第一篇：現(xiàn)代分子生物學常用實驗儀器

實驗一

分子生物學實驗室常用儀器及使用

事實證明，在科學飛速發(fā)展的今天，無論從事哪個領(lǐng)域的研究，要想突破，除了有良好的理論基礎外，更重要的是依賴于先進的技術(shù)和優(yōu)良的儀器設備以及良好的研究環(huán)境。一個標準的分子生物學實驗室除了具有一般生物學實驗室的常規(guī)儀器設備外，還具有一些特殊用途的儀器，這些儀器一般較精密，價格昂貴。下面介紹這些儀器的使用方法和注意事項。

一、冷凍離心機

低溫分離技術(shù)是分子生物學研究中必不可少的手段。基因片段的分離、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實驗中都離不開低溫離心技術(shù)，因此低溫冷凍離心機成為分子生物學研究中必備的重要儀器。在國內(nèi)，有多個廠家生產(chǎn)冷凍離心機，本實驗室的高速冷凍離心機為GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式轉(zhuǎn)頭：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。極限轉(zhuǎn)速20000rpm。

1.安裝與調(diào)試

離心機應放置在水平堅固的地面上，應至少距離10cm以上且具有良好的通風環(huán)境中，周圍空氣應呈中性，且無導電性灰塵、易燃氣體和腐蝕性氣體，環(huán)境溫度應在0～30℃之間，相對濕度小于80%。試轉(zhuǎn)前應先打開蓋門，用手盤動轉(zhuǎn)軸，輕巧靈活，無異?，F(xiàn)象方可上所用的轉(zhuǎn)頭。轉(zhuǎn)子準確到位后打開電源開關(guān)，然后用手按住門開關(guān)，再按運轉(zhuǎn)鍵，轉(zhuǎn)動后立即停止，并觀察轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)向，若逆時針旋轉(zhuǎn)即為正確，機器可投入使用。

2.操作程序

（1）插上電源，待機指示燈亮；打開電源開關(guān)，調(diào)速與定時系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示的閃爍數(shù)字為機器工作轉(zhuǎn)速的出廠設定，溫控系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示此時離心腔的溫度。（2）設定機器的工作參數(shù)，如工作溫度，運轉(zhuǎn)時間，工作轉(zhuǎn)速等。

（3）將預先平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上，關(guān)閉機蓋。按控制面板的運轉(zhuǎn)鍵，離心機開始運轉(zhuǎn)。在預先設定的加速時間內(nèi)，其運速升至預先設定的值。（5）在預先設定的運轉(zhuǎn)時間內(nèi)（不包括減速時間），離心機開始減速，其轉(zhuǎn)速在預先設定的減速時間內(nèi)降至零。

（6）按控制面板上的停止鍵，數(shù)碼管顯示dedT，數(shù)秒鐘后即顯示閃爍的轉(zhuǎn)速值，這時機器已準備好下一次工作。

3.注意事項

（1）離心機應始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線，機器不使用，要拔掉電源插頭。

（2）開機前應檢查轉(zhuǎn)頭安裝是否牢固，機腔中有無異物掉入。

（3）樣品應預先平衡，使用離心筒離心時離心筒與樣品應同時平衡。

（4）揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時，應使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機腔或造成事故。（5）除工作溫度、運轉(zhuǎn)速度和運轉(zhuǎn)時間外，不要隨意更改機器的工作參數(shù)，以免影響機器性能。轉(zhuǎn)速設定不得超過最高轉(zhuǎn)速，以確保機器安全運轉(zhuǎn)。

（6）使用中如出現(xiàn)0.00或其它數(shù)字，機器不運轉(zhuǎn)，應關(guān)機斷電，10秒鐘后重新開機，待所設轉(zhuǎn)速顯示后，再按運轉(zhuǎn)鍵，機器將照常運轉(zhuǎn)。

（7）不得在機器運轉(zhuǎn)過程中或轉(zhuǎn)子未停穩(wěn)的情況下打開蓋門，以免發(fā)生事故。（8）每次操作完畢應做好使用情況記錄，并定期對機器各項性能進行檢修。

二、電泳儀

電泳技術(shù)是分子生物學研究不可缺少的重要手段。電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳大類，自由界面電泳不需支持物，如等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等，這類電泳目前已很少使用。區(qū)帶電泳需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，常用的支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠―G薄層等，分子生物學實驗中最常用的是瓊脂糖凝膠電泳。應用電泳法可以對不同物質(zhì)進行定性或定量分析，或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M行組份分析或單個組份提取制備。下面以DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）為例介紹其使用方法。1.使用方法

（1）按電源開關(guān)，顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用DYY-12型電腦三恒多用電泳儀?”等字樣后，同時系統(tǒng)初始化，蜂鳴4聲，設置常設置。屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設置狀態(tài)，見圖一：

U:0V U＝100V ｜Mode： STD

I: 0mAI ＝50mA｜ P: 0W P＝50W｜T: 00:00 T＝ 01:00｜

其中:左側(cè)大寫U: I: P: T: 為電泳時實際值；中間部分顯示程序的常設值（預置值）。Mode(模)：STD(標準)；TIME(定時)；VH（伏時）；STEP（分步）

（2）設置工作程序。用鍵盤輸入新的工作程序。例如，要求工作電壓U＝1000V，電流I限200mA以內(nèi)，功率W限制在100W以內(nèi)，時間T為3小時20 分，并且到時間自

動關(guān)掉輸出。則操作步驟如下：

①按“模式”鍵，將工作模式由標準（STD）轉(zhuǎn)為定時（TIME）3 模式。每按一下模式鍵，其工作方式按下列順序改變： STD?TIME?VH?STEP?STD。

②先設置電壓U，按“選擇”鍵，先將其反顯，然后輸入數(shù)字鍵即可設置該參數(shù)的數(shù)值。按數(shù)字1000,則電壓即設置完成。

③設置電流I，按“選擇”鍵，先使I反顯，然后輸入數(shù)字200。

④設置功率P，按“選擇”鍵，先使P反顯，然后輸入數(shù)字100。

⑤設置時間T，按“選擇”鍵，先使T反顯，然后輸入數(shù)字320。如果輸入錯誤，可以按“清除”鍵，再重新輸入。

⑥確認各參數(shù)無誤后，按“啟動”鍵，啟動電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯示Start!并蜂鳴4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，注意安全。之后逐漸將輸出電壓加至設置值。同時在狀態(tài)欄中顯示“Run”，并有兩個不斷閃爍的高壓符號，表示端口已有電壓輸出。在狀態(tài)欄最下方，顯示實際的工作時間（精確到秒）。

⑦每次啟動輸出時，儀器自動將此時的設置數(shù)值存入“MO”號存儲單元。以后需要調(diào)用時可以按“讀取”鍵，再按“0”鍵，按“確定”鍵，即可將上次設置的工作程序取出執(zhí)行。

⑧電泳結(jié)束，儀器顯示：“END”，并連續(xù)蜂鳴提醒。此時按任一鍵可止鳴。2.注意事項

(1)U、I、P三個參數(shù)的有效輸入范圍是：U：5～3000V；I：4～400mA；P：4～400W.(2)一般情況下，當No Load！時，首先應關(guān)機檢查電極導線與電泳槽之間是否有接觸不良的地方，可以用萬用表的歐姆檔逐段測量。

(3)如果輸出端接多個電泳槽，則儀器顯示的電流數(shù)值為各槽電流之和，此時應選擇穩(wěn)壓輸出，以減小各槽的相互影響。

(4)注意保持儀器的清潔，不要遮擋儀器后方進風通道。嚴禁將電泳槽放在儀器頂部，避免緩沖液灑進儀器內(nèi)部。

(5)本儀器輸出電壓較高，使用中應不避免接觸輸出回路及電泳槽內(nèi)部，以免發(fā)生危險。

(6）長期不用儀器，應放置在干燥通風的清潔環(huán)境中保存

三、分析天平

分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方法，是獲得可靠分析結(jié)果的保證。分析天平的種類很多，有普通分析天平、半自動/全自動電光分析天平及電子分析天平等。目前實驗室常規(guī)備用的是自動化程度較高的電子分析天平。下面介紹電子分析天平

PL203/01型和AL104/01型

(METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。

PL203/01型精密電子天平：最大稱量210g；實際分度值0.001g；

AL104/01型高分辨率電子分析天平：最大稱量110g；實際分度值0.0001g 1.使用方法

（1）檢查并調(diào)整天平至水平位置。檢查電源電壓是否匹配（使用配置的穩(wěn)壓器），按天平儀器要求通電預熱至所需時間30min。

（2）打開天平開關(guān)“on”，天平則自動進行靈敏度及零點調(diào)節(jié)。待顯示屏上所有字段短時點亮，天平回零時，可進行正式稱量。

（3）稱量時將潔凈稱量瓶或稱量紙置于稱盤上，關(guān)上側(cè)門，天平將顯示該重量，點擊“?O/T?”鍵自動校對零，然后逐漸加入待稱物質(zhì)，直至所需重量為止。

（4）稱量結(jié)束應及時除去稱量瓶（紙），關(guān)上側(cè)門，切斷電源，并做好使用情況登記。

2.注意事項

（1）天平應放置在牢固平穩(wěn)水泥臺或木臺上，室內(nèi)要求清潔、干燥，同時應避免光線直接照射到天平上。

（2）稱量時應從側(cè)門取放物質(zhì)，讀數(shù)時應關(guān)閉箱門以免空氣流動引起天平擺動。（3）揮發(fā)性、腐蝕性、強酸強堿類物質(zhì)應盛于帶蓋稱量瓶內(nèi)稱量，防止腐蝕天平。

（4）電子分析天平若長時間不使用，則應定時通電預熱，每周一次，每次預熱2h，以確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。

四、分光光度計

不同物質(zhì)對不同波長入射的吸收程度各不相同，從而形成各具特征的吸收光譜。根據(jù)這一原理，應用比色法可以對某些有色物質(zhì)進行定性或定量分析。但由于比色法僅限于可見光區(qū)，而且精度低，已遠遠不能滿足高精度微量分析的要求。隨著科學技術(shù)不斷發(fā)展，分析儀器也 不斷地更新?lián)Q代，人們引進了分光光度法的概念，分光光度計隨之應用。分光光度計由光源、單色器、吸收池、接受器、顯示屏幕所組成，它不僅適應于可見光區(qū)，同時還擴展至紫外光 區(qū)及紅外光區(qū)。光密度（OD）是許多溶液中的溶質(zhì)定量的指標之一，通過所產(chǎn)生的單色光 而測定某一溶液對該單色光的吸收值。分子生物學實驗中常使用紫外分光光度計進行核酸溶 液定量和純度的初步判斷。下面介紹紫外可見光分光光度計GeneQantTM Pro（Amersham）的使用方法。該儀器除了能檢測核酸樣品濃度外，還可進行蛋白質(zhì)濃度以及細胞培養(yǎng)液濃度 的測定，能檢測低至幾微升樣品（70μl和5～7μl），樣品無需稀釋，測量后還可全部回收。5 使用方法

(1）打開電源開關(guān)（ON），等待數(shù)秒鐘，顯示屏上顯示一系列數(shù)據(jù)，如本機型號、當前日期 等，這些數(shù)據(jù)可以重新設置，當出現(xiàn)“instrument Ready”即可進入下一程序。

(2）在儀器面板上有許多功能鍵，其中包括檢測base sep、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲檢測DNA，按DNA鍵，即進入DNA檢測程序。在顯示屏上：Pathlengh 10mm Units μg/μl Use 320nm NO Dilution Faotor 1 Insert reference, 以上為儀器預設置的參考數(shù)據(jù)，若按“enter”鍵，和“select”鍵可以將以上的參數(shù)進行重新設定。

(3）取石英樣品杯70μl或5～7μl，容量大小根據(jù)需要。先用吸管吸高純水入樣品杯中，然 后放入儀器上的樣品槽中，放入時注意樣品杯的光學面朝前方。

(4)按“set ref”鍵，進行空白測試。顯示屏上出現(xiàn)一系列數(shù)據(jù)均“0.000”并提示插入樣品“Insert sample ”。將樣品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同樣吸入待測樣品，放入樣品槽 中進行測定。

(5）一個樣品測定完畢，按“stop”鍵，返回“Instrument Ready”。

(6）取出樣品杯，吸出樣品，然后用高純水洗幾次，自然晾干。由于樣品杯十分昂貴，使用時要小心操作。不能用手指拿樣品杯的光學面，用后要及時洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。

五、數(shù)字式酸度計

酸度計是實驗室配置溶液必備的儀器。本實驗室的酸度計為臺式微電腦酸堿度計和溫度計（Hanna）,測量pH范圍為0.00～14.00pH；溫度為0.0～100.0℃；

1.使用方法

（1）將pH電極和溫度探頭與主機連接，主機與電源連接。

第二篇：分子生物學實驗室常用儀器及使用方法

實驗一

分子生物學實驗室常用儀器及使用

事實證明，在科學飛速發(fā)展的今天，無論從事哪個領(lǐng)域的研究，要想突破，除了有良好的理論基礎外，更重要的是依賴于先進的技術(shù)和優(yōu)良的儀器設備以及良好的研究環(huán)境。一個標準的分子生物學實驗室除了具有一般生物學實驗室的常規(guī)儀器設備外，還具有一些特殊用途的儀器，這些儀器一般較精密，價格昂貴。下面介紹這些儀器的使用方法和注意事項。

一、冷凍離心機

低溫分離技術(shù)是分子生物學研究中必不可少的手段?；蚱蔚姆蛛x、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實驗中都離不開低溫離心技術(shù)，心機成為分子生物學研究中必備的重要儀器。室的高速冷凍離心機為GL-20G-Ⅱ型（上海安亭）×10ml和12×1.5ml。極限轉(zhuǎn)速20000rpm。

1.安裝與調(diào)試

離心機應放置在水平堅固的地面上，應至少距離中，周圍空氣應呈中性，且無導電性灰塵、易燃氣體和腐蝕性氣體，環(huán)境溫度應在之間，相對濕度小于80%。試轉(zhuǎn)前應先打開蓋門，用手盤動轉(zhuǎn)軸，輕巧靈活，無異常現(xiàn)象方可上所用的轉(zhuǎn)頭。轉(zhuǎn)子準確到位后打開電源開關(guān)，然后用手按住門開關(guān)，動后立即停止，并觀察轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)向，若逆時針旋轉(zhuǎn)即為正確，機器可投入使用。2.操作程序

（1）插上電源，待機指示燈亮；打開電源開關(guān)，調(diào)速與定時系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示的閃爍數(shù)字為機器工作轉(zhuǎn)速的出廠設定，溫控系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示此時離心腔的溫度。

（2）設定機器的工作參數(shù)，如工作溫度，運轉(zhuǎn)時間，工作轉(zhuǎn)速等。

（3）將預先平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上，關(guān)閉機蓋。

（4）按控制面板的運轉(zhuǎn)鍵，離心機開始運轉(zhuǎn)。預先設定的值。

（5）在預先設定的運轉(zhuǎn)時間內(nèi)（不包括減速時間）定的減速時間內(nèi)降至零。

（6）按控制面板上的停止鍵，數(shù)碼管顯示機器已準備好下一次工作。

3.注意事項

（1）離心機應始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線，機器不使用，要拔掉電源插頭。

（2）開機前應檢查轉(zhuǎn)頭安裝是否牢固，機腔中有無異物掉入。

（3）樣品應預先平衡，使用離心筒離心時離心筒與樣品應同時平衡。

（4）揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時，應使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機腔或造成事故。

在國內(nèi)，有多個廠家生產(chǎn)冷凍離心機，落地式。配有角式轉(zhuǎn)頭：10cm在預先設定的加速時間內(nèi)，其運速升，離心機開始減速，其轉(zhuǎn)速在預先設dedT，數(shù)秒鐘后即顯示閃爍的轉(zhuǎn)速值，這時1

本實驗6×50ml、120～30℃

至 因此低溫冷凍離 以上且具有良好的通風環(huán)境再按運轉(zhuǎn)鍵，轉(zhuǎn)

（5）除工作溫度、運轉(zhuǎn)速度和運轉(zhuǎn)時間外，不要隨意更改機器的工作參數(shù)，以免影響機器性能。轉(zhuǎn)速設定不得超過最高轉(zhuǎn)速，以確保機器安全運轉(zhuǎn)。

（6）使用中如出現(xiàn)0.00或其它數(shù)字，機器不運轉(zhuǎn)，應關(guān)機斷電，10秒鐘后重新開機，待所設轉(zhuǎn)速顯示后，再按運轉(zhuǎn)鍵，機器將照常運轉(zhuǎn)。

（7）不得在機器運轉(zhuǎn)過程中或轉(zhuǎn)子未停穩(wěn)的情況下打開蓋門，以免發(fā)生事故。

（8）每次操作完畢應做好使用情況記錄，并定期對機器各項性能進行檢修。

二、電泳儀

電泳技術(shù)是分子生物學研究不可缺少的重要手段。帶電泳大類，自由界面電泳不需支持物，泳目前已很少使用。區(qū)帶電泳需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，纖維薄膜、非凝膠性支持物、是瓊脂糖凝膠電泳。應用電泳法可以對不同物質(zhì)進行定性或定量分析，組份分析或單個組份提取制備。下面以為例介紹其使用方法。

1.使用方法

（1）按電源開關(guān)，顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用同時系統(tǒng)初始化，蜂鳴

U:

0V

U＝

I:

0mA

I ＝

P:

0W

P＝

T:

00:00

T＝

其中:左側(cè)大寫Mode(模式)：STD(標準

（2）設置工作程序。用鍵盤輸入新的工作程序。例如，要求工作電壓I限制在200mA以內(nèi)，功率動關(guān)掉輸出。則操作步驟如下：

①按“模式”鍵，將工作模式由標準（凝膠性支持物及硅膠―4聲，設置常設置。屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設置狀態(tài)，見圖一：

