第一篇：分子生物學(xué)教案

分子生物學(xué)教案

第一章 緒 論

本單元或章節(jié)的教學(xué)目的與要求

主要介紹分子生物學(xué)定義、研究內(nèi)容和發(fā)展簡史及未來發(fā)展方向等。授課主要內(nèi)容及學(xué)時分配 2 學(xué)時 第一章 緒 論

1.分子生物學(xué)定義：是研究核酸等生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能、及其重要性和規(guī)律性的科學(xué)，是人類從分子水平上真正揭開生物世

界的奧秘，由被動地適應(yīng)自然界轉(zhuǎn)向主動地改造和重組自然界的基礎(chǔ)學(xué)科。

分子生物學(xué)主要研究核酸在細(xì)胞生命過程中的作用，包括核酸本身的復(fù)制、保存以及基因的表達(dá)與調(diào)控規(guī)律，所以，這門學(xué)科其實(shí)應(yīng)該

叫做核酸生物學(xué)（biology of nucleic acid）。

2.生物學(xué)大事年表 1859 年達(dá)爾文出版《物種起源》，提出了自然選擇原則。但他無法解釋生物

為什么能將性狀遺傳給下一代。

1865 年孟德爾通過他的豌豆發(fā)現(xiàn)了統(tǒng)一規(guī)律和分離規(guī)律。（Gregor Mendel,1822-1884）: 遺傳學(xué)的奠基人

1869 年米歇爾(Friedrich Miescher)分離出核酸。

1879 年弗萊明(Walter Flemming)發(fā)現(xiàn)染色體，并描述了細(xì)胞分裂過程中染色體的行為。1900 年孟德爾的成果被重新發(fā)現(xiàn)。

1903 年薩頓(Walter Sutton)發(fā)現(xiàn)染色體是成對的，并攜帶遺傳信息。

1905 年加洛德(Archibald Garrod)提出了人類先天代謝疾病的概念，這是人類自身遺傳研究的開始。

1911 年摩爾根(Thomas Hunt Morgan)提出基因?qū)W說，闡釋基因在染色體上的分布，以及繁殖過程中染色體重組形成獨(dú)特新個體的過程。

1913 年斯特提萬特(Alfred Henry Sturtevant)繪制出第一張線式基因圖譜。1928 年格里菲斯(Frederick Griffith)發(fā)現(xiàn)了一種可以在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移的遺傳分子。1929 年列文(Phoebus Levene)提出 DNA 的化學(xué)成分和基本結(jié)構(gòu)。

1944 年 Oswald Avery, Colin Macleod 和 Maclyn McCarty 指出，Griffith 發(fā)現(xiàn)的遺傳分子就是 DNA。

1948 年鮑林(Linus Pauling)提出蛋白質(zhì)為螺旋形的理論。

1950 年查加夫(Edwin Chargaff)發(fā)現(xiàn)核酸中四種堿基的含量比例是一定的。1951 年富蘭克林(Rosalind Franklin)拍攝到了核酸的 X 射線衍射照片。

1952 年 Alfred Hershey 和 Martha Chase 利用病毒證實(shí)，傳遞遺傳信息的是 DNA 而不是蛋白質(zhì)。赫爾希也由于這一研究而榮獲 1969 年的諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎。

1953 年沃森(James Watson)和克里克(Francis Crick)在《自然》雜志上發(fā)表 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)的論文。J.Watson，美國冷泉港研

究所科學(xué)家； F.Crick，英國劍橋大學(xué)教授。1953 年他們創(chuàng)立了 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，獲得 1958 年諾貝爾獎。

1956 年 Joe Hin Tjio 和 Albert Levan Hereditas 確定人類共有 23 對染色體。Arthur Kornberg 分離出 DNA 聚合酶。

1957 年 Francis Crick 發(fā)表《論蛋白質(zhì)合成》的演講，提出 DNA 制造蛋白質(zhì)的概念。1959 年 Jerome Lejeune 發(fā)現(xiàn)唐氏綜合癥（先

