第一篇：張紹陽 20130524 《分子生物學(xué)》實(shí)驗(yàn)講稿20130223

銅仁學(xué)院

Tong ren xue yuan

講 稿

課 程 分子生物學(xué) 實(shí)驗(yàn) 專 業(yè) 生物科學(xué)科 年 級(jí) 2010級(jí) 教 師 張 紹 陽 職 稱、學(xué) 位 講 師 博 士 部系、教研室 生物科學(xué)與化學(xué)系植物教研室

2012至2013學(xué)年度第二學(xué)期

實(shí)驗(yàn)1 CTAB法提取植物基因組DNA

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮?基因組DNA提取實(shí)驗(yàn)意義

基因組DNA提取是植物生物技術(shù)的基本環(huán)節(jié)，所得DNA可用于基因克隆、分子標(biāo)記分析、基因文庫構(gòu)建以及Southern雜交等試驗(yàn)操作。2 基因組DNA提取方法

關(guān)于植物基因組DNA提取的方法有諸多文獻(xiàn)報(bào)道，但基本步驟和原理是相近的，其提取液主要成份不外乎兩種試劑，即十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethyl-ammonium bromide，CTAB）和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），并以CTAB為多。本次實(shí)驗(yàn)介紹CTAB法提取植物基因組DNA原理和相應(yīng)方法?；蚪MDNA提取CTAB法基本原理

植物組織是由多種組分構(gòu)成的，如糖、脂類、蛋白質(zhì)、DNA和RNA構(gòu)成。提取基因組DNA就是要先將組織細(xì)胞進(jìn)行破碎，然后通過試劑作用和離心作用將其余雜質(zhì)去除。植物組織經(jīng)液氮粉碎后用含表面活性劑的CTAB提取液提取，經(jīng)氯仿抽提，DNA和RNA得到回收而蛋白質(zhì)及細(xì)胞碎片和脂溶性雜質(zhì)得到去除。經(jīng)有機(jī)溶劑沉淀，DNA和RNA得以沉淀而水溶性雜質(zhì)被去除。RNA經(jīng)RNase處理可被降解，最終獲得基因組DNA。

以下是提取方法和基本步驟。

4.本實(shí)驗(yàn)要掌握事項(xiàng)：移液器使用注意事項(xiàng)、離心機(jī)操作注意事項(xiàng)

二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑、儀器及用具

1.實(shí)驗(yàn)材料及選取標(biāo)準(zhǔn)：健康無病蟲害的植物鮮嫩組織，通常是芽和未完全展開的幼葉。思考題：為什么要選用鮮嫩組織？說明不同植物材料DNA提取難易程度有顯著差別。本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)材料為：青甌柑幼葉。

2.試劑種類及其作用

2.1 試劑種類： 液氮、2×CTAB提取緩沖液、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（水不溶性）、β-巰基乙醇、氯仿:異戊醇（24:1）、酚: 氯仿:異戊醇（25:24:1）、異丙醇、70%乙醇、RNase（10mg/ml）、TE緩沖液等。

2.2 試劑作用：（1）液氮和PVP。液氮就是保持研磨時(shí)低溫降低組織內(nèi)生理生化反應(yīng)，同時(shí)使得組織變脆易于研磨。PVP是防止組織發(fā)生醌類反應(yīng)而褐化。（2）2×CTAB提取緩沖液（由2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl , 20 mmol/L EDTA, 1.4 mol/L NaCl, pH 8.0)，其作用就是細(xì)胞破碎，基因組DNA從核內(nèi)游離出來；其中，EDTA成分為DNase抑制劑，防止DNA被該酶降解。β-巰基乙醇，在提取前CTAB溶液中，具有抑制氧化作用，其具有臭雞蛋難聞氣味。加入該試劑要在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行。

（3）氯仿:異戊醇（24:1），該溶液密度比水大，其作用去除葉綠素等脂溶性物質(zhì)，包括糖和大部分蛋白質(zhì)。

（4）RNase A ,其作用就是去除RNA（5）酚: 氯仿:異戊醇（25:24:1）,去除蛋白質(zhì)，尤其是染色體上的組蛋白（6）異丙醇，使DNA沉淀。用前要-20度低溫遇冷半小時(shí)或更長時(shí)間。（7）乙醇，漂洗DNA，使得到的DNA更為純凈

（8）TE緩沖液（10 mM Tris和 1 mM EDTA，pH8.0）。溶解DNA。溶解完畢的DNA溶液，即為最終提取產(chǎn)物。也可以用超純水（或雙蒸水）進(jìn)行溶解。在TE緩沖液中，DNA更為穩(wěn)定。

3.儀器及用具：冷凍離心機(jī)、研缽、移液器、通風(fēng)廚、水浴鍋等。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，氯仿、甲醛、醋酸、?-巰基乙醇，都具有刺激性氣味，進(jìn)行相關(guān)操作時(shí)要在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行。

三、實(shí)驗(yàn)步驟（實(shí)驗(yàn)操作順序，以一A1小小組為例）

1.一A1-1 加提取緩沖液。將600 ?l 2×CTAB提取緩沖液和20 ?l ?-巰基乙醇加入1.5 ml 離心管中（在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行）, 將該離心管放入65℃水浴中進(jìn)行預(yù)熱。

2.液氮研磨組織。取適量植物組織（約0.5-1.0g），加入適量PVP，于液氮中研磨成粉末。（已有研磨好樣品，在本實(shí)驗(yàn)中，此步驟已省略）

3.一A1-2 65℃水浴45-60 min。取0.10-0.12g研磨好的組織粉末，轉(zhuǎn)入提取液已預(yù)熱過的離心管中，蓋好蓋子后，旋窩震蕩10-15s左右，然后隨浮板放入在65℃水浴中保溫45-60 min, 并每隔10-15min顛倒混勻10次左右。（待水浴完成后，將溫度設(shè)置為37℃，加入適量水，使其水溫降到37℃，以備后續(xù)RNA消解用）

4.一A1-3 等體積氯仿:異戊醇（24:1）抽提。加600 ?l 氯仿:異戊醇（24:1）到管中（在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行），蓋緊離心管蓋，顛倒混勻50-100次，12000 rpm 離心10 min。（在本實(shí)驗(yàn)中，4℃12000 rpm離心10min，只有異丙醇沉淀所必需，其他相應(yīng)操作可以不采用此條件。但為方便起見，均采用此條件）

5.一A1-1 RNase消解RNA。吸取500 ?l上清液（注意不要洗到下層溶液）轉(zhuǎn)入新的離心管中。（注A4和A5在此可直接跳到步驟6）。加入0.5 ?l RNase溶液，顛倒混勻后，隨浮板放入37℃水浴鍋內(nèi)，放置30min。

6.一A1-2 酚: 氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提。加入500 ?l（在通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行），蓋緊離心管蓋，顛倒混勻50-100次，12000 rpm 離心10 min。

7.一A1-3 異丙醇沉淀。用1 ml 移液器吸取400 ?l上清液（注意不要洗到下層溶液）轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入等體積的已遇冷的異丙醇，蓋緊離心管蓋，輕輕顛倒1-2次，-20℃冰柜內(nèi)放置30 min左右，然后于4℃下12000 rpm離心10 min。

8.一A1-1 70%乙醇漂洗兩次。小心倒棄上清液，在含DNA沉淀的離心管中加入1 ml 70%乙醇，輕輕顛倒1次，小心倒棄上清液，此為一次漂洗。重復(fù)一次漂洗。然后，短暫離心，充分吸棄殘液，敞開離心管口，散除乙醇10-15min；

9.一A1-2 TE緩沖液溶解DNA。加入30-50 ?l TE緩沖液（10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA，pH8.0），用移液器吸頭輕柔吸打溶解沉淀，沉淀溶解后，即為DNA提取產(chǎn)物，DNA提取到此結(jié)束；取5?l 產(chǎn)物用于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其余放置在-20℃冰柜保存?zhèn)溆?。DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和紫外分光度計(jì)檢測(cè)，見后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

四、思考題與作業(yè)

1.把你認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)過程中最應(yīng)該注意的事項(xiàng)寫下來。

實(shí)驗(yàn)2 核酸瓊脂糖凝膠電泳

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮驮?/p>

核酸電泳是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室最頻繁的基本操作之一，它可用于分析核酸片段的長度從而檢查特定長度的目的核酸片段是否存在，也可用于判斷核酸的質(zhì)量（如有無嚴(yán)重多糖污染）和降解程度，它也常用于粗略估計(jì)核酸的濃度以及用于核酸片段的純化。

核酸為多元酸，具有較強(qiáng)的酸性，因此在呈堿性的電泳緩沖液中帶有正電荷，在電場(chǎng)作用下由負(fù)極向正極移動(dòng)，核酸在瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)距離與凝膠濃度、核酸長度和構(gòu)象等因素相關(guān)。線性核酸在凝膠中的泳動(dòng)距離與核酸長度的對(duì)數(shù)呈線性負(fù)相關(guān)，根據(jù)這一特性，可以依據(jù)已知長度的核酸標(biāo)準(zhǔn)物計(jì)算目的條帶的長度。本實(shí)驗(yàn)的目的是掌握核酸瓊脂糖凝膠電泳的原理、影響因素及其應(yīng)用。

