第一篇：生化工程 - 03

微生物的營(yíng)養(yǎng)

微生物的營(yíng)養(yǎng)（nutrition）是指微生物從環(huán)境獲得它們合成自身的細(xì)胞物質(zhì)和提供機(jī)體進(jìn)行各種生理活動(dòng)所需的能量，以及形成代謝產(chǎn)物所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的全過(guò)程。

一、微生物的營(yíng)養(yǎng)類型

根據(jù)碳源不同，分為自養(yǎng)微生物（autotrophic microorganism）和異養(yǎng)微生物（heterotrophic microorganism）；根據(jù)所需能量不同，分為光能營(yíng)養(yǎng)（phototrophy）型和化能營(yíng)養(yǎng)（chemotrophy）型。

上述營(yíng)養(yǎng)型的分類并非絕對(duì)，在自養(yǎng)和異養(yǎng)、光能型和化能型之間都存在中間過(guò)渡類型，成為兼性營(yíng)養(yǎng)型。比如：氫細(xì)菌可以利用氫和CO2進(jìn)行自養(yǎng)生活，也可以直接利用有機(jī)物進(jìn)行異養(yǎng)生活；紅螺菌既可利用光能又可利用化能。微生物的營(yíng)養(yǎng)類型之間沒(méi)有絕對(duì)的界限。

二、微生物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)

（一）碳源（carbon source）

碳源主要是碳水化合物，如葡萄糖、糖蜜、蔗糖、淀粉等。葡萄糖：活性碳源，微生物可以直接吸收利用。

淀粉：惰性碳源，先要經(jīng)過(guò)微生物酶水解形成單糖才能被吸收利用。常用的淀粉原料有玉米、土豆、麩皮、米糠等，近年來(lái)木薯在發(fā)酵工業(yè)上廣泛用于生產(chǎn)酒精、檸檬酸、谷氨酸、賴氨酸等。

糖蜜是制糖生產(chǎn)的副產(chǎn)品，含有豐富的糖、含氮化合物、無(wú)機(jī)鹽和維生素等，物美價(jià)廉，是發(fā)酵工業(yè)常用的原料。

近年來(lái)，醇類、有機(jī)酸、石油烷烴也常被用作碳源來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)一些特殊產(chǎn)品。比如用烷烴或脂肪酸發(fā)酵生產(chǎn)化工原料長(zhǎng)鏈二元酸。

（二）氮源（nitrogen source）

有機(jī)氮源：花生餅、豆餅、棉籽餅、菜籽餅、玉米漿、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、魚(yú)粉、蠶蛹、酒糟、米糠等。提供蛋白質(zhì)、多肽、游離氨基酸，少量糖類、脂肪、無(wú)機(jī)鹽、維生素和某些生長(zhǎng)因子。

無(wú)機(jī)氮源：銨鹽、硝酸鹽、尿素、氨水等，與有機(jī)氮源配合使用往往效果更好。分子態(tài)氮：固氮微生物。

（三）無(wú)機(jī)元素（inorganic element）

主要功能：（1）構(gòu)成菌體的組成成分；（2）作為酶活性基團(tuán)的組成部分；（3）調(diào)節(jié)微生物體內(nèi)的pH和氧化還原電位；（4）某些自養(yǎng)菌的能源。

6種主要元素：C、H、O、N、P、S 大量元素：C、H、O、N、P、S、K、Mg、Ca、Fe 微量元素：Mn、Co、Cu、Zn、Ni等

（四）生長(zhǎng)因子（growth factor）

微生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不可缺少而需要量極少的一類特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括維生素、氨基酸、核苷酸等，以輔酶或輔基的形式參與菌體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的酶促反應(yīng)。許多天然碳源、氮源，比如玉米漿、麩皮、麥糠等含有豐富的生長(zhǎng)因子。

三、微生物的培養(yǎng)基（culture medium）

培養(yǎng)基：人工配制的適于微生物生長(zhǎng)繁殖或累積代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。

（一）按物理狀態(tài)分類

1.固體培養(yǎng)基（solid medium）

麩皮、米糠、豆餅粉、花生餅粉 + 無(wú)機(jī)鹽 + 水 —— 白酒廠、釀造廠等生產(chǎn)用 溶解的培養(yǎng)液 + 膠凝劑（瓊脂、明膠等）—— 實(shí)驗(yàn)室用 2.半固體培養(yǎng)基（semisolid medium）

半固體培養(yǎng)基是在培養(yǎng)液中加入少量的凝固劑（如0.2%～0.5%的瓊脂）。這種培養(yǎng)基常用于觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、厭氧菌的分離和菌種鑒定等。3.液體培養(yǎng)基（liquid medium）