天愚型）是由于人體的第 21 對染色體變異造成的。唐氏綜合征是人類最早發(fā)現(xiàn)的因染色體缺陷造成的疾病。

1960 年 Sydney Brenner, Francis Crick，F(xiàn)rancois Jacob 和 Jaque Monod 發(fā)現(xiàn)信使 RNA(mRNA)。

1961 年 Francois Jacob 和 Jacques Monod 提出在分子水平上特定基因被激活或抑制的機(jī)制。J.Monod ； F.Jacob，法國科學(xué)家。由于他們提出了乳糖操縱子學(xué)說和在酶合成的遺傳調(diào)控方面的重大貢獻(xiàn)獲得 1966 年諾貝爾獎。

1966 年 Marshall Nirenberg，Har Gobind Khorana 和 Robert Holley 闡明遺傳密碼。D.Baltimore ； H.Temin，美國科學(xué)家。由于他們各自發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶，打破了中心法則，該酶能使 mRNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，使真核基

因的克隆表達(dá)成為可能，為病毒學(xué)、遺傳學(xué)、基因工程作出了重大貢獻(xiàn)，他們獲得 1965 年諾貝爾獎。

1967 年 Mary Weiss 和 Howard Green 使用體細(xì)胞雜合技術(shù)推進(jìn)人類基因圖譜繪制。1969 年 Jonathan Beckwith 分離出一個細(xì)菌基因。

1970 年 Hamilton O.Smith 發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶，對核苷酸的排列順序的研究及 DNA 重組技術(shù)的研究提供了幫助。

D.Nathans，美國霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授。由于他在限制性核酸內(nèi)切酶方面的開創(chuàng)性成就獲得 1978 年諾貝爾獎。

W.Arber，瑞士巴塞爾生物研究中心教授。1968 年他第一個指出了限制性核酸內(nèi)切酶的存在并分離了 I 型酶 EcoB，獲得了 1978 年 獲諾貝爾獎。

H Smith，美國霍普金斯大學(xué)教授。1970 年他首次分離純化了Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶 Hind Ⅱ，并闡明了其切點(diǎn)的專一性，為基因工

程的誕生奠定了基礎(chǔ)，獲得 1978 年諾貝爾獎。1972 年 Paul Berg 創(chuàng)造出第一個重組 DNA 分子。

1973 年 Herbert Boyer 和 Stanley Cohen 發(fā)展了重組 DNA 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)改造后的 DNA 分子可在外來細(xì)胞中復(fù)制。

S.Cohen，美國斯坦福大學(xué)分子生物學(xué)教授。他在質(zhì)粒的研究中作出了開創(chuàng)性的研究，1973 年他又第一個實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間抗藥性基因的轉(zhuǎn)移，創(chuàng)立了基因工程重組模式?？茖W(xué)界把這一年定為基因工程誕生之年，以紀(jì)念這位基 因工程的創(chuàng)始人。

1974 年美國發(fā)表 Belmont 報告，確立科研中進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)的政策。

1975 年 Mary-Claire King 和和 Allan C.Wilson 發(fā)現(xiàn)，人類和猩猩的基因相似度達(dá)到 99%。1975 年 Georges Kohler 和 Cesar Milstein 開發(fā)出生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)。

1977 年 Walter Gilbert，Allan M.Maxam 和 Frederick Sanger 開發(fā)出 DNA 測序技術(shù)。F.Sanger，英國劍橋大學(xué)教授。由于他在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和核酸序列分析方面的天才創(chuàng)造和震驚世界的成果，在 1958 年和 1980 年先

后兩次獲得諾貝爾獎。他是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域里唯一兩次獲得這一最高榮譽(yù)的人，是一位謙虛謹(jǐn)慎、沉默寡言的偉大科學(xué)家。

1978 年 David Botstein 開創(chuàng)核酸限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)，用于標(biāo)志不同個體間的基因差別。