100V

50mA

｜

50W

｜ 01:00

｜U: I: P: T:)；TIME(定時W限制在 電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)如等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等，這類電G薄層等，分子生物學實驗中最常用的DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）DYY-12型電腦三恒多用電泳儀?”等字樣后，Mode：

STD

中間部分顯示程序的常設值)；VH（伏時）；STEP（分步）100W以內(nèi)，時間T為3STD）轉(zhuǎn)為定時（TIME）2

醋酸或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M行（預置值）。U＝1000V，電流20分，并且到時間自常用的支持物有濾紙、｜

為電泳時實際值； 小時 模式。每按一下模式鍵，其工作方式按下列順序改變：

STD?TIME?VH?STEP?STD。

②先設置電壓U，按“選擇”鍵，先將其反顯，然后輸入數(shù)字鍵即可設置該參數(shù)的數(shù)值。按數(shù)字1000,則電壓即設置完成。

③設置電流I，按“選擇”鍵，先使I反顯，然后輸入數(shù)字200。

④設置功率P，按“選擇”鍵，先使P反顯，然后輸入數(shù)字100。

⑤設置時間以按“清除”鍵，再重新輸入。

⑥確認各參數(shù)無誤后，按“啟動”鍵，啟動電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯示Start!并蜂鳴至設置值。同時在狀態(tài)欄中顯示“壓輸出。在狀態(tài)欄最下方，顯示實際的工作時間（精確到秒）

⑦每次啟動輸出時，儀器自動將此時的設置數(shù)值存入“要調(diào)用時可以按“讀取”鍵，再按“出執(zhí)行。

⑧電泳結(jié)束，儀器顯示：

2.注意事項

(1)U、I、P三個參數(shù)的有效輸入范圍是：

(2)一般情況下，當?shù)牡胤?，可以用萬用表的歐姆檔逐段測量。

(3)如果輸出端接多個電泳槽，則儀器顯示的電流數(shù)值為各槽電流之和，此時應選擇穩(wěn)壓輸出，以減小各槽的相互影響。

(4)注意保持儀器的清潔，不要遮擋儀器后方進風通道。嚴禁將電泳槽放在儀器頂部，避免緩沖液灑進儀器內(nèi)部。

(5)本儀器輸出電壓較高，使用中應不避免接觸輸出回路及電泳槽內(nèi)部，以免發(fā)生危險。

(6）長期不用儀器，應放置在干燥通風的清潔環(huán)境中保存。

三、分析天平

分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方 T，按“選擇”鍵，先使 4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，“No Load！時，首先應關(guān)機檢查電極導線與電泳槽之間是否有接觸不良

T反顯，然后輸入數(shù)字Run”，并有兩個不斷閃爍的高壓符號，表示端口已有電0”鍵，按“確定”鍵，即可將上次設置的工作程序取END”，并連續(xù)蜂鳴提醒。此時按任一鍵可止鳴。U：5 3

注意安全。3000V；I：320。如果輸入錯誤，可之后逐漸將輸出電壓加 MO”號存儲單元。以后需4～400mA P：4～400W.。～ ； 法，是獲得可靠分析結(jié)果的保證。分析天平的種類很多，有普通分析天平、半自動/全自動電光分析天平及電子分析天平等。目前實驗室常規(guī)備用的是自動化程度較高的電子分析天平。下面介紹電子分析天平PL203/01型和AL104/01型(METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。PL203/01型精密電子天平：最大稱量210g；實際分度值0.001g；AL104/01型高分辨率電子分析天平：最大稱量110g；實際分度值0.0001g

1.使用方法

（1）檢查并調(diào)整天平至水平位置。檢查電源電壓是否匹配（使用配置的穩(wěn)壓器），按天平儀器要求通電預熱至所需時間

（2）打開天平開關(guān)“短時點亮，天平回零時，可進行正式稱量。

（3）稱量時將潔凈稱量瓶或稱量紙置于稱盤上，關(guān)上側(cè)門，天平將顯示該重量，點擊“?O/T?”鍵自動校對零，然后逐漸加入待稱物質(zhì)，直至所需重量為止。

（4）稱量結(jié)束應及時除去稱量瓶（紙）

2.注意事項

（1）天平應放置在牢固平穩(wěn)水泥臺或木臺上，室內(nèi)要求清潔、干燥，同時應避免光線直接照射到天平上。

（2）稱量時應從側(cè)門取放物質(zhì)，讀數(shù)時應關(guān)閉箱門以免空氣流動引起天平擺動。

（3）揮發(fā)性、腐蝕性、強酸強堿類物質(zhì)應盛于帶蓋稱量瓶內(nèi)稱量，防止腐蝕天平。

（4）電子分析天平若長時間不使用，則應定時通電預熱，每周一次，每次預熱確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。

四、分光光度計

不同物質(zhì)對不同波長入射的吸收程度各不相同，從而形成各具特征的吸收光譜原理，應用比色法可以對某些有色物質(zhì)進行定性或定量分析。而且精度低，已遠遠不能滿足高精度微量分析的要求。不斷地更新?lián)Q代，人們引進了分光光度法的概念，單色器、吸收池、接受器、顯示屏幕所組成，它不僅適應于可見光區(qū)，同時還擴展至紫外光區(qū)及紅外光區(qū)。光密度（而測定某一溶液對該單色光的吸收值。液定量和純度的初步判斷。下面介紹紫外可見光分光光度計的使用方法。該儀器除了能檢測核酸樣品濃度外，的測定，能檢測低至幾微升樣品（30min。on”，天平則自動進行靈敏度及零點調(diào)節(jié)。待顯示屏上所有字段，關(guān)上側(cè)門，切斷電源，并做好使用情況登記。

隨著科學技術(shù)不斷發(fā)展，分光光度計隨之應用。OD）是許多溶液中的溶質(zhì)定量的指標之一，通過所產(chǎn)生的單色光分子生物學實驗中常使用紫外分光光度計進行核酸溶還可進行蛋白質(zhì)濃度以及細胞培養(yǎng)液濃度70μl和5～7μl），樣品無需稀釋，測量后還可全部回收。4

分光光度計由光源、GeneQantTM Pro

2h，以。根據(jù)這一分析儀器也Amersham）

但由于比色法僅限于可見光區(qū)，（使用方法

(1）打開電源開關(guān)（ON），等待數(shù)秒鐘，顯示屏上顯示一系列數(shù)據(jù)，如本機型號、當前日期等，這些數(shù)據(jù)可以重新設置，當出現(xiàn)“instrument Ready”即可進入下一程序。

(2）在儀器面板上有許多功能鍵，其中包括檢測base sep、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲檢測DNA，按DNA鍵，即進入DNA檢測程序。在顯示屏上：

以上為儀器預設置的參考數(shù)據(jù)，若按“新設定。

(3）取石英樣品杯后放入儀器上的樣品槽中，放入時注意樣品杯的光學面朝前方。

(4)按“set ref”鍵，進行空白測試。顯示屏上出現(xiàn)一系列數(shù)據(jù)均““Insert sample 中進行測定。

(5）一個樣品測定完畢，按“

(6）取出樣品杯，吸出樣品，然后用高純水洗幾次，自然晾干。由于樣品杯十分昂貴，使用時要小心操作。以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過

五、數(shù)字式酸度計

酸度計是實驗室配置溶液必備的儀器。本實驗室的酸度計為臺式微電腦酸堿度計和溫度計（Hanna

1.使用方法

（1）將pH

70μl或5。將樣品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同樣吸入待測樣品，放入樣品槽 ,測量pH范圍為

Pathlengh

10mm

Units

μg/μl

Use 320nm

NO

Dilution Faotor 1

Insert reference，enter”鍵，和“select”鍵可以將以上的參數(shù)進行重7μl，容量大小根據(jù)需要。先用吸管吸高純水入樣品杯中，然 0.000”并提示插入樣品stop”鍵，返回“Instrument Ready”?？捎脺厮蛳←}酸，乙醇15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。0.00～14.00pH；溫度為0.0～100.0℃；

～”不能用手指拿樣品杯的光學面，用后要及時洗滌，）電極和溫度探頭與主機連接，主機與電源連接。

（2）取出電極保護套，如果有結(jié)晶鹽出現(xiàn)，這是電極常見現(xiàn)象，浸入水后就會消逝。如果薄膜玻璃或透析膜發(fā)干，可在HI170300電極保存液中浸泡1小時。

（3）pH校準。將pH電極和溫度探棒浸泡在所選的標準緩沖液內(nèi)4cm（建議用pH6.86、7.01），緩沖液值可通過“D℃”或“?℃”鍵來調(diào)節(jié)。按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號及“7.01”數(shù)據(jù)。當讀數(shù)不穩(wěn)定時，屏幕會顯示“NOTREADY”；當讀數(shù)穩(wěn)定時，屏幕會顯示“READY”和“CFM”，按“CFM”鍵確認校準值。確認第一校準點后，將pH電極與溫度探棒浸泡在標準緩沖液內(nèi)4cm（建議用pH4.01、9.18、10.01）；再按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號及“4.01”數(shù)據(jù)。按“CFM”鍵確認校正值。

（4）pH測量。校準完畢后，儀器自動進入溶液約4cm，停幾分鐘讓電極讀數(shù)穩(wěn)定。

2.注意事項

（1）由于pH211酸度計內(nèi)裝有可充電電池，在剛購買或長時間放置后，再使用時，通電校正測量完畢后，可將電源繼續(xù)還插入電源插座，只需關(guān)閉開關(guān)，這樣可以保證電池充電，是校正值得以儲存，下次測量時無須校正即可進入精確測量。

（2）不可用蒸餾水、去離子水和純水浸泡電極。如果讀數(shù)偏差太大（±沒有校正或電極變干。為避免電極受損，在關(guān)機前要將狀態(tài)時，在電極浸入電極保存液前，電極要與機器分開。

（3）如儀器已測過幾種不同的樣品溶液，請用自來水清洗，樣品清洗電極。

（4）溫度會影響pH的讀數(shù)，為測量準確的補償，用HI7669/2W溫度探棒浸入樣品中，緊靠電極并停幾分鐘，如果被測溶液的溫度已知或測量是在相同溫度下進行，只需動手補償，示溫度讀數(shù)伴有℃信號閃爍。溫度可通過“

六、PCR儀

PCR儀，也稱DNA熱循環(huán)儀、基因擴增儀，它是使一對寡核苷酸引物結(jié)合到正負上的靶序列兩側(cè)，從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬倍的靶序列三種不同溫度進行DNA變性、引物復性、PCR儀主要應用于基礎研究和應用研究等許多領(lǐng)域，如基因分析、序列分析、進化分析、臨床診斷、法醫(yī)學等等。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，因此了解PCR儀的性能，熟練掌握儀器的正確使用方法及使用過程中的注意事項，將是十分必要的。

現(xiàn)介紹PCR 擴增儀（Tl Thermocycler）的使用方法和注意事項。

pH測量狀態(tài)，將電極與溫度探棒浸泡在待測

pH電極從溶液中拿出。當處于關(guān)機 或在插入樣品溶液前，用待測pH值，溫度要在適合的范圍內(nèi)進行自動溫度那么此時溫度探棒是不用連接，?℃”或“D℃”來調(diào)節(jié)。DNA片段，它的每一循環(huán)包括在DNA聚合酶催化的延伸反應的三個過程。PCR擴增技術(shù)也得到普及推廣應用，6

1pH），則是由于屏幕上會顯DNA鏈 1.使用方法

(1）接通電源開關(guān)，儀器進入準備狀態(tài)；在顯示屏上記錄了當前儀器的溫度和蓋子（Lid）的溫度。若儀器正在運行時，須按“

B ”鍵（start/stop），才能退出運行并返回準備狀態(tài)。

(2）編寫程序段。在準備狀態(tài)下按“

C ”鍵(programs)進入編程狀態(tài)，選定一程序號，然后按“enter”鍵，進入下一程序；按 “A”(list)鍵后，選一文件號（empty program）；再按“enter”鍵，進入下一程序；按“ABC”鍵，進入下一程序，用上下左右鍵號選擇一個字母（A、B、C、D、?），然后按“enter”鍵，進入下一程序；按“name ok”鍵，完成文件命名。

(3）設定蓋子的溫度。性溫度是95℃，那么蓋子的溫度就要設定為程序。

(4）設定變性溫度、變性時間、延伸溫度、延伸時間、退火溫度、退火時間及循環(huán)總數(shù)等參數(shù)。從第一步依次按“間，全部參數(shù)設置完后，按“

(5）運行程序。檢查設定是否正確，屏上可觀察到系統(tǒng)運行的情況，按“

七、凝膠成像系統(tǒng)

本系統(tǒng)屬全自動電腦控制影像分析系統(tǒng)，主要拍攝核酸的acrylamide電泳膠片。在與確定量，是分子生物學及生化蛋白試驗的重要檢測工具。像頭，變焦鏡，電腦以及專業(yè)凝膠圖象采集及分析斑點測量、PCR密度的定量分析等。此外，還提供圖像采集、標注、打印、數(shù)據(jù)和圖像發(fā)送到Word、Excel、圖像處理等功能。

1.使用方法

(1)打開電腦，啟動凝膠分析軟件，進入用戶界面。

（2）打開采集凝膠圖像的暗箱裝置電源開關(guān)，放入凝膠，打開紫外光源或白光光源，將采集裝置與電腦上采集卡相連，然后選擇“文件”菜單中的“圖像采集”或工具欄的“圖像采集”按鈕，出現(xiàn)圖像窗口：晰，可以調(diào)節(jié)暗箱上的變焦鏡，使之清晰?？芍苯訉D像保存起來，也可通過“圖像處理”對圖像進行旋轉(zhuǎn)、裁剪、濾波、調(diào)節(jié)對比度??方面的處理。

(3)對讀入的電泳凝膠圖像，可以啟動電泳凝膠分析系統(tǒng)。在“功能選擇”菜單中選擇“電泳凝膠”或在工具欄上的“電泳凝膠”工具，將出現(xiàn)泳道分析工具欄，并在“圖像顯示”子窗口中出現(xiàn)一個紅色的矩形框。還可進入“條帶分析”系統(tǒng)，對條帶 lid temp：

℃”enter”鍵進入，用四個移位鍵移動設定位置。先設定溫度，后設定時pgm ok”鍵，所設定的程序自動被保存。

按“Stop”可停止運行。markers比較后，可精確計算樣本的分子量，對核酸電泳也可準 “開始采集”105℃。待蓋子預熱后按“start”鍵，選擇設定好的程序，開始運行。顯示 agarose本系統(tǒng)包括暗箱，.軟件（3.3版）。該軟件提供對電泳凝膠、、“停止采集”、“采集圖像”等。如果圖像不清 7

10℃，例如變enter”鍵，進入下一 紫外透射儀，攝 進行編號，對“，蓋子的溫度一般比變性溫度要高 電泳膠片，及蛋白質(zhì)的二條以上的條帶進行比較。

（4）采集圖像結(jié)束后，關(guān)閉暗箱電源開關(guān)，從暗箱中取出凝膠，并將玻璃板清洗干凈，晾干。

八、空氣恒溫搖床

搖床（振蕩器）為實驗室的常規(guī)設備。SHK-99-Ⅱ型臺式空氣恒溫搖床，采用微電腦控制系統(tǒng)，溫度范圍：室溫＋5℃～60℃，精度±0.5℃；時間范圍：1分鐘～99小時59分鐘；轉(zhuǎn)速范圍：60RPM～250RPM。

1.使用方法

(1）LED屏幕上各段數(shù)據(jù)：

000

00.0

屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段則為“轉(zhuǎn)速，“Time”表示時間，不設定時可自動累計時間一直運行。的值隨時可以修改，隨時按新值運行。

(2）工作程序設置。按“F1”鍵，進入設置狀態(tài)?？稍谒俣?，溫度，時間，運行等四部分之間切換。在每一部分按“F2”鍵輸入數(shù)據(jù)，輸入完十位數(shù)據(jù)，再輸入個位數(shù)據(jù)，按“鍵，再按“F2”鍵，到小數(shù)位，再按“

(3）再按“F1”鍵，轉(zhuǎn)回運行狀態(tài)，按“

(4）按“End”鍵，結(jié)束系統(tǒng)運行。

2.注意事項

（1）打開電源，系統(tǒng)開始自檢，等待完畢，可以進行第2步參數(shù)設置。若屏幕出現(xiàn)：錯誤；b.“MOTOR ERROR”，表示電機部分有錯誤。

（2）運行過程可以打開箱蓋，這樣電機不運行，時間也停止，蓋上蓋接著運行。

（3）工作完畢，關(guān)閉電源。關(guān)機后，要等一段時間再開機。

九、水的凈化裝置

分子生物學實驗對水的純度要求越來越高，RPM

Temp

Time

00:00 2”，“Temp”表示溫度，“RPM”表示每分鐘“Temp”、“RPM”、F2”鍵，又到十位，以此循環(huán)。Start”鍵，電機開始運行，時間開始計時。LCD屏幕出現(xiàn)“WELCOME”字樣，系統(tǒng)自檢a.“TEMP ERROR”，表示溫度檢測線路有

一般蒸餾水常常難以滿足實驗要求，大多要求要

Time”F2”