二、實(shí)驗(yàn)材料、試劑、儀器及用具

1.材料：先前實(shí)驗(yàn)獲得的DNA或RNA樣品。本實(shí)驗(yàn)為青甌柑基因組DNA。2.試劑：瓊脂糖、1倍TAE 緩沖液、溴化乙錠（EB）、6 倍 loading buffer、DNA Marker(本實(shí)驗(yàn)用DL 2000 和 λ-Hind III，如下圖所示)等。

3.儀器及用具：電泳儀、水平電泳槽、紫外分析儀（或手提紫外燈）、凝膠成像系統(tǒng)、微波爐等。

三、實(shí)驗(yàn)步驟（有待調(diào)整，見5月25日早上正式版本；先看先了解）1.根據(jù)膠模面積計(jì)算制備瓊脂糖凝膠所需體積，控制凝膠的厚度在5-7mm左右。取所需體積的1×TAE電泳緩沖液（50×TAE電泳緩沖液的配法：24.2克Tris，3.72克EDTANa2?2H2O，加適量水，攪拌并稍加熱溶解后加5.71ml冰乙酸，加水至100 ml）于合適大小的三角瓶中。

[提示：（1）凝膠過薄影響點(diǎn)樣體積以及凝膠強(qiáng)度，低于1%的瓊脂糖凝膠宜厚些。過厚導(dǎo)致凝膠成像時(shí)背景較深且易導(dǎo)致條帶變得模糊（由于上下泳動(dòng)速度不完全一致所致）；（2）瓊脂糖凝膠電泳可采用的電泳緩沖液包括1×TAE和0.5×TBE，但后者不適于從瓊脂糖凝膠中回收DNA的操作，故實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一作用1×TAE為佳；（3）三角瓶的容量以達(dá)到電泳緩沖液的3-5倍以上為佳。] 2.根據(jù)所分離核酸片段大小確定瓊脂糖凝膠濃度，具體如下。

基因組DNA（約50 kb）

0.7%

質(zhì)粒（＞3kb）、RNA

0.8%

1000-3000 bp

1.0%

500-1000 bp

1.5%

<500 bp

2.0%

[提示：（1）凝膠濃度過低會(huì)導(dǎo)致凝固不良或凝膠強(qiáng)度低，而過高則會(huì)導(dǎo)致凝膠成像時(shí)背景較深；（2）濃度使用不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致條帶間分離不良；（3）低于300 bp的片段進(jìn)行電泳時(shí)條帶間往往難以獲得良好分離，使用高分辨率瓊脂糖可改善短片段間的分離效果，從而可應(yīng)用于AFLP或SSR產(chǎn)物的電泳，但所使用的濃度相應(yīng)提高。] 3.根據(jù)上兩步驟確定瓊脂糖用量，稱取瓊脂糖倒入已裝有電泳緩沖液的三角瓶中，混勻，置微波爐中加熱至微沸或接近微沸，取出，再次混勻，再用微波爐加熱至沸騰，取出，若溶液中尚有瓊脂糖顆粒的跡象，需重復(fù)加熱步驟。

[提示：（1）瓊脂糖的充分熔化對(duì)于最終電泳圖片的質(zhì)量十分重要。多次反復(fù)加熱比一次持續(xù)加熱更有利于瓊脂糖的熔化且可避免瓊脂糖溶液在沸騰時(shí)溢出；（2）選擇具透明爐門的微波爐有利于避免因過度沸騰導(dǎo)致的溶液溢出；（3）需戴防熱手套以防燙傷。] 4.取出三角瓶，在室溫放置0.5-1 min，然后加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5 ?g/ml，迅速混勻，然后將瓊脂糖溶液倒入膠模并插入電泳梳子。

[提示：（1）EB為致癌物質(zhì)，操作時(shí)需戴乳膠手套。EB在沸騰的瓊脂糖溶液中易揮發(fā)，因此，在室溫放置瓊脂糖溶液0.5-1 min使溫度稍降之后加入EB為佳。已添加EB的凝膠不宜再次熔化以避免EB揮發(fā)；（2）EB通常配制成10 mg/ml的貯存液，因此，每100 ml凝膠溶液中加入5 ?l貯存液即可。] 5.待瓊脂糖凝膠充分凝固后方可用于電泳。拔出電泳梳子，將凝膠連膠模放入電泳槽，點(diǎn)樣孔一端靠負(fù)極，倒入1×TAE電泳緩沖液至高出凝膠表面0.5 cm。

[提示：（1）瓊脂糖的充分凝固對(duì)于最終電泳圖片的質(zhì)量十分重要。夏天低濃度瓊脂糖凝膠的凝固需要較長時(shí)間，可在凝膠基本凝固后將凝膠連膠模放入4℃冰箱加速凝固；（2）凝膠長時(shí)間（如過夜）不用時(shí)需用保鮮膜包裹以防止水分蒸發(fā)，且不應(yīng)拔下電泳梳子。] 6.將5-10 ?l樣品與1-2 ?l 6×上樣緩沖液（0.25%溴酚蘭, 40%蔗糖）按大約5：1的比例混勻，然后點(diǎn)到凝膠點(diǎn)樣孔中；

[提示：（1）上樣體積宜根據(jù)核酸濃度確定，通常電泳條帶的量以20-200 ng為宜，過小導(dǎo)致條帶信號(hào)弱難以觀察，過大導(dǎo)致條帶間不易分離；（2）當(dāng)上樣體積較大時(shí)，可在制膠時(shí)使用梳孔較厚的梳子，但電泳分辨率不及梳孔較窄時(shí)；（3）隨凝膠濃度不同，溴酚蘭指標(biāo)對(duì)應(yīng)的DNA條帶長度約為300-1000 bp，當(dāng)溴酚蘭與目的條帶同一位置時(shí)會(huì)影響目的條帶的熒光觀察和攝像，此時(shí)可將上樣緩沖液用40%蔗糖稀釋3倍后使用；（4）出于DNA長度或濃度計(jì)算需要，需要同時(shí)點(diǎn)商業(yè)化的DNA Marker。] 7.點(diǎn)樣完畢后開始電泳，電泳電壓以5V/cm [即兩電極間的長度（以cm為單位）×5為宜]。用紫外分析儀或手提紫外燈監(jiān)測(cè)電泳進(jìn)程，待條帶間達(dá)到理想分離程度時(shí)停止電泳，進(jìn)行凝膠攝像。

[提示：（1）電泳時(shí)間過短不利于條帶分離，過長則易導(dǎo)致短片段條帶變寬模糊且熒光信號(hào)變?nèi)?；?）閱讀凝膠攝像儀說明書，進(jìn)行合理的參數(shù)設(shè)置對(duì)于獲得理想圖片十分重要。]

四、思考題與作業(yè)（可以思考，但不做要求）1.影響核酸泳動(dòng)距離的因素有哪些？

2.如何根據(jù)電泳結(jié)果計(jì)算目標(biāo)核酸片段的長度？ 3.如何獲得一張理想的電泳圖片？

第二篇：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義

實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒DNA的堿裂解法提取與純化

一、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。

質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來。

純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉環(huán)兩個(gè)性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級(jí)沉淀等方法，但這些方法相對(duì)昂貴或費(fèi)時(shí)。對(duì)于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。

二、實(shí)驗(yàn)試劑

1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min，貯存于4℃。

2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時(shí)配置。

3、溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5、苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）

6、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

8、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。

10、6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5μg/ml（注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時(shí)帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TBE），即可上樣。

三、實(shí)驗(yàn)操作

1、挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37℃、250g振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。

2、取1.0ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。

3、將細(xì)菌沉淀重懸于100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。

4、加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數(shù)次混勻（不要?jiǎng)×艺袷帲㈦x心管放置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液Ⅱ?yàn)榱呀庖海孰x心管中菌液逐漸變清）。

5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀,4℃離心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量離心管中。

6、加入450μl的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心8000g × 10min。

7、小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.0倍體積（1ml）預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置５min，4℃離心12000g×10min，棄上清。

8、加入1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干或吹干（不能過于干燥，造成溶解困難）。

9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、質(zhì)粒DNA的電泳檢測(cè)

觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色。該物質(zhì)含有一個(gè)可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個(gè)平面基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時(shí)即可以檢測(cè)到少量的DNA。

取制備的質(zhì)粒DNA 1-2μl，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣,采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負(fù)極向正極移動(dòng)至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測(cè)，攝片。

五、注意事項(xiàng)

本裂解法小量制備質(zhì)粒 DNA重復(fù)性好，一般無麻煩。若所提取質(zhì)粒 DNA不能被限制性內(nèi)切酶切割，可通過酚/氯仿再次抽提，以清除雜質(zhì)來解決問題。

六、習(xí)題：

1、什么是質(zhì)粒？質(zhì)粒有什么主要用途？

2、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中用的質(zhì)粒是由野生型改建而來的，它必須具備哪三個(gè)基本要素？

3、制備的質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠上通常以三種形式條帶存在，它們分別是什么？

實(shí)驗(yàn) 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

（1）學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式電泳儀的方法；

二、實(shí)驗(yàn)原理

瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實(shí)驗(yàn)室中分離鑒定核酸的常規(guī)方法。核酸是兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pH2-2.5，在常規(guī)的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：

