第一篇：細(xì)胞骨架的觀察

細(xì)胞生物學(xué)實驗

細(xì)胞骨架的觀察

姓名：鄧燕玲 學(xué)號：201011202912 專業(yè)：生命科學(xué)生物科學(xué) 實驗時間：20121030 指導(dǎo)老師：張偉 同組同學(xué)：張麗華

細(xì)胞生物學(xué)實驗

實驗?zāi)康?/p>

1.了解細(xì)胞骨架的組成、結(jié)構(gòu)和功能。2.學(xué)習(xí)細(xì)胞骨架標(biāo)記的原理和方法。3.學(xué)習(xí)用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲的方法步驟。

4.觀察小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞的細(xì)胞微絲骨架。5.討論細(xì)胞骨架在中學(xué)中教學(xué)的重點與難點。

實驗原理

1.細(xì)胞骨架一般是指真核細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)架系統(tǒng)。廣義大的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞膜骨架、細(xì)胞核骨架和細(xì)胞質(zhì)骨架。直至1963年，科學(xué)家用戊二醛在室溫下固定成功后，人們才廣泛地觀察到各類細(xì)胞骨架纖維的存在。細(xì)胞骨架包括微管、微絲和中間纖維。不同成分有不同的結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞骨架處于不斷地動態(tài)平衡中，并且有極性。2.微絲的標(biāo)記方法可分為在固定細(xì)胞中標(biāo)記和在活體中標(biāo)記。本實驗采用的是固定細(xì)胞標(biāo)記，主要運用帶熒光探針的抗體或鬼筆環(huán)肽標(biāo)記，這需要對樣品進(jìn)行化學(xué)固定和膜的通透。

3.熒光探針是一種標(biāo)記物，其中包含的熒光物質(zhì)在從外界吸收能量后變成激發(fā)態(tài)，在回到基態(tài)時以電磁波的形式釋放能量，從而產(chǎn)生熒光。熒光物質(zhì)在受到長時間的照射后會淬滅。

4.鬼筆環(huán)肽（phalloidin）是一種劇毒生物堿，能結(jié)合F-actin，而不與G-actin結(jié)合，并且在結(jié)合后可以抑制微絲的解聚，破壞微絲聚合和解聚的動態(tài)平衡。鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞有毒害作用，因此不利于活體細(xì)胞的研究。

5.熒光顯微鏡是用于觀察和分析樣品中產(chǎn)生的熒光物質(zhì)的成分和定位的一種光學(xué)顯微鏡，熒光物質(zhì)在受到激發(fā)光的激發(fā)下，會發(fā)出比激發(fā)光波長更長的光，從而在顯微鏡下觀察。

實驗器材

1.材料：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、CHO中國倉鼠卵巢細(xì)胞

2.試劑：PEM緩沖液（50 mM pipes,5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 0.225M 山梨醇），0.5 % Triton X-100（溶于PEM緩沖液），4%多聚甲醛（溶于PEM緩沖液），55nM Alex-phalloidin 3.器械：熒光顯微鏡 實驗步驟

1.將小培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液用移液槍吸掉，加入預(yù)熱的1mlPEM清洗，注意不要打在蓋玻片

細(xì)胞生物學(xué)實驗

上，洗三次。

2.加入1ml37°C預(yù)熱的0.5 % Triton X-100，放置10min。3.加入預(yù)熱的1mlPEM清洗，洗三次。4.加入預(yù)熱的4%多聚甲醛1ml，放置15min。5.加入預(yù)熱的1mlPEM清洗，洗三次。

6.剪下一段與載玻片寬度一樣的封口膜，將封口膜包在在玻片上，在玻片上的封口膜上加10?L的 55nM Alex –phalloidin，將載玻片有細(xì)胞的一面朝下蓋片，在暗盒中靜置25min。7.用37°預(yù)熱的PEM洗三次，將載玻片有細(xì)胞的一面朝上轉(zhuǎn)移到一個新的載玻片中，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