1978 年美國開始借助基因技術(shù)用大腸桿菌批量生產(chǎn)人類胰島素。

P.Berg，美國斯坦福大學(xué)化學(xué)教授。他首次用 SV40 作載體與λ噬菌體實(shí)現(xiàn)了兩種病毒 DNA 的重組。由于他在重組 DNA 技術(shù)方面的功 績獲得 1980 年諾貝爾獎。

H.Boyer，美國加州大學(xué)生化教授，美國基因工程公司董事長。1977 年，他首次用細(xì)菌合成生長激素釋放抑制素，是基因工程第一塊

金牌的獲得者。接著，1980 年，他又與華盛頓大學(xué)的學(xué)者合作，用酵母生產(chǎn)了人干擾素。他籌建了美國基因工程公司，是基因工程研 究中的權(quán)威科學(xué)家。

1982 年 GeneBank 數(shù)據(jù)庫建立。

W.Gilbert，美國哈佛大學(xué)教授。他與瑞士蘇黎世大學(xué)和生物基因 公司 教授 Weissmann 合作，用細(xì)菌生產(chǎn)了人干擾素。W.Gilbert 也是測定 DNA 序列的化學(xué)直讀法創(chuàng)始人。由于他對科學(xué)的巨大貢獻(xiàn)，獲 1980 年諾貝爾獎。1983 年 Kary Mullis 發(fā)展聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)

1983 年辯認(rèn)出與亨廷頓氏癥有關(guān)的基因，這是科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的第一個人類疾病基因。

1984 年 Alec Jeffreys 發(fā)明了基因指紋技術(shù)，可以用人的頭發(fā)、血液和精液等來鑒定身份。1984 年關(guān)于人類基因組測序的第一次公開討論開始。1986 年 Leroy Hood 開發(fā)自動測序機(jī)。1988 年人類基因組組織(HUGO)成立。

1990 年美國正式啟動人類基因組計(jì)劃。隨后，德國、日本、英國、法國和中國也相繼加入該計(jì)劃。1991 年 Craig Venter 開發(fā)出新的測序技術(shù)。1994 年美國一公司推出新的轉(zhuǎn)基因西紅柿罐頭，其保質(zhì)期比普通西紅柿更長，成為人類歷史上第一個轉(zhuǎn)基因食品。

1995 年 7 月，美國人類基因組研究所繪出了流感嗜血桿菌的基因圖譜； 3 個月后，科學(xué)家又繪制出了生殖器支原體的基因圖譜。1996 酵母基因組測序完成。

1997 年蘇格蘭羅斯林研究所培育出世界上第一例體細(xì)胞克隆動物綿羊“多莉”。1997 年大腸桿菌基因組測序完成。

1997 年參加人類基因組計(jì)劃的科學(xué)家決定將研究成果無償向全世界公開。1998 年結(jié)核性分枝桿菌以及梅毒螺旋體基因組測序完成。線蟲基因組測序完成。

日本科學(xué)家用一頭成年牛的體細(xì)胞克隆出 8 頭克隆牛犢。

1999 年人類第 22 號染色體測序完成，這是第一個完成測序的人類染色體。2000 年果蠅和擬南芥的基因組測序完成。

Craig Venter 和 Celera 公司和人類基因組計(jì)劃相繼宣布，人類基因組草圖完成。2001 年 Craig Venter 公布了繪制人類蛋白質(zhì)組圖譜的計(jì)劃。2002 年水稻、小鼠、瘧原蟲和按蚊基因組測序完成

2003 年人類基因組計(jì)劃宣布，人類基因組序列圖繪制成功，人類基因組計(jì)劃的所有目標(biāo)全部實(shí)現(xiàn)。3.DNA 的發(fā)現(xiàn)