（1）DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動(dòng)，因而遷移得越慢。

（2）DNA分子的構(gòu)象。當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時(shí),它在電場(chǎng)中移動(dòng)距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動(dòng)得最快，而開環(huán)狀DNA移動(dòng)最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時(shí)發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時(shí)，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個(gè)回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

（3）電源電壓。在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場(chǎng)強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過5v/cm。

（4）離子強(qiáng)度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(shí)（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)；在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。

溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成復(fù)合物，在波長為254nm紫外光照射下EB能發(fā)射熒光，而且熒光的強(qiáng)度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對(duì)照，就可估算出待測(cè)樣品的濃度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以現(xiàn)在也開發(fā)出了安全的染料，如Sybergreen。

常規(guī)的水平式瓊脂糖凝膠電泳適合于DNA和RNA的分離鑒定；但經(jīng)甲醛進(jìn)行變性處理的瓊脂糖電泳更適用于RNA的分離鑒定和Northern 雜交，因?yàn)樽冃院蟮腞NA是單鏈，其泳動(dòng)速度與相同大小的DNA分子量一樣，因而可以進(jìn)行RNA分子大小的測(cè)定，而且染色后條帶更為銳利，也更牢固結(jié)合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標(biāo)記的探針發(fā)生高效雜交。

三、試劑與器材

（一）材料

電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等

（二）試劑 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。

2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其完全溶解，分裝，室溫避光保存。

3、DNA加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)

四、操作方法

常規(guī)的水平式瓊脂糖電泳：

制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量；一般情況下，可參考下表：

瓊脂糖的含量（%）分離線狀DNA分子的有效范圍（Kb）

0.3 60-5

0.6 20-1

0.7 10-0.8

0.9 7-0.5

1.2 6-0.4

1.5 4-0.2

2.0 3-0.1

1、制備瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數(shù)分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻。在加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng),使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液；加熱時(shí)應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。

2、膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50℃左右時(shí)，加入最終濃度為0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘)，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內(nèi)，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；

3、加樣：點(diǎn)樣板或薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10 μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序和點(diǎn)樣量）。

4、電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當(dāng)瓊脂糖濃度低于0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負(fù)極（黑色）向正極（紅色）方向移動(dòng)。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板中央時(shí)，停止電泳。

5、觀察和拍照：電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后（2）的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。

五、注意事項(xiàng)

1、EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，易揮發(fā)，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。簡單處理方法為：加入大量的水進(jìn)行稀釋（達(dá)到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍體積新鮮配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍體積新鮮配制的0.5mol/L 的亞硝酸鈉，混勻，放置1天后，加入過量的1mol/L碳酸氫鈉。如此處理后的EB的誘變活性可降至原來的1/200左右。

2、由于EB會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使DNA遷移率降低。因此，如果要準(zhǔn)確地測(cè)定DNA的分子量，應(yīng)該采用跑完電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求與思考題

1、附上電泳結(jié)果的圖片并進(jìn)行正確的標(biāo)注（如下圖）

M：1Kb DNA ladder；1：質(zhì)粒DNA

2、瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？

3、如果樣品電泳后很久都沒有跑出點(diǎn)樣孔，你認(rèn)為有哪幾方面的原因？

4、為什么分子生物學(xué)實(shí)施時(shí)要擔(dān)心EB？

5、瓊脂糖凝膠電泳時(shí)膠中DNA是靠什么發(fā)出熒光的？為什么？

電泳流程圖：

實(shí)驗(yàn) PCR擴(kuò)增eGFP基因

一、PCR技術(shù)的基本原理

PCR類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。(Plateau)。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

PCR 技術(shù)應(yīng)用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實(shí)驗(yàn)，但本實(shí)驗(yàn)所介紹的方法可適應(yīng)于大多數(shù)DNA 擴(kuò)增反應(yīng)，即使有的不適應(yīng)，至少也確定了一個(gè)共同的起點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上可以作多種變化。不過下列因素在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用時(shí)應(yīng)予以特別注意，以求取得滿意結(jié)果。

1、模板：單、雙鏈DNA 和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得取第一條cDNA。雖然PCR 可以僅用極微量的樣品，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般宜用ng 量級(jí)的克隆DNA，ug 級(jí)的染色體DNA，待擴(kuò)增樣品質(zhì)量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制劑以及能結(jié)合DNA 的蛋白質(zhì)。

2、引物：引物是決定PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，下列原則有助于引物的合理設(shè)計(jì)。（1）盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，GC 含量類似于被擴(kuò)增片段的引物，盡量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。（2）避免具有明顯二級(jí)結(jié)構(gòu)（尤其是在引物3'—末端）的序列。

3、防止引物間的互補(bǔ)，特別要注意避免具有3'末端重疊的序列。

4、引物的長度約為20個(gè)堿基，較長引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。

5、引物濃度不宜偏高，過高易形成二聚體解鏈；然后冷卻至37—55℃，使引物與模板退

二、實(shí)驗(yàn)試劑

（一）儀器與器皿

PRC 擴(kuò)增儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備，微量取樣器，一次性eppendorf管，凝膠成像儀

（二）試劑與材料

1、瓊脂糖凝膠電泳試劑

1）電泳緩沖液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA

2）加樣緩沖液：0.25%溴酚蘭40% w/v蔗糖

3）溴化乙錠溶液：0.05mg/ml溴化乙錠/水

4）瓊脂糖

2、TaqDNA 多聚酶3、5′反應(yīng)緩沖液：

125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%

4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5 mmol/L)

5、DNA 模板

6、引物 1（10μmol/L）

7、引物 2（10μmol/L）

8、無菌水

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、按順序在200μl 指形管中加入以下試劑與樣品：（因購入的試劑批次不同，加樣時(shí)有所差別，以預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。

1）ddH2O 37μl

2）10*Buffer 5μl(含有MgCL2)

3）dNTP ２μl

4）引物1(上游)２μl

5）引物2（下游）２μl

6）模板 1μl（pEGFP質(zhì)粒）

7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）總體積共50μl

2、在PCR 擴(kuò)增儀上按以下反應(yīng)條件編入程序：（以下為參考值，因擴(kuò)增的DNA片段不同，各類PCR 擴(kuò)增儀程序設(shè)定各不相同，編程過程視擴(kuò)增的DNA 片段的要求及儀器而定參數(shù)。）

1)預(yù)變性 94℃ 3 分種

2)循環(huán)條件（30 次）

變性 94℃ 30 秒

復(fù)性 55℃ 30 秒

延伸 72℃ 1分

3)延長延伸 72℃ 7 分鐘

編完反應(yīng)程序，置反應(yīng)管于PCR擴(kuò)增儀的反應(yīng)孔中，開動(dòng)機(jī)器，擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)開始。

3、PCR 擴(kuò)增完畢，配1.5%瓊脂糖凝膠，電泳觀察結(jié)果。

4、凝膠成像儀或紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是否已擴(kuò)增到實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的DNA片段

四、習(xí)題

1、PCR反應(yīng)液中主要成分是哪些？在PCR反應(yīng)過程中各起什么作用？

2、為什么在PCR反應(yīng)過程中，使用三個(gè)不同的溫度變化？

3、用PCR擴(kuò)增目的基因，要想得到特異性產(chǎn)物需注意哪些事項(xiàng)？

實(shí)驗(yàn) 從動(dòng)物組織（豬肝）中提取DNA

一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

采用SDS裂解和蛋白酶K消化法從豬肝中提取DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。目的

(1)掌握SDS裂解法從豬肝中的原理和方法；(2)鞏固DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析實(shí)驗(yàn)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

DNA是一切生物細(xì)胞的重要組成成分，主要存在于細(xì)胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細(xì)胞；苯酚和氯仿可使蛋白質(zhì)變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。

三、實(shí)驗(yàn)材料

新鮮豬肝

TES 緩沖液 ： pH8.0 Tris-HCl 10 mmoL/L , EDTA 1mmoL/ L , SDS 0.1 mmoL/ L

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、剪取約0.5g肝臟組織，放入到研缽中磨碎；

2、向研缽中再加入1 ml TES輕輕研磨，將TES與破碎的組織混勻；

3、吸取535 μl組織勻漿液于2 ml EP管中，再加入60 μl SDS（10%），5.0 μl蛋白酶K，充分混勻后，于56°C保溫1 h，每30分鐘輕搖1次；

4、放置到室溫，加入等體積飽和酚（600μl），顛倒混勻，11000 rpm，離心10 min，吸取400 μl水相，并轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5 ml離心管中；

5、加入2倍體積（1000 μl）的無水乙醇和1/10倍體積（40 μl）3 M 醋酸鈉沉淀DNA，12000 rpm離心10 min，棄乙醇；

6、加入適量TE溶解DNA和RNAse A（具體依DNA的多少而定），并利用0.7%的瓊 脂溏進(jìn)行電泳分析。

五、注意事項(xiàng)

1、在將豬肝剪碎前要將豬肝清洗干凈，除去脂肪及系膜成分。

2、抽提每一步用力要柔和，防止機(jī)械剪切力對(duì)DNA的損傷。

3、取上層清液時(shí)，注意不要吸起中間的蛋白質(zhì)層。

4、乙醇漂洗去乙醇時(shí)，不要蕩起DNA。

5、離心后，不要晃動(dòng)離心管，拿管要穩(wěn)。

6、在乙醇沉淀后，經(jīng)離心要觀察留在EP管中的小白點(diǎn)，其主要成分就是DNA，在以后的實(shí)驗(yàn)中都要細(xì)心觀察，防止因?qū)⑿“c(diǎn)丟失。