“ 進行第二次蒸餾（雙蒸水），它可以去除水中的大部分有機雜質(zhì)，但制作時間較長，而且無機雜質(zhì)還是很多。許多實驗還需要去離子水，這就需要陰陽離子交換樹脂進行處理。目前，分子生物學實驗室都使用高質(zhì)量的超純水。如美國微孔濾膜公司的Milli-Q超純水制造系統(tǒng)所制造的超純水適用于許多學科領(lǐng)域，如分子克隆、各種色譜分析、氨基酸分析、DNA測序、酶反應、組織和細胞培養(yǎng)等實驗。下面介紹RO-MB壁掛式反滲透高純水機性能及使用方法。RO-MB反滲透高純水機（杭州永潔達）產(chǎn)水量（25℃）10L/H；產(chǎn)水水質(zhì)：RO純水：<10μs/cm，高純水：>15MΩ.cm；可用自來水制成普通實驗用水和高純水，同時滿足不同水質(zhì)要求。在線電導率儀對產(chǎn)水水質(zhì)連續(xù)檢測，可保證產(chǎn)水質(zhì)量。

1.使用方法

(1)準備：先檢測與純水機相連的原水管路、廢水管路連接是否正常，打開原水閥門。供電電源是否正常，檢查按鈕是否在關(guān)閉狀態(tài)（按鈕彈出狀態(tài)）220V電源插座上。

(2）開機：依次按下電源開關(guān)，泵開關(guān)，純水機啟動產(chǎn)水，同時廢水排出，指示燈亮起，并處于自動運行狀態(tài)。

(3）取純水：若打開閥門打開時，檢測儀表顯示高純水電導率或電阻值。一杯水后再取新鮮水。

(4）關(guān)機：不用時可關(guān)閉個按鈕停機，自來水進水閥門不必關(guān)閉，這時機子內(nèi)部的進水電磁閥已自動切斷水路。只要管路閥門不漏，也可使機子保持自動待機狀態(tài)。

2.注意事項

（1）純水機的正常使用環(huán)境溫度為度不低于5℃。

（2）預處理濾芯一般三至六個月更換一次，實際使用壽命與自來水水質(zhì)、總過濾量等有關(guān)。

（3）混床濾芯產(chǎn)高純水約水中含鹽量、總用水量等有關(guān)。天開機30分鐘沖洗一次，冬季每隔

（4）使用過程若發(fā)現(xiàn)停機后泵仍頻繁地每隔數(shù)分鐘有規(guī)則地啟動數(shù)秒鐘又停機，此為管路漏水引起，需及時打開機箱加以解決。象，有利于沖洗和保護反滲透膜元件，十、消毒設備

細菌和細胞培養(yǎng)以及核酸等有關(guān)實驗所用的試劑、RO純水或高純水出口閥門，則可獲得相應水質(zhì)的純水。當高純水出口 115～3噸，約二至四個月更換一次，2～3避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積。將電源插頭插入帶有接地線的為了獲得高質(zhì)量的高純水，可以先放掉 35℃，產(chǎn)水量會隨溫度降低而下降，冬季保養(yǎng)溫實際使用壽命與自來水水質(zhì)、2天。必須注意定期沖洗維護。夏季宜每 乃屬正常現(xiàn)尤其高溫季節(jié)。器皿及實驗用具，應嚴格滅菌，有的實驗

～設備停運時間超過天開機沖洗一次。若每隔半小時以上啟動數(shù)秒鐘又停機，還要求沒有核酸酶的污染，故應將實驗器械，試劑等進行高壓消毒。對于經(jīng)過導入DNA重組分子的菌株，操作后必須進行嚴格的高壓消毒滅活處理。

大批實驗物品、試劑、培養(yǎng)基等可以使用大型消毒器進行消毒。一些不能經(jīng)受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。所有的細胞培養(yǎng)、細菌培養(yǎng)的操作，都應在紫外線消毒后的超凈工作臺中進行。

下面介紹立式自動壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40BI）的使用方法。

1.使用方法

（1）開蓋：轉(zhuǎn)動手輪，使鍋蓋離開密封圈。

（2）通電：連接自動進水裝置。接通電源，將控制面板上電源開關(guān)按至低（LOW）紅燈亮，蒸發(fā)鍋內(nèi)屬斷水狀態(tài)；缺水（（3）加水：打開水源，水位達到低水位，控制面板上低水位紅燈和缺水黃燈相繼滅，加熱（1-綠燈）亮，繼續(xù)加水至高水位（（4）堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內(nèi)，這樣有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。

（5）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊。

（6）設定溫度：通電后數(shù)顯窗燈亮，上層為紅色，顯示溫度，下層為綠色，設定溫度和時間。先按控制面板上確認鍵，綠色數(shù)顯閃爍，進入溫度設定狀態(tài)。按一次移位鍵指相應位置閃爍，根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進行（單項循環(huán)）移位。按△增加鍵或所需溫度設定。設定完畢，按二次確認鍵，進行溫度確認。

（7）設定時間：按一次確認鍵，將溫度設定切換成時間設定；再按一次移位鍵，所指相應位置閃爍，完畢，按二次確認鍵，定時器開始倒計時。

（8）滅菌：在加熱初，將下排汽閥打開至垂直位置；下排汽閥待蒸汽冒出時，壓力表顯示指示為的15%為宜。安全閥設定數(shù)，超出壓力部分，安全閥將自動泄壓，并開始計數(shù)滅菌所需時間。滅菌完成，電控裝置將自動關(guān)閉加熱系統(tǒng)，伴有蜂鳴提醒；并將保溫時間切換成控制面板上電源開關(guān)按至

（9）干燥：物品滅菌后需要迅速干燥，須打開放汽閥和下排汽閥，將滅菌器內(nèi)的蒸汽迅速排出，使物品上殘留水蒸汽快速揮發(fā)。根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進行移位；進行時間設定確認?！鏁r，將下排汽閥推向水平關(guān)閉位置；留有微量蒸汽逸出，以控制總汽流量使用最高滅菌溫度為OFF HIGH）綠燈亮，自動停止加水。按增加鍵或減少鍵，時間采用倒計時，124℃～126℃，ON處，若水位LACK）黃燈亮，電源已正常輸入。

200mm×100mm×100mm為宜，各

所??減少鍵，進行 進行所需時間設定。設定當滅菌鍋內(nèi)溫度達到設定溫度，0.145Mpa～0.165Mpa范圍內(nèi)屬于END顯示；此時，將

100壓力在處；關(guān)閉電源，停止加熱待其冷卻。

（10）將蓋開啟，取出已滅菌物品。關(guān)閉水源，打開下排水閥，排盡滅菌室的水與水垢，以備下次使用。

2.注意事項

（1）堆放滅菌物品時，嚴禁堵塞安全閥的出汽孔，必須留出空位保證其空氣暢通，否則安全閥因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。

（2）滅菌液體時，應將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中，以不超過選用棉花紗塞，切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞，放蒸汽，必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。

（3）對不同類型，不同滅菌物要求的物品，切勿放在一起滅菌，以免顧此失彼，造成損失。

實驗二

質(zhì)粒DNA

一、實驗原理

細菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的在于細胞質(zhì)中、獨立于細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份，于染色體外的游離狀態(tài)，制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。

DNA，大小范圍從

在滅菌液體結(jié)束時不準立即釋 至200kb3/4體積為好，瓶口隨著染色體的復特別注意，的提?。瓑A裂解法1kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個步驟：①培養(yǎng)細菌，使質(zhì)粒DNA大量擴增；②收集和裂解細菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點以及質(zhì)粒DNA的用途進行選擇。本實驗介紹堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離質(zhì)粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。當加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH至中性時，因為共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而復性的質(zhì)粒DNA恢復原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。

二、儀器及試劑

1.儀器及耗材：37℃恒溫搖床、冷凍離心機、臺式離心機、微量移液器、50 ml離心管、1.5 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。

2.試劑及配制：

LB培養(yǎng)液的配制：

酵母浸提物

5.0 g；

胰蛋白胨

10.0 g；

NaCl

10.0 g；

依次稱量后加入800 ml去離子水后攪拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（約0.2 ml）調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值至7.0。再加去離子水將溶液定容至總體積為1000 ml，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。

溶液 Ⅰ（GET緩沖液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖

配制：1000 ml

mol/L Tris-HCl（pH8.0）

ml

0.5 mol/L EDTA（pH8.0）ml

20% Glucose（1.11mol/L）

ml

dH2O

910ml

將以上溶液混合裝瓶，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。

溶液II（變性液）：200 mmol/L NaOH，1% SDS

配制： 500 ml

10% SDS

ml

2N NaOH

ml

取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。室溫保存，此溶液保存時間最好不超過一個月，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要劇烈攪拌。

溶液 III(醋酸鉀液)：3 mol/L 醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 5.6。5 mol/L 冰醋酸

配制：500 ml

醋酸鉀

g

冰醋酸

57.5 ml

加入300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至高溫高壓滅菌后，4℃保存。

10×TE緩沖液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA

配制：1000ml mol/LTris-HCl 緩沖液(pH 8.0)

100ml

500 mmol/L EDTA(pH8.0)ml

加入約800 ml的去離子水，均勻混合。溶液定容至1 L。高溫高壓滅菌后，苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)：將量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入 13

500 ml。4℃保存。24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

其它試劑：TE（pH8.0）、異丙醇、氯仿/異戊醇（24:1）、無水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素貯存液（50 mg/ml）

三、操作步驟

1.菌體的培養(yǎng)和收獲

(1）將5～10 ml含有氨卞青霉素（后接入一單菌落，并保持通氣良好，于接一次，于37℃ 220 rpm振搖培養(yǎng)(2）吸取培養(yǎng)的菌液1.5 ml，轉(zhuǎn)入棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。

2.質(zhì)粒DNA提?。▔A裂解法）

（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重懸細菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。

（2）加200 ul溶液 Ⅱ，蓋緊管口，液變透明，粘稠）。

（3）加150 ul溶液 Ⅲ，輕微振蕩混和

（4）12000 rpm離心6 min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）

（5）加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻離心管。

（6）加1倍異丙醇，振蕩混勻，靜置倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。

（7）加200 ul 70％乙醇洗滌沉淀物，臺式離心機在室溫下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）

（8）沉淀加20μl TE, 反復吹打使質(zhì)粒

四、常見問題及可能原因

1.提取的質(zhì)粒DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵步驟反應時間過短；離心時間或速度不夠。

2.提取的質(zhì)粒DNA呈涂布狀：操作過程中用力過猛，動作過大；操作系統(tǒng)內(nèi)有污染。

AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml的三角瓶中，然37℃ 220 rpm振搖過夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉(zhuǎn)3～4 h。的離心管中，用臺式離心機以12000 rpm

輕緩上下顛倒離心管以混合內(nèi)容物。室溫靜置10 sec，置冰上10 min(溶液出現(xiàn)白色沉淀。1 min，12000 r/min離心6min，取上清液至另一10 min，12000 rpm離心6 min。棄上清液，將離心管 12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀。DNA充分溶解，－20℃保存。14 min。5 min（溶)。

1.5 ml離心 3.與染色體DNA分離不全：變性過程不完全；試劑配制有問題（成分，濃度或pH）。

實驗三

瓊脂糖凝膠電泳

一、實驗原理

瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化的多孔支持介質(zhì)（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場上。由于架兩側(cè)帶有含負電荷的磷酸根殘基，分子的遷移速度取決于分子篩效應。因而可依據(jù)DNA可以分離相對分子質(zhì)量相同，而構(gòu)型不同的相對分子質(zhì)量標準參照物和樣品一起進行電泳而得到檢測。以提供一個用于確定EB)，其分子可插入下，呈桔紅色熒光，因此也可對分離的

一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在

二、儀器及試劑

1.儀器及耗材：

水平電泳槽、電泳儀、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。

2.試劑及配制：

50×TAE緩沖液的配制：

配制1000 ml

DNA 片段的常用技術(shù)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)DNA分子的雙螺旋骨因此在電場中向正極移動。在一定的電場強度下，DNA具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，DNA，也DNA分子。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對分子質(zhì)量標準參照物相對可DNA片段大小的標準。在凝膠中加入少量溴化乙錠(ethidium bromide, DNA的堿基之間，形成一種絡合物，在254～365nm波長紫外光照射DNA進行檢測。0.2kb～50kb范圍內(nèi)的DNA片段。本實驗介紹瓊脂糖凝

DNA片段分離中的應用方法。

凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點樣板或parafilm、2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）15 分子的大小來使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的Tris

242 g

冰乙酸

57.1 ml

0.5 mol/L EDTA

ml

加入600 ml去離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1 L后。高溫高壓滅菌，室溫保存。

1×TAE緩沖液的配制：

稱量20 ml的50×TAE緩沖液，再加入980 ml的去離子水。

溴化乙啶貯存液：10 mg/ml 溴化乙啶

配制：100 ml

稱取1 g溴化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至100 ml后，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中。室溫保存。

6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。

配制：10 ml

溴酚藍mg

二甲苯青FF

mg

甘油

ml

用6×TAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。-20℃保存。

其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder、瓊脂糖、三、操作步驟

1.制備1％瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml)：稱取0.7 g中，加入70 ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。

2.膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取 16

0.5 g）瓊脂糖置于錐形瓶3次至瓊脂糖全部融化，并在固定位置放（下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。

3.加樣：在點樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應不小于1X。用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。

4.電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓60－100V，樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳。

(5）電泳完畢后，取出凝膠，用含有0.5 ug/ml的溴化乙錠1×TAE用清水漂洗10 min。

(6)觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

四、常見問題及注意事項

1．配瓊脂糖時應使其完全熔化后方可制膠。

2．瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時要輕緩。

3．電泳時應注意電源線路，預防觸電。

4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用時應帶乳膠或一次性塑料手套。并在專門的實驗室內(nèi)使用。

5．紫外線對人體有損傷作用，開燈時間不宜太長，注意防護。

6．DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。

7．質(zhì)粒DNA的存在形式有3種，①共價閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②開環(huán)DNA（ocDNA），此種質(zhì)粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力，形成松弛的環(huán)狀分子；③線狀DNA，因質(zhì)粒處斷裂而造成。因此質(zhì)粒DNA電泳的結(jié)果中有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們的泳動速度為：cccDNA > 線狀DNA > ocDNA。min，再DNA的兩條鏈在同一溶液染色約 DNA18

DNA

實驗四

限制性內(nèi)切核酸酶的酶切與鑒定

一、實驗原理

限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈分子中特異核苷酸序列的水解酶，主要存在于原核生物中。根據(jù)限制酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。其中Ⅱ類酶在分子克隆和基因操作中最為有用，是常用的分子生物學工具酶。

限制性內(nèi)切酶識別序列長度一般為4～8個呈回文序列的特異核苷酸對。一般情況下，識別序列越長，在同一DNA分子中識別位點出現(xiàn)的頻率就越小。許多限制性內(nèi)切酶的酶切位點已被確定。例如EcoRl 酶的識別與切割序列為以下6個堿基對。

5′??GAATTC??3′

EcoR I以獨特的方式識別并裂解這個順序，形成兩個 和

……G

這些末端為互補的，即粘性末端，并可在連接酶的催化下與由相連接。

限制性內(nèi)切酶主要用于基因組基因片段的分離與回收以及單酶切、雙酶切或部分酶切等不同方式。大量的酶切反應。小量酶切反應主要應用于質(zhì)粒的酶切鑒定，DNA，大量酶切反應用于制備目的基因片段，體積為

本實驗為EcoR I對質(zhì)粒性內(nèi)切核酸酶酶切位點。瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定酶切效果。

二、儀器與試劑

1.儀器：

水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、2.試劑：

質(zhì)粒pUC18、EcoR I限制性內(nèi)切核酸酶、內(nèi)切酶反應緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、樣緩沖液、溴化乙啶染液、無菌水等。

三、操作步驟

3′??

