動(dòng)物細(xì)胞工程

動(dòng)物細(xì)胞工程常用技術(shù)：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞核移植

動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗體的制備

其中動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，是動(dòng)物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)，也即動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞核移植，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，單克隆抗體的制備的基礎(chǔ)。

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

1.概念：就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞，然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和增殖。

2.原理：細(xì)胞增殖

3.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程

動(dòng)物組織塊

剪碎組織

用胰蛋白酶處理

分散成單個(gè)細(xì)胞

制成細(xì)胞懸液

原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)

4.細(xì)胞貼壁：懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，（單層）

要求：培養(yǎng)瓶（皿）內(nèi)表面光滑無毒易于貼附。

接觸抑制：細(xì)胞在貼壁生長過程中，隨著有絲分裂，數(shù)量不斷增多，當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時(shí)，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。

原代培養(yǎng)：動(dòng)物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

特點(diǎn)：10代以內(nèi)，能保持正常的二倍體核型。

目前使用或冷凍保存的正常細(xì)胞通常為10代以內(nèi)，以保持細(xì)胞正常的二倍體核型。

傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)接觸抑制時(shí)用胰蛋白酶處理后的分瓶培養(yǎng)稱之為傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞株：10-50代，遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變

細(xì)胞系：50代后，遺傳物質(zhì)發(fā)生改變

5.細(xì)胞培養(yǎng)條件

（1）

無菌，無毒

無菌：添加抗生素

無毒:定期更換培養(yǎng)，以便清除代謝產(chǎn)物，防止細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累對細(xì)胞自身造成危害。

（2）

營養(yǎng)

糖，促生長因子，無機(jī)鹽，氨基酸，血清，血漿，微量元素

加入血清，血漿的目的：血清，血漿可以補(bǔ)充培養(yǎng)基中缺乏的物質(zhì)。

（3）

溫度，pH

溫度：36.5+0.5

pH：7.2-74

（4）

氣體環(huán)境

95%空氣加5%CO2

O2是細(xì)胞代謝所必須的CO2主要作用是維持培養(yǎng)液pH

6.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)與植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基相比其特點(diǎn)是：

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：液體培養(yǎng)基，含有血清和血漿

植物細(xì)胞培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基，含有植物激素

動(dòng)物細(xì)胞核移植技術(shù)與克隆動(dòng)物

1.概念：將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎，這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育成新的個(gè)體。

核移植的方法得到的動(dòng)物稱為克隆動(dòng)物

原理：動(dòng)物細(xì)胞核具有全能性

2.核移植分類

胚胎細(xì)胞核移植：細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性容易

體細(xì)胞核移植：細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性不容易

3.體細(xì)胞核移植過程

（1）供體細(xì)胞：10代以內(nèi)細(xì)胞：

原因：10代以內(nèi)細(xì)胞一般能保持正常的二倍體核型

（2）受體細(xì)胞：減數(shù)第二次分裂中期去核卵母細(xì)胞

卵母細(xì)胞作為受體細(xì)胞的原因：

體積大，易操作

含有激發(fā)細(xì)胞核全能性的物質(zhì)

去核的原因：使后代的性狀主要由供體細(xì)胞核決定

去核的方法：顯微操作

（3）激活細(xì)胞的方法：電脈沖，鈣離子載體，乙醇，蛋白酶合成抑制劑

（4）獲得克隆動(dòng)物與供核動(dòng)物性狀不完全相同的原因：

可能發(fā)生基因突變

性狀是由基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果

克隆動(dòng)物大部分DNA來自供體細(xì)胞的細(xì)胞核，但其核外線粒體中DNA來自受體細(xì)胞

動(dòng)物細(xì)胞融合1.動(dòng)物細(xì)胞融合：是兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的過程，也稱細(xì)胞雜交。

雜交細(xì)胞：融合后形成的具有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞，稱為雜交細(xì)胞。

動(dòng)物細(xì)胞融合的原理：細(xì)胞膜的流動(dòng)性

2.動(dòng)物細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法

（1）物理法：離心，振動(dòng)，電激

（2）化學(xué)法：聚乙二醇(PEG)

（3）生物法：滅活的病毒(動(dòng)物細(xì)胞融合特有的方法)

3.注意

（1）細(xì)胞融合的過程包括細(xì)胞膜的融合、細(xì)胞質(zhì)融合和細(xì)胞核融合。

（2）在細(xì)胞膜融合中體現(xiàn)出細(xì)胞膜具有流動(dòng)性。

（3）其中細(xì)胞膜的融合是細(xì)胞融合的先導(dǎo)，沒有細(xì)胞膜的融合就不會(huì)有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞得到融合。

(4)動(dòng)物細(xì)胞融合的實(shí)質(zhì)及結(jié)束的標(biāo)志都是細(xì)胞核的融合。

4.優(yōu)點(diǎn)與應(yīng)用

(1)優(yōu)點(diǎn);突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。

應(yīng)用

(1)細(xì)胞融合技術(shù)是研究細(xì)胞遺傳，細(xì)胞免疫，腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。

利用細(xì)胞融合技術(shù)而發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。

單克隆抗體

1.傳統(tǒng)抗體的獲得：

(1)方法：

①向動(dòng)物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，使動(dòng)物產(chǎn)生抗體；

②從動(dòng)物血清中分離所需抗體。

(2)缺陷：產(chǎn)量低、純度低、特異性差。

2.比較制備單克隆抗體中的幾種細(xì)胞：

B淋巴細(xì)胞：能產(chǎn)生單一抗體，但不能無限增殖

骨髓瘤細(xì)胞：能無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體

雜交瘤細(xì)胞：既能產(chǎn)生專一抗體，又能無限增殖

3.制備單克隆抗體需要的技術(shù)手段：動(dòng)物細(xì)胞融合和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

原理：細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞增殖

4.單克隆抗體的制備

（1）免疫處理：提供B淋巴細(xì)胞的動(dòng)物必須先經(jīng)過免疫處理，否則不會(huì)產(chǎn)生特異性抗體。

（2）誘導(dǎo)融合的方法：

物理法：離心，振動(dòng)，離心

化學(xué)法：聚乙二醇(PEG)

生物法：滅活的病毒(動(dòng)物細(xì)胞融合特有的方法)

5.僅考慮兩兩融合的情況，形成的雜交細(xì)胞有三種

B淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞融合的細(xì)胞

骨髓瘤細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合的細(xì)胞

雜交瘤細(xì)胞

6.雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn)：既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生某種特異性抗體

7.兩次篩選的目的：第一次篩選的目的：篩選出雜交瘤細(xì)胞

第二次篩選的目的：篩選出產(chǎn)生特定抗體雜交瘤細(xì)胞

8.獲取單克隆抗體的場所

(1)若在培養(yǎng)基中進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，則培養(yǎng)液中提取

(2)若在小鼠和其他動(dòng)物的腹腔中進(jìn)行培養(yǎng)，則從腹水中提取。

腹腔培養(yǎng)：易于控制培養(yǎng)條件，成本低，但規(guī)模小，產(chǎn)量低

體外培養(yǎng)：規(guī)模大，產(chǎn)量高，但不易于控制培養(yǎng)條件，成本相對較高

9.雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn)：既能迅速大量繁殖，又能產(chǎn)生專一抗體

單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏性高，可大量制備

10.單克隆抗體的應(yīng)用：

(1)作為診斷試劑

(2)用于治療疾病和運(yùn)載藥物