第一篇：實(shí)驗(yàn)三 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

實(shí)驗(yàn)三 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)特征及其制備技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)器具及試劑 1．器具

普通光學(xué)顯微鏡、50ml燒杯、玻璃滴管、容量瓶、試劑瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子、小剪刀、吸水紙、擦鏡紙。2．試劑

M-緩沖液：咪唑、KCL、MGCL2、EGTA【乙二醇雙醚四乙酸】、EDTA、疏基乙醇或DTT(二硫蘇糖醇)；（PH6.8）磷酸緩沖液（用NaHCO3調(diào)PH值）；Triton X-100，用M-緩沖液配制；考馬斯亮藍(lán)R250,其溶劑為：甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸餾水46.5ml；戍二醛、乙醇、叔丁醇、正丁醇、二甲苯、中性樹(shù)膠等。3.實(shí)驗(yàn)材料 洋蔥鱗莖

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

細(xì)胞骨架事由蛋白質(zhì)絲組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)其組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為微管、微絲和中間纖維。它們對(duì)細(xì)胞形態(tài)的維持，細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、分裂、分化，物質(zhì)運(yùn)輸，能量轉(zhuǎn)換，信息傳遞，基因表達(dá)等起到重要作用。當(dāng)用適當(dāng)濃度的Triton X-100處理細(xì)胞時(shí)，可經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜中和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和全部脂質(zhì)被溶解抽提，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)不受破壞而被保存，經(jīng)用戊二醛固定，考馬斯亮藍(lán)R250染色后，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到由微絲組成的微絲束為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，就是細(xì)胞骨架。

（一）溶液配制（1）M-緩沖液配制：

M-緩沖液(10×原液)：咪唑34.04g，氯化鎂(MgCl2?6H2O)1.02g，EGTA（乙二醇雙醚四乙酸）3.8g，EDTA(乙二胺四乙酸)0.29g，巰基乙醇0.78g(0.7ml)蒸餾水加至1 000 ml。使用時(shí)，取100 ml(10×原液)加900 ml蒸餾水。（2）6mmol/L（PH6.5）磷酸緩沖液配制： 甲液：NaH2PO4?2H2O，0.938g 溶于蒸餾水中，最后稀釋至1 000ml。乙液：Na2HPO4 ?12H2O，2.15g加蒸餾水溶解，最后加水至1 000ml。取甲液685ml，乙液315ml加蒸餾水1000ml即成6mmol/LPH6.5的磷酸緩沖液。

（3）1%Triton X-100，用M-緩沖液配制： 取22ml Triton X-100液加M-緩沖液至200ml。（4）0.2%考馬斯亮藍(lán)R250：

考馬斯亮藍(lán)R250為0.2g，甲醇46.5ml、冰醋酸7ml、蒸餾水46.5ml（5）3%戍二醛，用磷酸緩沖液配制。

（二）實(shí)驗(yàn)方法與步驟

（1）撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮（約1cm2大小若干片）置于裝有PH6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉。

（2）吸去磷酸緩沖液，用1% Triton X-100處理20~30min。（3）吸去Triton X-100，用M-緩沖液洗3次，每次10min。（4）3%戊二醛固定0.5~1h。

（5）PH6.5磷酸緩沖液洗三次，每次10min。（6）0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色20~30min。

（7）用蒸餾水洗1~2次，細(xì)胞置于載破片上，加蓋玻片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

（8）如觀察效果好，可制作成永久切片。

在有樣品的50ml燒杯中，順序通過(guò)如下藥物：50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、1/2V95%乙醇+1/2V叔丁醇、叔丁醇（每級(jí)5-10min）；或正丁醇、正丁醇、二甲苯、二甲苯（每級(jí)5-10min），然后撈取樣品，平展于載玻片上，經(jīng)鏡檢，效果好的，可加一滴中性樹(shù)膠，蓋上蓋玻片，即成永久片。

四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1．繪出植物細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)圖。

2．分析在光學(xué)顯微鏡下觀察到的細(xì)胞骨架的形態(tài)特征。

第二篇：實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

實(shí)驗(yàn)三

細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握植物細(xì)胞骨架的光鏡標(biāo)本制作方法。

細(xì)胞骨架是指細(xì)胞質(zhì)中縱橫交錯(cuò)的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，按組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同可分為微管、微絲和中間纖維。它們對(duì)細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、分裂、分化和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)绕鹬匾饔谩９鈱W(xué)顯微鏡下細(xì)胞骨架的形態(tài)學(xué)觀察多用1% Triton X-100處理細(xì)胞，可使細(xì)胞膜溶解，而細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)被保存，再用考馬斯亮蘭R250染色，使得胞質(zhì)中細(xì)胞骨架得以清晰顯現(xiàn)。