把培養(yǎng)基成分溶解或懸浮在水中而進(jìn)行液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基。廣泛用于微生物的培養(yǎng)、研究和大規(guī)模生產(chǎn)。

（二）按營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來(lái)源分類

天然培養(yǎng)基（complex medium）：動(dòng)植物組織或微生物的浸出物、水解液等，如蛋白胨、牛肉膏、麥芽汁、馬鈴薯、玉米粉、米糠、豆餅粉等。

合成培養(yǎng)基（synthetic medium）：由已知化學(xué)成分及數(shù)量的化學(xué)藥品配制而成，適合于定性定量的研究工作。

半合成培養(yǎng)基（semi-synthetic medium）：在天然培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，適當(dāng)添加一些化學(xué)藥品，補(bǔ)充無(wú)機(jī)鹽等不足，使之更能充分滿足微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要。在實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)中使用最多。

（三）按用途分類

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basic medium）含有細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可供大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)

鑒別培養(yǎng)基（differential medium）在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使培養(yǎng)后會(huì)發(fā)生某種變化，從而區(qū)別不同類型的微生物。例如：伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基，Eosin-methylene blue medium）用于檢測(cè)水中的大腸桿菌污染。

加富培養(yǎng)基（enriched medium）有利于某種微生物而不利于其它微生物生長(zhǎng)而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。

選擇培養(yǎng)基（selected medium）在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)以抑制不需要菌的生長(zhǎng)而保證需要菌的生長(zhǎng)，從而在混雜的微生物中選出需要的菌種。

配制培養(yǎng)基的原則：

（1）目的明確：實(shí)驗(yàn)or生產(chǎn)？菌種的營(yíng)養(yǎng)類型？（2）營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)：特別是C :N（3）條件適宜：pH、滲透壓等

（4）經(jīng)濟(jì)節(jié)約：盡量選用容易獲得、價(jià)格低廉的原料作為培養(yǎng)基成分

四、微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收

? 被動(dòng)吸收：又稱單純擴(kuò)散，通過(guò)濾過(guò)、滲透、簡(jiǎn)單擴(kuò)散和易化擴(kuò)散（需要載體）等幾種形式，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。這種吸收形式不需要消耗能量。一些分子? 量低的物質(zhì)，如簡(jiǎn)單多肽、各種離子、電解質(zhì)和水等的吸收即為被動(dòng)吸收。

主動(dòng)吸收：又稱主動(dòng)運(yùn)輸，必須通過(guò)機(jī)體消耗能量，依靠細(xì)胞載體蛋白來(lái)完成的一種逆濃度梯度的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)形式。是細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要機(jī)制。被動(dòng)吸收和主動(dòng)吸收主要區(qū)別有兩點(diǎn)：主動(dòng)運(yùn)輸需要能量和載體，可以跨濃度梯度運(yùn)輸。被動(dòng)吸收有濾過(guò)、滲透、簡(jiǎn)單擴(kuò)散和易化擴(kuò)散，除易化擴(kuò)散外都不需要載體，但都是順濃度梯度運(yùn)輸，即靠滲透壓來(lái)運(yùn)輸，但都不消耗能量。

五、影響微生物生長(zhǎng)發(fā)育的因素

1.溫度

微生物的生長(zhǎng)實(shí)際上可以看做是生物體的一系列生物化學(xué)反應(yīng)的有機(jī)組合，溫度是這些反應(yīng)的必須條件。

最適溫度是一個(gè)相對(duì)的概念，最適生長(zhǎng)溫度未必最適合微生物的生物合成，反之亦然。

2.pH 一般霉菌、酵母最適pH為3~5，細(xì)菌、放線菌6.5~8。

不同生長(zhǎng)階段要求pH值不同，過(guò)程中pH值會(huì)發(fā)生改變（變酸為主），改變的原因是：

3.通氣（aeration）與攪拌（agitation / stirring）

根據(jù)微生物對(duì)氧的需求不同，可將其分為3類： ? ? 好氧微生物：工業(yè)發(fā)酵中應(yīng)用最多

厭氧微生物：分子態(tài)氧對(duì)其有毒害作用，如丙酮-丁醇產(chǎn)生菌

? 兼性微生物：酵母菌有氧生長(zhǎng)繁殖，無(wú)氧發(fā)酵產(chǎn)生酒精 發(fā)酵過(guò)程中通氣一般前少后多

攪拌能打碎氣泡，增加氣液接觸面積，加速氧的溶解，提高空氣利用率，促進(jìn)微生物的繁殖，但過(guò)度劇烈的攪拌會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)液產(chǎn)生大量氣泡，增加污染雜菌的機(jī)會(huì)。4.基質(zhì)濃度