六、習(xí)題

1、為了獲得高質(zhì)量的肝臟DNA，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意什么。

2、結(jié)合本人操作體會(huì)，總結(jié)在提取過程中如何避免大分子DNA的降解。

3、核酸提取中，去除蛋白質(zhì)的方法有哪些？ 實(shí)驗(yàn) 限制性內(nèi)切酶切割DNA

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1． 通過對(duì)DNA的酶切，學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)構(gòu)建體外重組DNA分子； 2． 根據(jù)目的基因合理選擇載體與限制性內(nèi)切酶； 3． 掌握DNA的酶切技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

限制性內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離出來的一種能在特異位點(diǎn)切割DNA分子的核酸內(nèi)切酶，目前已從多種細(xì)菌中分離出超過400種，識(shí)別各自不同的核苷酸順序，這一順序大多為具有一對(duì)稱中心的回文序列，如從大腸桿菌中分離的 EcoR I識(shí)別?GAATTC? 切割后產(chǎn)生?CTTAAG?、?G 和

AATTC?的末端，?CTTAAG?該末端由于有一段小的能互補(bǔ)配對(duì)的單鏈突出，故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團(tuán)，即?G-OH和?CTTAA-P。

有的限制性酶識(shí)別四堿基對(duì)的順序，如 San3A識(shí)別?GATC ?；有的識(shí)別六

堿基對(duì)，如上述的ECOR I。識(shí)別四堿基對(duì)的內(nèi)切酶由于識(shí)別順序在DNA出現(xiàn)的頻率更高（四堿基酶為44=256，六堿基酶為46＝4096），因而可將DNA切割成更小的片段，而識(shí)別八堿基對(duì)的Not I?GCGGCCGC?、?CGCCGGCG? 則識(shí)別和切割位點(diǎn)更少（48＝65536），但堿基并不以均等的概率出現(xiàn)，因而切割后產(chǎn)生的片段變化范圍很大。

＋

限制性內(nèi)切酶作用的溫度一般為37℃，反應(yīng)體系中以Mg2為唯一的輔助因子，且要求pH緩沖在7.5左右。

商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃貯存，活性通常較高，5u/μl（每單位即最適條件下1小時(shí)內(nèi)完全酶解1μg DNA的酶量）。

三、實(shí)驗(yàn)材料

待酶切的DNA樣品

四、實(shí)驗(yàn)儀器、器皿及試劑

1、儀器：可調(diào)微量加樣器、恒溫水浴箱、電泳儀、電泳槽、紫外檢測(cè)燈

2、器皿：Eppendorf管、Tip、試管架

3、試劑：標(biāo)準(zhǔn)DNA(Marker)

EcoRI限制性內(nèi)切酶

10×buffer：50mmol/l NaCl

10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)

10mmol/l MgCl2

lmmol/l

DTT（二硫蘇糖醇）

五、實(shí)驗(yàn)步驟

1、將DNA樣品8.5μl(質(zhì)粒pEGFP, 1μg)

2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由廠家提供。

3、加入1u（0.5μl）的限制性內(nèi)切酶EcoRI（限制性酶很昂貴，從-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip頭，以免污染雜質(zhì)，吸完后盡快放回冰箱）。

4、混勻反應(yīng)液后，稍離心使液體聚集，置37℃溫育１小時(shí)。

5、進(jìn)行電泳檢查酶切結(jié)果，100V 25分鐘。

6、紫外燈下觀察消化效果。

六、注意事項(xiàng)

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)大多為微量操作，DNA樣品與限制性內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性以保證酶切效果最佳?，F(xiàn)介紹三種微量取樣方法：

(1)吸樣時(shí)，將Tip尖剛剛接觸到液面時(shí)，輕輕吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的樣品，注意不要將Tip尖全部插入溶液，這樣Tip壁上會(huì)沾上很多的樣品，導(dǎo)致吸樣不準(zhǔn)。

(2)用1cm長的塑料毛細(xì)管代替Tip吸樣，此法也可吸取0.2~0.5μl的樣量。

(3)目前也有細(xì)長Tip出售，專門用于吸取微量樣品。

2、限制性內(nèi)切酶價(jià)格比較貴，因此要注意不使其污染而導(dǎo)致浪費(fèi)。這就要求每次吸酶時(shí)要用新的無菌Tip。另一個(gè)造成限制性內(nèi)切酶浪費(fèi)的因素就是限制性內(nèi)切酶的失活。因此，要注意加樣次序，即各項(xiàng)試劑加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要盡可能快，以使限制性內(nèi)切酶拿出冰箱的時(shí)間盡可能短。

若用同一酶消化很多樣品時(shí)，可先計(jì)算出所需酶量（可稍多計(jì)一點(diǎn)），取出此量的酶與1×緩沖液混合，然后再分裝至各個(gè)反應(yīng)管內(nèi)。這樣可節(jié)約用酶且縮短操作過程、減少污染機(jī)會(huì)。

3、開啟Eppendorf管時(shí)，手不要接觸到管蓋內(nèi)面，以防雜酶污染。

4、樣品在37℃與65℃保溫時(shí)，要注意將Eppendorf管蓋嚴(yán)，以防水進(jìn)入管內(nèi)造成實(shí)驗(yàn)失敗。

5、無實(shí)驗(yàn)必要應(yīng)盡量避免長時(shí)間酶消化樣品。因長時(shí)間消化，限制酶溶液中可能存在的雜酶會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。

七、習(xí)題

1、限制性核酸內(nèi)切酶天然存在于什么生物體內(nèi)？

2、什么是細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)？限制-修飾系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌有什么用途？

3、限制性內(nèi)切酶有幾類？這幾類限制性內(nèi)切酶各有什么特點(diǎn)？可作為工具酶的限制性內(nèi)切酶是哪一類？為什么？

4、限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列有什么特點(diǎn)？稱為什么序列？

5、酶通常在什么溫度中保存？為什么酶在該溫度下保存不會(huì)結(jié)凍？酶最后工作的時(shí)候其甘油濃度必須低于多少？ 6、1個(gè)單位（1 U）的限制性內(nèi)切酶代表什么意思？

實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握熱激法或電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定方法。實(shí)驗(yàn)材料：質(zhì)粒DNA；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

二、實(shí)驗(yàn)原理

質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。

（1）熱激法：大腸桿菌在0℃ CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。

（2）電轉(zhuǎn)化法：外加于細(xì)胞膜上的電場(chǎng)造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，也有利于孔DNA等大分子進(jìn)入。同時(shí)DNA在電場(chǎng)中形成的極性對(duì)于它運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞也是非常重要的。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250ml LB固體培養(yǎng)基中（冷卻止55攝氏度以下）加入Amp至終濃度50μg/ml，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；

2、取出1管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；

3、每100μl感受態(tài)細(xì)胞加入約20ng質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘；

4、熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動(dòng)離心管；

5、冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置1－2分鐘；

6、復(fù)蘇：每管加400 μl LB培養(yǎng)基，在37℃搖床溫和搖動(dòng)溫育45分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇；

7、布皿：取適當(dāng)體積均勻涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；

8、培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)12－16小時(shí)即可觀察到白色的菌落，即為轉(zhuǎn)化子。

四、結(jié)果與分析

計(jì)算轉(zhuǎn)化效率

菌落數(shù)/DNA質(zhì)量（μg）*稀釋倍數(shù)

五、習(xí)題

1、制備感受態(tài)細(xì)胞的關(guān)鍵是什么？

2、如果DNA轉(zhuǎn)化后，沒有得到轉(zhuǎn)化子或者轉(zhuǎn)化子很少，分析原因。

3、如何提高轉(zhuǎn)化效率？

第三篇：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方案

實(shí)驗(yàn)一 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)安全注意事項(xiàng)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需要的儀器設(shè)備的使用（2學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)二 分子材料的采集、保存和植物/動(dòng)物基因組DNA 的分離（8學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)三 DNA/RNA 的瓊脂糖凝膠檢測(cè)（4學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)三 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）（3學(xué)時(shí)）

實(shí)驗(yàn)四 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠檢測(cè)與聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)（6學(xué)時(shí)）實(shí)驗(yàn)五 分子生物學(xué)軟件的使用（4學(xué)時(shí)）

實(shí)驗(yàn)六 生物信息學(xué)（3學(xué)時(shí)）生物信息獲取與利用 實(shí)驗(yàn)考試

實(shí)驗(yàn)三：瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA

【目的要求】

學(xué)習(xí)并掌握DNA瓊脂糖凝膠電泳基本原理和操作，了解如何通過電泳判斷DNA純度、含量和分子量。

【實(shí)驗(yàn)原理】

凝膠電泳是分離、純化和鑒定DNA的常用方法。因?yàn)镈NA分子是兩性解離分子，在pH高于其等電點(diǎn)（約3.5）的中性或堿性溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極方向泳動(dòng)。DNA凝膠電泳的介質(zhì)主要有兩種：瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯凝膠的孔徑較小，適合于分離5-500bp的小片段DNA；而瓊脂糖凝膠的孔徑較大，可以分離100bp-60kb的較大片段DNA。不同濃度的瓊脂糖凝膠適合于分離不同大小的DNA片段（表7-1）。