實驗結(jié)果 思考題

1.PEM緩沖液的作用是什么？

答：促進(jìn)微管中肌動蛋白的聚合，抑制其解聚，使微管形態(tài)固定，便于觀察。2.1％Triton X-100處理細(xì)胞的作用是什么？

答：能溶解膜上的脂類和蛋白質(zhì)，使細(xì)胞膜穿孔，便于標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。3.如何在中學(xué)教學(xué)中推進(jìn)細(xì)胞骨架的教學(xué)？

第二篇：細(xì)胞骨架觀察實驗設(shè)計

細(xì)胞骨架觀察實驗設(shè)計

I、實驗內(nèi)容

一、正常細(xì)胞

二、秋水仙素處理 三、VP16處理 四、低溫處理 II、實驗流程

一、細(xì)胞傳代

二、細(xì)胞爬片

1~2d

三、細(xì)胞處理

6h

四、細(xì)胞固定、免染、觀察

1d III、實驗過程

一、細(xì)胞傳代

1、實驗材料

VEC

2、實驗器材

超凈臺、CO2培養(yǎng)箱、普通冰箱、倒置顯微鏡、離心機、離心管、微量加液器、吸管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（皿）、鑷子、酒精燈、消毒酒精、廢液缸

3、試劑

胰酶、PBS、培養(yǎng)液（牛血清、雙抗）

二、細(xì)胞爬片

已處理蓋片

三、細(xì)胞處理

細(xì)胞爬片、秋水仙素、VP16、普通冰箱

四、細(xì)胞固定、免染、觀察

1、實驗材料

已處理的爬片

2、實驗器材

離心機、離心管、玻璃培養(yǎng)皿、載玻片、濾紙、封口膜、溫箱、熒光顯微鏡、微量加液器、鑷子

3、試劑

PBS、BSA封閉液、一抗、二抗、蒸餾水、DAPI

4、步驟

固定

爬片置于玻璃培養(yǎng)皿中，PBS（500uL）洗3次，每次2min 吸棄PBS，加-20℃預(yù)冷甲醇，固定5min 吸棄甲醇，PBS洗3次，每次2min 免染

吸棄PBS，加100uL 2﹪BSA封閉液，蓋上培養(yǎng)皿蓋，室溫固定15min 濾紙吸去片子上封閉液，加30uL（1:500）稀釋一抗，蓋上封口膜（勿大于蓋片），37℃孵育30min ,邊上滴一滴PBS PBS洗3次，每次5min 在邊緣吸棄PBS（濾紙），滴加30uL（1:200）稀釋二抗，避光，蓋封口膜，37℃,30min 揭去封口膜，PBS洗3次，每次5min 吸棄PBS，蒸餾水清涮，迅速，片子正面朝上，晾干

干凈載玻片上，滴加3uLDAPI，將爬片鑷子夾上，反蓋于防淬滅劑上 熒光鏡觀察

IV、注意事項

1、區(qū)分蓋片正反面

2、保持樣品濕潤

3、一抗二抗孵育后，封口膜輕輕沖起

4、二抗孵育后，避光操作，以免熒光淬滅

5、標(biāo)本染色后立即觀察，不看時4℃保存

第三篇：植物細(xì)胞骨架的觀察

實驗六 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

一、實驗?zāi)康模赫莆罩参锛?xì)胞骨架處理及染色方法。

二、實驗原理：用適當(dāng)濃度的TritonX-100處理時，可將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)破壞，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻被保存，后者用考馬斯亮蘭R250染色，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

三、實驗試劑：

1、M-緩沖液；

2、pH6.8磷酸緩沖液； 3、1% TritonX-100，用M-緩沖液配制； 4、0.2%考馬斯亮蘭R250； 5、3%戊二醛，用pH6.8磷酸緩沖液；

四、實驗步驟：

1、撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞（約1cm2大小若干片）置于裝有pH6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉；