菌體生長(zhǎng)速率是基質(zhì)濃度的函數(shù)，常用Monod方程來(lái)描述菌體生長(zhǎng)速率與基質(zhì)濃度的關(guān)系：

第二篇：生化工程實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)操作規(guī)范

生化工程實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)操作規(guī)范

1.手套使用

原則上不論什么實(shí)驗(yàn)都應(yīng)帶手套操作，特別是： 1）無(wú)菌操作；

2）與RNA有關(guān)的所有操作；

3）重要克隆菌的挑單克隆、擴(kuò)增、保存等；

4）與有毒試劑有關(guān)的所有操作，比如用EB染膠，用有機(jī)溶劑提?。ㄔ谕L(fēng)櫥內(nèi)操作）。2.移液槍及槍頭使用 1）在合適量程范圍內(nèi)使用； 2）移液槍定期校對(duì)；

3）槍頭必須插緊，防止脫落以及吸樣體積不夠； 4）不要水平放置帶有槍頭的槍； 5）使用后掛在槍架上，不可以亂放；

6）裝槍頭時(shí)必須戴手套，滅菌后50-70℃烘干后使用；

7）加樣體積應(yīng)為槍頭最大體積的20-100%，低于該范圍的用小一號(hào)的槍頭。3.加樣

1）加用任何試劑前要將試劑混合（除飽和酚或一些特別的有機(jī)試劑）；

2）加樣的槍頭應(yīng)在試劑的中間表層吸收，防止槍頭外壁帶用過(guò)多試劑，改變加樣試劑體積（除飽和酚外，一定要伸到飽和酚液的下部吸?。?/p>

3）加酶時(shí)酶要放置在冰上，應(yīng)注意體積準(zhǔn)確，外壁不帶，內(nèi)壁吹打干凈。注意用槍頭從反應(yīng)體系的管底吸上，反復(fù)吹打。4.混勻

1）除上述特殊試劑外，所有試劑在使用前后都要充分混勻；多數(shù)分子操作在加樣后、反應(yīng)前都要充分混勻；

2）0.2ml和0.5ml管30%體積以下可進(jìn)行槍混勻和擦邊混勻；

3）0.5-1.5ml管15-40%體積時(shí)，試管30%體積以下時(shí)可使用漩渦混勻器混勻； 4）0.5-1.5ml管30-70%體積，試管30-70%時(shí)可進(jìn)行顛倒混勻。5.水浴鍋

1）需提前10-30分鐘調(diào)好溫度，穩(wěn)定后才能使用； 2）水位不可以低于水浴鍋高度的50%，及時(shí)添水或換水； 3）使用合適的浮子； 4）使用完畢及時(shí)關(guān)閉電源。6.離心

1）離心如果需要預(yù)冷，應(yīng)至少預(yù)冷15min； 2）要質(zhì)量對(duì)稱放置； 3）不合適的離心管應(yīng)外套其他型號(hào)的離心管；

4）離心后如果要移動(dòng)，應(yīng)放在離心管架上移動(dòng)，防止破壞液面； 5）短暫離心要在3000-8000rpm范圍內(nèi)，時(shí)間應(yīng)短于30秒； 6）離心完畢應(yīng)及時(shí)清理離心機(jī)。7.瓊脂糖凝膠電泳 1）凝膠制作

配制凝膠的濃度據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而變，一般在0．8％ ～2．0％之間，如果一次配制凝膠100 ml，沒(méi)用完的凝膠可以再次融化，但隨著融化次數(shù)的增加，水分丟失也越多，凝膠濃度則會(huì)越來(lái)越高，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，補(bǔ)水辦法：一是在容器上標(biāo)記煮膠前的刻度，煮膠后補(bǔ)充相應(yīng)的水分至原刻度；二是在煮膠前稱重，煮膠后補(bǔ)充水至原重量。粗略一點(diǎn)的方法是通過(guò)多次較恒定的煮膠條件得出一個(gè)經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)水值。2）梳板的選用