……CTT AA DNA的片段化、重組DNA分子物理圖譜的構(gòu)建等。根據(jù)酶切目的和要求不同，可有pUC18的小量酶切。在用特定的限制性內(nèi)切核酸酶對質(zhì)粒進行酶切反應后，CTT AAG?? 5′

5′突出末端：

AATTC……

EcoR I產(chǎn)生的其它分子末端DNA分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的可分為小量酶切反應和體積為20 μ50～100 μl，DNA

在質(zhì)粒的雙鏈環(huán)狀DNA電泳設備等。

l, 含0.210通?？刹捎? μg 30ug。6×上

G……根據(jù)酶切反應的體積不同，～用量在～分子上有多個限制

1．限制性內(nèi)切酶反應一般在滅菌的0.2或0.5ml PCR薄壁離心管中進行。

2.酶切反應體系（10ul）：

酶解緩沖液（10×buffer）ul

限制性內(nèi)切酶

0.5 ul EcoR I(7.5U)

底物DNA（質(zhì)粒）

滅菌ddH2O

限制性內(nèi)切酶最后加入，手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸，混勻后離心15s。37℃水浴消化

3.酶切完畢，分子量標準物同時進行電泳以確定應，或加入適量酶后繼續(xù)反應。

5.經(jīng)電泳觀察酶切反應完全后，將上述反應液置將剩余酶切產(chǎn)物保存于

四、注意事項

1.限制性內(nèi)切酶需保存于

2.限制性內(nèi)切酶溶液通常含有溶液底部，所以要充分搖勻。

3.加樣時吸頭垂直進入試劑管，避免碰到管壁，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。

4.酶（置于冰盒上）應最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深。

5.酶解消化反應溫度及時間根據(jù)該酶使用說明書而定。

6.注意酶的用量，加入的酶量按的10%，以避免酶液中甘油干擾反應活性的可能，即在識別序列以外的位點進行切割。此外，反應體系中甘油的質(zhì)量分數(shù)大于12%，以及缺少

五、相關(guān)問題

2h。取5ul酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，?C20℃?zhèn)溆谩?20℃，操作時應將酶保持在冰浴中，避免長時間置于高溫中。NACL和存在M

x ul（依質(zhì)粒濃度而定）

加至10 ul 鑒定酶切反應效果，DNA片段的大小。如果酶切不完全，可繼續(xù)65℃水浴中10～15min，中止酶切反應，50%甘油，加入反應管后，因密度較大，往往沉淀至

1-3U/ug DNA計算，酶的體積應低于反應總體積

。酶量過大（≥25U/ug DNA）時，有產(chǎn)生所謂星號 20

6000 r/min，DNA.酶解消化反

必須用 等情況下，都有可能出現(xiàn)星號活性。

1.酶的保存

不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中，這種特定配方的緩沖液能使酶活性維持較長時間。常用的保存緩沖液各組分作用如下：

Tris-HCl（7.4―7.8）：

維持穩(wěn)定的pH范圍。

50-100mmol/L

NaCl或KCl：提供一定的離子強度。

0.1mmol/L EDTA：

1mmol/L

DTT：

200-500ug/ml BSA：

度，防止蛋白質(zhì)分子濃度過低而導致酶分子變性。

50%的甘油：

1-5 g/L的Triton-100：

白質(zhì)分子的表面變性作用。

2.酶單位的定義

限制酶的單位通常定義為：1U的酶能在約完成酶切1ug的λDNA。確定限制酶單位的具體操作方法是分別向列的酶（1U左右），當電泳觀察到酶切片段的條帶不再發(fā)生變化時說明已作用完全，割的最少酶量定為1U的酶量。

3.限制酶的作用條件

限制酶切割DNA的反應中，酶切條件是實驗成功的重要因素，其中包括反應的溫度、時間與反應的緩沖體系，除了這些條件外，只有在正確選擇酶反應條件時才能達到最佳酶切效果。

（1）作用溫度

早期的酶切反應都在37℃進行，這種方法雖然簡單、統(tǒng)一，但卻不能達到每個酶的最適反應溫度。為了達到最佳酶切的效果，最好根據(jù)所選用的酶確定所需要的反應溫度。

（2）緩沖體系

限制酶反應的緩沖體系大致相同，都含有以下組分：約作用是將酶反應體系的pH維持在7.5-8.5；約

絡合掉能激活限制酶的鎂離子。

保護酶分子上的還原性基團。

牛血清白蛋白提高溶液中蛋白質(zhì)的濃

使酶液保存于-20℃不至凍結(jié)。

這是一種非離子型表面活性劑，能防止蛋50ul合適的反應緩沖體系中，在1ug的底物中加入一系DNA的純度與濃度也會影響酶切效果，100mmol/L10mmol/L的MgCl2，作用是為限制酶提供激

1h內(nèi)完全切Tris-HCl，的活因子；1mmol/L的DTT，作用是保護還原性基團；約150mmol/L的NaCl，作用是提供合適的離子強度。由于認識的局限性，早期的限制酶反應體系僅根據(jù)其中NaCl含量的不同分為高鹽、中鹽與低鹽三種，這同樣不能使每種酶獲得最適反應條件。現(xiàn)在提供酶的很多廠商能提供4-10種緩沖體系，其中各必需成分之間只有很小的差別，目的是使每種酶都發(fā)揮最大的作用。

緩沖液一般配成10倍的濃度，使用時以1/10的比例加入，當然為了減小吸量誤差也可自行配制5倍的緩沖液。

(3)反應體積與時間

酶反應體積一般不宜小于20ul。因為過小的反應體積在加入各種成分時易產(chǎn)生誤差，甘油含量易超過10%。在37℃保溫可因水分蒸發(fā)而明顯改變反應體系中各成分的濃度，從而影響酶活力。同時還要考慮反應完畢進行電泳時，所加樣品中DNA的量能夠在電泳中顯出清晰的泳帶。

常規(guī)的酶切反應一般控制在60min內(nèi)進行，但也可以根據(jù)切割對象與所用的酶將保溫時間延長至十幾個小時。

(4)DNA的純度與濃度

除了上述酶反應條件外，影響酶切效果的最主要因素是DNA的純度。例如，樣品中含有大量RNA雜質(zhì)時會因減少了酶的有效濃度而影響酶切效果；某些雜蛋白未除凈而結(jié)合在DNA時也會影響酶切效果。至于抽提過程中未除凈的各種影響因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是瓊脂糖凝膠中的硫酸根離子等。

DNA純度的另一個指標是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后電泳結(jié)果顯示出不清晰條帶或成為一片紅色（術(shù)語稱Smear）時，可肯定系統(tǒng)中已經(jīng)污染了DNA酶。

DNA樣品中含有大量RNA時可用RNA酶處理；含有結(jié)合在DNA上的雜蛋白與DNA酶時都可用氯仿/異戊醇抽提；當樣品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物質(zhì)時可以通過沉淀更換一個新的緩沖體系。當然，酶切失敗時也不能排除除DNA外的一切因素，如無菌水，EP管，吸咀等的干凈程度以及內(nèi)切酶自身的酶活性情況。

除純度外，DNA的濃度也會影響酶切效果，一般DNA質(zhì)量濃度在1ug/20ul才能得到較好的酶切效果，質(zhì)量濃度高達1.5ug/20ul時就可能發(fā)生酶切困難。

(5)終止酶切反應的方法

如果需對酶切片段進行連接或標記等操作時，首先要將限制酶滅活。滅活的方法可分為三種：第一種是向反應緩沖體系中加入終濃度為10-12.5mmol/L的EDTA，原理是絡合掉酶反應中所需的鎂離子。但這種方法會影響需鎂離子的后續(xù)反應。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法來更換緩沖體系，以除去EDTA，但這樣就會造成DNA的損失。第二種方法是熱失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保溫60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保溫 22 30min方能達到目的；極端的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加熱的方法使之失活。熱失活方法的特點是簡單并且未向體系中引入任何物質(zhì)，特別適用于連續(xù)進行幾個酶切反應；熱失活法的另一個特點是不用更換體系，所以不會造成DNA的損失。第三種方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片段。這種方法的特點是處理條件劇烈，能使酶徹底失活（不像第一種方法中酶蛋白并未變性而只是沒有激活因子而已）。

實驗五

大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化

一、實驗原理

體外連接的重組DNA分子導入合適的宿主細胞中才能大量的進行復制、增殖和表達。研究發(fā)現(xiàn)，用含Ca2+ 的溶液處理大腸桿菌細胞會易于吸收外源DNA。大腸桿菌吸收外源DNA的過程被稱為轉(zhuǎn)化。細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài)。用理化方法可以誘導細胞進入感受態(tài)，如電轉(zhuǎn)化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前實驗室常用的制備感受態(tài)細胞的方法，其原理是使細菌處于0°C、CaCl2低滲溶液中，細胞膨脹成球形，細胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細胞膜表面，經(jīng)42°C短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物。宿主細胞一般是限制―修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，而質(zhì)粒載體攜帶有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。若將轉(zhuǎn)化的細胞涂布與于含氨卞青霉素的平板上，則只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細胞才能生存并生長增殖。從而可以篩選出哪個克隆含有質(zhì)粒。

本實驗以E.coli JM109菌株為受體細胞，受體菌使其處于感受態(tài)，然后與pUC18質(zhì)粒共保溫實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細胞進行適當稀釋，在含有氨卞青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，化的受體細胞則因無抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過擴增后，可將轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA分離提取出來，用于電泳分析、限制性內(nèi)切酶圖譜的制作以及

二、儀器及試劑

1.儀器：

恒溫搖床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺、分光光度計、高速冷凍離心機、臺式離心機。

2.材料

E.coli JM109受體菌、質(zhì)粒pUC18。

3.試劑：

LB培養(yǎng)液（1L）：

胰蛋白胨

10g

酵母粉

5g

NaCl

10g（高鹽）或

氨芐青霉素（Ampicillin）

100mg/ml

用CaCl2處理而未有轉(zhuǎn)DNA測序等實驗。5g（低鹽）在三角瓶中將胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高壓滅菌。待冷卻至55℃，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨芐青霉素。然后貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

LB平板培養(yǎng)基：

胰蛋白胨

10g

酵母粉

5g

NaCl

10g

瓊脂

13g

在三角瓶中依次將上述配方加入1L的重蒸水中并高壓滅菌。待培養(yǎng)基降溫至養(yǎng)基并輕輕旋轉(zhuǎn)以使溶解的瓊脂均勻分布于整個培養(yǎng)基溶液中，根據(jù)需要加入氨芐青霉素，然后可直接從三角瓶中倒出培養(yǎng)基鋪制平板。90mm直徑的培養(yǎng)皿約需培養(yǎng)基完全凝結(jié)后，倒置平皿并貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

其它試劑：

0.1M CaCl2溶液、滅菌蒸餾水

三、操作步驟

1.感受態(tài)細菌的制備：

（1）用接種環(huán)從E.coli JM109菌平板上挑取一單克隆菌落，培養(yǎng)基的試管中中，37℃ 220 rpm振蕩培養(yǎng)過夜（12～16h）。

（2）取0.5 ml過夜菌液接種到裝有50ml LB液體培養(yǎng)基三角瓶中中，振蕩培養(yǎng)2－3h，隔20－30min測量OD600值，至OD600值為轉(zhuǎn)至1.5ml 離心管中，每管1ml菌液，按需要決定管數(shù)。

（3）4℃，12000 rpm，離心2 min，以回收細菌。

（4）倒凈上清液，倒置離心管于濾紙上1min，使殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。冰預冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細胞，冰浴30 min。

（5）4℃，12000 rpm，2 min。

（6）倒凈上清液，倒置離心管1min，使殘留液流盡。每管加CaCl2重新懸浮細胞（重懸時操作要輕），即成感受態(tài)細胞懸浮液。

2.細菌轉(zhuǎn)化：

（1）取3只滅菌的Ep管，分別編號1、2、3、分別加入以下各組分：加入

5g，30接種于裝有0.3-0.4。無菌條件下將細菌100 ul冰預冷的 50℃，取出培50ml培養(yǎng)基。5ml LB液體37℃，220 rpm每管加1ml0.1 mol/L 10～20ng

或 ～ 質(zhì)粒DNA（體積小于10ul），同時做兩個對照組：

1號：受體菌對照組：

100ul感受態(tài)細胞懸浮液+2ul無菌ddH2O

2號：質(zhì)粒DNA對照組：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19

3號：正常轉(zhuǎn)化組：100ul感受態(tài)細胞懸浮液+2ul pUC19

（2）輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min，促進DNA分子在感受態(tài)細胞表面的吸附。

（3）轉(zhuǎn)入便于DNA分子的吸附進入，提高轉(zhuǎn)化率。

（4）迅速轉(zhuǎn)入冰上冷卻

（5）使受體菌恢復正常生長狀態(tài)，并且表達

（6）取200ul37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)可將之置于37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，100ul左右，用移液器吹打重懸，再全部涂于含

（7）觀察并記錄轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的數(shù)目，計算轉(zhuǎn)化率。

四、注意事項：

1.實驗中所用的器皿均要滅菌，以防止雜菌和外源

2.實驗過程中要注意無菌操作，溶液移取、分裝等均應在無菌超凈工作臺上進行。

3.必須設對照組，以檢驗實驗過程中是否有污染。

4.整個實驗過程均需置于冰上。

5.選用對數(shù)生長期細胞，42℃水浴2min，通過熱刺激增強CaCL2的作用，2min，修復細胞膜。600u無抗生素lLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37℃，Ampicillin抗性基因。Ampicillin的LB平板，將平板置于無菌臺直至液體被吸收，12－16h后觀察結(jié)果，其余保存于4℃。如果平板上沒有長出菌落，同時將剩下的500ul菌液離心，Ampicillin的LB平板上，置 DNA

OD600不應高于0.6。26

使細胞膜產(chǎn)生通道，220 rpm，振蕩倒掉大部分上清，37℃培養(yǎng)。60min。留 加菌液涂在含 的污染。

實驗六

動物組織細胞基因組

一、實驗原理

真核生物的一切有核細胞（包括培養(yǎng)細胞）都能用來制備基因組的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內(nèi)，質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持組織細胞在含仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的

蛋白酶K在勻漿后提取EDTA則抑制細胞中分子完整地分離出來。

二、儀器及試劑

1.恒溫水浴鍋、臺式離心機、紫外分光光度計（離心管（滅菌）

SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶DNA的反應體系中，Dnase

、吸頭（滅菌）DNA提取 因此，制備DNA分子的完整。提取KDNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。SDS可破壞細胞膜、活性；而蛋白酶K可將 27

DNA的原則是既要將DNADNA核膜，并使組織蛋白與蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，GeneQuant）DNA。真核生物DNA與蛋白 DNA分離，使DNA 的一般過程是將分散好的的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯從溶液中析出。的重要特性是能在的 儀器：、移液器、玻璃勻漿器、2.試劑：

（1）細胞裂解緩沖液：

Tris(pH8.0)

mmol/L

EDTA(pH 8.0)

500 mmol/L

NaCL

mmol/L

SDS

10%

胰RNA酶

20ug/ml

（2）蛋白酶K：

稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，?C20℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）TE緩沖液（pH 8.0）：高壓滅菌，室溫貯存。

（4）酚?氯仿?異戊醇（25:24:1）、（5）異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。

三、操作步驟

1.取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。

2.加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行）

3.加等量的酚?氯仿?異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

4.取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿?異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

5.取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min，離心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm，5min。

8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

四、常見問題

1.選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不易過長。

2.在加入細胞裂解緩沖液前，細胞必須均勻分散，以減少

3.提取的DNA不易溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。

4.電泳檢測時DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。

5.分光光度分析DNA應加入SDS至終濃度為

6.酚/氯仿/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸?。汉邼舛鹊牡牧炕驕p少所取組織的量。

A280/A2600.5%，并重復步驟 DNA團塊形成。1.8；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，2～8。DNA，可加大抽提前緩沖液29

的小于

實驗七

DNA的定量

一、實驗原理

核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在260 nm的紫外吸收峰，其吸收強度與核酸的濃度成正比，這個物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎。OD260相當于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml?？梢源藖碛嬎愫怂針悠返臐舛取?/p>

紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計核酸的純度，純的DNA制品的比值為1.8，RNA的比值為DNA高于1.8,則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。

對于很稀的核酸溶液，可用熒光光度法進行測定。DNA 本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（EB）插入DNA 的堿基對平面之間并與之結(jié)合后，DNA樣品能在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生桔紅色熒光。熒光強度與被結(jié)合的EB的量成正比，而被結(jié)合的EB的量又與核酸分子長度和含量成正比，使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，可比較出被測DNA溶液的濃度。靈敏度可達1～5ng。由于是基于目測，所以是估計水平。簡便，但準確性較低。

二、儀器及試劑

1.儀器：Amersham

GeneQantTM Pro 紫外可見分光光度儀，瓊脂糖凝膠電泳設備。

2.試劑及配制：

5×上樣緩沖液：

配制10 ml

2.0, 波長處有特異若 該方法經(jīng)濟

0.5 mol/L EDTA(pH8.0)

ml

10% SDS

ul

50% 甘油

2.5 ml

0.2% 溴酚藍

mg

0.2% 二甲苯青FF

mg

加去離子水至10 ml

其它試劑：0.1×TE、DNA標準液，EB儲存液（10 mg/ml），三、實驗步驟

1.紫外分光光度法

（1）用0.1×TE對待測DNA樣品按1:20或合適的倍數(shù)稀釋。

（2）開機，儀器會自動對光路及分析軟件進行檢測，待顯示屏上出現(xiàn)“instrument Ready”時，進入核酸測定窗口

（3）調(diào)零。先用0.1×TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。點擊“set ref”鍵，儀器自動校正零點。將樣品槽內(nèi)的樣品杯取出，換上待測樣品。

（4）吸70 ul已稀釋的DNA樣品轉(zhuǎn)入石英樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。如果樣品很少，可以用5～7ul的石英樣品杯。點擊“enter” 鍵，儀器即進入分析狀態(tài)。窗口同時顯示260和280nm處的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA樣品的濃度等。

（5）打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用高純水清潔石英樣品杯，風干后，再加入下一個待測樣品。

（6）DNA純度：以OD260/ OD280比值來反映。當OD60 /OD80比值 <1.8時，說明樣品存在蛋白質(zhì)或酚等雜質(zhì)，可采用平衡酚/氯仿―異戊醇再抽提除去蛋白質(zhì)或用乙醚抽提去除殘留酚，再用無水乙醇沉淀，TE懸浮后再測定。當OD60/OD280比值>2.0，說明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去處RNA。

2.EB熒光分析法

（1）瓊脂糖凝膠的制備。

（2）樣品的準備。把待測DNA樣品進行1:2連續(xù)稀釋，并準備一份DNA標準液作對照。

（3）上樣。稀釋樣品與上樣緩沖液按1:5混合均勻后上樣。

（4）電泳。用100V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍指示劑遷移到凝膠的3/4處停止電泳。

（5）取出凝膠，入EB熒光染液中作用20min，取出后清水漂洗干凈，然后紫外檢測。肉眼可見到的最高稀釋度約含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸樣品中的嚴重污染干擾核酸紫外線吸收物質(zhì)的情況。

四、常見問題

1． 紫外分光光度法不能區(qū)分三種構(gòu)型，也不能區(qū)分染色體染色體DNA、以及偏高。

2．OD320值是背景，若溶液鹽濃度越高，3．的光面以避免干擾測定。

DNADNA和DNA解鏈的增色效應等因素的影響，因此測得的數(shù)據(jù)往往比實際濃度 RNA等。由于測定吸收光度OD320也越高。要小心不要摔破，32

DNA分子的超螺旋、開環(huán)、線狀A260時，難以排除 持杯時也不要接觸透明RNA、分子的構(gòu)型，如質(zhì)粒測樣品時使用的石英樣品杯比較貴，實驗八