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，當(dāng)熔化后再凝固時(shí)就會(huì)形成固體基質(zhì)，具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑大小取決于瓊脂糖濃度。DNA在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，受到電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)的雙重影響。電荷效應(yīng)由分子所帶的電荷量多少來決定，而分子篩效應(yīng)則與分子大小和構(gòu)象有關(guān)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的泳動(dòng)速度主要取決于分子量大小和構(gòu)象。線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠介質(zhì)中的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比。分子越大，遷移速度越慢，從而可以將不同大小的DNA分子分開。因此，通過與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物（MW marker）的遷移率對(duì)照，可以鑒定DNA分子的大小。DNA分子的構(gòu)象也可以明顯影響其遷移率。在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA有3種構(gòu)象：超螺旋的共價(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），松弛型的開環(huán)DNA（open circular DNA，ocDNA）和線性DNA，在瓊脂糖凝膠電泳中，其泳動(dòng)速度依次為：cccDNA >線性DNA >ocDNA，因而未酶切的質(zhì)粒DNA在電泳中多顯示為3條帶，泳動(dòng)速度最快的超螺旋帶越亮，說明質(zhì)粒DNA提取質(zhì)量越好。

表7-1：不同濃度瓊脂糖凝膠對(duì)DNA的有效分離范圍

瓊脂糖濃度（%）線性DNA有效分離范圍(kb)0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 DNA的遷移率還與電場(chǎng)強(qiáng)度（即單位長度的電壓降）有關(guān)，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，泳動(dòng)速度越快。當(dāng)需要快速觀察電泳結(jié)果時(shí)，可以適當(dāng)加大電場(chǎng)強(qiáng)度。但是電泳分辨率會(huì)隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大而縮小，因?yàn)楦叻肿痈咚倭鲃?dòng)時(shí)摩擦力增加，相對(duì)分子質(zhì)量與移動(dòng)速度就不一定成正比，因此一般電場(chǎng)強(qiáng)度應(yīng)不超過5V/cm。特別是當(dāng)需要較精確測(cè)定DNA片段大小、獲得理想的分辨率和漂亮的帶型時(shí)，應(yīng)該適當(dāng)降低電場(chǎng)強(qiáng)度，相應(yīng)的適當(dāng)延長電泳時(shí)間，并選用相對(duì)較低的凝膠濃度。

為了顯示凝膠中DNA的泳動(dòng)位置，需要加入染色劑染色。最常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)堿基之間，在紫外線的激發(fā)下發(fā)出橘紅色熒光。一般是在凝膠中直接加入終濃度為0.5μg/ml的溴化乙錠，這樣可以在電泳過程中隨時(shí)利用紫外燈觀察核酸的遷移情況。但是EB與DNA的結(jié)合會(huì)影響DNA的遷移率，因此對(duì)于需要較精確測(cè)定DNA片段大小、或需根據(jù)熒光強(qiáng)度測(cè)定DNA含量時(shí)，EB染色應(yīng)在電泳結(jié)束后再進(jìn)行（將凝膠浸入0.5μg/ml的溴乙錠水溶液中10min即可）。注意：EB是強(qiáng)誘變劑，使用EB必須戴一次性手套，不要灑在桌面地面上，被污染的物品必須專門處理后（加少量漂白粉可使EB分解），再徹底清洗或丟棄。

指示劑溴酚藍(lán)和二甲苯青的作用是指示樣品在凝膠中的遷移過程，以確定終止電泳時(shí)間。在0.6 %、1%、2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚藍(lán)分別約與1kb、600bp、150bp雙鏈線狀DNA片段的遷移率大致相同。在1%瓊脂糖凝膠中，二甲苯青大致相當(dāng)于2kb雙鏈線狀DNA的位置?！驹噭┢鞑摹?/p>

1．5×TAE：

2．10mg/ml溴化乙錠（EB），避光4℃保存。/ GoldView 常溫保存。3．6×上樣緩沖液（配方見附錄）4．（電泳）瓊脂糖

5． DNA、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

6．DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量marker（λDNA/HindIII）7．水平式電泳槽、電泳儀 8．透射式紫外燈 9．膠帶

10．微波爐或恒溫水浴 11．微量移液器 【操作步驟】

1．稱取瓊脂糖1g，置三角燒瓶中，加入1×TAE 100 ml，置沸水浴或微波爐中加熱，使充分溶解。注意：微波爐煮沸1次可能不能充分溶解，需取出混合后反復(fù)加熱1-2次，注意此時(shí)可能出現(xiàn)爆沸現(xiàn)象，避免蒸汽燙傷。

2．待瓊脂糖溶液冷卻至60-65℃左右時(shí)加入溴化乙錠/5ulGold View，使終濃度為0.5μg/ml，混勻。

3．用膠帶把制膠模具的兩端邊緣封好，置水平位置，選擇孔徑適宜的加樣孔模板（梳子），并垂直安插好。注意梳齒必須與模具底面保持一定距離（約0.5-1mm），防止樣品槽破裂，導(dǎo)致樣品泄漏。

圖3-1：凝膠灌膠過程示意圖

4．將冷卻至50-60℃左右的瓊脂糖溶液緩慢倒入制膠模具中，使凝膠液緩慢展開，直至形成厚度適當(dāng)（一般為0.3-0.5cm）的膠層。小心去除加樣孔周圍的氣泡。室溫靜置30-60分鐘。（如圖3-1）

5．瓊脂糖完全凝固后，小心取出梳子，去掉模具兩端的膠帶，將凝膠放入電泳槽中。6．電泳槽中注入適量0.5×TBE緩沖液，使液面高于凝膠約1mm左右。7．分別取5μl DNA或者2μl PCR產(chǎn)物和約0.5μg DNA分子量marker，加入1/5體積（2ul）的上樣緩沖液，混勻。

8．小心緩慢將樣品上樣于凝膠加樣孔中。記錄樣品加樣孔順序。

9．上樣完成后，盡快開始電泳，以防止樣品漂流。接通電源，注意正負(fù)極是否正確。調(diào)節(jié)電壓在1-5V/cm左右，樣品進(jìn)膠前電壓不要太高。電泳開始后不久就可以觀察到溴酚藍(lán)從加樣孔遷移到凝膠中。

10．根據(jù)指示劑遷移的位置，或根據(jù)反射紫外燈顯示的DNA遷移位置，判斷是否需要終止電泳。切斷電源后，取出凝膠。

11．將凝膠置于透射紫外燈上，打開紫外燈（注意盡量避免使用254nm短波紫外燈，并戴好防護(hù)眼鏡或防護(hù)罩），觀察染色后發(fā)出橘紅色熒光的DNA條帶，拍照記錄。

注意觀察樣品DNA條帶是否清晰，有無拖尾現(xiàn)象，條帶數(shù)量、大小是否正確，判斷樣品DNA分子大小，與預(yù)期大小是否相符，并目測(cè)粗略估算樣品DNA含量?！咀⒁馐马?xiàng)】

（1）凝膠不能有氣泡。（2）電泳是從負(fù)極到正極。

（3）EB是致癌劑，操作要帶手套。【實(shí)驗(yàn)安排】

本實(shí)驗(yàn)一天內(nèi)可做完?！咀鳂I(yè)】

寫出實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)。

相關(guān)溶液配制

1,50倍TAE緩沖液的配制(pH8.5)配方：2MTris-HAc、100mM EDTA 配制量：1L 配制方法：

1）稱取Tris堿242.3g，置于燒杯中

2）稱取EDTA固體29.3g或Na2EDTA-2H2O固體37.2g 3）加入700mLddH2O，溶解完全 4）加入57mLHAc，充分?jǐn)嚢?5）用HAc調(diào)pH至8.5 6）定容至1L，室溫保存

2，溴化乙錠(EB)【強(qiáng)致癌物】 配制量：100mL 配制方法：

1）1gEB于專用容器中

2）加入100mLddH2O,攪拌數(shù)小時(shí)至溶解完全 3）轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，避光保存 3，6×上樣緩沖液Loading Buffer 配方：30mMEDTA；36%（V/V）丙三醇；0.05%溴酚藍(lán)；pH7.0 配制量：100mL 配置方法：

1）6mL EDTA（500mM，pH8.0）加入50ml ddH2O中 2）5mL 1%溴酚藍(lán) 3）取36mL丙三醇

4)用2N的NaOH調(diào)pH=7.0 5）定容至100mL 4，6×甘油上樣緩沖液Loading Buffer 配方、配制量：

成分及終濃度 0.15%溴酚藍(lán)

0.15%二甲苯靑EF 5mmol/L EDTA 50%甘油 水

配制10ml溶液各成分用量 1.5ml 1%溴酚藍(lán)

1.5ml 1%二甲苯靑EF

100ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)3ml 3.9ml

5.GoldView(GV)GoldView(GV)是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同，在100ml瓊脂糖膠溶液中加入5μl GoldView?即可。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，也可用于染RNA。

由于未發(fā)現(xiàn)GoldView?有致癌作用，且靈敏度與EB相當(dāng)，將有可能逐漸取代EB而得以廣泛應(yīng)用。

概 述

GoldView?是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，采用瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA時(shí)，GoldView?與核酸結(jié)合后能產(chǎn)生很強(qiáng)的熒光信號(hào)，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)綠色熒光，而且也可用于染RNA。

