第一篇：?jiǎn)慰寺】贵w藥物概述

單克隆抗體藥物概述

高熹

（2015級(jí) 交流學(xué)院 生物技術(shù) 168615140001）

摘要：?jiǎn)慰寺】贵w藥物作為一種具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)的生物靶向藥物，具有特異性高、靶向性強(qiáng)和毒副作用低的特點(diǎn)，在治療方面效果顯著。伴隨著抗體技術(shù)的不斷發(fā)展以及新型抗體的不斷出現(xiàn)，單克隆抗體藥物已成為制藥業(yè)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一，目前正在研究的生物技術(shù)藥物中有四分之一都是單克隆抗體藥物，期間又涌現(xiàn)出了各種單抗衍生物，包括抗體藥物偶聯(lián)物、小分子抗體、雙特異性抗體等。本文就單克隆抗體藥物的分類、制備、應(yīng)用和發(fā)展等進(jìn)行綜述。關(guān)鍵詞：?jiǎn)慰寺】贵w藥物；抗體技術(shù)；單抗衍生物

1975年分子生物學(xué)家G.J.F.克勒和C.米爾斯坦在自然雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建立雜交瘤技術(shù)，他們把可在體外培養(yǎng)和大量增殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與經(jīng)抗原免疫后的純系小鼠B細(xì)胞融合，成為雜交細(xì)胞系，既具有瘤細(xì)胞易于在體外無(wú)限增殖的特性，又具有抗體形成細(xì)胞的合成和分泌特異性抗體的特點(diǎn)。將這種雜交瘤作單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，可形成單細(xì)胞系，即單克隆。雜交瘤技術(shù)為規(guī)?；a(chǎn)特異性高、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)均一穩(wěn)定的單克隆抗體提空了有力的保障。單克隆抗體藥物的發(fā)展和現(xiàn)狀

1986年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第一個(gè)鼠源單克隆抗體藥物Muromonab-CD3上市，用于預(yù)防腎移植時(shí)急性器官排斥。單克隆抗體藥物的發(fā)展因人抗鼠抗體反應(yīng)在1988年到1993年間陷入低谷。之后隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，各種抗體人緣化技術(shù)迅速發(fā)展，單克隆抗體藥物經(jīng)歷了人鼠嵌合單抗、人源化單抗階段。隨后出現(xiàn)的噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)和轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，使全人源單抗的產(chǎn)生成為可能。過(guò)去的30年抗體工程的研究主要集中于減弱鼠源抗體的免疫原性和提高產(chǎn)生抗體的能力，如今全人源抗體已成為治療性單抗的主流，2002年第一個(gè)全人源抗體阿達(dá)木單抗上市。且隨著微生物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)進(jìn)步和表達(dá)水平的提高，使治療性單克隆抗體在臨床和商業(yè)上都取得了巨大的成功。盡管如此，單克隆抗體藥物的發(fā)展仍然存在許多挑戰(zhàn)。迄今為止，大多數(shù)FDA 批準(zhǔn)上市的單抗藥物都是未經(jīng)修飾的全長(zhǎng)抗體，這是相對(duì)分子質(zhì)量在150×103左右的大蛋白分子，這些抗體藥物在臨床應(yīng)用取得巨大成功的同時(shí)，本身的局限性也得到越來(lái)越多的關(guān)注[1]?，F(xiàn)如今，單抗藥物經(jīng)歷了市場(chǎng)和時(shí)間的考驗(yàn)，已經(jīng)成為生物醫(yī)藥的最重要組成部分，在疾病治療上具有廣闊的應(yīng)用前景，成功用于治療腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反應(yīng)等多種疾病。治療性單抗的安全性和有效性很大程度上由其作用的靶點(diǎn)決定，上市和在研的單抗藥物有些靶向相同的靶點(diǎn)，有些有自己獨(dú)特的作用靶點(diǎn)，新的作用靶點(diǎn)也在不斷地出現(xiàn)。隨著研究深入、技術(shù)進(jìn)步，單抗藥物呈現(xiàn)出旺盛的發(fā)展勢(shì)頭[2]。

隨著已上市品種的銷售額不斷增長(zhǎng)以及新適應(yīng)癥的批準(zhǔn)和新品種的上市，單克隆抗體藥物市場(chǎng)容量迅速攀升。1997-2007年是全球單抗產(chǎn)業(yè)增長(zhǎng)的爆發(fā)期，十年間CAGR高達(dá)58.6%。2008年-2015年，全球單抗產(chǎn)業(yè)增速放緩明顯，CAGR降至14.8%，但仍要顯著高于全球醫(yī)藥行業(yè)約5%的增速水平。1997年全球單抗藥物銷售額僅3.7億美元，2015年全球單抗藥物的銷售額已超過(guò)980億美元。1992-2015 年間，國(guó)外共批準(zhǔn)上市了61個(gè)原研抗體藥，其中后有6個(gè)退市。在現(xiàn)有上市的55個(gè)產(chǎn)品（49個(gè)單抗產(chǎn)品，6個(gè)具有抗體功能的受體-Fc融合蛋白）中，51個(gè)是由美國(guó)或歐盟首先批準(zhǔn)上市的，數(shù)量占比高達(dá) 92.7%，生產(chǎn)企業(yè)方面：羅氏、諾華等10家歐美企業(yè)共開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)了全球70%以上的抗體藥物，歐美國(guó)家在全球抗體產(chǎn)業(yè)中居于絕對(duì)主導(dǎo)地位。2015年全球最暢銷藥物TOP 10中有5個(gè)單抗，分別是阿達(dá)木單抗、英夫利昔單抗、利妥昔單抗、貝伐珠單抗和曲妥珠單抗，它們占據(jù)了單抗藥物的半壁江山，銷售額約為426.6億美元，約占2015年全球單克隆抗體藥物總銷售額的44%。根據(jù)預(yù)測(cè)，2016-2020 年，全球單抗產(chǎn)業(yè)仍將以9.84%的RAGR快速發(fā)展（同期全球藥品市場(chǎng)CAGR約為 5%），2020年市場(chǎng)規(guī)模有望突破1300億美元。

相比處于上升期的國(guó)外單抗產(chǎn)業(yè)，我國(guó)單抗產(chǎn)業(yè)仍處于初創(chuàng)期，單抗藥物仍以仿制為主，單抗藥物無(wú)論產(chǎn)品種類和銷售規(guī)模都遠(yuǎn)低于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，并且進(jìn)口單抗藥物占據(jù)了主要市場(chǎng)。2015年中國(guó)單抗藥物市場(chǎng)容量約為70多億元人民幣，約80%的市場(chǎng)被外資制藥企業(yè)占據(jù)。在單抗藥物領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)制藥企業(yè)面臨市場(chǎng)快速增長(zhǎng)和進(jìn)口替代的雙重機(jī)遇。單克隆抗體研究已被列入863計(jì)劃和國(guó)家重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目。十三五期間，生物產(chǎn)業(yè)將是國(guó)家重點(diǎn)支持的戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)。單抗藥物的研究、開(kāi)發(fā)和市場(chǎng)應(yīng)用必將吸引一大批制藥企業(yè)的參與和布局。目前全國(guó)有100多家企業(yè)在做單抗，除了中信國(guó)健、百泰生物、海正藥業(yè)等一些老牌企業(yè)之外，近幾年還涌現(xiàn)出了很多新興企業(yè)，包括麗珠單抗、信達(dá)生物等。在2016三生制藥集團(tuán)媒體開(kāi)放日活動(dòng)上，三生制藥集團(tuán)董事長(zhǎng)婁競(jìng)博士表示三生制藥集團(tuán)的3萬(wàn)升生產(chǎn)線建成后將成為中國(guó)規(guī)模最大的單克隆抗體生產(chǎn)線，也是從細(xì)胞系、培養(yǎng)基、原液到制劑（多種劑型和規(guī)格）的全球最完整生產(chǎn)線之一。單克隆抗體藥物分類

根據(jù)來(lái)源的不同.單克隆抗體大體可分為4類,即鼠源化單克隆抗體、人鼠嵌

[3]合體單克隆抗體、人源化單克隆抗體、全人源化單克隆抗體，這也是單克隆抗體發(fā)展的四個(gè)重要的階段。2.1 鼠源化單克隆抗體

人用鼠源單抗的生產(chǎn)方法一般分為體內(nèi)法和體外法2種。2.1.1 體內(nèi)法

體內(nèi)法即腹水法。盡管腹水中抗體濃度比較高(2-10mg/ml),但由于所用的BALB/c小鼠必須達(dá)到SPF級(jí),繁殖、飼養(yǎng)BALB/c小鼠及生產(chǎn)腹水、純化抗體的廠房必須符合GMP要求,WHO及我國(guó)對(duì)體內(nèi)法生產(chǎn)的人用鼠源單克隆抗體的質(zhì)檢項(xiàng)目繁多,要求嚴(yán)格,因此限制了體內(nèi)法在人用鼠源單抗生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用。2.1.2體外法

體外法(雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)法)的產(chǎn)品純度高,可以避免鼠類病毒的污染,簡(jiǎn)化質(zhì)檢項(xiàng)目,操作具有可控制性,適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn),因此是人用鼠源單抗生產(chǎn)方式的主要發(fā)展方向[4]。體外法的制備流程也基本相同，即從超免疫的供體中即抗原免疫的小鼠獲取脾細(xì)胞，選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細(xì)胞，待細(xì)胞融合后，對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行克隆，體外培養(yǎng)出能分泌單抗的克隆細(xì)胞。

