nóng)作物及畜、禽新品種，還可以培養(yǎng)出具有特殊用途的動(dòng)、植物。如轉(zhuǎn)基因魚（生長(zhǎng)快、耐不良環(huán)境、肉質(zhì)好），轉(zhuǎn)基因牛（乳汁中含有人生長(zhǎng)激素），轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的甜椒，轉(zhuǎn)魚抗寒基因的番茄，轉(zhuǎn)黃瓜抗青枯病基因的馬鈴薯，不會(huì)引起過敏的轉(zhuǎn)基因大豆，抗蟲棉等。

基因工程在環(huán)境保護(hù)工業(yè)方面的應(yīng)用?；蚬こ套龀傻腄NA探針能夠十分靈敏地檢測(cè)環(huán)境中的病毒、細(xì)菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分靈敏地反映環(huán)境污染的情況，卻不易因環(huán)境污染而大量死亡，甚至還可以吸收和轉(zhuǎn)化污染物。如有一種超級(jí)細(xì)菌，能快速分解石油，可用于清除被石油污染的海域。這種超級(jí)菌是美國(guó)科學(xué)家用基因工程方法，把降解不同石油化合物的基因移植到一個(gè)菌株內(nèi)而產(chǎn)生的。

總之，基因工程的發(fā)展將會(huì)給人類社會(huì)帶來巨大的變化。

三 基因工程的進(jìn)展?fàn)顩r

基因工程技術(shù)是一項(xiàng)正在蓬勃發(fā)展的技術(shù)，而且也已經(jīng)取得了許多重要的應(yīng)用成果，但我們也應(yīng)該看到，基因工程技術(shù)不是一項(xiàng)已經(jīng)成熟的技術(shù)，仍然還很粗糙和原始，在許多方面尚需完善和改進(jìn)。

1．基因工程在技術(shù)上存在一定的不確定性和盲目性。目前的基因工程在技術(shù)上有很多的不確定性。這種不確定性表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是技術(shù)方面的不穩(wěn)定性，二是由于對(duì)不同生物的生理特性的了解不很深入，如我們將魚類抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)移到不抗寒的羅非魚等熱帶魚中，雖然抗凍蛋白基因得到表達(dá)，但并沒有使受體魚產(chǎn)生預(yù)期的抗寒效果。目前我們所進(jìn)行的基因工程基本上只能對(duì)簡(jiǎn)單的、單基因控制的性狀進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造，操作對(duì)象只限于一些比較簡(jiǎn)單的單因子基因。但生物絕大部分的重要性狀是由多個(gè)基因共同控制的，對(duì)這些多基因控制的性狀，現(xiàn)有的基因工程技術(shù)幾乎仍然是束手無策。我們對(duì)活的生物體中基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制知之甚少，有關(guān)的知識(shí)僅限于對(duì)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子有所了解，對(duì)生物體整體的調(diào)節(jié)復(fù)雜性的認(rèn)識(shí)還剛剛開始。

2．在安全性方面存在著不確定性。對(duì)社會(huì)大眾來說，最主要和最關(guān)心的是基因工程的安全性問題，基因工程的安全性問題包括兩個(gè)方面：一是基因工程產(chǎn)品的消費(fèi)安全問題，二是轉(zhuǎn)基因生物的生態(tài)安全問題。目前用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)出來的食品因其成分的某些改變是否會(huì)對(duì)人類的健康產(chǎn)生不良的影響，這需要實(shí)驗(yàn)和時(shí)間來驗(yàn)證。有著某種生存優(yōu)勢(shì)的轉(zhuǎn)基因生物如果進(jìn)入到自然生態(tài)系統(tǒng)，就有可能排擠自然種群，降低生態(tài)系統(tǒng)里物種的多樣性，打破生態(tài)平衡。

所以我們?cè)诖罅Πl(fā)展轉(zhuǎn)基因技術(shù)的同時(shí)，必須高度重視對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、植物及微生物品種的生物控制和控制技術(shù)的研究。在轉(zhuǎn)基因品種的安全性沒有進(jìn)行全面的評(píng)估和沒有可靠的生物控制措施之前，應(yīng)嚴(yán)格禁止其進(jìn)行生產(chǎn)和進(jìn)入開放的自然生態(tài)系統(tǒng)，只有其生態(tài)安全性達(dá)到了傳統(tǒng)育種方法培育的新品種時(shí)，或無生殖能力的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物才能允許進(jìn)入自然界進(jìn)行生產(chǎn)，也只有這樣才是有益于人類和社會(huì)進(jìn)步的。