首先，40 年代發(fā)現(xiàn)了生物的遺傳物質(zhì)是 DNA。Avery 在美國 1934 年的一次學(xué)術(shù)會議上，首次報導(dǎo)了肺炎球菌(Djprococcus pneumonas)的轉(zhuǎn)化。超越時代的科學(xué)成就往往不容易很快被人們接受，Avery 成就的命運(yùn)也是一樣，當(dāng)時并沒有引起陣陣掌聲。事隔 年，他的論文才公開發(fā)表； Avery 的工作意義深遠(yuǎn)，他不僅證明 DNA 是遺傳物質(zhì)、還證明 DNA 可以把一個細(xì)菌的性狀轉(zhuǎn)給另一個

細(xì)菌，理論意義十分重大。正如諾貝爾獎金獲得者 Lederberg 指出的，Avery 的工作是現(xiàn)代生物學(xué)科學(xué)性的革命開端、也可以說是基 因工程的先導(dǎo)。

早在 1928 年，Griffith 等人就發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。細(xì)菌的毒力（致病力）是由細(xì)胞表面夾膜中的多糖

所決定的。具有光滑外表的 S 型肺炎鏈球菌因?yàn)閹в袏A膜多糖而能使小鼠發(fā)病，具有粗糙外表的 R 型細(xì)菌因?yàn)闆]有夾膜多糖而失去致 病力。

Avery 用實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)了 Griffith 的發(fā)現(xiàn)。Avery 第一個用實(shí)驗(yàn)方法證明了基因就是 DNA 分子。其次，50 年代搞清了生物遺傳物

質(zhì)的分子機(jī)制。1953 年，Watson 利 Crick 提出了 DNA 結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型。這一成就對于生命科學(xué)的發(fā)展，作出了可與達(dá)爾文學(xué)說 媲美、與孟德爾定律齊名的貢獻(xiàn)。

1952 年 Alfred Hershey 和 Martha Chase 利用病毒證實(shí)，傳遞遺傳信息的是 DNA 而不是蛋白質(zhì)。

美國冷泉港卡內(nèi)基遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家 Hershey 和他的學(xué)生 Chase 在 1952 年從事噬菌體侵染細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)。噬菌體專門寄生在細(xì)菌 體內(nèi)。噬菌體感染細(xì)菌時，1）先是其尾部吸附在細(xì)菌表面；）隨后像注射器那樣由尾部將頭部的 DNA 注入細(xì)菌體內(nèi)，蛋白質(zhì)外殼并不侵入； 3）進(jìn)入菌的 DNA 借助宿主細(xì)菌的原料和能量，合成噬菌體自身的 DNA 和蛋白質(zhì)； 4）新合成的 DNA 和蛋白質(zhì)外殼，能組裝成許許多多與親代完全相同的子代噬菌體； 5）細(xì)菌細(xì)胞因噬菌體的大量增殖而破裂，結(jié)果釋放出幾十甚至幾百個既有蛋白質(zhì)外殼又有頭部 DNA 的完整結(jié)構(gòu)的噬菌體。

第三，60 年代確定了遺傳信息的傳遞方式。從 1961 年開始，以 Nirenberg 等為代表的一批科學(xué)家，經(jīng)過不倦的努力，確定遺傳信息

是以密碼方式傳遞的，每三個核苷酸組成一個密碼子，代表一種氨基酸。

到 1966 年全部破譯了 64 個密碼，編排了一個震驚世界的密碼字典，闡述了中心法則，提出的遺傳信息流是 DNA → RNA →蛋白質(zhì)。

從此，千百年來使人迷惑不解的種瓜得瓜、種豆得豆的遺傳現(xiàn)象，在分子水平上得到了合理解釋。

4.分子生物學(xué)的研究內(nèi)容： 1）DNA 重組技術(shù) 2）基因表達(dá)調(diào)控研究 3）生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究）基因組、功能基因組與生物信息學(xué)研究

4.1 DNA 重組技術(shù) DNA 重組技術(shù)（又稱基因工程），它是將不同的 DNA 片段（某個基因或基因的一部分）按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起

來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生影響受體細(xì)胞的新的遺傳性狀。嚴(yán)格地說，DNA 重組技術(shù)并不完全等于基因工程，因?yàn)楹笳哌€包括其他可能使生物細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)得到改進(jìn)的體系。