但鼠源單抗在臨床應(yīng)用方面存在著很大的弊端，主要是鼠源單抗與NK等免疫細(xì)胞表面Fc段受體親和力弱，產(chǎn)生的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（ADCC）較弱，而且它與補(bǔ)體成分結(jié)合能力低，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力較弱，并且鼠源性抗體分子質(zhì)量較大,在人血循環(huán)中的半衰期短，在體內(nèi)穿透血管的能力較差;它發(fā)揮ADCC作用的時(shí)間較短；其次鼠單克隆抗體還具有免疫原性，易引起宿主過(guò)敏反應(yīng)[5]，產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMAs)，將其清除出體外，因此限制了它的應(yīng)用。2.2 人鼠嵌合單克隆抗體

抗體分子由兩個(gè)相同的輕鏈和兩個(gè)相同的重鏈組成，具有典型的功能區(qū)結(jié)構(gòu)，其與抗原的結(jié)合完全取決于氨基端的可變區(qū)。恒定區(qū)與抗體抗原結(jié)合無(wú)關(guān)，并且恒定區(qū)是抗體分子免疫原性的主要部位，因此可通過(guò)用人的恒定區(qū)取代鼠單抗的恒定區(qū)進(jìn)行人源化，消除其大部分異源性，并能保留親本鼠單抗結(jié)合抗原的特異性和親和力，這種方法得益于DNA重組技術(shù)的發(fā)展。1984年首次應(yīng)用上述方法重組制備了抗半抗原磷酸膽堿的全分子人鼠嵌合抗體[6]。

嵌合抗體可將同一個(gè)可變區(qū)與不同類別的恒定區(qū)鏈接在一起，比較在相同特異性情況下不同類別的功能。其制備過(guò)程主要包括了可變區(qū)的克隆，表達(dá)載體的構(gòu)建及嵌合抗體的表達(dá)。可變區(qū)基因的克隆在早期主要從雜交瘤細(xì)胞的基因組文庫(kù)中克隆出來(lái)帶有完整上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的輕重鏈可變基因DNA片段，組裝到含有人恒定區(qū)的表達(dá)載體中。PCR方法的建立和發(fā)展為抗體可變區(qū)基因的克隆提供了簡(jiǎn)便有效的方法。接著將控制小鼠抗體重鏈和輕鏈中可變區(qū)的基因片段與人抗體重鏈及輕鏈的不變區(qū)的基因片段在體外鏈接形成重組基因，然后導(dǎo)入真核細(xì)胞的某種表達(dá)質(zhì)粒中，再將這種含有重組基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物骨髓瘤細(xì)胞，篩選能分泌完整抗體的轉(zhuǎn)化子。但嵌合抗體仍保留著30%左右的鼠源序列，并且其常達(dá)不到預(yù)期的效果。

嵌合抗體目前主要有3種應(yīng)用形式：嵌合免疫球蛋白G、嵌合Fab和嵌合,F（ab’）2。嵌合免疫球蛋白G因含有人抗體的Fc段，能介導(dǎo)補(bǔ)體及細(xì)胞對(duì)靶抗原的殺傷和吞噬作用，但因鼠源性成分較多，免疫原性大且組織穿透力差[7]；嵌合 Fab 和嵌合F（ab’）2抗體分子小、穿透力強(qiáng)，可充當(dāng)小分子載體用于放射免疫顯像及放射免疫治療。2.3 人源化單克隆抗體

由于鼠源抗體的可變區(qū)仍殘留一定的免疫原性人緣化單克隆抗體又較嵌合抗體有所改進(jìn)。由于鼠源性抗體可變區(qū)中的骨架區(qū)仍殘留一定的免疫原性，為了最大限度地減少鼠源成分，用人骨架區(qū)替代鼠骨架區(qū)可形成更為完全的人源化抗體，即在此抗體中除了CDR是鼠源以外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)。這一類型的抗體被稱為CDR移植抗體或改型抗體，包括完全CDR移植抗體、部分CDR移植抗體和特異決定區(qū)（SDR）移植抗體[8]。2.3.1 完全CDR移植抗體

完全CDR移植抗體由于鼠源性抗體VR中的骨架區(qū)仍殘留一定的免疫原性，為最大限度的減少鼠源成分，用人FR替代鼠FR可形成更為完全的人源化抗體，即在此抗體中除了３個(gè)CDR是鼠源以外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)，這一類型的抗體稱為CDR移植抗體或改型抗體。應(yīng)用這一策略，將鼠源McAb的CDR區(qū)完全移植，得到了抗磷脂酰肌醇（蛋白）聚糖嵌合抗體。但隨后多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，簡(jiǎn)單的CDR移植往往明顯降低抗原－抗體反應(yīng)的親和力，甚至喪失與抗原結(jié)合的能力。其原因在于FR不僅作為骨架對(duì)CDR起到支持作用，F(xiàn)R中的某些非CDR區(qū)補(bǔ)充調(diào)控殘基還為CDR的回折構(gòu)象提供必要的支持，其形狀和側(cè)鏈大小協(xié)同決定CDR的基本結(jié)構(gòu)，影響CDR與抗原結(jié)合的特異性和親和力[9-10]。2.3.2 部分CDR移植抗體

在簡(jiǎn)單CDR移植的基礎(chǔ)上又相繼發(fā)展了部分CDR移植技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)輕鏈的 CDR1、CDR2和重鏈的CDR3對(duì)保證抗體與抗原特異性結(jié)合至關(guān)重要，其余三個(gè)CDR的作用則較低[11]。因此只將抗體結(jié)合抗原必須的CDR移植到人抗體的FR骨架上即能獲得對(duì)人免疫原性更小的嵌合抗體，這類抗體稱為部分CDR移植抗體。2.3.3 特異決定區(qū)移植抗體

正如并非所有的CDR在抗原抗體反應(yīng)中具有同樣的重要作用，X射線晶體衍射實(shí)驗(yàn)提示具體到一個(gè)CDR中,不是所有的蛋白分子都參與抗原的特異性識(shí)別。執(zhí)行抗原識(shí)別的CDR中的一些特定區(qū)域稱為SDR。由此又產(chǎn)生了SDR移植抗體。該抗體是將McAb中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR等少數(shù)殘基移植到人抗體的相關(guān)部位，從而進(jìn)一步提高抗體的人源化水平。根據(jù)目前的研究，抗體輕鏈的SDR多位于27d、34、50、55、89、96位殘基，而重鏈的SDR多位于31、35b、50、58、95、101位殘基[12]?；谏鲜鰞煞N策略，部分CDR移植、SDR移植的構(gòu)建方法主要有：（1）模板替換，使用與鼠對(duì)應(yīng)部分有較大同源性的人FR替換鼠FR；（2）表面重塑，對(duì)鼠 CDR和FR表面殘基進(jìn)行鑲飾或重塑，使其具有類似于人抗體CDR的輪廓或人FR的形式；（3）補(bǔ)償變換，對(duì)起關(guān)鍵作用的殘基進(jìn)行改變以補(bǔ)償完全的CDR移植；（4）定位保留，人源化McAb以人FR保守序列為模板，但保留了鼠源McAb VR中參與抗原結(jié)合的氨基酸殘基，包括CDR和FR中的一些關(guān)鍵殘基。

2.4 全人源單克隆抗體

由于免疫原性的存在，人們一直在努力制備全人源化的單克隆抗體，目前主要有抗體庫(kù)技術(shù)和人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)兩種。2.4.1 抗體庫(kù)技術(shù)

抗體庫(kù)技術(shù)的主導(dǎo)思想是將某種動(dòng)物的所有抗體可變區(qū)基因克隆在質(zhì)?；蚴删w中表達(dá)，利用不同的抗原篩選出攜帶特異抗體基因的克隆，從而獲得相應(yīng)的特異性抗體?？贵w庫(kù)技術(shù)不僅可以模擬動(dòng)物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的過(guò)程，還具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，令雜交瘤技術(shù)難以相比。抗體庫(kù)技術(shù)無(wú)需免疫，從理論上講，106-108的庫(kù)容就可能包容所有的抗體。利用抗原即可直接從非免疫動(dòng)物抗體庫(kù)中篩選出特異性抗體，?并能篩選到針對(duì)該物種自身抗原的抗體。從人的抗體庫(kù)中可以得到完全是人源的McAb，?克服了難以用雜交瘤技術(shù)獲得人源McAb的障礙。此外，由于細(xì)菌細(xì)胞增殖快，培養(yǎng)成本低廉，利于大量制備高純度抗體。抗體庫(kù)技術(shù)主要包括了噬菌體抗體庫(kù)和核糖體展示技術(shù)。

噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)：從免疫或未被免疫的B細(xì)胞中分離抗體可變區(qū)基因;PCR 擴(kuò)增抗體全套基因片段(如VH、VL)，將體外擴(kuò)增的VH、VL基因片段隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體,形成組合文庫(kù);將基因組合文庫(kù)插入噬菌體編碼膜蛋白的基因Ⅲ(g3)或基因Ⅷ(g8)的先導(dǎo)系列的緊靠下游，使外源基因表達(dá)的多肽以融合蛋白的形式展示在外殼蛋白gpⅢ或gpⅧ的N端。用固相化抗原經(jīng)“親和結(jié)合—洗脫—擴(kuò)增”數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡(jiǎn)捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫(kù)。