參考文獻(xiàn)：

[1]羅琛主編，生物工程與生命，北京，高等教育出版社，2000；

[2]顏青山主編，洞悉生命的真諦，西安，陜西科學(xué)技術(shù)出版社，2003，11；

[3]劉祖洞編著，遺傳學(xué)，北京，高等教育出版社，1991；

[4]王鏡巖等主編，生物化學(xué)，北京，高等教育出版社；

[5]程玉忠;植物基因工程進(jìn)展[J];遺傳;1991年04期；

[6]劉金元;植物基因轉(zhuǎn)移及其應(yīng)用前景[J];生物技術(shù);1994年06期；

[7]吳乃虎,黃美娟;植物基因工程的克隆載體[J];中國(guó)生物工程雜志;1987年02期；

[8]孟建華;農(nóng)業(yè)基因工程研究進(jìn)展報(bào)道[J];中國(guó)生物工程雜志;1989年01期；

[9]侯云德.動(dòng)物病毒載體與基因治療的現(xiàn)狀和前景(續(xù))[J].中國(guó)生物工程雜志, 1994,14(3)；

[10]李璇.植物抗性基因工程研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志, 1991,11(2)；

[11]李以莞.基因工程抗體研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志, 1991,11(4)；

[12]陳紅梅,李昆志,陳麗梅.植物來源抗蟲基因的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程

雜志, 2008；

[13]陳章良, 潘乃穟.植物基因工程的現(xiàn)狀、前景及問題[J].中國(guó)生物工程雜志, 1989,9(3)；

[14]TheodoreFriedmann, 楊靖.人類基因療法的進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志, 1990,10(3)；

[15]金由辛.真核生物tRNA基因的表達(dá)[J].中國(guó)生物工程雜志, 1994,14(1)；

[16]何晨陽(yáng), 王金生.植物防衛(wèi)反應(yīng)基因的類型、表達(dá)、調(diào)控和應(yīng)用[J].中國(guó)生物工程雜志, 1994,14(4)；

[17]吳明.轉(zhuǎn)基因作物研究、開發(fā)和市場(chǎng)預(yù)測(cè)[J].中國(guó)生物工程雜志, 1991,11(1)；

[18]戴秀玉.生物技術(shù)的由來[J].中國(guó)生物工程雜志, 1991,11(1)；

[19]門大鵬.質(zhì)粒[J].中國(guó)生物工程雜志, 1993,13(3)；

[20]趙貴英;張樹庸;;生命科學(xué)與生物技術(shù)研究進(jìn)展2009[J];中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù);2010年01期；

[21]北京大學(xué) 王岳;轉(zhuǎn)基因:立法規(guī)范與人文反思[N];社會(huì)科學(xué)報(bào)；

[22]毛黎;科技創(chuàng)造未來美食[N];中國(guó)食品報(bào)；

第五篇：材料基因工程

材料基因工程

——為什么是一項(xiàng)“顛覆性前沿技術(shù)”

1.前言

材料基因組技術(shù)是近幾年興起來的材料研究新理念和新方法，是當(dāng)今世界材料科學(xué)與工程領(lǐng)域的最前沿。材料基因工程借鑒人類基因組計(jì)劃，探究材料結(jié)構(gòu)與材料性質(zhì)變化的關(guān)系。并通過調(diào)整材料的原子或配方、改變材料的堆積方式或搭配，結(jié)合不同的工藝制備，得到具有特定性能的新材料。但是材料基因組與人類基因組的又有很大的區(qū)別，材料的微觀結(jié)構(gòu)多樣化，不但成分組成可以不同，微觀形貌等結(jié)構(gòu)也可能千差萬別，其組成-結(jié)構(gòu)-性能之間的關(guān)系更加復(fù)雜。

2.材料基因組技術(shù)

2.1材料基因組技術(shù)

材料基因組計(jì)劃是通過“多學(xué)科融合”實(shí)現(xiàn)“高通量材料設(shè)計(jì)與試驗(yàn)”；其核心目標(biāo)在于通過“高通量計(jì)算、實(shí)驗(yàn)和大數(shù)據(jù)分析”技術(shù)加速材料“發(fā)現(xiàn)-研發(fā)-生產(chǎn)-應(yīng)用”全過程，縮短材料研發(fā)周期，降低材料研發(fā)成本，引發(fā)新材料領(lǐng)域的科技創(chuàng)新和商業(yè)模式變革。