2、吸去pH6.8磷酸緩沖液，用1% TritonX-100處理20min；

3、吸去1% TritonX-100，用M-緩沖液洗三次，每次8min；

4、3%戊二醛固定30min；

5、pH6.8磷酸緩沖液洗三次，每次8min；

6、0.2%考馬斯亮蘭R250染色20min；

7、用蒸餾水洗1-2次，將內(nèi)表皮細(xì)胞平鋪子載玻片上，加蓋玻片，于顯微鏡下觀察。

五、實驗作業(yè)：

1、繪制你所觀察到的植物細(xì)胞骨架圖象；

2、戊二醛、考馬斯亮蘭R250、TritonX-100是什么？在本實驗中各起什么作用？

第四篇：實驗二、植物細(xì)胞骨架的觀察

實驗

二、植物細(xì)胞骨架的觀察

一、實驗?zāi)康?/p>

觀察植物細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)狀的骨架結(jié)構(gòu)。

二、實驗原理

在真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，存在著由蛋白質(zhì)纖維構(gòu)成的網(wǎng)狀骨架系統(tǒng)。Triton X-100是非離子去垢劑，用適當(dāng)濃度的Triton X-100處理細(xì)胞，可將細(xì)胞的膜成分抽提掉，由于失去膜的保護(hù)和維系作用，細(xì)胞內(nèi)其他可溶性成分也隨之流失，這樣一來水不溶性的細(xì)胞骨架系統(tǒng)蛋白質(zhì)卻被保留下來，而這被保留下來的蛋白質(zhì)用考馬斯亮藍(lán)R250染色，便可在光學(xué)顯微鏡下觀察它們——細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。為了更好地觀察微絲束的結(jié)構(gòu)，采用了戊二醛對細(xì)胞進(jìn)行固定。戊二醛是一種雙交聯(lián)劑，滲透快，交聯(lián)能力強，對蛋白質(zhì)的固定效果好，且不破壞細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)。M-緩沖液洗滌細(xì)胞,可以提高細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。M－緩沖液和磷酸緩沖液作用都是維持細(xì)胞的滲透壓

三、實驗用品

顯微鏡、50ml燒杯、蓋玻片、載玻片、濾紙、M-緩沖液、磷酸緩沖液（PBS）、1% Triton X-100、0.2%考馬斯亮藍(lán)R250、3%戊二醛、洋蔥鱗莖。

四、實驗方法與步驟

1、撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮若干片，大小約1平方厘米，置于裝有PH6.8的磷酸緩沖液（PBS）的50ml燒杯中，使其下沉。

2、用濾紙吸去磷酸緩沖液（PBS），用1% Triton X-100處理20-30分鐘。

3、吸去Triton X-100，用M-緩沖液洗3次，每次10分鐘。

4、用3%戊二醛固定10-15分鐘。

5、用磷酸緩沖液（PBS）洗3次，用濾紙吸干。

6、用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色20-30分鐘。

7、用蒸餾水洗1-2次，將洋蔥細(xì)胞置于載玻片上，加上蓋片。

8、在光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

五、作業(yè)

寫出你的實驗結(jié)果并繪成圖。

附：藥品配置

1、M—緩沖液（10×原液）

咪唑（50m mol）34.04g MgCl.6H2O 1.02g EGTA（1m mol）3.80g EDTA（0.1m mol）0.29g 巰基乙醇 0.78（0.7ml）蒸餾水 加至1000ml 用時稀釋，取50ml（10×原液）加450ml蒸餾水。

2、磷酸緩沖液（PBS）

配方①：

NaCl 8.0g Na2HPO4.2H2O 1.42g KCl 0.20g KH2PO4 0.20g MgCl2.6H2O 0.10g CaCl2（無水）0.10g 0.5%酚紅 4ml 雙蒸水 加至100ml 用 5%NaHCO3調(diào)PH值至6.8。也可先配成10被濃縮液，使用時再稀釋。配方②：

6m mol/L PH6.5磷酸鹽緩沖液

A液：NaH2PO4.2H2O 938mg/1000ml B液：Na2HPO4.12H2O 2150mg/1000ml 取A液68.5ml，B液31.5ml，加蒸餾水100ml即為工作液。加入0.5%酚紅4ml。3、1% Triton X-100 用M-緩沖液配制。

取1mlTriton X-100液加M-緩沖液至100ml。4、0.2%考馬斯亮藍(lán)R250配制

考馬斯亮藍(lán)R250 0.2g 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸餾水 46.5ml 5、3%戊二醛的配制