核糖體展示技術(shù)：將基因型和表型聯(lián)系在一起，編碼蛋白的DNA在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與翻譯，由于對(duì)DNA進(jìn)行了特殊的加工與修飾，如去掉3′末端終止密碼子，核糖體翻譯到mRNA末端時(shí)，由于缺乏終止密碼子，停留在mRNA 的3′末端不脫離，從而形成蛋白質(zhì)-核糖-2mRNA三聚體，將目標(biāo)蛋白特異性的配基固相化，如：固定在ELISA 微孔或磁珠表面，含有目標(biāo)蛋白的核糖體三聚體就可在ELISA 板孔中或磁珠上被篩選出，對(duì)篩選分離得到的復(fù)合物進(jìn)行分解，釋放出的mRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶鏈聚合反應(yīng)(RT-PCR)，PCR產(chǎn)物進(jìn)入下一輪循環(huán)，經(jīng)過(guò)多次循環(huán)，最終可使目標(biāo)蛋白和其編碼的基因序列得到富集和分離。2.4.2 人源性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)

適宜基因工程改造的小鼠成為親和力成熟全人源抗體產(chǎn)生的強(qiáng)勁引擎，其體內(nèi)免疫系統(tǒng)自然選擇與成熟機(jī)制促使產(chǎn)生的抗體具備成為藥物的天然優(yōu)勢(shì)，包括高效與特異性、低免疫原性與可工藝性等。產(chǎn)生的系列抗體包括針對(duì)全新靶點(diǎn)的全新作用機(jī)制的抗體藥物，也包括針對(duì)經(jīng)典靶點(diǎn)的升級(jí)抗體藥物[13]。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，目的是用人的抗體基因轉(zhuǎn)入小鼠相應(yīng)基因，產(chǎn)生分泌人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。在轉(zhuǎn)基因小鼠的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生分泌抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。在目前FDA批準(zhǔn)上市的全人源單抗中，技術(shù)來(lái)源除了噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)外，有三種轉(zhuǎn)基因小鼠平臺(tái)技術(shù)，即HuMAb-Mouse、XcnoMouse和VelocImmuneTM。

HuMAb-Mouse：HUMab轉(zhuǎn)基因小鼠整合入人抗體基因450kb(200kbIgH；230kb Igk，約占人類IgGκ的50％)，免疫該小鼠可以產(chǎn)生0.1-5nmol／L的抗體。雖然該小鼠轉(zhuǎn)入的人抗體基因組還是比較小，但仍獲得巨大成功。

XcnoMouse:XenoMouse轉(zhuǎn)基因小鼠也是目前最為成功、應(yīng)用最廣的轉(zhuǎn)基因小鼠之一。該轉(zhuǎn)基因小鼠整合入大部分人抗體VH和Vκ基因，大小分別為1020kb和800kb。重鏈包含34個(gè)V區(qū)基因、所有的重鏈D區(qū)和J區(qū)，以及Cγ

2、Cμ和Cδ基因，共66個(gè)功能基因；輕鏈包含18個(gè)V區(qū)基因、所有的5個(gè)J區(qū)和Cκ基因，共32個(gè)功能基因。該轉(zhuǎn)基因小鼠XMG2-KL可以產(chǎn)生全人IgM和IgG2，親和力可以達(dá)0.1～1nmol／L。

VelocImmuneTM：不同于以往的轉(zhuǎn)基因小鼠抗體篩選平臺(tái)，VelocImmuneTM產(chǎn)生人可變區(qū)與鼠恒定區(qū)組成的反向嵌合抗體。小鼠Ig H恒定區(qū)通過(guò)B細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域(如Igα與Igβ)傳遞天然的免疫信號(hào)，并通過(guò)與其他類型免疫細(xì)胞上的Fc受體的結(jié)合促使小鼠產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，并提供半衰期長(zhǎng)且親和力高的抗體。該類轉(zhuǎn)基因小鼠免疫后產(chǎn)生的抗體可變區(qū)編碼序列通過(guò)基因克隆技術(shù)與人源恒定區(qū)編碼序列進(jìn)行構(gòu)建，反向嵌合抗體即可轉(zhuǎn)變?yōu)檫m宜藥用的全人源抗體。

另外轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)還有TC MouseTM、KM MouseTM和Five-feature mouse，但它們都還未經(jīng)過(guò)市場(chǎng)的檢驗(yàn)。單克隆抗體衍生物

為了更好地發(fā)揮抗體藥物的治療效果，人們構(gòu)建各種形式的工程抗體來(lái)改善它們的特性和效能。例如，制備抗體和藥物的偶聯(lián)物，增加對(duì)靶細(xì)胞的殺傷；改變抗體分子大小，構(gòu)建小分子抗體，使之有較好的腫瘤/血液比；制備雙特異性抗體，同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不同的抗原表位；增加抗體的親和力；改進(jìn)抗體ADCC或CDC效應(yīng)；改變抗體的藥代動(dòng)力學(xué)，使半衰期延長(zhǎng)。3.1 抗體藥物偶聯(lián)物

抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)是通過(guò)一個(gè)化學(xué)鏈接將具有生物活性的小分子藥物連接到單抗上，單抗作為載體將小分子藥物靶向運(yùn)輸?shù)侥繕?biāo)細(xì)胞中[14]。單抗和小分子本身都是藥物，都可以單獨(dú)用來(lái)治療疾病，ADC的設(shè)計(jì)思路是利用兩者的長(zhǎng)處來(lái)彌補(bǔ)可能的不足或者缺陷。單抗具有很高的專一性，但是通常藥效不強(qiáng)，往

往需要與小分子藥物治療并用；小分子藥物活性強(qiáng)，缺點(diǎn)是專一性較差，從而可能存在毒性，受副作用和劑量的影響較大；有些小分子藥物，特別是肽類藥物在血液中的半衰期過(guò)短，通過(guò)和單抗結(jié)合，可以改善這方面的缺陷。ADC 將兩者結(jié)合，在到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞時(shí)將小分子藥物釋放出來(lái)，這不僅能靈敏地區(qū)分出健康和疾病組織，限制與非目標(biāo)細(xì)胞的作用，降低毒性，還能夠明顯改善藥代動(dòng)力學(xué)和向目標(biāo)組織的傳遞[15]。

構(gòu)建抗體偶聯(lián)物主要有三個(gè)步驟：選擇合適的抗體、選擇合適的藥物和選擇合適的鏈接方式。這樣構(gòu)建的抗體偶聯(lián)物需要具有以下的特性：（1）穩(wěn)定性，鏈接需要在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定，避免過(guò)早發(fā)生裂解，造成對(duì)健康組織器官損傷；（2）分特異性免疫反應(yīng)，即藥物結(jié)合到單抗不能破壞單抗本身的特異結(jié)合能力；（3）內(nèi)化和藥物的釋放，一般ADC都是通過(guò)單抗與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合后再內(nèi)化，將小分子藥物在細(xì)胞內(nèi)釋放，因此需要控制藥物的數(shù)量，以發(fā)揮最大的效果；（4）藥物作用，釋放出的藥物需要在很低的濃度（皮摩爾級(jí)）發(fā)揮效果，因此需考慮藥物的活性。3.2 小分子抗體

小分子抗體具有分子量小、穿透性強(qiáng)、抗原性低、可在原核系統(tǒng)表達(dá)及易于基因工程操作等優(yōu)點(diǎn)。常見(jiàn)的單價(jià)小分子抗體有Fab段、ScFv段、FV段、二硫鍵穩(wěn)定的Fv段、單域抗體和超變區(qū)等；多價(jià)小分子有雙鏈抗體、三鏈抗體和微型抗體等；特殊類型的小分子抗體有雙特異抗體和催化抗體等[16]。當(dāng)前，常用于生產(chǎn)小分子抗體片段的表達(dá)系統(tǒng)通常有大腸桿菌（E．coli）表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)四種[17]。小分子抗體的優(yōu)勢(shì)在于不需要糖基化修飾，可以在原核細(xì)胞中表達(dá)，操作方便。因此這四種表達(dá)系統(tǒng)的成本是依次增加的，但翻譯后的加工精確性和準(zhǔn)確度卻是依次遞減的。3.2.1 Fab抗體

Fab抗體由一條完整的輕鏈和重鏈Fd段通過(guò)一個(gè)鏈間二硫鍵連接組成一個(gè)異二聚體，大小為完整抗體的三分之一，但其仍保持了親本抗體的fv段結(jié)構(gòu)和與抗原結(jié)合的特異性與活性的能力。并且分子結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定具有穿透力強(qiáng)、免疫原性低，可與多種藥物及放射性同位素偶聯(lián)，可與多種毒素和酶結(jié)合，用作藥物的導(dǎo)向治療載體和顯影等特點(diǎn)。3.2.2 單鏈抗體

在DNA水平上用一段 適當(dāng)?shù)墓丫酆塑账嶙鳛檫B接肽（linker）將VH和VL連在一起，使之表達(dá)成為一條單一肽鏈，即為單鏈抗體（ScFv）。單鏈抗體大小僅為全抗體的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原結(jié)合部位的最小片段,但有時(shí)構(gòu)建的ScFv其親和力明顯低于親本抗體，并常有聚集的傾向。3.2.3 單域抗體