材料基因組技術(shù)包括高通量材料計(jì)算方法、高通量材料實(shí)驗(yàn)方法和材料數(shù)據(jù)庫(kù)三大組成要素。

2.1.1高通量材料計(jì)算方法

高通量計(jì)算是指利用超級(jí)計(jì)算平臺(tái)與多尺度集成化、高通量并發(fā)式材料計(jì)算方法和軟件結(jié)合，實(shí)現(xiàn)大體系材料模擬、快速計(jì)算、材料性質(zhì)的精確預(yù)測(cè)和新材料的設(shè)計(jì)，提高新材料篩選效率和設(shè)計(jì)水平，為新材料的研發(fā)提供理論依據(jù)。其中并發(fā)式材料計(jì)算方法包括第一原理計(jì)算方法、計(jì)算熱力學(xué)方法、動(dòng)力學(xué)過程算法等，跨越原子模型、簡(jiǎn)約模型和工程模型等多個(gè)層次，并整合了從原子尺度至宏觀尺度等多尺度的關(guān)聯(lián)算法。

高通量材料集成計(jì)算技術(shù)利用第一性原理、分子動(dòng)力學(xué)與位錯(cuò)動(dòng)力學(xué)、合金相圖計(jì)算、相場(chǎng)計(jì)算等方法，快速并行模擬實(shí)驗(yàn)室中成分與性能優(yōu)化的傳統(tǒng)試錯(cuò)式材料研發(fā)過程，并基于材料科學(xué)知識(shí)，迅速挑選有利于目標(biāo)性能的合金成分與微觀結(jié)構(gòu)特征，從而加速新材料的研發(fā)進(jìn)程并顯著降低材料研發(fā)成本。

2.1.2高通量材料實(shí)驗(yàn)方法

傳統(tǒng)材料研發(fā)模式依賴于成分與工藝的不斷“試錯(cuò)”實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)合對(duì)結(jié)構(gòu)-性能關(guān)系的不斷理解以獲得滿足性能指標(biāo)的材料。但是，新型關(guān)鍵材料具有成分多元化、復(fù)雜化、微結(jié)構(gòu)多級(jí)化等特點(diǎn)，傳統(tǒng)的“試錯(cuò)”模式在實(shí)際材料開發(fā)中不僅耗費(fèi)巨大，而且?guī)缀蹼y以取得成功。

高通量實(shí)驗(yàn)平臺(tái)是發(fā)展材料基因組技術(shù)具備的條件之一。高通量實(shí)驗(yàn)平臺(tái)可以為據(jù)庫(kù)提供數(shù)據(jù)支撐；而就高通量集成計(jì)算而言，高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)為各種計(jì)算模擬工作提供計(jì)算目標(biāo)。材料基因組概念中的高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)具有快速制備快速表征各類金屬與非金屬樣品的能力，典型的高通量實(shí)驗(yàn)方法有擴(kuò)散多元結(jié)與材料基因芯片

2.1.3材料數(shù)據(jù)庫(kù)

數(shù)據(jù)可以看作是感興趣參量的具體數(shù)值，這些參量在空間與時(shí)間上的一系列數(shù)值就構(gòu)成數(shù)據(jù)集，不同的數(shù)據(jù)集結(jié)合到一起并按照一定的協(xié)議實(shí)現(xiàn)相互調(diào)用，體量巨大、結(jié)構(gòu)性的數(shù)據(jù)集就構(gòu)成大數(shù)據(jù)。利用物理層面的分布式服務(wù)器對(duì)隨時(shí)間不斷膨脹的數(shù)據(jù)集進(jìn)行存放，利用通訊協(xié)議實(shí)現(xiàn)服務(wù)器中數(shù)據(jù)集的遠(yuǎn)程調(diào)用與管理，利用專門的算法對(duì)不同數(shù)據(jù)集自身和數(shù)據(jù)集之間進(jìn)行分析并提取有價(jià)值的信息，并用專門的軟件實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)分析的可視化，就構(gòu)成了基于大數(shù)據(jù)方法的材料數(shù)據(jù)庫(kù)技術(shù)。

材料信息學(xué)通過數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)分析與數(shù)據(jù)協(xié)作，實(shí)現(xiàn)從已有數(shù)據(jù)中提取高價(jià)值信息和知識(shí)的目的。由于計(jì)算材料數(shù)據(jù)庫(kù)是綜合物理，化學(xué)及生物的交叉學(xué)科的數(shù)據(jù)庫(kù)。因此，材料數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，有利于減少材料的重復(fù)實(shí)驗(yàn)和測(cè)試，對(duì)縮短新材料的研發(fā)周期，節(jié)約新材料的研發(fā)成本具有非常積極的作用