用磷酸緩沖液（PBS）配制。取3ml戊二醛加PH7.0、（1/15）磷酸鹽緩沖液至100ml。

第五篇：細(xì)胞骨架組分的熒光染色觀察

細(xì)胞生物學(xué)實驗報告

細(xì)胞骨架組分的熒光染色觀察

姓名：

學(xué)號：

班級：

專業(yè)：

同組成員：

一、實驗原理

鬼筆環(huán)肽(phalloidin)是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細(xì)胞松弛素的作用相反, 只與聚合的微絲結(jié)合, 而不與肌動蛋白單體分子結(jié)合。它同聚合的微絲結(jié)合后, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動態(tài)平衡。

由于鬼筆環(huán)肽非常特異地結(jié)合并穩(wěn)定聚合態(tài)肌動蛋白,因而對肌動蛋白的動態(tài)平衡造成嚴(yán)重影響.此外, 較高濃度的鬼筆環(huán)肽對細(xì)胞有毒害作用。因此,用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲并不是用于研究活體細(xì)胞的理想方法。

二、實驗?zāi)康?/p>

1．掌握細(xì)胞骨架的顯示方法 2.掌握熒光顯微鏡的使用方法

3.了解熒光顯微鏡下細(xì)胞骨架的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)

三、實驗器材 1.材料：

CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）、雞胚成纖維細(xì)胞 2.試劑：

PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 0.5% Triton X-100溶于PEM緩沖液。4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液。3.儀 器

超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡 4.其它用品：

蓋玻片（無菌）、35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、試管、移液管，滴管，酒精燈、75％酒精棉球、廢液缸。

四、方法與步驟

由于上節(jié)課雞胚成纖維細(xì)胞被污染，本次實驗所用細(xì)胞為CHO細(xì)胞（1）準(zhǔn)備好實驗器材。（本次實驗無需在超凈臺中進(jìn)行）

（2）將上節(jié)課進(jìn)行細(xì)胞爬片的培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，取出蓋片，于小平皿中。（3）37℃預(yù)溫 PEM洗3次(每次 1mL)（4）Triton X-100處理約10min(1mL)（5）37℃預(yù)溫 PEM洗3次(每次 1mL)（6）37℃預(yù)溫 4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min(1mL)（7）37℃預(yù)溫 PEM洗3次

（8）55nM Alex-phalloidin 10μL濕盒中室溫染色30min。（避光）（9）在parafilm 膜上加PEM，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片。（10）37℃預(yù)溫 PEM洗數(shù)3次，滴加10μL Ho.33342復(fù)染色。（11）熒光顯微鏡下觀察并拍照。

五、注意事項

1.蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕。2.注意不要弄碎蓋片，分清細(xì)胞所在面； 3.各步洗細(xì)胞要輕，勿使細(xì)胞脫落； 4.熒光觀察注意避光操作，防止熒光淬滅。5.節(jié)約試劑。

六、實驗結(jié)果

本次實驗我們對CHO細(xì)胞爬片結(jié)果進(jìn)行了熒光染色，在熒光顯鏡下用不同波長的激發(fā)光對細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)及細(xì)胞核進(jìn)行了觀察、拍攝照片并將結(jié)果疊加。得到以下的實驗現(xiàn)象：

圖1.CHO細(xì)胞微絲熒光染色圖

圖2.CHO細(xì)胞核熒光染色圖

圖3.CHO細(xì)胞微絲及細(xì)胞核熒光染色合成圖

從拍攝的照片可以較為清晰的看到CHO細(xì)胞骨架的微絲被染成了綠色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色；微絲的形狀為長條的紡錘狀細(xì)絲，遍布整個細(xì)胞，在細(xì)胞中起到了類似骨架般的支撐作用；細(xì)胞核為橢圓形，之后再將兩圖合成，可觀察到細(xì)胞核被遍布的微絲結(jié)構(gòu)包圍。實驗較為成功。在實驗時要注意熒光染料均存在淬滅問題，所以要盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。每步洗滌要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀釋下一步的抗體或試劑，這樣才能得到清晰的熒光圖像。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 桑建利, 譚信.細(xì)胞生物學(xué)實驗指導(dǎo).北京:科學(xué)出版社, 2010.[2] 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院.細(xì)胞生物學(xué)實驗.北京:北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2015.9.