由抗體輕、重鏈可變區(qū)基因（VH、VL）間通過(guò)一段連接肽基因拼接后表達(dá)形成的重組蛋白，大小為全抗體的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原結(jié)合部位的最小片段。其分子量更小，具有一定的可溶性和穩(wěn)定性特點(diǎn)，相較于其它的抗體分子，單域抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞。3.2.4 雙特異性抗體

雙特異性抗體是含有2種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人工抗體，一個(gè)位點(diǎn)可與靶細(xì)胞表面抗原結(jié)合，另一個(gè)位點(diǎn)則可與載荷物如毒素、酶、細(xì)胞因子、放射毒素等耦合，能在靶細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，其靶向性的特點(diǎn)可以減少載荷物的毒副作用。單克隆抗體的應(yīng)用

隨著單克隆抗體的完善與推廣，單克隆抗體在農(nóng)業(yè)、食品、治療疾病等方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，并取得了良好的效果。4.1 農(nóng)業(yè)和食品 由于單克隆抗體的高特異性和高靈敏性，單克隆抗體農(nóng)業(yè)和食品的應(yīng)用主要集中在了檢測(cè)方面。在食品中對(duì)動(dòng)物性食品中β興奮劑、抗生素和激素等的檢測(cè)，植物性食品中農(nóng)藥殘留物的檢測(cè)，還可以檢測(cè)儲(chǔ)存食品中的微生物含量。在農(nóng)業(yè)中，單克隆抗體可以對(duì)牲畜的細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)的患病情況進(jìn)行篩選。在植物中，除了對(duì)病蟲(chóng)害的診斷應(yīng)用以外，單克隆抗體還在藥用植物活性成分定性定量分析、成分分離、培植育種中得到了廣泛的應(yīng)用。4.2 醫(yī)學(xué)

單克隆抗體主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)方面，不僅為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)提供了有價(jià)值的載體，更在臨床醫(yī)學(xué)得到了廣泛的應(yīng)用，如治療腫瘤、移植排斥、自身免疫病、心血管疾病、病毒感染等。4.2.1 治療腫瘤

近20年來(lái)，抗腫瘤抗體藥物已成為治療癌癥的重要方法，是治療癌癥最成功的的策略之一。據(jù)PharmaprojectsV5數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，目前上市與臨床在研的約500種抗體藥物中，約有50%用于腫瘤治療，臨床在研的抗腫瘤抗體藥物共約20多種，針對(duì)70多個(gè)靶點(diǎn)[18]。目前，銷量排名前五的抗體類藥物，其中有三個(gè)都是用于治療腫瘤，其中貝伐珠單抗用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥，曲妥珠單抗通過(guò)附著在Her2上來(lái)阻止人體表皮生長(zhǎng)因子在Her2上的附著，從而阻斷癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，利妥昔適用于復(fù)發(fā)或耐藥的濾泡性中央型淋巴瘤的治療。截止2015年底，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)了21個(gè)抗腫瘤類藥物，2016年新批準(zhǔn)了用于膀胱癌靶向治療的Tecentriq和治療軟組織肉瘤的Lartruvo。近年來(lái)，利用單克隆抗體靶向治療腫瘤已經(jīng)成為全球靶向治療藥物的主流，免疫檢驗(yàn)點(diǎn)靶向抗體藥物的研發(fā)更是極大地推動(dòng)腫瘤免疫治療，是目前腫瘤治療的最熱點(diǎn)所在[19]。同時(shí)抗體治療聯(lián)合其他治療策略也成為了必然的發(fā)展趨勢(shì)，聯(lián)用型治療適用性更廣，臨床效果更持久，不良反應(yīng)更少，病灶去除更徹底，有效防止腫瘤的復(fù)發(fā)，顯著提高了存活率。4.2.2 器官移植

移植排斥是器官移植失敗的重要因素之一，而單克隆抗體可以有效地改善移植排斥反應(yīng)，其應(yīng)用也在不斷增長(zhǎng)，目前的研究和應(yīng)用主要集中于清除不同種類的白細(xì)胞分化抗原（CD），例如采用抗CD154單克隆抗體阻斷免疫細(xì)胞活化信號(hào)傳導(dǎo)途徑,主要應(yīng)用于胰腺、心臟、皮膚等多個(gè)器官的移植，證明抗CD154單抗能有效地抑制移植排斥反應(yīng)，延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間[20]。4.2.3 自身免疫病

自身免疫性疾病的治療通常采用的糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等,雖然有一定療效,但長(zhǎng)期使用都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng),而且都只能減緩病情的發(fā)展,并不能根治疾病[21]。而單克隆抗體可以有效地改善和治療自身免疫病，主要有以下的三種作用機(jī)制。（1）封閉細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的單克隆抗體藥物，其中最成功的便是TNF抑制劑，包括伊納西普、英孚利昔、阿達(dá)木、賽妥珠和戈利木，適用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、青少年關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、結(jié)腸炎、脊柱炎和銀屑病等；（2）受體阻滯和受體調(diào)節(jié)的單克隆抗體藥物，即單抗結(jié)合受體，阻斷配體和受體相互作用，下調(diào)細(xì)胞表面目標(biāo)受體的表達(dá)，這些抗體包括治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的IL-6受體抗體tocilizumab,重組非糖基化的人IL-1受體拮抗劑阿那白滯素(anakin-ra)等；（3）耗竭異常免疫細(xì)胞及介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)的單克隆抗體藥物，通過(guò)結(jié)合細(xì)胞表面抗原,如CD20,CD22、CD80和CD52,通過(guò)FcγR介導(dǎo)的ADCC作用和CDC作用殺傷異常的淋巴細(xì)胞，有治療1型糖尿病的otelixizumab、治療多發(fā)性硬化癥的阿倫和治療慢性淋巴細(xì)胞白血病ofatumumab等一系列單抗藥物。4.2.4 抗感染

細(xì)菌和病毒等病原體感染機(jī)體的機(jī)制復(fù)雜,由于單克隆抗體只能識(shí)別單一抗原表位,限制了抗體藥物的抗感染效果。抗感染領(lǐng)域的抗體藥物發(fā)展緩慢，目前僅有抗呼吸道合胞病毒的帕利珠單抗以及抗炭疽桿菌的瑞西巴庫(kù)單抗兩個(gè)品種上市[22]。目前抗感染的單克隆抗體的研究熱點(diǎn)集中于埃博拉病毒抗體、抗呼吸道合胞病毒抗體、抗炭疽桿菌抗體等，2014年西非大規(guī)模埃博拉病毒疫情爆發(fā)后，實(shí)驗(yàn)性抗體藥物ZMapp第一個(gè)被用于臨床治療，中國(guó)研制的抗體藥物MIL77也成功用于治療，抗體藥物再次顯示了在抗感染領(lǐng)域的應(yīng)用前景。單克隆抗體藥物可能存在的問(wèn)題

單克隆抗體導(dǎo)致的不良發(fā)應(yīng)主要有皮膚及附件損害、全身反應(yīng)、心血管損害等，具體表現(xiàn)為皮疹、瘙癢、寒戰(zhàn)、發(fā)熱、心慌、心跳加快等，嚴(yán)重可導(dǎo)致急性呼吸衰竭、多器官功能衰竭、嚴(yán)重出血、腦梗死、過(guò)敏性休克等。單克隆抗體可能的不良反應(yīng)也許與以下3個(gè)機(jī)理之一有關(guān):所用mAb的異源性,特別是當(dāng)給予mAb而無(wú)相關(guān)的免疫抑制劑時(shí)；生理功能的抑制以及mAb的特異性；mAb與靶點(diǎn)結(jié)合后炎癥細(xì)胞或介導(dǎo)物的活性[23]。從發(fā)生人群來(lái)看，患者的年齡集中在兒童和老人，這可能是由于兒童的器官/系統(tǒng)發(fā)育不完善，使得個(gè)體對(duì)藥物的吸收、分布、代謝相對(duì)緩慢，藥物在體內(nèi)滯留的時(shí)間較長(zhǎng)；而老人往往患有心血管疾病、高血壓、糖尿病等，這些可能都會(huì)引起不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，臨床中使用單克隆抗體藥物是應(yīng)注意：（1）重視患者人群，注意防范兒童或老年患者不良反應(yīng)的發(fā)生。（2）注意首次用藥，初次靜脈滴注單克隆抗體時(shí)，應(yīng)控制滴速。（3）詢問(wèn)患者藥物過(guò)敏史和既往病史。（4）使用前建議預(yù)防使用抗過(guò)敏藥物。（5）對(duì)具有肝炎病史的患者，注意對(duì)肝功能和病毒的檢測(cè)，避免肝病復(fù)發(fā)。（6）按照說(shuō)明書使用單克隆抗體藥物，避免超說(shuō)明書用藥。（7）單克隆抗體制劑應(yīng)保存在2-8℃的環(huán)境中，避免凍結(jié)。（8）輸注藥液的過(guò)程中，加強(qiáng)巡視，嚴(yán)密觀察藥物引起的不良反應(yīng)，及時(shí)給予相應(yīng)的處理，保證患者的用藥安全[24]。展望