二、材料、試劑和儀器

1． 材料

新鮮洋蔥鱗莖、人口腔上皮細(xì)胞

2． 試劑

1）M緩沖液（pH 7.2）各成分終濃度為：

50mmol/L咪唑(MW:68.08)，50mmol/L KCl(MW:74.55)，0.5mmol/L MgCl2?6H2O(MW:203.30)，1mmol/L EGTA(MW:380.36)，0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)，1mmol/L DTT(MW:154.3)

2）6mmol/L PBS磷酸緩沖液（pH 6.5）:

KH2PO4 : Na2HPO4?2H2O = 7:3(見(jiàn)附錄3 查磷酸緩沖液的配置)

3）0.7% NaCl生理鹽水

4）1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)溶于 M-緩沖液

5）3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL ,PBS 88mL

6）0.2% 考馬斯亮藍(lán)R250染液 200mL:

考馬斯亮藍(lán)R250 0.2g，甲醇 46.5mL，冰乙酸 7mL，蒸餾水46.5 mL

3．儀器

光學(xué)顯微鏡，鑷子，剪刀，試管，表面皿，滴管，載玻片，蓋玻片,滅菌牙簽，1.5mL離心管，1mL吸頭，1mL取液器，酒精燈，染色缸 細(xì)胞骨架動(dòng)畫

三、實(shí)驗(yàn)程序

四、結(jié)果與分析

洋蔥鱗莖外層與內(nèi)層的表皮細(xì)胞比較（放大倍數(shù)10×20）

五、思考題

1．光鏡下觀察到的細(xì)胞骨架有何形態(tài)特征？

2．對(duì)實(shí)驗(yàn)成功或失敗的原因進(jìn)行討論。

實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)和關(guān)鍵步驟

第三篇：實(shí)驗(yàn)五 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

實(shí)驗(yàn)五 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

掌握植物細(xì)胞骨架處理及染色方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理：

用適當(dāng)濃度的TritonX-100處理時(shí)，可將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)破壞，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻被保存，后者用考馬斯亮藍(lán)R250染色，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

三、實(shí)驗(yàn)試劑：

1、M-緩沖液；

2、pH6.8磷酸緩沖液； 3、1% TritonX-100，用M-緩沖液配制； 4、0.2%考馬斯亮蘭R250； 5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸緩沖液配制；

四、實(shí)驗(yàn)步驟：

1、撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞約1cm2大小若干片，置于裝有pH6.8磷酸緩沖液的培養(yǎng)皿中使其下沉(約1-2min)；

2、吸去pH6.8磷酸緩沖液，用1% TritonX-100處理30min；

3、吸去1% TritonX-100，用M-緩沖液洗三次，每次5min； 4、3%戊二醛固定30min；

5、pH6.8磷酸緩沖液洗三次，每次5min； 6、0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色10min；

7、用蒸餾水洗1-2次，將內(nèi)表皮細(xì)胞平鋪于載玻片上，加蓋玻片，于顯微鏡下觀察。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

在光學(xué)顯微鏡下，可以清晰的看到細(xì)胞骨架呈淡藍(lán)色。

六、分析與討論：

1、洋蔥表皮細(xì)胞中，質(zhì)膜下，核周，胞質(zhì)中的細(xì)胞骨架的分布有無(wú)不同？ 答: 核周細(xì)胞骨架分布緊密，向外基質(zhì)出延伸時(shí)明顯變得稀疏，質(zhì)膜下維持細(xì)胞的外部形態(tài)。因此顯微鏡下看到的細(xì)胞骨架形態(tài)基本與細(xì)胞形態(tài)相似。胞質(zhì)中細(xì)胞骨架呈現(xiàn)纖維狀向質(zhì)膜發(fā)射，質(zhì)膜處的細(xì)胞骨架圍成細(xì)胞固有形態(tài)。

2、為什么試驗(yàn)中所看到的洋蔥表皮細(xì)胞中細(xì)胞骨架有的成纖維狀，有的成串球狀？

答: 細(xì)胞骨架有運(yùn)輸細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的作用，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)沿著細(xì)胞骨架的通路進(jìn)行運(yùn)輸，因此細(xì)胞骨架成串珠狀可能是由于被運(yùn)輸物質(zhì)停留在纖維的某一位置上使纖維狀的細(xì)胞骨架成串珠狀。

第四篇：實(shí)驗(yàn)二、植物細(xì)胞骨架的觀察

實(shí)驗(yàn)

二、植物細(xì)胞骨架的觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

觀察植物細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)狀的骨架結(jié)構(gòu)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