一般每個(gè)制膠模具均配有多個(gè)齒型不同的梳板，梳齒寬厚，形成的點(diǎn)樣孔容積較大，用于DNA 片段回收實(shí)驗(yàn)等；相反，梳齒窄而薄，形成的點(diǎn)樣孔容積就較小，用于PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物鑒定等。梳板的選擇主要是看上樣量的多少而定，一般來(lái)說(shuō)，上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制膠，此時(shí)電泳條帶致密清晰，便于結(jié)果分析。另外，每次制膠時(shí)都要注意梳齒與底板的距離至少要1 mm，否則，拔梳板時(shí)易損壞凝膠孔底層，導(dǎo)致點(diǎn)樣后樣品滲漏。當(dāng)然，點(diǎn)樣孔的破壞還與拔梳板的時(shí)間和方法有關(guān)，一般凝膠需冷卻30 min以上方可拔梳板，應(yīng)急的情況下可以將成型的凝膠塊放4℃ 冰箱中冷卻15 min 左右，拔梳板的方法是將制膠槽放置在電泳槽中的電泳緩沖液中，然后垂直向上慢慢用力，因?yàn)橛幸后w的潤(rùn)滑作用，梳板易拔出且不易損壞點(diǎn)樣孔。3）點(diǎn)樣

點(diǎn)樣需加上樣緩沖液，因?yàn)樯蠘泳彌_液中加了甘油或蔗糖增加密度，使樣品沉入孔底；指示樣品的遷移過(guò)程，上樣緩沖液中一般加了兩種指示劑，溴酚蘭和二甲苯青(值得注意的是指示劑并非染色劑，DNA染色劑是溴化乙錠，而且要在紫外光的激發(fā)下才能看見(jiàn)桔紅色熒光)。上樣緩沖液儲(chǔ)存液一般為6×(10×)，表示其濃度為工作濃度的六倍。使用時(shí)上樣緩沖液應(yīng)稀釋到一倍濃度。點(diǎn)樣方法是將移液器基本垂直點(diǎn)樣孔，用另一只手幫助固定移液器下端，移液器槍頭尖端進(jìn)入點(diǎn)樣孔即可將樣品注入孔內(nèi)，千萬(wàn)不可將尖插至孔底，并點(diǎn)上適合的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，所謂適合是指樣品DNA分子量大小應(yīng)基本在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)范圍之內(nèi)。4）電泳 將電泳儀的正極與電泳槽的正極相連，負(fù)極與負(fù)極相連，核酸帶負(fù)電荷，從負(fù)極向正極移動(dòng)。電泳槽中電泳緩沖液與制膠用電泳緩沖液應(yīng)相同，電泳緩沖液剛好沒(méi)過(guò)凝膠1 mm 為好，電泳緩沖液太多則電流加大，凝膠發(fā)熱。電泳時(shí)凝膠上所加電壓一般不超過(guò)5 v/cm(指的是正負(fù)電極之間的距離，而不是凝膠的長(zhǎng)度)，電泳時(shí)間一般為30-60 min，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要也可作適當(dāng)調(diào)整，電壓增高，電泳時(shí)間縮短，核酸條帶相對(duì)來(lái)說(shuō)不夠整齊，不夠清晰；相反，電壓降低，電泳時(shí)間較長(zhǎng)，核酸條帶整齊清晰。另外，如果電泳后樣品泳動(dòng)很慢或者沒(méi)泳動(dòng)，請(qǐng)檢查膠模兩端的封口膠條是否已去掉。5）結(jié)果分析

較成功的電泳結(jié)果是分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶整齊清晰，樣品條帶也整齊清晰，如果條帶模糊暗淡，單從瓊脂糖凝膠電泳角度來(lái)說(shuō)，可能的原因：EB見(jiàn)光易分解，母液配制時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或保存不當(dāng)(一般4℃ 避光保存一年內(nèi)有效)，或者終濃度沒(méi)達(dá)到0.5 ug/ml；電泳槽中緩沖液使用次數(shù)過(guò)多，緩沖能力下降。特別是TAE緩沖液，一般用2-3次就要更換，TBE緩沖液則可使用10次左右。另外，溴化乙錠(EB)是一種中等強(qiáng)度誘變劑，操作過(guò)程中要戴手套，并將加有EB的染色液作好標(biāo)記、妥善保存。實(shí)驗(yàn)室要嚴(yán)格區(qū)分污染區(qū)和非污染區(qū)，不要把污染區(qū)的物品拿到非污染區(qū)，碰過(guò)EB的手套要及時(shí)丟棄。

第三篇：生化實(shí)驗(yàn)

1．火

（1）酒精及其它可溶于水的液體著火時(shí)，可用水滅火

（2）汽油、乙醚、甲苯等有機(jī)溶劑著火時(shí)，應(yīng)用石棉布或砂土撲滅，絕對(duì)不能用水，否則反而會(huì)擴(kuò)大燃燒面積。

（3）電起火，不能用水和二氧化碳滅火器，應(yīng)切斷電源或用四氯化碳滅火器。2．燒傷

（1）強(qiáng)堿燒傷：先用大量水沖洗，再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液沖洗。（2）強(qiáng)酸燒傷：先用大量水沖洗，再用5%的碳酸氫鈉或5%的氫氧化銨沖洗。