通過Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠睪丸精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)，致突變性結(jié)果均為陰性；而溴化乙錠（EB）是一種強(qiáng)致癌劑。因此用Goldview?代替EB不失為一種明智的選擇。

使用方法

1.將100ml瓊脂糖凝膠溶液（濃度一般為0.8%~2%）在微波爐中融化。

2.加入5ul GoldView，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡。

3.冷卻至不燙手時(shí)倒膠，待瓊脂糖凝膠完全凝固后上樣電泳。

4.電泳完畢在紫外燈下觀察。若使用數(shù)碼相機(jī)照相記錄，則關(guān)閉相機(jī)的閃光燈，放在自動(dòng)檔即可；若使用凝膠成像系統(tǒng)照相，通過調(diào)節(jié)光圈、曝光時(shí)間，選擇合適的濾光片，可得到成像清晰、背景較低的照片。

注意事項(xiàng)

1.膠厚度不宜超過0.5cm，膠太厚會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。

2.加入GoldView的瓊脂糖凝膠反復(fù)融化可能會(huì)對(duì)核酸檢測(cè)的靈敏度產(chǎn)生一定影響，但不明顯。

3.通過凝膠電泳回收DNA片段時(shí)，建議使用GoldView染色，在自然光下切割DNA條帶，避免紫外線與EB對(duì)目的DNA產(chǎn)生的損傷，可明顯提高克隆、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄等分子生物學(xué)下游操作的效率。

4.雖然未發(fā)現(xiàn)GoldView有致癌作用，但對(duì)皮膚、眼睛會(huì)有一定的刺激，操作時(shí)應(yīng)戴上手套。

第四篇：分子生物學(xué)講稿

碩士研究生公共選修課

分子生物學(xué)講稿

浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所

胡東維

二零零三年八月修改

概

論

一、分子生物學(xué)的基本含義

分子生物學(xué)是從分子水平研究生命本質(zhì)為目的的一門新興邊緣學(xué)科，它以核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)及其在遺傳信息和細(xì)胞信息傳遞中的作用為研究對(duì)象，是當(dāng)前生命科學(xué)中發(fā)展最快并正在與其它學(xué)科廣泛交叉與滲透的重要前沿領(lǐng)域。分子生物學(xué)的發(fā)展為人類認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象帶來了前所未有的機(jī)會(huì)，也為人類利用和改造生物創(chuàng)造了極為廣闊的前景。

所謂在分子水平上研究生命的本質(zhì)主要是指對(duì)遺傳、生殖、生長和發(fā)育等生命基本特征的分子機(jī)理的闡明，從而為利用和改造生物奠定理論基礎(chǔ)和提供新的手段。這里的分子水平指的是那些攜帶遺傳信息的核酸和在遺傳信息傳遞及細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間通訊過程中發(fā)揮著重要作用的蛋白質(zhì)等生物大分子。這些生物大分子均具有較大的分子量，由簡單的小分子核苷酸或氨基酸排列組合以蘊(yùn)藏各種信息，并且具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)以形成精確的相互作用系統(tǒng)，由此構(gòu)成生物的多樣化和生物個(gè)體精確的生長發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)。闡明這些復(fù)雜的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系是分子生物學(xué)的主要任務(wù)。

二、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容

1.核酸的分子生物學(xué)

核酸的分子生物學(xué)研究核酸的結(jié)構(gòu)及其功能。由于核酸的主要作用是攜帶和傳遞遺傳信息，因此分子遺傳學(xué)（molecular genetics）是其主要組成部分。由于50年代以來的迅速發(fā)展，該領(lǐng)域已形成了比較完整的理論體系和研究技術(shù)，是目前分子生物學(xué)內(nèi)容最豐富的一個(gè)領(lǐng)域。研究內(nèi)容包括核酸/基因組的結(jié)構(gòu)、遺傳信息的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯，核酸存儲(chǔ)的信息修復(fù)與突變，基因表達(dá)調(diào)控和基因工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用等。遺傳信息傳遞的中心法則（central dogma）是其理論體系的核心。

2.蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)

蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)研究執(zhí)行各種生命功能的主要大分子──蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。盡管人類對(duì)蛋白質(zhì)的研究比對(duì)核酸研究的歷史要長得多，但由于其研究難度較大，與核酸分子生物學(xué)相比發(fā)展較慢。近年來雖然在認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及 1 其與功能關(guān)系方面取得了一些進(jìn)展，但是對(duì)其基本規(guī)律的認(rèn)識(shí)尚缺乏突破性的進(jìn)展。

3.細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子生物學(xué)研究細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間信息傳遞的分子基礎(chǔ)。構(gòu)成生物體的每一個(gè)細(xì)胞的分裂與分化及其它各種功能的完成均依賴于外界環(huán)境所賦予的各種指示信號(hào)。在這些外源信號(hào)的刺激下，細(xì)胞可以將這些信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橐幌盗械纳锘瘜W(xué)變化，例如蛋白質(zhì)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變、蛋白質(zhì)分子的磷酸化以及蛋白與蛋白相互作用的變化等，從而使其增殖、分化及分泌狀態(tài)等發(fā)生改變以適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的需要。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的目標(biāo)是闡明這些變化的分子機(jī)理，明確每一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與傳遞的途徑及參與該途徑的所有分子的作用和調(diào)節(jié)方式以及認(rèn)識(shí)各種途徑間的網(wǎng)絡(luò)控制系統(tǒng)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理的研究在理論和技術(shù)方面與上述核酸及蛋白質(zhì)分子有著緊密的聯(lián)系，是當(dāng)前分子生物學(xué)發(fā)展最迅速的領(lǐng)域之一。

三、分子生物學(xué)發(fā)展簡史

1．準(zhǔn)備和醞釀階段

19世紀(jì)后期到20世紀(jì)50年代初，是現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的準(zhǔn)備和醞釀階段。在這一階段產(chǎn)生了兩點(diǎn)對(duì)生命本質(zhì)的認(rèn)識(shí)上的重大突破：

確定了蛋白質(zhì)是生命的主要基礎(chǔ)物質(zhì)

19世紀(jì)末Buchner兄弟證明酵母無細(xì)胞提取液能使糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名稱，酶是生物催化劑。20世紀(jì)20-40年代提純和結(jié)晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黃酶、細(xì)胞色素C、肌動(dòng)蛋白等），證明酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)生命的許多基本現(xiàn)象（物質(zhì)代謝、能量代謝、消化、呼吸、運(yùn)動(dòng)等）都與酶和蛋白質(zhì)相聯(lián)系，可以用提純的酶或蛋白質(zhì)在體外實(shí)驗(yàn)中重復(fù)出來。在此期間對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)也有較大的進(jìn)步。1902年Emil Fisher證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是多肽；40年代末，Sanger創(chuàng)立二硝基氟苯（DNFB）法、Edman發(fā)展異硫氰酸苯酯法分析肽鏈N端氨基酸；1953年Sanger和Thompson完成了第一個(gè)

多肽分子--胰島素A鏈和B鏈的氨基全序列分析。由于結(jié)晶X-線衍射分析技術(shù)的發(fā)展，1950年P(guān)auling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)模型。所以在這階段對(duì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)都有了認(rèn)識(shí)。確定了生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA

雖然1868年F.Miescher就發(fā)現(xiàn)了核素（nuclein），但是在此后的半個(gè)多世紀(jì)中并未引起重視。20世紀(jì)20-30年代已確認(rèn)自然界有DNA和RNA兩類核酸，并闡明了核苷酸的組成。由于當(dāng)時(shí)對(duì)核苷酸和堿基的定量分析不夠精確，得出DNA中A、G、C、T含量是大致相等的結(jié)果，因而曾長期認(rèn)為DNA結(jié)構(gòu)只是“四核苷酸”單位的重復(fù)，不具有多樣性，不能攜帶更多的信息，當(dāng)時(shí)對(duì)攜帶遺傳信息的侯選分子更多的是考慮蛋白質(zhì)。40年代以后實(shí)驗(yàn)的事實(shí)使人們對(duì)核酸的功能和結(jié)構(gòu)兩方面的認(rèn)識(shí)都有了長足的進(jìn)步。1944年O.T.Avery等證明了肺炎球菌轉(zhuǎn)化因子是DNA；1952年A.D.Hershey和M.Chase用DNA35S和32P分別標(biāo)記T2噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸，感染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了是遺傳物質(zhì)。在對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的研究上，1949-52年S.Furbery等的X-線衍射分析闡明了核苷酸并非平面的空間構(gòu)像，提出了DNA是螺旋結(jié)構(gòu)；1948-1953年Chargaff等用新的層析和電泳技術(shù)分析組成DNA的堿基和核苷酸量，積累了大量的數(shù)據(jù)，提出了DNA堿基組成A=T、G=C的Chargaff規(guī)則，為堿基配對(duì)的DNA結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)打下了基礎(chǔ)。2．現(xiàn)代分子生物學(xué)的建立和發(fā)展階段