單克隆抗體藥物這些特征使它成為了生物醫(yī)藥領(lǐng)域一顆耀眼的明珠。過(guò)去的30年中，隨著研究的不斷突破，單克隆抗體從鼠源發(fā)展到人緣，提高了單克隆抗體的藥效和安全性。雖然單抗藥物還存在一些尚未解決的問(wèn)題，最突出的問(wèn)題是如何降低單抗的免疫原性，單抗的異源性所引起的抗體反應(yīng)，不但降低了單抗的效價(jià)，而且會(huì)給患者帶來(lái)嚴(yán)重的后果。但是我們可以相信隨著研究的不斷深入；生產(chǎn)工藝的不斷成熟；檢測(cè)技術(shù)不斷的完善，現(xiàn)有的問(wèn)題會(huì)逐一地解決，并且必將出現(xiàn)更高靶向性和藥效更強(qiáng)的單克隆抗體藥物，單克隆抗體藥物將在治愈疾病中顯示出它獨(dú)特的效果，為患者帶來(lái)更大的希望。

未來(lái)伴隨著生物技術(shù)制藥的發(fā)展，單克隆抗體將在其中占有更重要的地位，并逐漸成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展的主要方向。目前單克隆抗體藥物快速擴(kuò)大的市場(chǎng)已經(jīng)成為制藥業(yè)爭(zhēng)奪的焦點(diǎn)，為制藥公司提供了發(fā)展的契機(jī)。我國(guó)企業(yè)雖然進(jìn)入該領(lǐng)域較晚，但在仿制單克隆抗體藥物的規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)上，積極探索、開(kāi)發(fā)和創(chuàng)新，相信很快會(huì)在國(guó)際市場(chǎng)上占有一席之地。

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第二篇：?jiǎn)慰寺】贵w藥物綜述

單克隆抗體藥物綜述

摘 要: 通過(guò)淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)或基因工程技術(shù)制備單克隆抗體藥物 ,已經(jīng)成為生物制藥領(lǐng)域的一個(gè)重要方面 ,由于單克隆抗體藥物專一性強(qiáng)、療效顯著 ,因此成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)藥物之一。此文就單抗藥物的分類、應(yīng)用進(jìn)行了綜述 ,并對(duì)其應(yīng)用前景及存在的不足作了概述。

關(guān)鍵詞:單克隆抗體 抗體藥物 靶向 聯(lián)用

自 1975 年Koeh ler 和M ilstein 首先報(bào)道利用小鼠雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體以來(lái), 經(jīng)過(guò)近30 年的發(fā)展, 單抗技術(shù)在生命科學(xué)研究及醫(yī)學(xué)實(shí)踐方面作出了杰出的貢獻(xiàn), 已經(jīng)成為了現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的支柱之一。

然而, 盡管單抗推動(dòng)了生物診斷技術(shù)的革命, 但是在將單抗應(yīng)用于人體疾病的治療方面, 卻在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)遲遲沒(méi)有進(jìn)展。早期的臨床試驗(yàn)結(jié)果都不盡人意, 這是因?yàn)槭笤磫慰箲?yīng)用于人體有許多限制].現(xiàn)今上市的單抗藥物, 治療的領(lǐng)域主要集中在腫瘤、自身免疫疾病、器官移植排斥及病毒感染等領(lǐng)域。由于單抗具有明確的作用位點(diǎn), 與靶位點(diǎn)親和力高, 而且通過(guò)改造的抗體其免疫原性大大減弱, 這些因素使得單抗在臨床治療中具有特異性強(qiáng)、見(jiàn)效快、副作用較低等優(yōu)點(diǎn), 因而單抗治療有著廣闊的前景。目前, FDA 批準(zhǔn)上市的 17 個(gè)單抗藥物中即有 8 個(gè)是用于治療淋巴細(xì)胞腫瘤、乳腺癌及結(jié)直腸癌等, 而在開(kāi)發(fā)階段的單抗也有一半以上是與治療各種癌癥相關(guān)。可以預(yù)見(jiàn), 在未來(lái)幾年來(lái)將有更多的治療性單抗藥物上市, 其市場(chǎng)份額將進(jìn)一步擴(kuò)大。

目前, 單抗類藥物的市場(chǎng)銷售逐年提升的年均增長(zhǎng)幅度在20%以上, 表現(xiàn)強(qiáng)勁。用于治療非霍奇金淋巴瘤的單抗藥物R ituxan 已成為世界第一的抗腫瘤藥物, 2003 年銷售為 14.89億美元, 2002 年為 11.63 億美元, 在 2002 年全球最暢銷前 50位商標(biāo)名處方藥中排名 43 位。用于治療關(guān)節(jié)炎的單抗藥物Rem icade, 2002 年銷售額為 12.97 億美元, 當(dāng)年全球藥物銷售排名第 37 位。2000 年世界單抗藥物的銷售額為 22.05 億美元, 據(jù)F ro st&Sullivan 預(yù)測(cè), 到 2003 年銷售額將達(dá)到 47 億美元。

下面就單克隆抗體藥物的研究進(jìn)展作一綜述。

1單克隆抗體藥物的分類

單抗藥物一般分為:治療疾病(尤其是腫瘤)的單抗藥劑、抗腫瘤單抗偶聯(lián)物、治療其他疾病的單抗。單抗藥劑針對(duì)的靶點(diǎn)通常為細(xì)胞表面的疾病相關(guān)抗原或特定的受體。如:最早被美國(guó) FDA批準(zhǔn)用于治療腫瘤的單抗藥物利妥昔單抗;抗腫瘤單抗偶聯(lián)物 ,或稱免疫偶聯(lián)物(Immunoconjugate), 由單抗與有治療作用的物質(zhì)(如:放射性核素、毒素和藥物等)兩部分構(gòu)成 ,其中包括放射免疫偶聯(lián)物、免疫毒素、化學(xué)免疫偶聯(lián)物 ,此外還有酶結(jié)合單抗偶聯(lián)物、光敏劑結(jié)合單抗偶聯(lián)物等。

2作為腫瘤治療藥劑的單克隆抗體藥物

表1概括了近年來(lái)美國(guó) FDA 批準(zhǔn)上市的 5 個(gè)治療腫瘤的單克隆抗體藥物的基本情況 ,下面具體加以介紹。

2.1利妥昔單抗 在自身免疫性疾病形成過(guò)程中 ,B 細(xì)胞起重要作用。CD20是前B細(xì)胞向成熟淋巴細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)的表面抗原 ,參與調(diào)節(jié)B細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。利妥昔單抗(美羅華)是一種針對(duì) CD20抗原的人鼠嵌合型單克隆抗體 ,是第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)用于臨床治療的單抗。進(jìn)入人體后可與 CD20 特異性結(jié)合導(dǎo)致 B 細(xì)胞溶解 ,從而抑制 B 細(xì)胞增殖 ,誘導(dǎo)成熟 B細(xì)胞凋亡 ,但不影響原始B細(xì)胞。它能通過(guò)介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)作用和抗體與CD20分子結(jié)合引起的直接效應(yīng) ,包括抑制細(xì)胞生長(zhǎng) ,改變細(xì)胞周期以及凋亡等方式殺死淋巴瘤細(xì)胞[1 ]。

由于利妥昔單抗藥物可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性 ,所以利妥昔單抗藥物的優(yōu)勢(shì)就在于與其他治療藥物及治療方式配合使用。臨床研究表明美羅華單藥或聯(lián)合化療治療腫瘤具有良好的療效和安全性 ,但還是存在一定的毒副作用。夏忠軍等[2 ]進(jìn)行的臨床研究:34例確診惰性淋巴瘤的患者接受含利妥昔的方案化療 ,結(jié)果總有效率為 92.3 % ,完全緩解率為60.0 %。主要不良反應(yīng)為骨髓抑制 ,其它不良反應(yīng)包括惡心嘔吐、輕度脫發(fā)和肝功能受損等。張曉艷等[3 ]對(duì) 4例 CD20陽(yáng)性非霍奇金淋巴瘤(NHL)病人進(jìn)行了5次利妥昔單抗聯(lián)合自體外周血干細(xì)胞移植(APBSCT)的治療研究 ,結(jié)果顯示所有病人均對(duì)利妥昔單抗耐受良好 ,植入后在 8～11 d內(nèi)達(dá)造血重建 ,表明利妥昔單抗聯(lián)合APBSCT治療 CD20陽(yáng)性NHL 是一種耐受及效果良好的方法。