氨基酸的分離鑒定紙層析法

紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。層析溶劑由有機(jī)溶劑和水組成。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移）來(lái)表示的：

在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)；層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。

在操作過(guò)程中，手不要摸濾紙。點(diǎn)樣直徑不超過(guò)3mm。

點(diǎn)樣的一端朝下, 擴(kuò)展劑的液面需低于點(diǎn)樣線1cm。

即時(shí)取出濾紙, 以免出現(xiàn)氨基酸層析跑到濾紙的外面不能檢測(cè)。

蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng) 雙縮脲反應(yīng)

紫紅色

肽鍵 可用于蛋白質(zhì)的定性或定量測(cè)定 一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。茚三酮反應(yīng)

除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有α—氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。此反應(yīng)的適宜pH為5~7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過(guò)大時(shí)甚至不顯色。

與茚三酮呈陽(yáng)性反應(yīng)的不一定就是蛋白質(zhì)或氨基酸。在定性、定量測(cè)定中，應(yīng)嚴(yán)防干擾物存在。該反應(yīng)十分靈敏，1∶1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。黃色反應(yīng)

含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成橙黃色的硝醌酸鈉。苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。

坂口反應(yīng)

與精氨酸反應(yīng)呈紅色，精氨酸是唯一呈此反應(yīng)的氨基酸，反應(yīng)極為靈敏 醋酸鉛反應(yīng)

蛋白質(zhì)分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿條件下，可分解形成硫化鈉。硫化鈉和醋酸鉛反應(yīng)生成黑色的硫化鉛沉淀。若加入濃鹽酸，就生成有臭味的硫化氫氣體。

蛋白質(zhì)分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿條件下，可分解形成硫化鈉。硫化鈉和醋酸鉛反應(yīng)生成黑色的硫化鉛沉淀。若加入濃鹽酸，就生成有臭味的硫化氫氣體。

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定和沉淀反應(yīng)

當(dāng)溶液的pH達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場(chǎng)中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動(dòng)，也不向陽(yáng)極移動(dòng)，此時(shí)溶液pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制成各種不同pH值的緩沖液。向緩沖液溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)

在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋?。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。

（1）可逆的沉淀的反應(yīng)

此時(shí)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來(lái)的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)，常利用此類反應(yīng)。

（2）不可逆沉淀反應(yīng)

此時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來(lái)溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于此類。

蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度

考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰(max)位置由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過(guò)測(cè)定595 nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。靈敏度高，測(cè)定快速簡(jiǎn)便，干擾物質(zhì)少。

微量凱氏定氮法

有機(jī)物與濃硫酸共熱，有機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)氮（氨），氨與硫酸作用生成硫酸氨，后者與強(qiáng)堿作用釋放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此過(guò)量酸液被中和的程度，即可計(jì)算出樣品的含氮量。

中和程度用滴定法來(lái)判斷，分回滴法和直接法兩種。

（1）回滴法：用過(guò)量的標(biāo)準(zhǔn)酸吸收氨，其剩余的酸可用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，由鹽酸量減去滴定所耗NaOH的量即為被吸收的氨之量。此法采用甲基紅做指示劑。

（2）直接法：用硼酸作為氨的吸收溶液，結(jié)果使溶液中[H+]降低，混合指示劑（PH4.3－5.4），黑紫色變?yōu)榫G色。再用標(biāo)準(zhǔn)酸來(lái)滴定，使硼酸恢復(fù)到原來(lái)的氫離子濃度為止，指示劑出來(lái)淡紫色為終點(diǎn)，此時(shí)所耗的鹽酸量即為氨的量。

樣液：1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl液，并稀釋至100ml。如有不溶物，離心取上清液備用。

醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)

本實(shí)驗(yàn)是以醋酸纖維素薄膜作為支持體的區(qū)帶電泳。

方法是將少量新鮮血清用點(diǎn)樣器點(diǎn)在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過(guò)濾紙與電泳槽中緩沖液相連，所用緩沖液pH值為8.6，血清蛋白質(zhì)在此緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。

由于血清中不同蛋白質(zhì)帶有的電荷數(shù)量及分子量不同而泳動(dòng)速度不同。帶電荷多及分子量小者泳動(dòng)速度快；帶電荷少及分子量大者泳動(dòng)速度慢，從而彼此分離。