在真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，存在著由蛋白質(zhì)纖維構(gòu)成的網(wǎng)狀骨架系統(tǒng)。Triton X-100是非離子去垢劑，用適當(dāng)濃度的Triton X-100處理細(xì)胞，可將細(xì)胞的膜成分抽提掉，由于失去膜的保護(hù)和維系作用，細(xì)胞內(nèi)其他可溶性成分也隨之流失，這樣一來(lái)水不溶性的細(xì)胞骨架系統(tǒng)蛋白質(zhì)卻被保留下來(lái)，而這被保留下來(lái)的蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍(lán)R250染色，便可在光學(xué)顯微鏡下觀察它們——細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。為了更好地觀察微絲束的結(jié)構(gòu)，采用了戊二醛對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。戊二醛是一種雙交聯(lián)劑，滲透快，交聯(lián)能力強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)的固定效果好，且不破壞細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)。M-緩沖液洗滌細(xì)胞,可以提高細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。M－緩沖液和磷酸緩沖液作用都是維持細(xì)胞的滲透壓

三、實(shí)驗(yàn)用品

顯微鏡、50ml燒杯、蓋玻片、載玻片、濾紙、M-緩沖液、磷酸緩沖液（PBS）、1% Triton X-100、0.2%考馬斯亮藍(lán)R250、3%戊二醛、洋蔥鱗莖。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮若干片，大小約1平方厘米，置于裝有PH6.8的磷酸緩沖液（PBS）的50ml燒杯中，使其下沉。

2、用濾紙吸去磷酸緩沖液（PBS），用1% Triton X-100處理20-30分鐘。

3、吸去Triton X-100，用M-緩沖液洗3次，每次10分鐘。

4、用3%戊二醛固定10-15分鐘。

5、用磷酸緩沖液（PBS）洗3次，用濾紙吸干。

6、用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色20-30分鐘。

7、用蒸餾水洗1-2次，將洋蔥細(xì)胞置于載玻片上，加上蓋片。

8、在光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

五、作業(yè)

寫出你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并繪成圖。

附：藥品配置

1、M—緩沖液（10×原液）

咪唑（50m mol）34.04g MgCl.6H2O 1.02g EGTA（1m mol）3.80g EDTA（0.1m mol）0.29g 巰基乙醇 0.78（0.7ml）蒸餾水 加至1000ml 用時(shí)稀釋，取50ml（10×原液）加450ml蒸餾水。

2、磷酸緩沖液（PBS）

配方①：

NaCl 8.0g Na2HPO4.2H2O 1.42g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl2.6H2O 0.10g CaCl2（無(wú)水）0.10g 0.5%酚紅 4ml 雙蒸水 加至100ml 用 5%NaHCO3調(diào)PH值至6.8。也可先配成10被濃縮液，使用時(shí)再稀釋。配方②：

6m mol/L PH6.5磷酸鹽緩沖液

A液：NaH2PO4.2H2O 938mg/1000ml B液：Na2HPO4.12H2O 2150mg/1000ml 取A液68.5ml，B液31.5ml，加蒸餾水100ml即為工作液。加入0.5%酚紅4ml。3、1% Triton X-100 用M-緩沖液配制。

取1mlTriton X-100液加M-緩沖液至100ml。4、0.2%考馬斯亮藍(lán)R250配制

考馬斯亮藍(lán)R250 0.2g 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸餾水 46.5ml 5、3%戊二醛的配制

用磷酸緩沖液（PBS）配制。取3ml戊二醛加PH7.0、（1/15）磷酸鹽緩沖液至100ml。

第五篇：植物細(xì)胞骨架的觀察

實(shí)驗(yàn)六 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆罩参锛?xì)胞骨架處理及染色方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理：用適當(dāng)濃度的TritonX-100處理時(shí)，可將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)破壞，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻被保存，后者用考馬斯亮蘭R250染色，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

三、實(shí)驗(yàn)試劑：

1、M-緩沖液；

2、pH6.8磷酸緩沖液； 3、1% TritonX-100，用M-緩沖液配制； 4、0.2%考馬斯亮蘭R250； 5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸緩沖液；

四、實(shí)驗(yàn)步驟：

1、撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞（約1cm2大小若干片）置于裝有pH6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉；

2、吸去pH6.8磷酸緩沖液，用1% TritonX-100處理20min；

3、吸去1% TritonX-100，用M-緩沖液洗三次，每次8min；

4、3%戊二醛固定30min；

5、pH6.8磷酸緩沖液洗三次，每次8min；

6、0.2%考馬斯亮蘭R250染色20min；

7、用蒸餾水洗1-2次，將內(nèi)表皮細(xì)胞平鋪?zhàn)虞d玻片上，加蓋玻片，于顯微鏡下觀察。

五、實(shí)驗(yàn)作業(yè)：

1、繪制你所觀察到的植物細(xì)胞骨架圖象；

2、戊二醛、考馬斯亮蘭R250、TritonX-100是什么？在本實(shí)驗(yàn)中各起什么作用？