2.2結(jié)論

材料計(jì)算模擬是實(shí)現(xiàn)“材料按需設(shè)計(jì)”的基礎(chǔ)，可以幫助縮小高通量材料實(shí)驗(yàn)范圍，提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)；高通量材料實(shí)驗(yàn)起著承上啟下的角色，既可以為材料模擬計(jì)算提供海量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，也可以充實(shí)材料數(shù)據(jù)庫(kù)，并為材料信息學(xué)提供分析素材，同時(shí)還可以針對(duì)具體應(yīng)用需求，直接快速篩選目標(biāo)材料；材料數(shù)據(jù)庫(kù)可以為材料計(jì)算模擬提供計(jì)算基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為高通量材料實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的依據(jù)，同時(shí)計(jì)算和實(shí)驗(yàn)所得的材料數(shù)據(jù)亦可以豐富材料數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)。

3．結(jié)論

材料基因組技術(shù)融合了材料科學(xué)、固體力學(xué)、信息科學(xué)、軟件工程、先進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法等學(xué)科，采用數(shù)值模擬、數(shù)據(jù)庫(kù)及數(shù)據(jù)挖掘、人工智能等技術(shù)研究材料的工藝過程、微/細(xì)觀結(jié)構(gòu)、性能和服役行為等，闡明成分、微結(jié)構(gòu)和工藝對(duì)性能的控制機(jī)制，引導(dǎo)并支撐實(shí)體材料的研發(fā)和應(yīng)用。

在材料基因工程提出之前，新材料從研發(fā)到市場(chǎng)應(yīng)用實(shí)踐跨度非常大，某種材料從最初的研究開發(fā)，經(jīng)過性能優(yōu)化、系統(tǒng)設(shè)計(jì)與集成、驗(yàn)證、制造再到投入市場(chǎng)通常需要10-20年時(shí)間。部分原因是一直以來過度依賴對(duì)材料研發(fā)的科學(xué)自覺與實(shí)驗(yàn)判斷，目前大部分材料的設(shè)計(jì)與測(cè)試時(shí)通過耗時(shí)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)完成的、而實(shí)際上，有些實(shí)驗(yàn)通過理論計(jì)算工具就能完成模擬。材料基因工程采用強(qiáng)大的計(jì)算分析和理論模擬工具，減少新材料研發(fā)和生產(chǎn)過程中對(duì)物理實(shí)驗(yàn)的依賴。改進(jìn)的數(shù)據(jù)共享系統(tǒng)和一體化的工程團(tuán)隊(duì)將允許設(shè)計(jì)、系統(tǒng)工程與生產(chǎn)活動(dòng)的重疊與互動(dòng)。這種新的綜合設(shè)計(jì)將結(jié)合更多的計(jì)算與信息技術(shù)，加上實(shí)驗(yàn)與表征方面的進(jìn)步，將顯著加快材料投入市場(chǎng)的種類及速度，材料的開發(fā)周期可從目前的 10~20 年縮短為 5~10 年。因此說材料基因組技術(shù)是一項(xiàng)“顛覆性前沿技術(shù)”

參考文獻(xiàn)

[1]李楠楠，沈一筍，臧亮，等.對(duì)比人類基因 探秘材料基因：人類基因組計(jì)劃對(duì)材料基因組計(jì)劃的啟發(fā).中國(guó)材料進(jìn)展

[2]關(guān)永軍，陳柳，王金三.材料基因組技術(shù)內(nèi)涵與發(fā)展趨勢(shì).航空材料學(xué)報(bào)，2016（3）[3]劉利民.材料基因工程:材料設(shè)計(jì)與模擬[J].新型工業(yè)化，2015,5（12）；71-88 [4]向勇，閆宗楷，朱炎鱗，張曉琨.材料基因組技術(shù)前沿進(jìn)展.電子科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,6 [5]汪洪,向勇,項(xiàng)曉東,等.材料基因組技術(shù)—材料研發(fā)新模式[J].科技導(dǎo)報(bào),2015,33(10): 13-19 [6]王海舟,汪洪,丁洪,等.高通量材料實(shí)驗(yàn)與表征[J].科技導(dǎo)報(bào),2015,33(10): 31-49.[7]HOLDREN J P.Materials genome initiative for globalcompetitiveness[R].Washington D C, USA: NSTC, 2011.