PCR基因擴增

一、實驗原理

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴增系統(tǒng)，其原理類似DNA分子的天然復制過程，是將在待擴增的DNA片段和與其兩側(cè)互補的兩個寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，生物學中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。

PCR的工作程序?qū)嶋H上是一個在模板種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應。擴增的特異性取決于引物與模板DNA的結(jié)合。整個擴增過程分三步：①變性，加熱使模板裂而形成兩條單鏈；②退火，突然降低溫度后模板存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度、物與模板之間；③延伸，在DNA聚合酶及鎂離子等的存在條件下，從引物的結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新的循環(huán)，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的40個循環(huán)后，DNA 可擴增106～109倍。

二、儀器及試劑

1.儀器：PCR儀、臺式離心機、移液器及吸頭、2.試劑：

10X PCR 緩沖液配制（部分隨Taq

250～500 mmol/L

100～500 mmol/L

15～20 mmol/L

0.5%

1mg/L

其它試劑：模板DNA、dNTP 混合液、凝膠、等

DNA擴增 DNA、一對已知序列的寡核苷酸引物和四DNA引物按堿基配對原則互補結(jié)合，也結(jié)構(gòu)簡單等特點，DNA鏈。完成以上三步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個DNA鏈又成為下一輪循環(huán)的模板?，F(xiàn)用圖示說明PCRPCR薄壁管、電泳儀等： KCl Tris-Cl（pH8.4）

MgCl2

Tween-20

BSA Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、瓊脂糖33

2n 倍。該技術(shù)已成為分子DNA主要的結(jié)合發(fā)生在引: 3 ′端開始，經(jīng)過25～ 雙鏈間的氫鍵斷 原理酶提供）

三、操作步驟

1.PCR 體系（40ul）：

4ul

10XPCR 緩沖液

4ul

25mM MgCl2（根據(jù)不同公司PCR 緩沖液的不同而定）

Xul

模板DNA ≥50ng

1ul

上游引物（50-100ng）

1ul

下游引物（50-100ng）

1ul

dNTP Mixture（終濃度

0.4 ul

Taq聚合酶

加ddH2O至40ul

視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2.將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，使反應成分集于管底。

3.PCR反應熱循環(huán)程序設置：

（1）95℃

300s

變性

（2）94℃

45s

變性

（3）55℃

45s

退火（根據(jù)不同引物可能有不同退火溫度）

（4）72℃

45s

延伸（每分鐘可延伸

重復步驟2-4共 30 循環(huán)

（5）72℃

600s

延伸

反應結(jié)束后短暫離心，吸取少量（10ul）進行分析，其余置

4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

20－200uM）1kp）6000 rpm 15 sec

離心

四、注意事項：

1.PCR 體系所加成分的實際用量應根據(jù)實驗者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進行核算。

2.加樣時要認真,吸頭垂直進入試劑管，每加完一樣要換一個吸頭，同時在已加的樣品前做個記號以防止錯加或漏加，避免污染。

3.Taq聚合酶（置于冰盒上）應最后加入，盡量減少室溫接觸機會。加酶時吸頭深入不可過深，酶量不能過多。

五、影響PCR的主要因素

1.模板DNA

單鏈、雙鏈DNA白水解酶等的污染。模板用量依具體實驗而定，PCR反應時模板變性要充分。

2.PCR引物

PCR引物設計是否成功是能否獲得高質(zhì)量應用時，需注意以下重要環(huán)節(jié)：

（1）PCR引物的長度約為以使它們在相近的溫度下與其互補序列結(jié)合。隨機的，應避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基，否則會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。引物免選用T ,尤其應避免連續(xù)出現(xiàn)

（2）一般來說，PCR引物長度選擇24bp左右為宜。

（3）要避免引物分子自身序列互補，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。兩個互之間的3，末端序列不能有明顯的互補性，以免形成引物二聚體。

（4）引物的熔點溫度（引物的GC/AT應與要擴增的模板

（5）引物的3，末端必須與模板嚴格互補，而

（6）目前在引物選擇中已廣泛應用計算機軟件，從基因序列，并對設計的引物在引物二聚體形成、自身互補性及特異性等方面進行分析評價。PCR

18～30個核苷酸，并且成對引物間的2個以上T500bp時，引物長度選擇 Tm值）要適當。DNA相當或略高些。一般熔點溫度以大于DNA樣品盡量純凈，不能有核酸酶、蛋一般為100ul反應液有105-106個目標分子。PCR產(chǎn)物最關(guān)鍵的因素之一。在設計和G＋C含量應相似。G+C含量應為45%～55%之間。堿基分布是尤其是不應在其3，端出現(xiàn)3個連續(xù)G或C，3，端堿基最好選用A、G、C,盡可能地避16-18bp；PCR產(chǎn)物≥5kb時，PCR引物相 Tm值與引物的堿基組成和長度有關(guān)；PCR55℃為宜。5，末端的要求可靈活些。EMBL或Genebank中查找有關(guān)

均可作為的模板。產(chǎn)物≤

（7）用于亞克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性內(nèi)切酶位點。為了保證內(nèi)切酶有效酶切擴增產(chǎn)物，一般在酶切位點的5，端再加上幾個額外的堿基。

（8）引物的濃度，在終濃度為0.2～1.0 umol/L的范圍內(nèi)產(chǎn)量基本相同，低于0.2 umol/L時會影響產(chǎn)量。但過高時一乃不經(jīng)濟，二則會出現(xiàn)非特異擴增及增加引物二聚體的產(chǎn)生。

3.熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）

一般用量為2.5 U/100uL 反應體積。酶量過多易導致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。適溫度為75℃，在低溫下仍保留相當高的活性，易引起不完全配對的引物伸及引物二聚體的擴增延伸，所以應注意防止非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)。

4.dNTPs

PCR常用的dNTP濃度在50-200umol/L。四種

低則反應速度下降，過高則特異性下降，可根據(jù)具體實驗來確定最適的

5.PCR緩沖液

因PCR反應中的dNTP能與Mg2+結(jié)合，影響反應液中游離應按不同條件，確定合適的Mg2+濃度。一般在標準的Mg2+濃度約為1.5mmol/L。Mg2+離子濃度可顯著影響出現(xiàn)非特異擴增，過低則酶活性顯著下降。應用無核酸酶的及5mmol的二硫蘇糖醇（DTT）對酶有一定的保護作用。

6.PCR循環(huán)的溫度

預變性：起始變性的時間應該長些，以使變性充分。一般為不完全時，DNA雙鏈會很快復性，影響PCR反應，但若變性溫度太高（不宜超過會影響Taq酶的活性。

變性：一般為94℃ 30s或95℃ 20s。

引物退火：應根據(jù)具體反應中引物與模板的堿基配對情況及實驗的目的確定。一般為50-72℃。退火溫度增高會增強對不正確退火引物的識別，還能降低引物酸的錯誤延伸。

延伸：一般為72℃ 60-90s。最后一個循環(huán)后應在物合成的完整性。

7．平臺效應和PCR循環(huán)的次數(shù)

dNTPsPCR反應中（PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性。BSA 72℃保留該類酶的最-模板的非特異延

dNTP濃度。Mg2+的濃度，所以dNTP濃度200umol/L），濃度高則Tween-20(0.05%～0.1%)94℃ 3-5min。變性95℃），3，端不正確核苷5min，以保證PCR產(chǎn)應等當量。濃度、在PCR基因擴增的后期，由于產(chǎn)物的堆積，將使原來產(chǎn)物以指數(shù)增加的速度變?yōu)槠教骨€，即所謂平臺效應。它的出現(xiàn)是由于PCR原料的不斷消耗、酶的穩(wěn)定性的降低、終產(chǎn)物的阻滯效應及非特異性產(chǎn)物等多種因素造成的，所以選擇合理的循環(huán)次數(shù)，既能得到足夠量的PCR產(chǎn)物，又不要無意義地增加循環(huán)次數(shù)。

8.操作環(huán)境

避免環(huán)境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目標DNA的污染等。

實驗九 瓊脂糖凝電泳分離與純化目的一、實驗原理

不同大小的片段分離位于不同的位置，的片段。有許多型號的低熔點瓊脂糖可在雙鏈DNA的解鏈溫度高于收DNA片段。該法的優(yōu)點是可直接在熔化的凝膠中進行各種酶反應，如合成同位素探針、進行限制酶切割和連接反應等。

二、儀器及試劑：

1.儀器

電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器、離心管、吸頭等。

2.試劑：

低熔點瓊脂糖、待純化的

三、操作步驟：

1.配制1％的瓊脂糖凝膠，在適當?shù)奈恢们幸粭l與加樣槽平行的槽，換低熔點瓊脂糖凝膠。

2.加樣，100V

DNA DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在電泳過程中切下目的片段并采用低熔點瓊脂糖回收法即可獲得目65℃時熔化成液體，在65℃，所以可以熔化凝膠而 DNA、凝膠回收試劑盒、去離子水或38

30℃時凝固成凝膠。由于DNA并不變性，在凝膠成液態(tài)時回TE（pH7.6）

分離和純化。

電泳，觀察所需片段是否移至低熔點膠內(nèi)。3.在紫外燈下切含有DNA的低熔點膠，置1.5 ml離心管中，于70℃熱水中熔化。

4.按凝膠回收試劑盒說明書操作。

12.取適量純化好的目的DNA在 GeneQuant 中檢測，確定純度和濃度，其余樣品于-20℃保存。

四、注意事項：

1.配凝膠的三角瓶、電泳槽和配膠板要先沖洗干凈

實驗十

DNA重組

一、實驗原理

外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這種重新組合的DNA在體外的連接重組是基因工程操作的核心技術(shù)之一，其本質(zhì)是一個酶促反應過程。即在一定的條件下，DNA連接酶催化兩個雙鏈DNA用，形成磷酸二酯鍵的過程。常用的DNA連接酶有兩種：菌DNA連接酶。其中T4噬菌體DNA連接酶對底物的要求低，能更有效地連接末端，應用更廣泛。

T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應分連接酶通過ATP的磷酸與連接酶的賴氨酸的氨基形成酶―隨后從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的51端的磷酸基團上，形成磷酸―磷酸鍵。③鏈31端的羥基被活化，取代ATP后與DNA51端的磷酸根形成磷酸二酯鍵，完成DNA之間的連接。T4噬菌體DNA連接酶需要鎂離子和溫度和pH條件下進行連接反應。

二、儀器及試劑：

1.儀器：

臺式離心機、移液器、吸頭、恒溫水浴鍋等。

2.試劑：

T4 DNA連接酶、10×T4 DNA連接酶緩沖液、載體

三、操作步驟

1.外源DNA片段和載體DNA的連接

DNA51端磷酸和31端羥基之間相互作T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿3步：①首先，ATP與T4ATP復合物。②被激活的并釋放出ATP作為輔助因子，DNA、外源DNA。DNA的平DNAAMPDNAAMP，在一定的 叫做重組子。片段的噬菌體

取1只無菌Ep管、用微量進樣器按下列順序加入各成分。

10×T4 DNA Ligase Buffer

2.5 ul

酶切后的DNA片段

*1

約0.3 pmol

酶切后的載體DNA *2

約0.03pmol

T4 DNA Ligase

ddH2O

*1 DNA片段的摩爾數(shù)應控制在載體

*2 相同末端的載體與DNA自身環(huán)化。

2.蓋好蓋子，用手指輕彈Ep

3.將反應管放入16℃過夜反應（4.取出約25ng的DNA連接液進行瓊脂糖凝膠電泳，片段和酶切DNA片段作電泳。

5.用0.1×TE將連接混合物稀釋至

四、注意事項

1.連接產(chǎn)物經(jīng)鑒定后應迅速做轉(zhuǎn)化實驗。

2.根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)酶的用量。平端連接或接頭連接都比黏端連接慢得多，而且酶的用量也增大。

3.單價陽離子或低濃度的聚乙二醇可提高平端連接的效率。

4.防止載體DNA自身環(huán)化，常用堿性磷酸酶處理線性載體，去掉載體的DNA片段的自身環(huán)化。

5.正確調(diào)整載體DNA和外源

五、相關(guān)問題

1.連接反應的影響因素

1ul

加至 25ul DNA摩爾數(shù)的3－12～16h）。鑒定連接結(jié)果，50ul，使用10～20ul DNA之間的比例有助于獲得高產(chǎn)量的重組產(chǎn)物。40

10倍。2s 以集中溶液。以未經(jīng)連接的質(zhì)粒 51?CDNA

片段進行連接時，應首先將載體進行去磷酸化處理，以防止其管數(shù)次，并于臺式離心機離心轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。磷酸以抑制

除了載體、供體的濃度及其比例等因素外，影響連接反應的因素還有很多，如緩沖液組分、連接溫度與時間、酶濃度、DNA濃度及片段末端的堿基序列等。

（1）連接緩沖液的影響

不同的公司提供的連接緩沖液可能有所不同，但大體上都含有以下組分：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的范圍在7.4-7.8，較多用7.8，目的是提供合適酸堿度的連接體系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L，作用是維持還原性環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。與限制酶緩沖液不同的是連接酶緩沖液還含有0.5-4mmol/L的ATP，現(xiàn)多用1mmol/L，是酶反應所必需的。

（2）pH的影響

一般將緩沖液的pH調(diào)節(jié)到7.4-7.8，較多用7.8。有實驗表明，若把pH為7.5-8.0時的酶活力定為100%，那么體系偏堿（pH為8.3）時僅為全部活力的65%；當體系偏酸（PH為6.9）時僅為全部活力的40%。

（3）ATP濃度的影響

連接緩沖液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，較多用1mmol/L。研究發(fā)現(xiàn)，ATP的最適濃度為0.5-1mmol/L，過濃會抑制反應。例如，5mmol/L的ATP會完全抑制平末端連接，黏端的連接也有10%被抑制；還有報道，當ATP的濃度為0.1mmol/L時，去磷酸載體的自環(huán)比例最大。由于ATP極易分解，所以當連接反應失敗時，除了DNA與酶的問題外，還應考慮ATP的因素。含有ATP的緩沖液應于-20℃保存，溶化取用后立即放回。連接緩沖液體積較大時最好分小管貯存，防止反復凍融引起ATP分解。與限制酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長期保存），臨用時加入新配制的ATP母液。

（4）連接溫度與時間的影響

因為黏性末端的DNA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會使氫鍵不穩(wěn)定，但連接酶的最適溫度又恰為37℃。為了解決這一矛盾，在經(jīng)過綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16℃，時間為4-16h。現(xiàn)經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，對于一般的黏性末端來說，20℃ 30min就足以取得相當好的連接效果，當然如果時間充裕的話，20℃ 60min能使連接反應進行得更完全一些。對于平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。

（5）酶濃度的影響

根據(jù)New England Biolabs公司對T4 DNA連接酶的定義，1U的酶可在16℃ 30min內(nèi)連接20ul體系中Hind Ⅲ酶切片段（黏性末端為0.12umol/L 5,末端，此時DNA質(zhì)量濃度約為300ng/ul）的50%。日常使用的DNA濃度比酶單位定義狀態(tài)低10-20倍，連接平末端時酶用量要比連接黏端大10-100倍，廠商為了滿足這一要求，又往往提供高濃度的酶（幾百個 41 單位/ul），所以進行黏末端連接時需先行稀釋。除了立即用于反應的部分可用酶反應緩沖液稀釋外，其余都應使用廠商提供的稀釋液。稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似，稀釋液中的酶能在長時間保持活力，也便于隨時取用。

（6）DNA濃度的影響

盡管有的實驗手冊上推薦使用0.1-1nmol/L的DNA濃度，但考慮到用質(zhì)粒作為載體克隆時，最后要求得到環(huán)化的有效連接產(chǎn)物，所以DNA濃度不可過高，一般不會超過20nmol/L。相比較而言，以噬菌體、cosmid質(zhì)粒為載體的克隆過程最后要求線性化的連接產(chǎn)物，所以，DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。此外，在用大質(zhì)粒載體進行大片段克隆時，以及在雙酶切片段的連接反應中，DNA濃度還應降低，甚至是DNA的總濃度低至幾個nmol/L。另據(jù)研究，T4 DNA連接酶對DNA末端的表觀Km值為1.5nmol/L，所以，連接時DNA濃度不應低于1nmol/L。即應具有2nmol/L的末端濃度。

2.三種連接酶單位定義

（1）Weiss單位

連接酶單位最早是1968年由Weiss提出的Weiss單位，現(xiàn)也稱PPi單位。他的單位定義為：37℃ 20min內(nèi)將1nmol的32P從焦磷酸根上置換到ATP分子上所需的酶量?，F(xiàn)在大多數(shù)廠商仍使用這種單位。

（2）d（A-T）環(huán)化單位

由于Weiss單位定義中測試的是T4 DNA連接酶中除連接功能外的另一種磷交換功能，并且測試溫度高達30℃，與實際連接反應相比無論在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich與Lehman提出了真正度量連接功能的d(A-T)環(huán)化單位，又稱外切酶抗性檢測。d（A-T）環(huán)化單位的定義為：30℃ 30min 內(nèi)將100nmol/L的d（A-T）（約2kb長）轉(zhuǎn)化成抗外切酶的形式。

（3）黏性末端單位

與Weiss單位相比，d（A-T）環(huán)化單位更接近實際，但仍有一定的問題，例如，環(huán)化單位測試中用的是純AT片段，與實際連接中4種堿基隨機排列不符；再說，如果連接酶將片段連接成多聚體而末環(huán)化時，仍可能被外切酶組所切；除此之外，與實際上大多數(shù)連接反應使用的溫度16℃相比，30℃仍顯得偏高。為了衡量實際連接條件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最實用的黏性末端單位，它的單位定義為：16℃ 30min內(nèi)將5,末端濃度為0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片段的50%連接上。