2.2曲妥珠單抗

曲妥珠單抗為一種針對(duì) HER22/ neu的重組人源化 IgG單克隆抗體 ,能特異性識(shí)別 Her22調(diào)控的細(xì)胞表面蛋白 HER22 ,使其通過(guò)內(nèi)吞噬作用離開(kāi)胞膜進(jìn)入核體內(nèi) ,抑制其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) ,從而起到治療腫瘤的作用。美國(guó) FDA 于 1999 年批準(zhǔn)其上市 ,2002年在我國(guó)上市。大量臨床資料證實(shí)曲妥珠單用于乳腺癌的有效率為21 % ,而且它與化療聯(lián)合應(yīng)用明顯提高了生存時(shí)間[4 ]。據(jù)報(bào)道 ,歐洲曲妥珠單抗輔助治療試驗(yàn)研究了曲妥珠單抗對(duì) HER22 陽(yáng)性伴有或不伴有淋巴結(jié)陽(yáng)性的乳腺癌患者的療效 ,其中 1 組給予 1 年的曲妥珠單抗治療 ,另1組作為對(duì)照。曲妥珠單抗治療 1 年組與對(duì)照組相比 ,復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)減少了46 % ,兩組的整體生存率無(wú)明顯區(qū)別 ,說(shuō)明曲妥珠單抗用于治療輔助化療后的 HER22陽(yáng)性乳腺癌患者 ,明顯延長(zhǎng)了患者的無(wú)病生存期[5 ]。我國(guó)也對(duì)曲妥珠進(jìn)行了臨床研究 ,沈坤煒等[6 ]對(duì) 42 例 Ⅱ～ ⅢA期浸潤(rùn)性乳腺癌患者紫杉醇聯(lián)合曲妥珠單抗治療 24 周 ,結(jié)果單用新輔助化療組完全緩解率為 26.3 % ,在新輔助化療聯(lián)用曲妥珠單抗組為65.2 % ,可見(jiàn) ,對(duì)于 HER22 過(guò)表達(dá)的乳腺癌化療聯(lián)用曲妥珠單抗能顯著提高完全緩解率。

2.3阿倫珠單抗 阿倫珠單抗是人源化、非結(jié)合型單抗 ,作用靶點(diǎn)為正常與異常B淋巴細(xì)胞的 CD52 抗原 ,CD52 廣泛分布于正常的 B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞表面 ,在慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞表面尤為豐富。它與帶 CD52 的靶細(xì)胞結(jié)合后 ,通過(guò)宿主效應(yīng)子的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)、抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)和細(xì)胞凋亡等機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞死亡。阿倫珠單抗作為一種作用機(jī)制獨(dú)特的單克隆抗體 ,對(duì)源于B和 T細(xì)胞的各種惡性腫瘤具有很好的治療作用。

英國(guó)科學(xué)家應(yīng)用阿倫珠單抗和利妥昔單抗治療復(fù)發(fā)性淋巴瘤患者 ,結(jié)果總反應(yīng)率為 52 % ,其中完全緩解 8 % ,表明聯(lián)合使用阿倫珠單抗和利妥昔單抗是安全可行的。在其它 T細(xì)胞惡性腫瘤的治療中:對(duì) 22 例 Ⅲ～ Ⅳ期皮膚 T細(xì)胞淋巴瘤(蕈樣肉芽腫病和 Sezary綜合征)患者靜脈輸注阿倫珠 12周 ,結(jié)果顯示阿倫珠具有非常好的療效 ,總有效率達(dá) 55 %。其中 ,紅皮病患者總有效率達(dá) 69 % ,片狀斑或皮膚腫瘤患者達(dá)40 %[7 ]。阿倫珠單抗聯(lián)合其他藥物、化療等治療腫瘤具有顯著的效果。但臨床研究表明 ,其還存在一些常見(jiàn)并發(fā)癥 ,如低血壓、寒顫、發(fā)熱、惡心、嘔吐、氣短、支氣管痙攣、皮疹、疲乏、呼吸困難、頭痛、腹瀉、感染等。2.4西妥昔單抗

西妥昔單抗為 IgG 1 單克隆抗體 ,是表皮生長(zhǎng)因子受體拮抗劑 ,可與表達(dá)于正常細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)特異性結(jié)合 ,并競(jìng)爭(zhēng)性阻斷 EGF和其他配體 ,如α 2轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF 2 α)的結(jié)合。它通過(guò)增加細(xì)胞周期抑制因子 p27kip 使得細(xì)胞周期停留在 G 1 期;增加 Bax表達(dá)和減少 bcl22表達(dá) ,誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡;它還可減少基質(zhì)金屬蛋白酶和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的產(chǎn)生。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明 ,西妥昔單抗可抑制過(guò)度表達(dá) EGFR的腫瘤細(xì)胞的增殖 ,但是對(duì)缺乏 EGFR表達(dá)的腫瘤細(xì)胞則沒(méi)有抗腫瘤效果 ,還發(fā)現(xiàn)西妥昔與化療聯(lián)用要優(yōu)于單獨(dú)化療[8 ]。

在對(duì)西妥昔單抗聯(lián)合化療的研究中 ,BOAD 試驗(yàn)最為著名。576例晚期結(jié)直腸癌(ACRC)患者中 82 %的 EGFR 過(guò)表達(dá)。治療采取兩個(gè)方案 ,第1組用西妥昔單抗聯(lián)合伊立替康治療;第2組單獨(dú)用西妥昔單抗單藥治療。西妥昔單抗聯(lián)合伊立替康與單用西妥昔單抗相比 ,聯(lián)用療效優(yōu)于單一使用 ,有效率分別為23 %和11 % ,疾病控制率為 56 %和 32 % ,疾病進(jìn)展中位時(shí)間為4.1和1.5個(gè)月 ,中位生存時(shí)間為8.6和6.9個(gè)月 ,而且西妥昔單抗并沒(méi)有增加化療的副作用。以上臨床實(shí)驗(yàn)顯示:西妥昔單抗能夠克服 ACRC患者對(duì)伊立替康的耐藥性 ,生存質(zhì)量明顯提高[9 ]。西妥昔單抗的毒副作用包括:痤瘡樣皮疹、虛弱、腹痛、惡心、嘔吐、白細(xì)胞減少和過(guò)敏反應(yīng)等。其中痤瘡樣皮疹是最常見(jiàn)的不良反應(yīng) ,皮疹主要分布在臉部和軀干上部 ,這可能是由于西妥昔單抗干擾了 EGF的表皮生理作用所致[10 ]。

2.5貝伐單抗

貝伐單抗是抗VEGF的人源化單抗 ,主要通過(guò)中和VEGF來(lái)阻斷其與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合 ,使得腫瘤細(xì)胞不能得到養(yǎng)分和氧 ,起到治療腫瘤的作用。Presta 等[11 ]將鼠抗人VEGF單克隆抗體(muMAB VEGF)A.4.6.1 的互補(bǔ)決定區(qū)與人 IgG 1的恒定區(qū)框架嵌合 ,并對(duì)相應(yīng)氨基酸殘基加以修飾 ,最終形成了人鼠嵌合型 VEGF單抗 ,仍然有 7 %的氨基酸來(lái)源于鼠抗體。實(shí)驗(yàn)表明 ,貝伐單抗用于治療腫瘤安全有效。鄭航等[12 ]探究貝伐單抗聯(lián)合伊立替康治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的療效 ,90例患者中給予貝伐單抗聯(lián)合伊立替康治療的一組有效率為43.3 % ,血清腫瘤標(biāo)志物的濃度治療前后有顯著變化。這說(shuō)明貝伐聯(lián)合伊立替康治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌具有更高的疾病控制率。2005 年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)年會(huì)上報(bào)道了貝伐單抗的最新研究結(jié)果 ,采用貝伐單抗聯(lián)合伊立替康和順鉑一線治療轉(zhuǎn)移性胃癌或者胃食管連接部腺癌的患者 ,治療的不良反應(yīng)除了原有伊立替康和順鉑引起的腎髓抑制、胃腸道反應(yīng)等 ,還有貝伐單抗造成的不良反應(yīng)包括栓塞性疾病、胃穿孔等。

3抗腫瘤單抗偶聯(lián)物

3.1放射免疫偶聯(lián)物

放射免疫治療(RIT)是以單克隆抗體為載體 ,以放射性核素為彈頭 ,通過(guò)抗體特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原 ,將產(chǎn)生高能射線的放射性核素靶向到腫瘤細(xì)胞 ,實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的近距離內(nèi)照射治療。RIT利用攜帶放射性核素的單克隆抗體特異地結(jié)合到病灶部位 ,減少了對(duì)正常組織的損傷。90Y— ibri2tumomab是第1個(gè)被 FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的放射免疫制劑 ,主要用于復(fù)發(fā)的淋巴瘤患者或?qū)为?dú)應(yīng)用利妥昔單抗療效不佳的患者。

3.2免疫毒素

免疫毒素是用化學(xué)方法或基因工程方法將腫瘤選擇性單抗與經(jīng)修飾的多肽毒素共價(jià)連接而成的腫瘤治療藥物。免疫毒素可與腫瘤細(xì)胞表面受體或與細(xì)胞表面的靶抗原相結(jié)合后內(nèi)化 ,繼而在胞內(nèi)抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成 ,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。毒素有很多種 ,如植物毒素、細(xì)菌毒素、動(dòng)物毒素 , 其中引用最廣泛的是植物毒素中的白喉毒素。美國(guó) FDA已經(jīng)批準(zhǔn)了白喉毒素與白細(xì)胞介素 2 重組的免疫毒素 ONTAK(DAB3892I L2),用于治療人皮膚 T細(xì)胞淋巴瘤[13214 ]。

3.3化學(xué)免疫偶聯(lián)物 單抗是藥物良好的靶向性載體 ,通過(guò)藥物分子上特殊的功能基團(tuán)如:羥基、巰基、氨基等 ,將治療藥物與單抗相連接而組成化學(xué)免疫偶聯(lián)物 ,避免了藥物對(duì)其他正常組織的毒害作用,選擇性地發(fā)揮治療作用。常與單抗進(jìn)行偶聯(lián)的藥物有阿霉素、柔紅霉素、平陽(yáng)霉素、博安霉素、絲裂霉素、新制癌菌素、氨甲喋呤等。