這一階段是從50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型作為現(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)基本理論建立和發(fā)展的黃金時(shí)代。DNA雙螺旋發(fā)現(xiàn)的最深刻意義在于：確立了核酸作為信息分子的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ);提出了堿基配對(duì)是核酸復(fù)制、遺傳信息傳遞的基本方式；從而最后確定了核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，為認(rèn)識(shí)核酸與蛋白質(zhì)的關(guān)系及其在生命中的作用打下了最重要的基礎(chǔ)。在此期間的主要進(jìn)展包括： 遺傳信息傳遞中心法則的建立

在發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)同時(shí)，Watson和Crick就提出DNA復(fù)制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl 用同位素標(biāo)記和超速離心分離實(shí)驗(yàn)為DNA半保留模型提出了證明；1968年Okazaki（岡畸）提出DNA不連續(xù)復(fù)制模型；1972年證實(shí)了DNA復(fù)制開始需要RNA作為引物；70年代初獲得DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，并對(duì)真核DNA聚合酶特性做了分析研究；這些都逐漸完善了對(duì)DNA復(fù)制機(jī)理的認(rèn)識(shí)。

在研究DNA復(fù)制將遺傳信息傳給子代的同時(shí)，提出了RNA在遺傳信息傳到蛋白質(zhì)過程中起著中介作用的假說。1958年Weiss及Hurwitz等發(fā)現(xiàn)依賴于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA雜交證明mRNA與DNA序列互補(bǔ)；逐步闡明了RNA轉(zhuǎn)錄合成的機(jī)理。

在此同時(shí)認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)是接受RNA的遺傳信息而合成的。50年代初Zamecnik等在形態(tài)學(xué)和分離的亞細(xì)胞組分實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)微粒體（microsome）是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的部位；1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分離出tRNA并對(duì)它們?cè)诤铣傻鞍踪|(zhì)中轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能提出了假設(shè)；1961年Brenner及Gross等觀察了在蛋白質(zhì)合成過程中mRNA與核糖體的結(jié)合；1965年Holley首次測(cè)出了酵母丙氨酸t(yī)RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)；特別是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學(xué)家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質(zhì)的遺傳密碼，隨后研究表明這套遺傳密碼在生物界具有通用性，從而認(rèn)識(shí)了蛋白質(zhì)翻譯合成的基本過程。

上述重要發(fā)現(xiàn)共同建立了以中心法則為基礎(chǔ)的分子遺傳學(xué)基本理論體系。1970年Temin和Baltimore又同時(shí)從雞肉瘤病毒顆粒中發(fā)現(xiàn)以RNA為模板合成DNA的反轉(zhuǎn)錄酶，又進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了遺傳信息傳遞的中心法則。對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)

1956-58年Anfinsen和White根據(jù)對(duì)酶蛋白的變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn)，提出蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)是由其氨基酸序列來確定的。1958年Ingram證明正常的血紅蛋白與鐮刀狀細(xì)胞溶血癥病人的血紅蛋白之間，亞基的肽鏈上僅有一個(gè)氨基酸殘基的差別，使人們對(duì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)影響功能有了深刻的印象。與此同時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)研究的手段也有改進(jìn)，1969年Weber開始應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量；60年代先后分析得血紅蛋白、核糖核酸酶A等一批蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)；1973年氨基酸序列自動(dòng)測(cè)定儀問世。中國科學(xué)家在1965年人工合成了牛胰島素；4 在1973年用1.8AX-線衍射分析法測(cè)定了牛胰島素的空間結(jié)構(gòu)，為認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)做出了重要貢獻(xiàn)。

3．初步認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并開始改造生命的深入發(fā)展階段

70年代后，以基因工程技術(shù)的出現(xiàn)作為新的里程碑，標(biāo)志著人類深入認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)并能動(dòng)改造生命的新時(shí)期開始。其間的重大成就包括： 重組DNA技術(shù)的建立和發(fā)展

分子生物學(xué)理論和技術(shù)發(fā)展的積累使得基因工程技術(shù)的出現(xiàn)成為必然。1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶為基因工程提供了有力的工具； 1972年Berg等將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，使本來在真核細(xì)胞中合成的蛋白質(zhì)能在細(xì)菌中合成，打破了種屬界限；1977年Boyer等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質(zhì)粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽；1978年Itakura（板倉）等使人生長激素191肽在大腸桿菌中表達(dá)成功；1979年美國基因技術(shù)公司用人工合成的人胰島素基因重組轉(zhuǎn)入大腸桿菌中合成人胰島素。至今我國已有人干擾素、人白介素

2、人集落刺激因子、重組人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹瀉疫苗等多種基因工程藥物和疫苗進(jìn)入生產(chǎn)或臨床試用，世界上還有幾百種基因工程藥物及其它基因工程產(chǎn)品在研制中，成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)發(fā)展的重要方向，將對(duì)醫(yī)學(xué)和工農(nóng)業(yè)發(fā)展作出新貢獻(xiàn)。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物和基因剔除動(dòng)植物的成功是基因工程技術(shù)發(fā)展的結(jié)果。1982年P(guān)almiter等將克隆的生長激素基因?qū)胄∈笫芫鸭?xì)胞核內(nèi)，培育得到比原小鼠個(gè)體大幾倍的“巨鼠”，激起了人們創(chuàng)造優(yōu)良品系家畜的熱情。我國水生生物研究所將生長激素基因轉(zhuǎn)入魚受精卵，得到的轉(zhuǎn)基因魚的生長顯著加快、個(gè)體增大；轉(zhuǎn)基因豬也正在研制中。用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物還能獲取治療人類疾病的重要蛋白質(zhì)，導(dǎo)入了凝血因子Ⅸ基因的轉(zhuǎn)基因綿羊分泌的乳汁中含有豐富的凝血因子Ⅸ，能有效地用于血友病的治療。在轉(zhuǎn)基因植物方面，1994年能比普通西紅柿保鮮時(shí)間更長的轉(zhuǎn)基因西紅柿投放市場(chǎng)，1996年轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因大豆相繼投入商品生產(chǎn)，美國最早研制得到抗蟲棉花，我國科學(xué)家將自己發(fā)現(xiàn)的蛋白酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入棉花獲得抗棉鈴蟲的棉花株。到1996年全世界已有250萬公頃土地種植轉(zhuǎn)基因植物。

基因診斷與基因治療是基因工程在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)重要方面。1991年美國向一患先天性免疫缺陷?。ㄟz傳性腺苷脫氨酶ADA基因缺陷）的女孩體內(nèi)導(dǎo)入 重組的ADA基因，獲得成功。我國也在1994年用導(dǎo)入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治療了乙型血友病的患者。在我國用作基因診斷的試劑盒已有近百種之多?；蛟\斷和基因治療正在發(fā)展之中。

這時(shí)期基因工程的迅速進(jìn)步得益于許多分子生物學(xué)新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)。包括：核酸的化學(xué)合成從手工發(fā)展到全自動(dòng)合成，1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后發(fā)明了三種DNA序列的快速測(cè)定法；90年代全自動(dòng)核酸序列測(cè)定儀的問世；1985年Cetus公司Mullis等發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的特定核酸序列擴(kuò)增技術(shù)，更以其高靈敏度和特異性被廣泛應(yīng)用，對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展起到了重大的推動(dòng)作用。

基因組研究的發(fā)展

目前分子生物學(xué)已經(jīng)從研究單個(gè)基因發(fā)展到研究生物整個(gè)基因組的結(jié)構(gòu)與功能。1977年Sanger測(cè)定了ΦX174-DNA全部5375個(gè)核苷酸的序列；1978年Fiers等測(cè)出SV-40DNA全部5224對(duì)堿基序列；80年代λ噬菌體DNA全部48，502堿基對(duì)的序列全部測(cè)出；一些小的病毒包括乙型肝炎病毒、艾滋病毒等基因組的全序列也陸續(xù)被測(cè)定；1996年底許多科學(xué)家共同努力測(cè)出了大腸桿菌基因組DNA的全序列長4x106堿基對(duì)。測(cè)定一個(gè)生物基因組核酸的全序列無疑對(duì)理解這一生物的生命信息及其功能有極大的意義。1990年人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project）開始實(shí)施，這是生命科學(xué)領(lǐng)域有史以來全球性最龐大的研究計(jì)劃。2002和2003年完成了水稻和人類全基因組。更多的基因組學(xué)研究工作正在鋪開。

此外。功能基因組學(xué)的研究正在生命各學(xué)科快速展開。單克隆抗體及基因工程抗體的建立和發(fā)展

1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體以來，人們利用這一細(xì)胞工程技術(shù)研制出多種單克隆抗體，為許多疾病的診斷和治療提供了有效的手段。80年代以后隨著基因工程抗體技術(shù)而相繼出現(xiàn)的單域抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、重構(gòu)抗體、雙功能抗體等為廣泛和有效的應(yīng)用單克隆抗體提供了廣闊的前景?；虮磉_(dá)調(diào)控機(jī)理

分子遺傳學(xué)基本理論建立者Jacob和Monod最早提出的操縱元學(xué)說打開了人類認(rèn)識(shí)基因表達(dá)6 調(diào)控的窗口，在分子遺傳學(xué)基本理論建立的60年代，人們主要認(rèn)識(shí)了原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一些規(guī)律，70年代以后才逐漸認(rèn)識(shí)了真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的復(fù)雜性。1977年最先發(fā)現(xiàn)猴SV40病毒和腺病毒中編碼蛋白質(zhì)的基因序列是不連續(xù)的，這種基因內(nèi)部的間隔區(qū)（內(nèi)含子）在真核基因組中是普遍存在的，揭開了認(rèn)識(shí)真核基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控的序幕。1981年Cech等發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA的自我剪接，從而發(fā)現(xiàn)核酶（ribozyme）。80-90年代，使人們逐步認(rèn)識(shí)到真核基因的順式調(diào)控元件與反式轉(zhuǎn)錄因子、核酸與蛋白質(zhì)間的分子識(shí)別與相互作用是基因表達(dá)調(diào)控根本所在。