電泳后，將薄膜取出，經(jīng)染色和漂洗，薄膜上顯示出五條藍(lán)色區(qū)帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)，按泳動(dòng)快慢順序，一般經(jīng)漂洗后，薄膜上可呈現(xiàn)清晰的5條區(qū)帶，由正極端起，依次為清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。

經(jīng)洗脫比色觀察不同蛋白質(zhì)的區(qū)帶。

1、醋酸纖維素薄膜一定要充分浸透后才能點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后電泳槽一定要密閉。電流不宜過(guò)大，以防止薄膜干燥，電泳圖譜出現(xiàn)條痕。

2、緩沖溶液離子強(qiáng)度不應(yīng)小于0.05或大于0.07。因?yàn)檫^(guò)小可使區(qū)帶拖尾，過(guò)大則使區(qū)帶過(guò)于緊密。

3、電泳槽中緩沖液要保持清潔(數(shù)天過(guò)濾)兩極溶液要交替使用；最好將連接正、負(fù)極的線路調(diào)換使用。

4、通電過(guò)程中，不準(zhǔn)取出或放入薄膜。通電完畢后，應(yīng)先斷開(kāi)電源后再取薄膜，以免觸電。

酶的特性

溫度對(duì)酶活力的影響

大多數(shù)動(dòng)物酶的最適溫度為37－40℃，植物酶的最適溫度為50－60℃。高溫失活，低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。pH對(duì)酶活性的影響

唾液淀粉酶的最適pH約為6.8。唾液淀粉酶的活化和抑制

酶的活性受活化劑或抑制劑的影響。氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。

血糖的定量測(cè)定

動(dòng)物血液中的糖主要是葡萄糖，其含量較恒定。用硫酸鋅和氫氧化鈉除去被檢測(cè)血中的蛋白質(zhì)制成無(wú)蛋白血濾液。當(dāng)將血濾液與標(biāo)準(zhǔn)鐵氰化鉀溶液共熱時(shí),一部分鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，并與鋅離子生成不溶性化合物。

向混合物中加入碘化物后，用硫代硫酸鈉溶液滴定所釋放的碘。即可知剩余的鐵氰化鉀量。血糖越多，剩余的鐵氰化鉀越少，所消耗的硫代硫酸鈉也越少。硫代硫酸鈉溶液用量與血糖的關(guān)系可以由經(jīng)驗(yàn)確定下來(lái)的數(shù)字表查出。對(duì)照組要多一些，且要先查表再相減

脂肪酸的β－氧化

樣品中丙酮的含量=(V1-V2)x C Na2S2O3 x 1/6 V1—滴定對(duì)照所消耗的Na2S2O3 的體積 V2—滴定樣品所消耗的Na2S2O3 的體積 C—Na2S2O3 的濃度

維生素C的定量測(cè)定

2，6-二氯酚靛酚滴定法

用藍(lán)色的堿性染料標(biāo)準(zhǔn)溶液,對(duì)含維生素 C的酸性浸出液進(jìn)行氧化還原滴定,染料被還原為無(wú)色,當(dāng)?shù)竭_(dá)滴定終點(diǎn)時(shí),多余的染料在酸性介質(zhì)中則表現(xiàn)為淺紅色,如無(wú)其他干擾物質(zhì)存在，樣品提取液所還原的標(biāo)準(zhǔn)染料量與樣品中所含的還原性抗壞血酸量成正比。

過(guò)氧化物酶的作用 過(guò)氧化物酶能催化過(guò)氧化氫釋出新生氧以氧化某些酚類和胺類物質(zhì)，例如氧化溶于水中的焦性沒(méi)食子酸生成不溶于水的焦性沒(méi)食子橙（橙紅色）；氧化愈創(chuàng)木脂中的愈創(chuàng)木酸成為藍(lán)色的愈創(chuàng)木酸的臭氧化物。

目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法：

物理性質(zhì)：紫外分光光度法。

化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法等。染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法。其他性質(zhì)：熒光法。

一、凱氏定氮法： 根據(jù)蛋白質(zhì)的含氮量來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量

公式:每g樣品中含氮克數(shù) × 6.25 ×100

二、比色法：利用蛋白質(zhì)與不同試劑的呈色反應(yīng)，測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，如雙縮尿法和酚試劑法（lowry’s method）。

三、紫外分光光度法：利用蛋白質(zhì)對(duì)280nm紫外光有最大的吸光度而采用

第四篇：生化心得體會(huì)