實驗十一 動物組織細胞總RNA的提取

一、實驗原理

RNA是基因表達的中間產(chǎn)物，存在于細胞質(zhì)與核中。對中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA 是很多分子生物學實驗所必需的，如雜交、cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上取決于內(nèi)的大部分RNA是以核蛋白復合體的形式存在，所以在提取質(zhì)變性劑，迅速破壞細胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與RNA分離，釋放出機溶劑處理、離心，使RNA與其他細胞組分分離，得到純化的總抑制內(nèi)源和外源的RNase活性，保護RNA分子不被降解。中進行?？墒褂肦Nase抑制劑，如DEPC是RNase的強抑制劑，常用來抑制外源性。提取緩沖液中一般含SDS、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質(zhì)變性劑，也能抑制并有助于除去非核酸成分。

本實驗介紹異硫氰酸胍法和TRIzol法提取動物組織總

二、儀器和試劑

1.儀器：

超凈工作臺、高速冷凍離心機、電泳儀、紫外分光光度計、吸頭、Ep管、玻璃勻漿器、試管、玻璃器皿洗凈后置180℃烘烤8h；不耐高溫的器皿（如塑料制品）應用2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高壓20min，再70～80

2.試劑：

(1)細胞裂解液：

異硫氰酸胍

4mol/L

檸檬酸鈉（pH7.0）

25mmol/L

十二烷基肌氨酸鈉

0.5%

RNA進行操作在分子生物學NorthernRNA的質(zhì)量。由于細胞RNA時要利用高濃度的蛋白RNA。再通過酚、氯仿等有RNA。在提取的過程中要RNase的環(huán)境RNase活RNase活性。RNA并通過電泳 進行鑒定。振蕩器、移液器、0.1% DEPC浸泡 因此提取必須在無凝膠成像系統(tǒng)、℃烘烤干燥方可使用。

β-巰基乙醇

0.1mol/L

稱取檸檬酸鈉0.64g，十二烷基肌氨酸鈉0.415g，吸取β-巰基乙醇0.7ml，用無Rnase的蒸餾水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，異硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)10×凝膠緩沖液：

嗎啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0）

200mmol/L

NaAc

EDTA(pH 8.0)

過濾除菌后避光保存。

（3）5×變性上樣緩沖液：

水飽和的溴酚藍

500mmol/LEDTA(pH 8.0)

甲醛（37%）

甘油

甲酰胺

10×凝膠緩沖液

加無RNase水至10ml，4℃可保存

（4）TRIzol RNA抽提試劑

（5）2mol醋酸鈉

（6）0.1% DEPC

(7)平衡酚：氯仿：異戊醇（（8）平衡酚、氯仿

（9）無水乙醇、70%乙醇、異丙醇

100mmol/L

10mmol/L

16μl

80μl

720μl

2ml

3084μl

4ml 3個月。25：24：1）

(10)無RNase水

三、操作步驟

（一）異硫氰酸胍法（PLT）

1.取新鮮動物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預冷的細胞裂解液1ml,在冰浴中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細胞懸浮液吸入另一試管中。

2.加入2mol醋酸鈉（pH4.0）120μl，充分混勻。

3.加入1.2ml酚：氯仿：異戊醇，充分混勻搖振10s，冰浴15min。

4.將混合物轉(zhuǎn)移至1.5ml Ep管中，4℃，離心10 000r/min,20min.5.移取上層水相至另一Ep管中，加入等體積的異丙醇，靜置?C20℃，30min沉淀RNA.6.4℃，離心12 000r/min，15min.7.棄上清液，加入70%乙醇400μl,洗滌RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被懸浮，則4℃離心10 000r/min，10min。

8.棄上清液，自然干燥，但應避免沉淀完全干燥，否則RNA難以溶解。

9.加入100μl無RNase水重懸RNA，或加1ml無水乙醇和1/10體積3mol醋酸鈉（pH4.0），?C70℃保存。

（二）TRIzol試劑提取RNA

1.取新鮮動物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預冷的Trizol液 1ml 于玻璃勻漿器中，在冰浴中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細胞懸浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室溫下靜置5min。

2.加入200μl氯仿，劇烈振搖15s混勻后，室溫靜置3min。

3.4℃，10 000r/min離心15min，RNA分布于水相中。

4.將上層無色水相轉(zhuǎn)移到另一Ep管中，加入500μl 異丙醇，室溫靜置10min。

5.4℃，10 000r/min離心10min。

6.棄上清液，用1ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀物，4℃，7500r/min離心5min。

7.棄上清液，室溫干燥15min.45

8.向干燥過的沉淀物中加入200μl DEPC處理水（無核水）溶解沉淀物，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（三）RNA檢測

1.在紫外分光光度計上檢測RNA濃度及純度。

方法同實驗四，用DEPC處理水校正零點；用DEPC處理水稀釋RNA樣品；讀取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。

2.瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳檢測

（1）制備凝膠（1.2%）。稱1.2g瓊脂糖，加72ml DEPC處理水，加熱熔化。冷卻至60℃，在通風櫥內(nèi)加入10×凝膠緩沖液10ml，甲醛（37%）18ml，混勻后，倒膠。

（2）制備樣品。在離心管中，將RNA樣品與5×變性上樣緩沖液以4：1溫育5～10min，迅速在冰上冷卻5min，離心數(shù)秒。

（3）上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品卷入上樣孔。以5V/cm的電壓電泳2h.。

（4）待溴酚藍遷移至凝膠長度的2/3～4/5處結(jié)束電泳。將凝膠置于溴化乙啶溶液μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配制）中染色約30min。

（5）在凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析。

四、注意事項

1.RNA是極易降解的核酸分子。因此提取總RNA必須在無RNase 環(huán)境中，戴口罩、手套、使用無RNase污染的試劑、材料、容器。

2.所有溶液應加DEPC至0.05%～0.1%，室溫處理過夜，然后高壓處理或加熱至小時或60℃過夜，以除去石油殘留的DEPC。

3.所用的化學試劑應為新包裝，稱量時使用干烤處理的稱量勺，所有操作均應在冰浴中進行，低溫條件可減低RNA酶活性。

4.根據(jù)RNA樣品的紫外吸收OD值，可計算出RNAd 濃度。

單鏈RNA [ssRNA]=40×（OD260-OD310）×稀釋倍數(shù)

純RNA OD260 / OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,說明有蛋白質(zhì)等污染，/氯仿在抽提。若比值低于2.0,表明有鹽、胍、糖可用LiCL選擇沉淀RNA以除去雜質(zhì)。

65℃1.5～（0.570℃ 1 應用酚 混勻。

5.RNA樣品電泳后，可見28S、18S及5S小分子RNA條帶，則說明完整性好。若有降解可能是操作不當或污染了RNase.。28S和18S RNA比值約為2：1,表明RNA無降解。如比值逆轉(zhuǎn)，則表明RNA降解。電泳中如果在28S 后方還有條帶，表明有DNA污染，應用DNase處理后再進行純化。

主要參考書：

1..金冬雁等譯.分子克隆實驗指南.第二版.北京：科學出版社，1995

2.子穎等譯.精編分子生物學實驗指南

3.周俊宜編.分子生物學基本技能和策略

4.姜泊等編.分子生物學常用實驗方法

5.劉進元等編.分子生物學實驗指導

.科學出版，.科學出版社.北京：人民軍醫(yī)出版社，.北京：清華大學出版社，47

1996.2002.

第三篇：現(xiàn)代分子生物學總結(jié)

醫(yī)學細胞與分子生物學習題庫

一、名詞解釋

1．基因組

2．基因文庫

3．衛(wèi)星DNA

4．SD序列

5．分子克隆

6．載體

7．反式作用因子

8．粘性末端

9．限制性內(nèi)切酶

10．cDNA文庫

11．轉(zhuǎn)化率

12．質(zhì)?？截悢?shù)

13．體外重組

14．感受態(tài)細胞

15．探針

16．核酸雜交

17．陽性克隆

18．固相雜交

19．解鏈溫度

20．C值悖理

21．基因家簇

22．反義RNA

23．RNA干擾

24．魔斑

25．順式作用元件

二．填空題

1.真核生物基因組DNA序列可分為（）、（）和（）。

2.真核生物基因組高度重復序列包括（）、（）、（）和（）四種。

5.原核生物轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的方式有（）和（）兩種方式；前者又可分為（）和（）；后者可分為（）和（）。

6.真核生物基因表達調(diào)控包括（）、（）、（）、（）和（）五個層次。

7.真核生物基因組DNA水平的調(diào)控包括（）、（）、（）、（）和（）五種方式。

8.反式作用因子可劃分為（）、（）和（）三類。

12.影響雜交的因素有（）、（）、（）、（）和（）。

15.逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，具有（）、（）、（）三種功能，但無（）作用。

16.DN的損傷突變類型有（）、（）、（）、（）和（）。

17.引起DNA損傷突變的因素是（）、（）、（）、（）和（）。

18.DNA的損傷修復方式有（）、（）、（）和（）。

20.病毒基因組可由（）或（）組成；細菌基因組由一條（）組成；真核生物基因組由（）和（）形成（）。

21.原核生物基因表達調(diào)控的方式有（）和（）；其中（）是主要的方式。

22.、操縱子由（）、（）和（）組成；受（）產(chǎn)物的調(diào)控。

23．順式作用元件按功能可劃分為（）、（）、（）和（）。

24．分子克隆技術(shù)的操作包括（）、（）、（）和（）等四個基本過程。

25．限制性內(nèi)切酶分為（）、（）、（）三種，其中只

有（）在基因工程操作中被應用。

26.限制性內(nèi)切酶識別（）序列； DNA分子在該酶切割下可產(chǎn)生（）、（）或（）末端。

27．分子克隆中常用的工具酶有（）、（）、（）和（）。

28．分子克隆中常用的載體有（）、（）、（）和（）。

29．目的基因制備的常用方法有（）、（）、（）。

30．體外重組常用方法有（）、（）、（）和（）。

31．重組體導入原核生物細胞中的常用方法有（）和（）；重組體導入真核生物細胞中的常用方法有（）、（）和（）。

32．重組體的篩選方法有（）、（）、（）、（）。

33．cDNA文庫的構(gòu)建步驟是（）、（）（）、（）。

34．常用的核酸探針包括（）、（）和（）。

35．放射性同位素標記常用的標記方法有（）、（）、（）。

36．分子克隆中常用的非放射性同位素標記物有（）、（）、（）等；常用的標記方法有（）、（）。

37．核酸雜交技術(shù)可分為（）和（）兩種類型；后者又可分為（）和（）。

39．PCR技術(shù)的基本過程是（）、（）、（）。

40．影響PCR的因素有（）、（）、（）、（）、（）。

41．PCR反應的特點是（）、（）、（）、（）。

45．限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點是（）、（）、（）、（）。

50．DNA切除修復需要的酶有（）、（）和（）。

三、判斷題

1、生物越高度，基因組越龐大，基因數(shù)目就越多。（）

2、真核生物結(jié)構(gòu)基因都是單拷貝，rRNA基因為多拷貝。（）

3、同基因是一類結(jié)構(gòu)上完全相同，表達產(chǎn)物功能也相同的一組基因。（）

4、真核細胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。（）

5、原核細胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順反子。（）

6、真核生物基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼的區(qū)域。（）

7、衛(wèi)星DNA實際上是出現(xiàn)在非編碼區(qū)的串聯(lián)重復序列。

8、串聯(lián)重復序列是形成衛(wèi)星DNA 的基礎。

9、所有真核生物基因組中都有α衛(wèi)星DNA。

10、高度重復序列在真核生物細胞基因組中重復出現(xiàn)可達106次以上。

11、中度重復序列的長度和拷貝數(shù)很不均一。

12、短分散片段重復順序的平均長度約為3500-5000bp。

13、長分散片段重復順序的平均長度約為300bp。

14、中度重復序列大多不編碼蛋白質(zhì)。

15、高度重復序列中有一些可編碼蛋白質(zhì)。

16、中度重復順序一般具有種特異性。

17、每種組蛋白的基因在同一種生物中拷貝數(shù)是相同的。

18、不同生物中組蛋白基因在基因組中的排列不一樣。

19、端粒是所有生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)。

20、以RNA為模版合成出的DNA鏈叫負股鏈。

21、顛換是指原為嘧啶突變后變?yōu)猷堰省?/p>

22、置換是指原為嘧啶突變后變?yōu)猷堰省?/p>

23、重組修復也叫復制后的修復。

24、原核細胞和真核細胞中許多mRNA都是多順反子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

25、限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段都具有粘性末端。

26、原核生物中mRNA一般不需要轉(zhuǎn)錄后加工。

27、增強子并沒有啟動子活性，卻具有增強啟動子活性，促進轉(zhuǎn)錄起始的效能。

28、在雙向復制中一條鏈按5′→3′的方向合成，另一條鏈按3′→5′的方向合成。

29、原核細胞和真核細胞復制在多個位點同時起始進行。

30、真核細胞的基因是不連續(xù)的，轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA都必須經(jīng)過加工。（31、生物DNA分子的大小等于基因的總和。（）

32、所有多肽鏈經(jīng)核糖體翻譯出來即有正常生理功能。

33、核糖體是蛋白質(zhì)和rRNA構(gòu)成的功能復合體。

34、機體的各種細胞中含有相同的遺傳信息，所以有相同的表達，35、在負控誘導系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應物結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。

36、在負控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應物結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。

37、CAP結(jié)合在啟動子上時，能促進RNA聚合酶與啟動子結(jié)合，促進轉(zhuǎn)錄。）

38、CAP首先與cAMP形成復合物才能與啟動子結(jié)合。

39、RBS是指mRNA起始密碼AUG前的一段非翻譯區(qū)。

40、反義RNA由反義基因轉(zhuǎn)錄而來。

41、轉(zhuǎn)錄后基因沉默被稱為RNAi。

42、細胞中蛋白質(zhì)合成旺盛時，mRNA鏈上核糖體數(shù)量就多，poly（A）也較長。

43、限制性核酸內(nèi)切酶是原核生物所特有的酶。

44、只有Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶在分子生物學中被應用。

45、COS區(qū)是指λ噬菌體粘性末端構(gòu)成的區(qū)域。

53、基因擴增是指某些基因的拷貝數(shù)大量增加的現(xiàn)象。

54、基因重排是DNA水平調(diào)控的重要方式之一

55、所有核酸的合成都是以堿基配對為基礎的。

56、甲基化程度與基因的表達一般呈反比關(guān)系。

57、基因的甲基化程度愈高，其表達則降低。

58、去除組蛋白基因轉(zhuǎn)錄活性降低。

59、常染色質(zhì):結(jié)構(gòu)松散，基因不表達。

60、異染色質(zhì):結(jié)構(gòu)緊密，基因表達。

61、有基因表達活性的染色質(zhì)DNA對DNaseⅠ更敏感。

62、真核生物基因調(diào)控主要也是在轉(zhuǎn)錄水平上進行的。

四、選擇題：

1.原核生物基因組中的復制起始點有（）

A．1個B．2個C．多個D．1000個以上

2．真核生物基因組中的復制起始點有（）

A．1個B．2個C．多個D．1000個以上

3.真核生物基因之間的間隔區(qū)與基因組大?。ǎ?/p>

A．有關(guān)B．無關(guān)C．成正比E．成反比

４.衛(wèi)星DNA的長度一般為()

A．5-10bpB．300bpC．100bpD．500-1000bp

５.在大腸桿菌細胞中DNA復制的保真性主要是下列哪個酶的作用（A．DNA聚合酶ⅠB．DNA聚合酶Ⅱ

C．DNA聚合酶ⅢD．DNA連接酶

６.既有內(nèi)切酶活力，又有連接酶活力的是

A．拓撲異構(gòu)酶B．DNA聚合酶Ⅱ

C．解螺旋酶D．DNA連接酶）

7.轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息的轉(zhuǎn)遞方向是()

A．DNA→RNAB．RNA→DNAC．DNA→DNAD．RNA→RNA

8.hnRNA是()

A．存在于細胞核內(nèi)的tRNA前體B.存在于細胞核內(nèi)的mRNA前體

C.存在于細胞核內(nèi)的rRNA前體D.存在于細胞核內(nèi)的snRNA前體

9.以RNA為模板合成DNA的酶是（）

A．DNA聚合酶ⅢB．DNA聚合酶ⅠC．RNA聚合酶D．反轉(zhuǎn)錄酶

10.蛋白質(zhì)的生物合成中肽鏈延伸方向是（）

A．5→3B．從N端到C端C．3→5D．從C端到N端，，11.蛋白質(zhì)翻譯后的加工主要包括（）。

A．氨基酸側(cè)鏈修飾B．水解修飾

C．二硫鍵的形成D． 上述各種修飾都包括

12.操縱子調(diào)控系統(tǒng)屬于哪一種水平的調(diào)控（）

A．復制水平的調(diào)節(jié)B。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)

C．翻譯水平的調(diào)節(jié)D。轉(zhuǎn)錄后加工的調(diào)控

13.與乳糖操縱子操縱基因結(jié)合的物質(zhì)是（）

A．RNA聚合酶B．DNA聚合酶C．阻遏蛋白D．誘導物

14、參與線粒體DNA復制的酶是（）

A．polαB．polδC．polβD．polγ

15、參與領(lǐng)頭鏈DNA復制的酶是（）

A．polαB．polδC．polβD．polγ

16、端粒酶是一種()