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究成為新的前沿領(lǐng)域

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理的研究可以追述至50年代。Sutherland1957年發(fā)現(xiàn)cAMP、1965年提出第二信使學(xué)說，是人們認(rèn)識(shí)受體介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一個(gè)里程碑。1977年Ross等用重組實(shí)驗(yàn)證實(shí)G蛋白的存在和功能，將G蛋白與腺苷環(huán)化酶的作用相聯(lián)系起來，深化了對(duì)G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的認(rèn)識(shí)。70年代中期以后，癌基因和抑癌基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白酪氨酸激酶的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)與功能的深入研究、各種受體蛋白基因的克隆和結(jié)構(gòu)功能的探索等，使近10年來細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究更有了長足的進(jìn)步。目前，對(duì)于某些細(xì)胞中的一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已經(jīng)有了初步的認(rèn)識(shí)，尤其是在免疫活性細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別及其活化信號(hào)的傳遞途徑方面和細(xì)胞增殖控制方面等都形成了一些基本的概念，當(dāng)然要達(dá)到最終目標(biāo)還需相當(dāng)長時(shí)間的努力。

以上簡要介紹了分子生物學(xué)的發(fā)展過程，可以看到在近半個(gè)世紀(jì)中它是生命科學(xué)范圍發(fā)展最為迅速的一個(gè)前沿領(lǐng)域，推動(dòng)著整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展。至今分子生物學(xué)仍在迅速發(fā)展中，新成果、新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，這也從另一方面說明分子生物學(xué)發(fā)展還處在初級(jí)階段。分子生物學(xué)已建立的基本規(guī)律給人們認(rèn)識(shí)生命的本質(zhì)指出了光明的前景，但分子生物學(xué)的歷史還短，積累的資料還不夠，例如：在地球上千姿萬態(tài)的生物攜帶龐大的生命信息，迄今人類所了解的只是極少的一部分，還未認(rèn)識(shí)核酸、蛋白質(zhì)組成生命的許多基本規(guī)律；又如人類基因組DNA 3x109 bp的全序列，包括了3萬多個(gè)基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)，但是要徹底搞清楚這些基因產(chǎn)物的功能、調(diào)控、基因間的相互關(guān)系和協(xié)調(diào)，要理解近90%不為蛋白質(zhì)編碼的序列的作用等等，都還要經(jīng)歷漫長的研究道路。

第五篇：醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)

1.簡述動(dòng)物組織蛋白質(zhì)，DNA ,RNA提取的大致過程及原理。

答：共同的第一步都是取動(dòng)物組織進(jìn)行清洗剪碎，然后用高速組織搗碎機(jī)破碎。

DNA的提?。?/p>

通過勻漿、離心得到細(xì)胞核組分，然后用SDS（十二烷基硫酸鈉，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，釋放出DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，再加入高濃度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—異戊醇混合液，振蕩、乳化，使蛋白質(zhì)變性，DNP復(fù)合物解離，離心后，DNA溶于上層水相，蛋白質(zhì)沉淀夾在水相和有機(jī)相之間得以除去，最后用有機(jī)溶劑沉淀出DNA。

RNA的提取:

取組織，剪成小塊，在乳缽種研碎，加20mLSDS-緩沖鹽溶液（見試劑1.）使成均漿，倒入磨口具塞錐形瓶內(nèi)，再加同樣體積的含水酚液，室溫下劇烈振蕩10分鐘。置冰浴中分層，在0-4℃下，以4000rpmn離心15分鐘。吸出上清液，加等體積氯仿－異戊醇，室溫下劇烈振蕩10分鐘，以4000rpm離心5分鐘，或在室溫下放置10分鐘使分層。吸出上清液（若有必要，該操作可反復(fù)多次），加2倍體積2%乙酸鉀的乙醇溶液，在冰浴中放置1小時(shí)使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱內(nèi)較長期存放。若要得到干燥制品，可將沉淀液以4000rpm離心10分鐘，傾去上清液。沉淀用少許75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇各洗1次，同上法離心，傾去乙醇后，空氣干燥。

蛋白質(zhì)的提取:

1.組織稱重，切小塊放入管中。

2.配置含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑（1ml抽提試劑中加入5 μl蛋白酶抑制劑混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。

3.加入預(yù)冷的含抑制劑的蛋白質(zhì)抽提試劑（250mg組織中加入1ml抽提試劑）。

4.用勻漿器每次30秒低速勻漿，每次勻漿間隔冰浴1分鐘，至組織完全裂解。

5.裂解液于預(yù)冷的離心機(jī)中14，000xg離心15分鐘。上清液立刻轉(zhuǎn)移入新的離心管中保存待用。

原理：在細(xì)胞核內(nèi)，核酸通常是與某些組織蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，因此在提取和制備DNA或RNA時(shí)，首先必須設(shè)法將這兩類核蛋白分開。在不同濃度的鹽溶液中，RNP與DNP的溶解度有很大的差別。在低濃度的NaCl溶液中，DNP的溶解度隨著NaCl濃度的增加而逐漸下降，當(dāng)NaCl 濃度為0.14mol/L時(shí)，DNP的溶解度僅為其在純水中溶解度的1%，而當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNP的溶解度又漸次增大，當(dāng)NaCl濃度增至0.5 mol/L時(shí)，DNP的溶解度約與其在純水中的溶解度近似，當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)增加至1.0 mol/L時(shí)，DNP的溶解度約為其在純水中的溶解度的兩倍，且隨著鹽濃度的上升，其溶解度仍繼續(xù)呈增大的趨勢(shì)。但RNP則與之不同，在0.14 mol/L的鹽溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相當(dāng)大，因此，通常采用0.14 mol/L的鹽溶液來除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用濃鹽溶液（1.7 mol/L濃度以上的NaCl）來提取DNP。

提取出DNA或RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體（DNP）后，在將其中的蛋白質(zhì)除去

2.簡述基因工程的原理及過程。

答：基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品?；蚬こ碳夹g(shù)為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究提供了有力的手段。

所謂基因工程（genetic engineering）是在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行操作的復(fù)雜技術(shù)。是將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長、繁殖的受體細(xì)胞中，以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙。一般步驟：1克隆重組：提取供體生物目的基因，酶解，連接到另一個(gè)DNA分子（克隆載體）上形成重組DNA；2轉(zhuǎn)化：將重組子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并在其中復(fù)制保存；3篩選鑒定：已吸收重組子的細(xì)胞；4大量培養(yǎng)監(jiān)測(cè)外源性基因是否表達(dá)。

3.比較原核生物與真核生物的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

答：

原核生物基因表達(dá)調(diào)控 真核生物基因表達(dá)調(diào)控

啟動(dòng)因子：σ因子決定RNA聚合酶識(shí)別的特異性TF2D決定RNA聚合酶識(shí)別的特異性

轉(zhuǎn)錄激活：操縱子 調(diào)節(jié)蛋白順式作用元件轉(zhuǎn)錄因子

主要機(jī)制：操縱子模型具有普遍性順式作用元件具有普遍性

主要為負(fù)性調(diào)節(jié)（阻遏調(diào)節(jié)）主要為正性調(diào)節(jié)

特有機(jī)制：轉(zhuǎn)錄衰減染色體結(jié)構(gòu)變化

共同點(diǎn)： 1.基因表達(dá)都有時(shí)間特異性和空間特異性2.基因調(diào)控的多層次性和復(fù)雜性3轉(zhuǎn)錄起始部分是基因表達(dá)的基本調(diào)控點(diǎn)

4.簡述 PCR的原理及其應(yīng)用，引物設(shè)計(jì)的原則。

答：PCR的原理：以擴(kuò)增的DNA分子為模板，以1對(duì)與模板互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，依半保留機(jī)制沿模板鏈延伸直至完成2條新鏈合成。通過變性，退火和延伸重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。反應(yīng)體系基本成分有模板DNA，特異引物，耐熱性DNA聚合酶，dNTP和含有 Mg2+的緩沖液。

PCR的主要用途：1目的基因的克隆；2.基因的體外突變3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列測(cè)定5.基因突變分析

PCRD的衍生技術(shù)：1錨定PCR(anchored PCR)2..不對(duì)稱PCR(asymmetric PCR)3.反向PCR(inverse PCR)4.多重PCR(multiplex PCR)5.逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)

引物設(shè)計(jì)的基本原則

①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。②引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。③引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。④兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。⑤引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。⑥引物3?端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。⑦引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

5.簡southern blot的原理及其應(yīng)用。

答：原理： 將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。可用于檢測(cè)樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。

主要應(yīng)用于1.遺傳病診斷 2.DNA圖譜分析 3.PCR產(chǎn)物分析。例如在研究轉(zhuǎn)基因的時(shí)候，可用于檢測(cè)外源基因的插入和整合情況。