生化心得體會(huì)——糖的一生

糖是人體所必需的一種營(yíng)養(yǎng)，經(jīng)人體吸收后馬上轉(zhuǎn)化為碳水化合物，以供人體能量。糖主要分為單糖和雙糖。單糖——葡萄糖，分子式為C6分子單鏈，人體可以直接吸收再轉(zhuǎn)化為人體所需。雙糖——食用糖，有些糖人體不能直接吸收，須經(jīng)胰蛋白酶轉(zhuǎn)化為單糖再被人體吸收利用。以上便是糖的簡(jiǎn)介，接下來(lái)便是進(jìn)入我們正題——糖的一生。

說(shuō)道糖的一生，那可是多姿多彩，但又是那么的短暫。糖的一生最主要的就是糖代謝，糖代謝又分為好多種，什么糖的氧化，磷酸戊糖途徑，糖原合成與分解和糖異生。當(dāng)人吃東西的那一刻起，便到了糖的繁殖期。糖的繁殖分為三種，第一是食物會(huì)在人的轉(zhuǎn)化為糖。第二種是肝糖原分解成為糖。第三種是非糖的物質(zhì)轉(zhuǎn)化如甘油，乳酸及生糖氨基酸通過(guò)上面所說(shuō)糖代謝中的糖異生轉(zhuǎn)化為糖。而糖的繁殖期是非常短暫的。因?yàn)槿梭w時(shí)時(shí)刻刻都需要消耗能量，而葡萄糖作為人體能量的直接來(lái)源，所以他也被時(shí)時(shí)刻刻的轉(zhuǎn)化為能量，也就是糖的去路。糖的去路大致分為5種。第一種是糖的氧化分解。第二種是肝糖原和肌糖原的合成。第三種是轉(zhuǎn)化為其他糖類糖類近似物。第四種是轉(zhuǎn)化為非糖物質(zhì)。第五種是隨人的尿液或汗液排出體外，而出現(xiàn)這種情況就是臨床上所說(shuō)的糖尿病，由此可以看出糖的代謝是多模的重要。

提到糖代謝，最主要的就是糖的無(wú)氧氧化和糖的有氧氧化。因?yàn)樘堑拇蟛糠秩ヂ范际亲叩倪@條路徑，而這兩條途徑中最重要的就是有氧氧化。糖的無(wú)氧氧化一共有10步。葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸；葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣?6-磷酸；果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣?1,6-二磷酸；果糖-1,6-二磷酸裂解成2分子磷酸丙糖；磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油醛；3-磷酸甘油醛氧化為1,3-二磷酸甘油酸；1,3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變成3-磷酸甘油；3-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)換為2-磷酸甘油酸；2-磷酸甘油酸脫水生成磷酸烯醇式丙酮酸；磷酸烯醇式丙酮酸將高能磷酸基轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP和丙酮酸。而這些過(guò)程可以規(guī)劃為活化、裂解、放能、還原?；罨A段又分為磷酸化、異構(gòu)、再磷酸化。這些步驟中需要另一種人體必需物質(zhì)——酶的催化，這就是糖的無(wú)氧氧化。糖的有氧氧化就不向無(wú)氧氧化這樣簡(jiǎn)單，他不緊經(jīng)歷了無(wú)氧氧化的經(jīng)歷，已經(jīng)了無(wú)氧氧化沒(méi)有的經(jīng)歷。而有氧氧化又是錯(cuò)綜復(fù)雜的，雖然它分為葡萄糖經(jīng)酵解生成丙酮酸；丙酮酸進(jìn)入線粒體氧化脫羧生成乙酰輔酶A；乙酰輔酶A進(jìn)入檸檬酸循環(huán)以及氧化磷酸化生成ATP這三步。但每一步幽會(huì)多多少少分成號(hào)多小步，尤其是檸檬酸循環(huán)，竟分為8步，而其中又有很多的酶，而且乙酸輔酶A在很多代謝中都會(huì)產(chǎn)生，所以很多代謝都要經(jīng)過(guò)糖的有氧氧化，所以說(shuō)糖的有氧氧化是主要的，也是錯(cuò)綜復(fù)雜的。產(chǎn)生的能量也是最多的。接下來(lái)便是磷酸戊糖途徑，意思是從糖酵解的中間產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸開(kāi)始形成旁路，通過(guò)氧化、基團(tuán)轉(zhuǎn)移兩個(gè)階段生成果糖-6-磷酸甘油醛，從而返回糖酵解的代謝途徑，已成為磷酸為糖旁路。它分為兩個(gè)階段，第一是氧化階段，第二是一系列基團(tuán)轉(zhuǎn)化反應(yīng)。磷酸戊糖途徑的生理意義生成NADPH和磷酸戊糖。再來(lái)就是糖原的合成與分解，這也是最簡(jiǎn)單的途徑，糖原就是由多個(gè)葡萄糖連接成的多聚體，糖原的合成與分解受嚴(yán)格調(diào)控。最后就糖異生，也是相當(dāng)重的要一條途徑。糖異生的定義是饑餓下由非糖化合物（乳酸、甘油、生糖氨基酸等)轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃倪^(guò)程成為糖異生。糖異生的生理意義是維持血糖的恒定。它其中也是分為好多步，也是錯(cuò)綜復(fù)雜的，糖的異生一般發(fā)生在正在處于一種饑餓狀態(tài)下的人體，他們無(wú)法靠外界攝取糖類或者能量，只能靠體內(nèi)的一些非糖物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化為糖類，來(lái)提供體內(nèi)所需的能量。所以說(shuō)，糖異生也是糖代謝中的重要環(huán)節(jié)