A．逆轉(zhuǎn)錄酶B．RNA聚合酶C．DNA聚合酶D．DNA酶

17.含稀有堿基最多的RNA是（）

A．mRNAB、rRNAC．5S-rRNAD．tRNA

18.大腸桿菌DNA連接酶需要下列哪一種輔助因子？（）

A．FAD作為電子受體B．NADP+作為磷酸供體

C．NAD+形成活性腺苷酰酶D．NAD+作為電子受體

19.真核生物RNA聚合酶I催化轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是（）

A．mRNAB．45S-rRNAC．5S-rRNAD．tRNA

20.魔斑是指（）

A．ppGppB．cAMPC．cGMPD．7mGppp

21.CAP復合體與操縱子結(jié)合的部位是（）

A．啟動子B．操縱基因C．結(jié)構(gòu)基因D．調(diào)節(jié)基因

22.基因的甲基化修飾一般發(fā)生在（）

A．CpGB．ApGC．GpTD．TpG

23.有基因表達活性的染色質(zhì)DNA對下列那個酶敏感性增加？（）

A．DNaseⅠB．DNA polⅠC．DNA polⅡD.Rnase H

24.真核生物的RNA聚合酶識別的是（）

A．啟動子B．增強子C．TF-DNA復合體D．RF

25.在分子生物學中被應用的限制性核酸內(nèi)切酶是（）

A．Ⅰ型B．Ⅱ型C．Ⅲ型D．以上都沒用

26.限制性核酸內(nèi)切酶錯位切割產(chǎn)生（）

A．粘性末端B．平頭末端C．3’-磷酸D．5’-羥基

27.大腸桿菌DNA連接酶只能連接（）

A．粘性末端B．平頭末端C．3’-磷酸D．5’-羥基

28.pBR322是（）

A．復制型載體B．表達型載體C．穿梭載體D．噬菌體載體

29、pUC載體是（）

A．復制型載體B．表達型載體C．穿梭載體D．噬菌體載體

30.M13噬菌體是（）

A．單鏈DNA噬菌體B．雙鏈DNA噬菌體

C．RNA噬菌體D．都不是

31、B．表達型載體C．穿梭載體D．噬菌體載體

五．問答題

1．分子克隆中常用的工具酶有哪些？各有何用途？

2．何謂載體？分子克隆中常用的載體有哪些？理想的載體應具備哪些條件？

3．何謂PCR？試述PCR基本技術(shù)原理和影響因素。

4．常用的核酸探針有哪些類型？各有何優(yōu)缺點？

5．將目的DNA與載體DNA連接起來的方法有哪些？并用文或圖表示各種連接過程。

6．簡述原核生物與真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點。

9．體外重組常用的連接方法有哪些？各有何優(yōu)缺點？

13．何謂核酸雜交？常用的雜交方法有哪些？

28.何謂宿主細胞？分子克隆中常用的宿主細胞有哪些？宿主細胞應具備哪些條件？

31.簡述重組體導入哺乳動物細胞的方法

35、DNA損傷修復有哪些類型？試述各類型的修復方式。

第四篇：現(xiàn)代分子生物學總結(jié)

第一章、基因的結(jié)構(gòu)和功能實體及基因組

1、基因定義

基因（遺傳因子）是遺傳的物質(zhì)基礎，是DNA（脫氧核糖核酸）分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱，攜帶有遺傳信息的DNA序列，是具有遺傳效應的DNA分子片段，是控制性狀的基本遺傳單位，通過指導蛋白質(zhì)的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個體的性狀表現(xiàn)。

2、DNA修復

DNA修復（DNA repairing）是細胞對DNA受損傷后的一種反應，這種反應可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復原樣，重新能執(zhí)行它原來的功能；但有時并非能完全消除DNA的損傷，只是使細胞能夠耐受這DNA的損傷而能繼續(xù)生存。也許這未能完全修復而存留下來的損傷會在適合的條件下顯示出來（如細胞的癌變等），但如果細胞不具備這修復功能，就無法對付經(jīng)常在發(fā)生的DNA損傷事件，就不能生存。對不同的DNA損傷，細胞可以有不同的修復反應。

3、DNA損傷

DNA損傷是復制過程中發(fā)生的DNA核苷酸序列永久性改變，并導致遺傳特征改變的現(xiàn)象。情況分為：substitutation（替換）deletion（刪除）insertion（插入）exon skipping（外顯子跳躍）。

DNA損傷的改變類型：a、點突變：指DNA上單一堿基的變異。嘌呤替代嘌呤（A與G之間的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C與T之間的替代）稱為轉(zhuǎn)換（transition）；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換（transvertion）。b、缺失：指DNA鏈上一個或一段核苷酸的消失。c、插入：指一個或一段核苷酸插入到DNA鏈中。在為蛋白質(zhì)編碼的序列中如缺失及插入的核苷酸數(shù)不是3的整倍數(shù)，則發(fā)生讀框移動（reading frame shift），使其后所譯讀的氨基酸序列全部混亂，稱為移碼突變（frame-shift mutaion）。d、倒位或轉(zhuǎn)位：（transposition）指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。e、雙鏈斷裂：對單倍體細胞一個雙鏈斷裂就是致死性事件。

4、同源重組 同源重組，（Homologus Recombination)是指發(fā)生在姐妹染色單體（sister chromatin)之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。同源重組需要一系列的蛋白質(zhì)催化，如原核生物細胞內(nèi)的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物細胞內(nèi)的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重組反應通常根據(jù)交叉分子或holiday結(jié)構(gòu)（Holiday Juncture Structure)的形成和拆分分為三個階段，即前聯(lián)會體階段、聯(lián)會體形成和Holiday 結(jié)構(gòu)的拆分。a、基因敲除

基因敲除（geneknockout），是指對一個結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實驗，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應基因的功能。這與早期生理學研究中常用的切除部分-觀察整體-推測功能的三部曲思想相似?；蚯贸芍兄鼓骋换虻谋磉_外，還包括引入新基因及引入定點突變。既可以是用突變基因或其它基因敲除相應的正?；?，也可以用正?；蚯贸鄳耐蛔兓?。b、因轉(zhuǎn)移法

同源重組(homologousrecombination)是將外源基因定位導人受體細胞染色體上的方法，因為在該座位有與導人基因同源的序列，通過單一或雙交換，新基因片段可替換有缺陷的基因片段，達到修正缺陷基因的目的。位點特異性重組是發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點上的重組，重組的發(fā)生需一段同源序列即特異性位點(又稱附著點；attachmentsite，att)和位點特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。重組酶僅能催化特異性位點間的重組，因而重組具有特異性和高度保守性。

5、堿基錯配對修復

錯配修復（mismatch repair，MMR）：在含有錯配堿基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢復的修復方式；主要用來糾正DNA雙螺旋上錯配的堿基對，還能修復一些因復制打滑而產(chǎn)生的小于4nt的核苷酸插入或缺失。MMR的過程需要區(qū)分母鏈和子鏈，做到只切除子鏈上錯誤的核苷酸，而不會切除母鏈上本來就正常的核苷酸。修復的過程是：識別出正確的鏈，切除掉不正確的部分，然后通過DNA聚合酶III和DNA連接酶的作用，合成正確配對的雙鏈DNA。

6、基因組學

基因組學（英文genomics），研究生物基因組和如何利用基因的一門學問。用于概括涉及基因作圖、測序和整個基因組功能分析的遺傳學分支。該學科提供基因組信息以及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)利用，試圖解決生物，醫(yī)學，和工業(yè)領(lǐng)域的重大問題。基因組研究應該包括兩方面的內(nèi)容：以全基因組測序為目標的結(jié)構(gòu)基因組學（structural genomics）和以基因功能鑒定為目標的功能基因組學（functional genomics)，又被稱為后基因組（postgenome）研究，成為系統(tǒng)生物學的重要方法?；蚪M學的主要工具和方法包括： 生物信息學，遺傳分析，基因表達測量和基因功能鑒定。第二章、基因的結(jié)構(gòu)實體

1、核酸分子

核酸（Nucleic Acids）是一種主要位于細胞核內(nèi)的生物大分子，其充當著生物體遺傳信息的攜帶和傳遞。DNA分子含有生物物種的所有遺傳信息，為雙鏈分子，其中大多數(shù)是鏈狀結(jié)構(gòu)大分子，也有少部分呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分子量一般都很大。RNA主要是負責DNA遺傳信息的翻譯和表達，為單鏈分子，分子量要比DNA小得多。核酸存在于所有動植物細胞、微生物和病毒、噬菌體內(nèi)，是生命的最基本物質(zhì)之一，對生物的生長、遺傳、變異等現(xiàn)象起著重要的決定作用。核酸大分子可分為兩類：脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋白質(zhì)的復制和合成中起著儲存和傳遞遺傳信息的作用。核酸不僅是基本的遺傳物質(zhì)，而且在蛋白質(zhì)的生物合成上也占重要位置，因而在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現(xiàn)象中起決定性的作用。

2、DNA的結(jié)構(gòu)

DNA即脫氧核糖核酸（英文Deoxyribonucleic acid的縮寫）,又稱去氧核糖核苷酸，是染色體主要組成成分，同時也是組成基因的材料。DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)是相對穩(wěn)定的。這是因為在DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè),通過氫鍵形成的堿基對,使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固地并聯(lián)起來。另外,堿基對之間縱向的相互作用力也進一步加固了DNA分子的穩(wěn)定性。各個堿基對之間的這種縱向的相互作用力叫做堿基堆集力,它是芳香族堿基π電子間的相互作用引起的?，F(xiàn)在普遍認為堿基堆集力是穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)的最重要的因素。再有,雙螺旋外側(cè)負電荷的磷酸基團同帶正電荷的陽離子之間形成的離子鍵,可以減少雙鏈間的靜電斥力,因而對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)也有一定的穩(wěn)定作用。DNA分子由于堿基對的數(shù)量不同,堿基對的排列順序千變?nèi)f化,因而構(gòu)成了DNA分子的多樣性。例如,一個具有4 000個堿基對的DNA分子所攜帶的遺傳信息是4種,即10種。不同的DNA分子由于堿基對的排列順序存在著差異,因此,每一個DNA分子的堿基對都有其特定的排列順序,這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息,從而使DNA分子具有特異性。

3、DNA的拓撲學

首先以一260 bp雙鏈線形B-DNA為例，此DNA在松弛時，螺旋數(shù)為25（260/10.4），首尾連接成環(huán)形后，為一松弛環(huán)形DNA，并處于最穩(wěn)定狀態(tài)。若將此線形DNA先擰松2個連環(huán)再連成環(huán)形，則可以形成兩種環(huán)形DNA，一種稱為松弛解鏈環(huán)形DNA；另一種環(huán)形DNA稱為超螺旋DNA，其螺旋周數(shù)為25，有2個負超螺旋。由此引入拓撲學參數(shù)： 1.連環(huán)數(shù)（Linking number）：在雙螺旋DNA中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，以L 表示（或以α表示），其計數(shù)方法為處于松弛環(huán)形DNA時的螺旋周數(shù)，肯定為整數(shù)，右手螺旋為正、左手螺旋為負。2.纏繞數(shù)（Twisting number）：即DNA分子中的Watson-Crick螺旋周數(shù)，以T 表示(或以β表示)，其數(shù)值可直接在處于最穩(wěn)定狀態(tài)下的雙鏈環(huán)形（或超螺旋形式）DNA中的實際螺旋周數(shù)計數(shù)得到，不一定是整數(shù)，右手螺旋為正，左手螺旋為負。但必須注意T僅針對于形成雙螺旋區(qū)域而言，解鏈部分的bp數(shù)就不涉及T的計算。對于一定長度的DNA雙鏈，一旦出現(xiàn)解鏈T值就減少。如260bp B-DNA雙鏈自然狀態(tài)下T=25，解鏈20%時的T=20。3.超螺旋數(shù) 或 紐數(shù)（Writhing number）：其數(shù)值有公式L=T+W 計算得到，以W表示（或以τ表示），不一定為整數(shù)。左手超螺旋為正，右手超螺旋為負（此點解釋見后）。4.比連環(huán)差：為雙鏈DNA的超螺旋密度。用σ表示，由公式σ = Lβ /β 表示。

4、染色體和核小體

染色體（Chromosome），是細胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的物體，易被堿性染料染成深色，又叫染色質(zhì)。其本質(zhì)是脫氧核甘酸，是細胞核內(nèi)由核蛋白組成、能用堿性染料染色、有結(jié)構(gòu)的線狀體，是遺傳物質(zhì)基因的載體。在無性繁殖物種中，生物體內(nèi)所有細胞的染色體數(shù)目都一樣；而在有性繁殖大部分物種中，生物體的體細胞染色體成對分布，稱為二倍體。性細胞如精子、卵子等是單倍體，染色體數(shù)目只是體細胞的一半。哺乳動物雄性個體細胞的性染色體對為XY，雌性則為XX。鳥類和蠶的性染色體與哺乳動物不同：雄性個體的是ZZ，雌性個體為ZW。

染色體是細胞核中載有遺傳信息的物質(zhì)，在顯微鏡下呈圓柱狀或桿狀，主要由脫氧核糖核酸和蛋白質(zhì)組成，在細胞發(fā)生有絲分裂時期容易被堿性染料（例如龍膽紫和醋酸洋紅）著色，因此而得名。在無性繁殖物種中，生物體內(nèi)所有細胞的染色體數(shù)目都一樣；而在有性繁殖大部分物種中，生物體的體細胞染色體成對分布，稱為二倍體。性細胞如精子、卵子等是單倍體，染色體數(shù)目只是體細胞的一半。哺乳動物雄性個體細胞的性染色體對為XY，雌性則為XX。鳥類和蠶的性染色體與哺乳動物不同：雄性個體的是ZZ，雌性個體為ZW。

核小體（英語：Nucleosome，也譯作核體或核仁小體等）是組成真核生物染色質(zhì)（除精子染色質(zhì)外）的基本單位。核小體是由DNA與四對組織蛋白（共8個）的復合物，其中有H2A和H2B的二聚體兩組以及H3和H4的二聚體兩組。另外還有一種H1負責連結(jié)兩個核小體之間的DNA。核小體假說是在1974年，由Don Olins、Ada Olins與羅杰·科恩伯格等人首次提出的。核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，由DNA和組蛋白（histone）構(gòu)成，是染色質(zhì)（染色體）的基本結(jié)構(gòu)單位。由4種組蛋白H2A、H2B、H3和H4，每一種組蛋白各二個分子，形成一個組蛋白八聚體，約200bp的DNA分子盤繞在組蛋白八聚體構(gòu)成的核心結(jié)構(gòu)外面，形成了一個核小體。

5、染色質(zhì)的構(gòu)象狀態(tài)

(chromosome conformation capture，3C)通過一種定量手段(PCR產(chǎn)物的有和無、產(chǎn)量的高和低)對DNA之間是否存在相互作用這一定性問題進行研究。主要經(jīng)過甲醛交聯(lián)、限制性酶切、稀釋和連接、解交聯(lián)、DNA純化與PCR鑒定。通過一對分別與選定的2段DNA配對的引物進行PCR擴增，通過PCR產(chǎn)物的有無、產(chǎn)量的高低等，就可以對是否存在相互作用進行判斷。

6、常染色質(zhì)和異染色質(zhì)

常染色質(zhì)：常染色質(zhì)是指間期核內(nèi)染色質(zhì)纖維折疊壓縮程度低，處于伸展狀態(tài)，用堿性染料染色時著色淺的那些染色質(zhì)。在常染色質(zhì)中，DNA包裝比約為1/2000-1/1000，即DNA實際長度為染色質(zhì)纖維長度的1000-2000倍。構(gòu)成常染色質(zhì)的DNA主要是單一序列DNA和中度重復序列DNA（如組蛋白基因和tRNA基因）。常染色質(zhì)并非所有基因都具有轉(zhuǎn)錄活性，處于常染色質(zhì)狀態(tài)只是基因轉(zhuǎn)錄的必要條件，而不是充分條件。

異染色質(zhì)：在細胞周期中，間期、早期或中、晚期，某些染色體或染色體的某些部分的固縮常較其他的染色質(zhì)早些或晚些，其染色較深或較淺，具有這種固縮特性的染色體稱為異染色質(zhì)（heterochromatin）。具有強嗜堿性，染色深，染色質(zhì)絲包裝折疊緊密，與常染色質(zhì)相比，異染色質(zhì)是轉(zhuǎn)錄不活躍部分，多在晚S期復制。異染色質(zhì)分為結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)和功能異染色質(zhì)兩種類型。結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)是指各類細胞在整個細胞周期內(nèi)處于凝集狀態(tài)的染色質(zhì)，多定位于著絲粒區(qū)、端粒區(qū)，含有大量高度重復順序的脫氧核糖核酸（DNA），稱為衛(wèi)星DNA（satel-lite DNA）。第三章、基因的功能實體

1、基因的功能

基因有控制遺傳性狀和活性調(diào)節(jié)的功能?；蛲ㄟ^復制把遺傳信息傳遞給下一代，并通過控制酶的合成來控制代謝過程，從而控制生物的個體性狀表現(xiàn)。基因還可以通過控制結(jié)構(gòu)蛋白的成分，直接控制生物性狀。、生物體細胞中的DNA分子上有很多基因，但并不是每一基因的特征都表現(xiàn)出來。即使是由同一受精卵發(fā)育分化而來的同一人體不同組織中的細胞，如肌肉細胞、肝臟細胞、骨細胞、神經(jīng)細胞、紅細胞、和胃黏膜細胞等。它們的細胞形狀都是各不相同的。為什么會出現(xiàn)這種現(xiàn)象呢？原來，細胞核中的基因在細胞的一生中并非始終處于活性狀態(tài)，它們有的處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，即活性狀態(tài)，這時基因打開，有的處于非轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，即基因關(guān)閉。在生物體的不同發(fā)育期，基因的活性是不同的，而且基因的活性有嚴格的程序?；蚧钚缘膰栏癯绦蚴巧芷诜€(wěn)定的基礎。各種不同的生物因其細胞內(nèi)的基因具有獨特的活性調(diào)節(jié)而呈現(xiàn)不同的形態(tài)特征。