4單克隆抗體在其他疾病中的應(yīng)用 單克隆抗體藥物不只在腫瘤的治療中取得了很好療效 ,在其他疾病的治療中也取得了一些療效 ,例如:奧馬珠單抗(omalizumab)通過(guò)與游離 IgE結(jié)合而顯著降低游離 IgE的水平,阻斷 IgE與肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞結(jié)合 ,防止炎癥介質(zhì)的釋放?？娠@著改善哮喘病人的癥狀、肺功能及生活質(zhì)量 ,減少哮喘惡化的發(fā)作次數(shù) ,減少糖皮質(zhì)激素的用量 ,使用安全 ,具有很好的耐受性[15 ]。Mab03.2C1C2 在體外能抑制白念珠菌芽管的形成 ,從而抑制白念珠菌對(duì)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的粘附 ,降低白念珠菌的侵襲力。利妥昔單抗對(duì)類風(fēng)濕和系統(tǒng)性紅斑狼瘡也有很好的治療作用。英夫利昔單抗對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者疼痛、晨僵、關(guān)節(jié)腫脹等臨床癥狀減輕程度就可達(dá)60 %。另有研究顯示 ,輸注英夫利昔單抗可快速、顯著緩解頑固性銀屑病、關(guān)節(jié)炎病人的關(guān)節(jié)和皮損癥狀[16 ]。英利昔單抗對(duì)克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、酒精性肝病等消化系統(tǒng)疾病都有較好療效 ,且在推薦的治療范圍內(nèi)安全性良好[17 ]。

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第三篇：7單克隆抗體制備教案

單克隆抗體的制備

一、教學(xué)目標(biāo)

知識(shí)目標(biāo)：

1、單克隆抗體的概念

2、單克隆抗體的制備過(guò)程，以及過(guò)程中涉及的具體篩選過(guò)程。

3、單克隆抗體的應(yīng)用，和普通抗體相比的優(yōu)點(diǎn)。能力目標(biāo)：

1、學(xué)會(huì)從復(fù)雜的制備過(guò)程中找出簡(jiǎn)單的流程圖

2、注意前后知識(shí)點(diǎn)的對(duì)比學(xué)習(xí)。情感態(tài)度價(jià)值觀：從生物導(dǎo)彈的應(yīng)用了解單克隆抗體目前在抗癌方面的貢獻(xiàn)，并努力掌握更多的相關(guān)知識(shí)。

二、教學(xué)的重點(diǎn)難點(diǎn)：

單克隆抗體的制備過(guò)程，以及過(guò)程中涉及的具體篩選過(guò)程。

三、教學(xué)課時(shí)：1課時(shí)

四、教學(xué)過(guò)程：

【一】錨式問(wèn)題：從“生物導(dǎo)彈”一個(gè)新穎而又陌生的畫面入手。引發(fā)學(xué)生的探究熱情。具體結(jié)合材料和圖片來(lái)介紹生物導(dǎo)彈。資料：“生物導(dǎo)彈”是免疫導(dǎo)向藥物的形象稱呼，它由單克隆抗體與藥物或放射性同位素配合而成，因帶有單克隆抗體而能自動(dòng)導(dǎo)向，在生物體內(nèi)與特定目標(biāo)細(xì)胞或組織結(jié)合，并由其攜帶的藥物產(chǎn)生治療作用。問(wèn)題：生物導(dǎo)彈中的關(guān)鍵成分是什么？什么是單克隆抗體？ 【二】自主探究（4分鐘，學(xué)生看課本完成）

1、長(zhǎng)期人們?cè)鯓荧@得抗體？這樣的抗體有什么缺點(diǎn)？

（給動(dòng)物反復(fù)注射抗原，然后在動(dòng)物的血清中提取抗體?？贵w產(chǎn)量低、純度低、特異性差）

2、B淋巴細(xì)胞在分泌抗體時(shí)有什么特點(diǎn)？B淋巴細(xì)胞實(shí)際指的是什么細(xì)胞？（一個(gè)或是一種B淋巴細(xì)胞只能分泌一種抗體；效應(yīng)B細(xì)胞或是漿細(xì)胞）

分析：這兩個(gè)問(wèn)題比較簡(jiǎn)單，而且在課本中能直接找到答案，學(xué)生迅速閱讀課本就能完成。【三】繼續(xù)探究（10分鐘，學(xué)生看課本，查閱資料，討論合作完成）

1、寫出單克隆抗體制備的過(guò)程簡(jiǎn)圖（略，見(jiàn)課件）

2、怎么獲得免疫小鼠，目的是什么？

（給小鼠注射特定的抗原，使小鼠發(fā)生特定的體液免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞）

3、為何選擇B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞？

（B淋巴細(xì)胞能產(chǎn)生特定的抗體，單不能無(wú)限增殖；骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖）

4、過(guò)程中大致需要幾次篩選？怎么篩選？目的是什么？（主要是2次。第一次為了篩選出雜交瘤細(xì)胞；第二次篩選出能大量產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞。）

5、最終獲得單克隆抗體的辦法有幾種？分別是？

（兩種。體內(nèi)在小鼠的腹水中提??；體外在細(xì)胞的培養(yǎng)液中提取）

6、單克隆抗體制備過(guò)程涉及的技術(shù)及其原理有哪些？

（細(xì)胞融合：原理是細(xì)胞膜具有流動(dòng)性；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原理：細(xì)胞增殖）

分析：上述的6個(gè)問(wèn)題涉及的內(nèi)容是本節(jié)課的重點(diǎn)和難點(diǎn)，也是考點(diǎn)，需要和學(xué)生一起系統(tǒng)化的梳理，并強(qiáng)調(diào)重點(diǎn)內(nèi)容作好筆記?！舅摹坷^續(xù)探究總結(jié)

1、單克隆抗體的“單”和“克隆”分別指的是什么？

（單：?jiǎn)蝹€(gè)能產(chǎn)生大量抗體的雜交瘤細(xì)胞；克?。簾o(wú)性繁殖即有絲分裂）

2、單克隆抗體的應(yīng)用主要有哪些？

（主要集中在醫(yī)學(xué)方面，診斷疾病，治療疾病等）

3、單克隆抗體的主要優(yōu)點(diǎn)有哪些？

（特異性強(qiáng)、靈敏度高、純度大、可大量制備）【五】運(yùn)用質(zhì)疑

1、科學(xué)家用小鼠骨髓瘤細(xì)胞與某種細(xì)胞融合，得到雜交細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的單克隆抗體，與骨髓瘤細(xì)胞融合的是(A)A．經(jīng)過(guò)免疫的B淋巴細(xì)胞 B．不經(jīng)過(guò)免疫的T淋巴細(xì)胞 C．經(jīng)過(guò)免疫的T淋巴細(xì)胞 D．不經(jīng)過(guò)免疫的B淋巴細(xì)胞

2、將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與一種B淋巴細(xì)胞融合，可使融合的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生單克隆抗體，下列說(shuō)法中不正確的是(C)A．動(dòng)物細(xì)胞融合和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是單克隆抗體技術(shù)的基礎(chǔ) B．實(shí)驗(yàn)中雜交瘤細(xì)胞從培養(yǎng)基中吸收葡萄糖的方式是主動(dòng)運(yùn)輸

C．B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞直接放入培養(yǎng)液中就能融合為雜交瘤細(xì)胞

D．按照培養(yǎng)基的用途分類，實(shí)驗(yàn)中篩選雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基是選擇培養(yǎng)基

6、單克隆抗體是指（C）

A．單個(gè)骨髓瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生的抗體

B．單個(gè)B淋巴細(xì)胞增殖產(chǎn)生的抗體 C．單個(gè)雜交瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生的抗體

D．單個(gè)抗體通過(guò)克隆化，產(chǎn)生大量抗體 【六】課外延伸

單克隆抗體是來(lái)自誰(shuí)？如果直接給人注射，會(huì)有什么反應(yīng)？請(qǐng)同學(xué)想辦法來(lái)解決??！

第四篇：《動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體》教案設(shè)計(jì)

《動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體》教案設(shè)

計(jì)

一、教材的地位和作用

《動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體》是人教版普通高中程標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)教科書生物選修3專題二第2節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程中第2小節(jié)的內(nèi)容，由于細(xì)胞工程是建立在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能、生理等研究基礎(chǔ)上的新技術(shù)，動(dòng)物細(xì)胞融合又是細(xì)胞工程中基本技術(shù)之一，所以第2小節(jié)教學(xué)內(nèi)容是在高中必修教材基礎(chǔ)上的深入和擴(kuò)展，也是第1小節(jié)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)教學(xué)后的必然及延伸，是安排在學(xué)習(xí)了免疫、遺傳與基因工程的基礎(chǔ)上來(lái)進(jìn)行教學(xué)的，學(xué)生既有一定的知識(shí)基礎(chǔ)，又能為后面的微生物與發(fā)酵工程的教學(xué)奠定基礎(chǔ)，尤其是為微生物的選種教學(xué)打下基礎(chǔ)。同時(shí)，生物技術(shù)中各個(gè)分支領(lǐng)域相互滲透、相互促進(jìn)，細(xì)胞融合技術(shù)也不例外，它在現(xiàn)代生物技術(shù)中具有一定的理論意義和經(jīng)濟(jì)意義。