以上是糖代謝的幾個(gè)大的方面，還有一些小的方面，比如說(shuō)隨著尿液與汗液排出體外，當(dāng)然這是一種病例的體現(xiàn)，如果有人發(fā)生這種情況，一是這個(gè)人體內(nèi)糖分過(guò)高，二是這個(gè)人體內(nèi)糖不能進(jìn)行正常的代謝，臨床上把這種現(xiàn)象成為糖尿病，得了這種病的人要及時(shí)去就醫(yī)，隨然剛開(kāi)始病狀不會(huì)很明顯，但如果到了最后，病情變得嚴(yán)重了那就會(huì)有一系列的后果，如：糖尿病足病、糖尿病腎病、糖尿病眼病、糖尿病腦病、糖尿病性心臟病、糖尿病胰腺癌、糖尿病皮膚病、糖尿病性病、糖尿病口腔病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病神經(jīng)病變、糖尿病合并高血壓、無(wú)癥狀糖尿病、糖尿病ED。這些都是糖尿病的并發(fā)癥，這不禁讓我想起一句話，改編一下就是，糖尿病不是病，可病起來(lái)那是真要命呀。所以糖的代謝在人的一生當(dāng)中是不可缺少的東西。

以上便是我今天所介紹的我的生化心得——糖的一生

臨床三班

袁朔 201310010312

第五篇：生化實(shí)驗(yàn)計(jì)劃

2016-2017學(xué)年第一學(xué)期生物化學(xué)教研室實(shí)驗(yàn)室工作計(jì)劃

一、指導(dǎo)思想

堅(jiān)持以鄧小平理論和“三個(gè)代表”的重要思想及科學(xué)發(fā)展觀為指導(dǎo)，踐行社會(huì)主義核心價(jià)值觀,開(kāi)展教育教學(xué)改革，全力推進(jìn)以高等衛(wèi)生職業(yè)教育為核心的素質(zhì)教育，抓好教育教學(xué)管理工作。

二、工作計(jì)劃

（一）實(shí)驗(yàn)室日常管理計(jì)劃

1、牢固樹(shù)立“教學(xué)中心”意識(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的儀器耗材進(jìn)行精確登記備案，以便為《生物化學(xué)》實(shí)驗(yàn)做好后勤服務(wù)。

2、嚴(yán)格執(zhí)行儀器使用人使用儀器必須登記的規(guī)章制度。

3、嚴(yán)格執(zhí)行及時(shí)更新實(shí)驗(yàn)耗材的規(guī)章制度。

4、嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)安全條例，做好實(shí)驗(yàn)室安全意識(shí)宣講，做到實(shí)驗(yàn)室安全零事故。

5、嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室值日制度。

6、嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生制度，保持實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生整潔，給學(xué)生提供一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

7、嚴(yán)格執(zhí)行學(xué)院規(guī)定及時(shí)批改實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

8、切實(shí)做好實(shí)驗(yàn)課的示教工作。

（二）實(shí)驗(yàn)室?guī)熧Y隊(duì)伍建設(shè)

1、開(kāi)展政治學(xué)習(xí)和業(yè)務(wù)學(xué)習(xí)，特別是學(xué)習(xí)社會(huì)主義核心價(jià)值體系和人才培養(yǎng)水平評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，提高教師的政治品德和業(yè)務(wù)素養(yǎng)，組織教師開(kāi)展高等衛(wèi)生職業(yè)教育理念討論，切實(shí)轉(zhuǎn)變教學(xué)理念，改變教學(xué)方式，提高教學(xué)水平。

2、加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師的管理和培養(yǎng)，提高實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)的準(zhǔn)備能力和指導(dǎo)水平。

3、加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師的安全責(zé)任意識(shí)。

生物化學(xué)教研室 2016年9月