2、順反因子

順式作用元件（cis-acting element）能影響基因表達，但不編碼RNA和蛋白質(zhì)的DNA序列

反式作用因子（trans-actingfactor）能識別和結(jié)合特定的順式作用元件,并影響基因轉(zhuǎn)錄的一類蛋白質(zhì)或RNA

3、順式調(diào)控元件

有順式調(diào)控元件(cis-regulatory element)，或順式作用元件是調(diào)節(jié)位于相同的DNA分子(通常是一個染色體)的基因的表達的DNA或RNA的區(qū)域。這個詞是從拉丁詞順，這意味著“在同一側(cè)的”構(gòu)建?？赡苡许樖皆挥诳刂?或什至更上游的啟動子區(qū)域)的基因的編碼序列的上游，在一個內(nèi)含子，或該基因的編碼序列的下游，無論是在非翻譯或未轉(zhuǎn)錄區(qū)域。

4、非編碼RNA分子的調(diào)控作用 非編碼RNA（Non-coding RNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA 和microRNA 等多種已知功能的 RNA，還包括未知功能的RNA。這些RNA的共同特點是都能從基因組上轉(zhuǎn)錄而來，但是不翻譯成蛋白，在RNA 水平上就能行使各自的生物學功能了。非編碼RNA 從長度上來劃分可以分為3類:小于50 nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；50 nt到500 nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA 等等；大于500 nt，包括長的mRNA-like 的非編碼RNA，長的不帶polyA 尾巴的非編碼RNA等等。

5、基因在細胞核內(nèi)的地域分布 第四章、基因組的組織結(jié)構(gòu)

1、基因組

在生物學中，一個生物體的基因組是指包含在該生物的DNA（部分病毒是RNA）中的全部遺傳信息，又稱基因體(genome)?；蚪M包括基因和非編碼DNA。1920年，德國漢堡大學植物學教授漢斯.溫克勒（Hans Winkler）首次使用基因組這一名詞。更精確地講，一個生物體的基因組是指一套染色體中的完整的DNA序列。

2、原核生物基因組的特點

a、基因組較小，通常只有一個環(huán)形或線形的DNA分子。

b、基因組的大部分序列是用來編碼蛋白質(zhì)的，基因之間的間隔序列很短。

c、功能相關(guān)的序列常串連在一起，由共同的調(diào)控元件調(diào)控，并轉(zhuǎn)錄成同一mRNA分子，可指導多種蛋白質(zhì)的合成，這種結(jié)構(gòu)稱操縱子。

3、真核生物基因組的特點 a、基因組較大。真核生物的基因組由多條線形的染色體構(gòu)成，每條染色體有一個線形的DNA分子，每個DNA分子有多個復制起點。

b、不存在操縱子結(jié)構(gòu)。真核生物的同一個基因簇的基因，不會像原核生物的操縱子結(jié)構(gòu)那樣，轉(zhuǎn)錄到同一個mRNA上。

c、存在大量的重復序列。真核生物的基因組里存在大量重復序列，通過其重復程度可將其分成高度重復序列、中度重復序列、低度重復序列和單一序列。

d、有斷裂基因。大多數(shù)真核生物為蛋白質(zhì)編碼的基因都含有“居間序列”，即不為多肽編碼，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在mRNA前體的加工過程中被切除的成分。

4、基因的拷貝數(shù)

拷貝數(shù)就是指某基因（可以是質(zhì)粒）在某一生物的基因組中的個數(shù).單拷貝就是該基因在該生物基因組中只有一個,多則指有多個。

(一)在細菌細胞中，某種特定質(zhì)粒的數(shù)目。根據(jù)復制特性，質(zhì)粒分嚴緊型和松弛型兩類，前者在細胞中只含1～2個，而后者含10～15個以上。恒定的拷貝數(shù)與質(zhì)粒復制控制系統(tǒng)、宿主細胞遺傳背景及生長條件有關(guān)。質(zhì)粒復制控制系統(tǒng)首先通過調(diào)節(jié)復制的起始點來控制拷貝數(shù)，調(diào)節(jié)因素包括阻遏蛋白、反義RNA和某些順向重復序列。有些質(zhì)粒還有其他控制系統(tǒng)，如有分配功能的par系統(tǒng)和確保質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳的ccd系統(tǒng)。一旦質(zhì)粒上與調(diào)控有關(guān)的基因或位點突變，可使拷貝數(shù)明顯增加或減少。(二)在細菌細胞中，某種特定基因的數(shù)目。

5、線粒體DNA 線粒體中的遺傳物質(zhì)，線粒體能為細胞產(chǎn)生能量，是在細胞線粒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的脫氧核糖核酸特殊形態(tài)。線粒體DNA（mtDNA）呈雙鏈環(huán)狀，在哺乳動物中大小一般在15kb～18kb之內(nèi)。一個線粒體中一般有多個DNA分子。

與核基因組相比，線粒體基因組有如下有趣的性質(zhì)： 所有的基因都位于一個單一的環(huán)狀DNA分子上。遺傳物質(zhì)不為核膜所包被。DNA不為蛋白質(zhì)所壓縮。

基因組沒有包含那么多非編碼區(qū)域（垃圾DNA或“內(nèi)含子”）。一些密碼子與通用密碼子不同。相反，與一些紫色非硫細菌相似。一些堿基為兩個不同基因的一部分：某堿基作為一個基因的末尾，同時作為下一個基因的開始。

線粒體DNA比DNA存活時間長得多，而且遺傳自母親，因此用來確認家庭關(guān)系十分理想。第五章、基因的自身維護

1、DNA復制

DNA復制是指DNA雙鏈在細胞分裂以前的分裂間期進行的復制過程，復制的結(jié)果是一條雙鏈變成兩條一樣的雙鏈（如果復制過程正常的話），每條雙鏈都與原來的雙鏈一樣。這個過程通過邊解旋邊復制和半保留復制機制得以順利完成。DNA復制主要包括引發(fā)、延伸、終止三個階段。

2、DNA復制的特點

A、半保留復制：DNA在復制時，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA，每個子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復制。DNA以半保留方式進行復制，是在1958年由M.Meselson 和 F.Stahl 所完成的實驗所證明。

B、有一定的復制起始點：DNA在復制時，需在特定的位點起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復制起始點（復制子）。在原核生物中，復制起始點通常為一個，而在真核生物中則為多個。

C、需要引物（primer)：DNA聚合酶必須以一段具有3'端自由羥基（3'-OH）的RNA作為引物，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個核苷酸，而在真核生物中約為10個核苷酸。

D、雙向復制：DNA復制時，以復制起始點為中心，向兩個方向進行復制。但在低等生物中，也可進行單向復制。

E、半不連續(xù)復制：由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，因此兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時的方式是不同的。以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在聚合時基本上是連續(xù)進行的，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈（leading strand)。而以5'→3'方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在聚合時則是不連續(xù)的，這條鏈被稱為隨從鏈（lagging strand)。DNA在復制時，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段（Okazaki fragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個核苷酸，而在真核生物中約為100個核苷酸。

3、DNA復制的忠實性維護

DNA聚合酶高度選擇性、DNA聚合酶的自我校對、錯配修復

4、連接體和去連接體

5、幾種特殊形式的DNA合成

誘導型穩(wěn)定DNA復制、DNA重組依賴的DNA復制、組成型穩(wěn)定DNA復制、DNA的跨損傷復制。

6、DNA復制的多種形式

滾環(huán)復制：滾環(huán)式復制(rolling circle replication)是噬菌體中常見的DNA復制方式。滾環(huán)式復制的一個特點是以一條環(huán)狀單鏈DNA為模板，進行新的DNA環(huán)狀分子合成。噬菌體的雙鏈DNA環(huán)狀分子先在一條單鏈的復制起點上產(chǎn)生一個切口(nick)，然后以另一條單鏈為模板不斷地合成新的單鏈。釋放出的新合成的單鏈或是先復制成雙鏈DNA，被酶切割成單位長度后，再形成環(huán)狀雙鏈DNA分子；或是釋放出的新合成的單鏈DNA，先被酶切割成單位長度形成單鏈環(huán)狀DNA分子后再復制成雙鏈環(huán)狀DNA分子。

D環(huán)復制：雙螺旋的兩條鏈并不同時進行復制，重鏈先開始復制，稍后輕鏈再開始復制，當復制沿輕鏈開始時，重鏈上產(chǎn)生了D環(huán)，隨環(huán)形輕鏈復制的進行，D環(huán)增大，輕鏈后亦開始復制，最后兩條鏈完成復制形成兩條新的DNA雙螺旋。第六章、綜合

1、DNA的損傷和修復

DNA損傷修復是在細胞中多種酶的共同作用下，使DNA受到損傷的結(jié)構(gòu)大部分得以恢復，降低了突變率，保持了DNA分子的相對穩(wěn)定性。DNA分子的損傷類型有多種。UV照射后DNA分子上的兩個相鄰的胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)之間可以共價鍵連結(jié)形成環(huán)丁酰環(huán)，這種環(huán)式結(jié)構(gòu)稱為二聚體。胸腺嘧啶二聚體的形成是 UV對DNA分子的主要損傷方式。

Χ射線、γ射線照射細胞后，由細胞內(nèi)的水所產(chǎn)生的自由基既可使DNA分子雙鏈間氫鍵斷裂,也可使它的單鏈或雙鏈斷裂?；瘜W物中的博萊霉素、甲基磺酸甲烷等烷化劑也能造成鏈的斷裂。

絲裂霉素C可造成DNA分子單鏈間的交聯(lián)，這種情況常發(fā)生在兩個單鏈的對角的鳥嘌呤之間。鏈的交聯(lián)也往往帶來DNA分子的斷裂。

DNA分子還可以發(fā)生個別堿基或核苷酸的變化。例如堿基結(jié)構(gòu)類似物5-溴尿嘧啶等可以取代個別堿基，亞硝酸能引起堿基的氧化脫氨反應，原黃素（普魯黃）等吖啶類染料和甲基氨基偶氮苯等芳香胺致癌物可以造成個別核苷酸對的增加或減少而引起移碼突變（見基因突變）。

一種 DNA損傷劑往往可以同時引起幾種類型的損傷，其損傷效應的大小和類型與劑量及細胞所處的周期狀態(tài)有關(guān)。

2、基因重組與重排

基因重排是指通過基因的轉(zhuǎn)座，DNA的斷裂錯接而使正?；蝽樞虬l(fā)生改變。

基因組重排技術(shù)結(jié)合了傳統(tǒng)誘變技術(shù)和細胞融合技術(shù),是一項對整個微生物基因組重排的新型育種技術(shù)?；蚪M重排技術(shù)通過多親本原生質(zhì)體遞歸融合,可以使工程菌快速獲得多樣復雜優(yōu)良表型,并且無須了解其基因組學、代謝組學等具體背景。介紹了基因組重排技術(shù)的過程及應用,展現(xiàn)了基因組重排技術(shù)的優(yōu)點,并給出了基因組重排技術(shù)的發(fā)展在未來的應用情景。

3、細胞周期控制及細胞死亡控制

細胞周期分為：合成DNA的時期稱為DNA合成期（S期），進行DNA拷貝分配和細胞分裂的時期稱為有絲分裂期（M期），在M期結(jié)束后和S期開始前的一段間隙稱為G1期，而在S期結(jié)束后和M期開始前的間隙則稱為G2期。真核細胞內(nèi)有一個調(diào)控機構(gòu)，使細胞周期能有條不紊地依次進行。細胞周期的準確調(diào)控對生物的生存、繁殖、發(fā)育和遺傳均是十分重要的，細胞周期各時相中有各自特異性的細胞周期蛋白控制細胞周期有序地進行。細胞是有機體的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，而細胞周期則是保證細胞進行生命活動的基本過程。細胞周期分為：合成DNA的時期稱為DNA合成期（S期），進行DNA拷貝分配和細胞分裂的時期稱為有絲分裂期（M期），在M期結(jié)束后和S期開始前的一段間隙稱為G1期，而在S期結(jié)束后和M期開始前的間隙則稱為G2期。真核細胞內(nèi)有一個調(diào)控機構(gòu)，使細胞周期能有條不紊地依次進行。細胞周期的準確調(diào)控對生物的生存、繁殖、發(fā)育和遺傳均是十分重要的，細胞周期各時相中有各自特異性的細胞周期蛋白控制細胞周期有序地進行。細胞死亡是生命現(xiàn)象不可逆停止及生命的結(jié)束，正常的組織中經(jīng)常發(fā)生細胞死亡，是維持組織機能和形態(tài)所必須的，包括細胞主動死亡-程序性死亡和細胞被動死亡即細胞壞死、細胞凋亡。

細胞的死亡方式有兩種A被動死亡——細胞壞死，它是指細胞受到環(huán)境因素的影響，導致細胞死亡的病理過程。B主動死亡（細胞編程性死亡）——即細胞凋亡，為了維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，細胞發(fā)生主動的，由基因控制的自我消亡過程，此過程需要消耗能量。

第五篇：分子生物學實驗總結(jié)

分子生物學實驗

1.TOMY全自動滅菌鍋的使用

（1）檢查排放蒸汽的水壺，腔體內(nèi)的水位與托板齊平。（2）SET鍵設置溫度和時間（121℃，20min）（3）關(guān)閉排氣閥，Start機器開始運行，Check Heat檢查設置的溫度，Stop鍵終止機器運行。（4）程序運行結(jié)束，旋開排氣閥或機器自行排氣至壓力為0。溫度降至80℃以下壓力為0時方可開蓋。運行過程中勿接觸蓋子。（5）腔體內(nèi)經(jīng)常清潔。2.LB液體培養(yǎng)基（1000mL）

將胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g完全溶解在950mL去離子水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至總體積為1000mL，121℃濕熱滅菌20min。冷卻后4℃保存?zhèn)溆谩９腆w還要再加瓊脂。3.堿裂解法

堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們的。在pH值介于12.0～12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的氫鍵會斷裂，但兩條互補鏈彼此纏繞，仍會緊密的結(jié)合在一起。當加入 pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液，恢復pH至中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)－SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。

溶液Ⅰ：葡萄糖，Tris-HCl，EDTA 葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受機械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制DNase對DNA的降解作用。溶液Ⅱ：氫氧化鈉，SDS 氫氧化鈉加入后堿性環(huán)境12-12.5促使染色體DNA與質(zhì)粒的變性解離成單鏈。SDS是一種陰離子去垢劑，它的主要作用有：①溶解細胞膜上的脂肪與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜；②解聚細胞中的核蛋白，使蛋白質(zhì)與DNA分開；③SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為SDS-蛋白質(zhì)復合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀；④SDS能抑制核酸酶的作用，防止對DNA的降解。

溶液Ⅲ：乙酸鉀。用pH4.2的KAc溶液是為了調(diào)整溶液pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/L醋酸鉀(KAc)有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白質(zhì)復合物凝聚而沉淀。4.loading buffer 電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。5.限制性內(nèi)切酶（I型）限制性內(nèi)切酶：能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。

(II型)限制性內(nèi)切酶：能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的，因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。

（III型）限制性內(nèi)切酶：也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應用于基因克隆。6.引物設計和選擇目的DNA序列區(qū)域時遵循下列原則： 引物長度約為16～30bp；引物中G+C含量通常為40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估計引物的解鏈溫度；四種堿基應隨機分布，在3’端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣易導致錯誤；引物3’端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應，以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對；在引物內(nèi)，尤其在3’端應不存在二級結(jié)構(gòu)；兩引物之間尤其在3’端不能互補，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量；引物5’端對擴增特異性影響不大，可引入酶切位點或突變位點；引物不與模板結(jié)合位點以外的序列互補；簡并引物應選用簡并程度低的密碼子；引物的濃度一般為0.1～0.5μmol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴增，引物濃度偏低則降低產(chǎn)量。7.dNTP 常用的濃度為20～200μmol/L，而且4種dNTP的終濃度相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足而出現(xiàn)的錯誤摻入；dNTP濃度過高雖可加快反應速度，但會增加堿基的錯誤摻入率，同時會抑制Taq DNA聚合酶的反應活性；適當?shù)牡蜐舛葧岣叻磻木_度；注意協(xié)調(diào)Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。8.感受態(tài)

處于對數(shù)生長期的細菌經(jīng)低溫CaCl2處理后接受外源DNA的能力顯著增加。細菌處于容易吸收外源 DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過細菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob 基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌，需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài),以攝取外源DNA。9.轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化是將外源DNA 分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-,M-)，它可以容忍外源DNA 分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)。10.DNA連接酶

有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶；DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過牛小腸堿性磷酸酶CIP處理克服； 連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個折中的溫度，即12～16℃，連接12～16h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；

pMD18-T Vector 是一種高效克隆PCR 產(chǎn)物（TA Cloning）的專用載體，該載體由pUC18 載體改建并在其3’端添加“T”而成

大部分耐熱性DNA聚合酶進行PCR反應時都有在PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率；

轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導入細菌的過程 11.α互補

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞后，還需對轉(zhuǎn)化菌落進行篩選鑒定。利用α互補現(xiàn)象進行篩選是最常用的一種鑒定方法； α互補：質(zhì)粒載體上lacZ’基因編碼的α肽段與失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突變受體菌之間實現(xiàn)互補的現(xiàn)象，由α互補而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal顯色測定出來；任何攜帶著lacZ’基因的質(zhì)粒載體在轉(zhuǎn)化β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細胞后，在含有Xgal的培養(yǎng)基平板上形成藍色菌落，而含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色菌落。