二、學(xué)情分析

學(xué)生是在學(xué)習(xí)了《植物細(xì)胞工程》和《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)》的基礎(chǔ)上學(xué)習(xí)本節(jié)的，所以對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞融合這一部分應(yīng)該能較輕松的理解，但是單克隆抗體的制備較復(fù)雜學(xué)生理解起來(lái)會(huì)有一定的難度，教師應(yīng)詳細(xì)介紹。

三、教學(xué)目標(biāo)

根據(jù)新標(biāo)要求和本節(jié)的具體內(nèi)容，結(jié)合學(xué)生現(xiàn)有的知識(shí)水平，擬定下列教學(xué)目標(biāo)。

、知識(shí)目標(biāo)

（1）掌握動(dòng)物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交的區(qū)別和聯(lián)系。

（2）簡(jiǎn)述動(dòng)物細(xì)胞融合和單克隆抗體制備的過(guò)程。

（3）了解單克隆抗體在醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的應(yīng)用，并說(shuō)其應(yīng)用實(shí)例。

2、能力目標(biāo)

（1）由植物體細(xì)胞雜交技術(shù)導(dǎo)出動(dòng)物細(xì)胞融合過(guò)程，培養(yǎng)學(xué)生的知識(shí)遷移能力、思維能力。

（2）讓學(xué)生嘗試設(shè)計(jì)單克隆抗體的制備過(guò)程，指導(dǎo)學(xué)生掌握獲取知識(shí)和探索生物科學(xué)的基本方法，使學(xué)生了解生物科學(xué)認(rèn)識(shí)模式以發(fā)展學(xué)生的創(chuàng)造性能力。

（3）分析動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)的意義和應(yīng)用，逐步提高學(xué)生獨(dú)立獲取知識(shí)、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。

3、情感目標(biāo)

（1）初步培養(yǎng)學(xué)生勇于探索，不斷創(chuàng)新的精神和合作精神。

（2）通過(guò)向?qū)W生介紹動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展動(dòng)態(tài)及一些新的研究成果，使學(xué)生明確人們對(duì)生命奧秘的揭示愈加廣泛和深入，知識(shí)不斷更新并向前發(fā)展，認(rèn)識(shí)到學(xué)無(wú)止境，形成終生學(xué)習(xí)的意識(shí)。

（3）關(guān)注動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用前景。

四、教學(xué)重難點(diǎn)

、重點(diǎn)

（1）動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)。

（2）單克隆抗體的制備過(guò)程。

2、難點(diǎn)

單克隆抗體的制備過(guò)程。

五、教學(xué)實(shí)施程序

教師組織和引導(dǎo)

學(xué)生活動(dòng)

設(shè)計(jì)意圖

創(chuàng)設(shè)情境，導(dǎo)入新、多媒體播放科幻電影中相關(guān)橋段，并展示人-鼠細(xì)胞雜交的圖片，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)欲望，導(dǎo)出本節(jié)的題。

2、進(jìn)行學(xué)習(xí)目標(biāo)的解讀。、觀看電影片段和人-鼠細(xì)胞雜交的圖片，回憶所學(xué)知識(shí)。

2、熟悉本節(jié)所學(xué)內(nèi)容，把握難點(diǎn)內(nèi)容。

1、回顧人-鼠細(xì)胞雜交試驗(yàn)，讓學(xué)生對(duì)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)有初步的認(rèn)識(shí)。

2、教學(xué)做到有的放矢。

自主學(xué)習(xí)，知識(shí)梳理、多媒體展示相關(guān)問(wèn)題，組織學(xué)生進(jìn)行解答。

2、根據(jù)學(xué)生的回答了解學(xué)生的預(yù)習(xí)情況。、通過(guò)前預(yù)習(xí)并進(jìn)行知識(shí)梳理，組內(nèi)討論，形成統(tǒng)一認(rèn)知。

2、小組進(jìn)行展示。

培養(yǎng)學(xué)生自主學(xué)習(xí)的能力，并體現(xiàn)學(xué)生的主體地位。

合作探究，班內(nèi)交流、多媒體展現(xiàn)合作探究?jī)?nèi)容，引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行相互交流，并進(jìn)行小組展示。

1、并合作交流，并確定學(xué)習(xí)難點(diǎn)內(nèi)容。

培養(yǎng)學(xué)生合作精神。

點(diǎn)撥精講，解難釋疑

單克隆抗體制備的過(guò)程：

通過(guò)多媒體展示單克隆抗體的設(shè)計(jì)思路及制備過(guò)程，同時(shí)提出問(wèn)題，學(xué)生討論。

（教師講解為主）

合作探究以下問(wèn)題：

、如何獲得B淋巴細(xì)胞？

2、如果把B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞放在一起時(shí)，會(huì)有幾種融合方式（類型）？

3、選擇雜交瘤細(xì)胞的兩步篩選的目的各是什么？

4、如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測(cè)及克隆化培養(yǎng)？

本部分知識(shí)較難，但學(xué)生通過(guò)預(yù)習(xí)能簡(jiǎn)單的分析出一部分，通過(guò)討論使知識(shí)完整培養(yǎng)學(xué)生全面思考問(wèn)題的能力

隨堂練習(xí)，當(dāng)堂反饋

多媒體展示相關(guān)習(xí)題

讀題，思考與討論，并進(jìn)行解答

、鞏固學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)分析解讀能力。

2、通過(guò)對(duì)學(xué)生練習(xí)結(jié)果的評(píng)價(jià)，了解學(xué)生對(duì)知識(shí)的掌握情況，以便確定下一步的補(bǔ)償性學(xué)習(xí)的安排。

歸納總結(jié)，科評(píng)價(jià)、多媒體展示“三個(gè)重要過(guò)程”“三個(gè)一”，幫助學(xué)生記憶和理解。

2、對(duì)學(xué)生的堂表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

觀看多媒體展示內(nèi)容，對(duì)所學(xué)內(nèi)容有一個(gè)概括性的總結(jié)。

科學(xué)評(píng)價(jià)有利于小組內(nèi)學(xué)生之間的相互團(tuán)結(jié)，培養(yǎng)學(xué)生團(tuán)隊(duì)合作的意識(shí)

七、板書設(shè)計(jì)

222動(dòng)物細(xì)胞融合與單克隆抗體

一、動(dòng)物細(xì)胞的融合二、單克隆抗體*、概念：、抗體11概念:Ig

2：B細(xì)胞

2、方法：

2、概念：雜交瘤細(xì)胞、高度單

一、抗體

3、過(guò)程

3、制備過(guò)程（雜交瘤制備技術(shù)）

4、意義：制備單克隆抗體

4、應(yīng)用：“生物導(dǎo)彈”

八、教學(xué)反思

第五篇：?jiǎn)慰寺】贵w生產(chǎn)的雜交瘤技術(shù)

Hybridoma Technology for the Generation of Monoclonal Antibodies(mAbs)單克隆抗體生成的雜交瘤技術(shù) Abstract 1 Introduction 2 Materials

2.1 Preparation of splenocytes 2.1 脾細(xì)胞制備 spleens from immunized mice 免疫小鼠的脾臟 RPMI-1640 medium(Serum-free cell freezing medium)無(wú)血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基 無(wú)血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基 3 Petri dishes 有蓋培養(yǎng)皿 Sterile surgical instruments,including microdissecting scissors and forceps,for collecting animal samples 用于收集動(dòng)物樣品的無(wú)菌手術(shù)器械，包括顯微解剖剪和鉗子，5 sterile microscope glass slide with frosted ends 磨砂的的無(wú)菌顯微玻片 6 15-ml conical tubes 15-ml 錐形瓶

2.2 Preparation of myeloma cells as the fusion partner 作為融合頭（融合標(biāo)簽）的骨髓瘤細(xì)胞的制備 2.3 cell fusion 細(xì)胞融合

2.4 hybridoma screening by FACS 2.5 hybridoma screening by ELISA 通過(guò)ELISA進(jìn)行雜交瘤篩選 2.6 hybridoma screening by IHC 2.7 hybridoma subcloning 2.8 hybridoma cryopreservation 低溫保存雜交瘤細(xì)胞 2.9 antibody isotyping 抗體同型

2.10 thawing and growth of hybridoma cells 雜交瘤細(xì)胞的融化和生長(zhǎng)methods 3.1 preparation of splenocytes from the immunized mouse 來(lái)自免疫鼠的脾細(xì)胞的制備 3.2 preparation of myeloma cells 骨髓瘤細(xì)胞的制備 3.3 cell fusion 細(xì)胞融合

3.4 hybridoma screening using flow cytometry 通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行雜交瘤篩選 3.5 hybridoma screening by ELISA 通過(guò)ELISA進(jìn)行雜交瘤篩選 3.6 hybridoma screening by IHC 通過(guò)免疫組化進(jìn)行雜交瘤篩選 3.7 hybridoma subcloning 雜交瘤亞克隆

3.8 hybridoma cryopreservation 雜交瘤低溫保存 3.9 antibody isotyping 抗體同型

3.10 Thawing and growth of hybridoma cells 雜交瘤細(xì)胞的融化和生長(zhǎng) 4 小記 參考文獻(xiàn)