DNA 重組技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用前景）可用于大量生產(chǎn)某些正常細(xì)胞代謝中產(chǎn)量很低的多肽，如激素、抗生素、酶類及抗體等，提高產(chǎn)量，降低成本，使許多有價值的多 肽類物質(zhì)得到廣泛應(yīng)用。）可用于定向改造某些生物的基因結(jié)構(gòu)，使它們所具備的特殊經(jīng)濟(jì)價值得到成百上千倍地提高。如用在分解石油、生產(chǎn)避孕疫苗及在 實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)蜘蛛絲等。）可用于基礎(chǔ)研究。如對啟動子的研究、增強(qiáng)子及對轉(zhuǎn)錄因子的克隆與分析的研究等。4.2 基因表達(dá)調(diào)控研究

蛋白質(zhì)分子參與被控制了細(xì)胞的一切代謝活動，而決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和合成時序的信息都由核酸（主要是 DNA）分子編碼，表現(xiàn)為特定的

核苷酸序列，所以基因表達(dá)實(shí)質(zhì)上就是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

在個體生長發(fā)育過程中生物遺傳信息的表達(dá)按一定的時序發(fā)生變化（時序調(diào)節(jié)），并隨著內(nèi)外環(huán)境的變化而不斷加以修正（環(huán)境控制）

基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上。原核生物的基因組和染色體結(jié)構(gòu)比真核生物簡單，轉(zhuǎn)錄和翻譯在同一時間和空間內(nèi)發(fā)生，基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。

真核生物有細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間和空間上是分開進(jìn)行的，并且在轉(zhuǎn)錄和翻譯后都有復(fù)雜的信息加工過程，其基因表達(dá)的調(diào)控 可以發(fā)生在各種不同的水平上。

基因表達(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究、轉(zhuǎn)錄因子研究及 RNA 剪接 3 個方面。

信號傳導(dǎo)是指外部信號通過細(xì)胞膜上的受體蛋白傳到細(xì)胞內(nèi)部，并激活諸如離子通透性、細(xì)胞形狀或其它細(xì)胞功能方面的應(yīng)答過程。

當(dāng)信號分子（配體）與相應(yīng)的受體作用后，可以引發(fā)受體分子的構(gòu)型變化，使之形成專一性的離子通道，也可以引發(fā)受體分子的蛋白激

酶或磷酸酯酶活性，還可以通過受體分子指導(dǎo)合成 cGMP、cAMP、肌醇三磷酸等第二信使分子。信號傳導(dǎo)引起細(xì)胞功能的改變，主要是由于信號最后活化了某些蛋白質(zhì)分子，使之發(fā)生構(gòu)型變化，從而直接作用于靶位點(diǎn)，打開或關(guān)閉 某些基因。

轉(zhuǎn)錄因子是一群能與基因 5 '端上游特定序列專一結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。

在對植物的某些性狀進(jìn)行遺傳分析時發(fā)現(xiàn)，某些基因的突變會影響其它基因的表達(dá)。例如，有 20 多個基因參與玉米花青素的生物合成，但其中的 Cl、r、pl、或 b 基因發(fā)生突變后，則這個代謝途徑中的結(jié)構(gòu)酶基 因全部被關(guān)閉。

真核基因在結(jié)構(gòu)上的不連續(xù)性是近10 年來生物學(xué)上的重大發(fā)現(xiàn)之一。當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄成 pre-mRNA 后，在 5 '端加帽，3 '端加 poly（A），還要切去內(nèi)含子，使外顯子（編碼區(qū)）相連后成為成熟 mRNA。

研究發(fā)現(xiàn)，許多基因中的內(nèi)含子并不是一次全部切去，而是在不同的細(xì)胞或不同的發(fā)育階段選擇性剪切其中部分內(nèi)含子，生成不同的 mRNA 及蛋白質(zhì)分子。

RNA 選擇性剪切是真核基因表達(dá)調(diào)控中一種比較靈活的方式。4.3 生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究——結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)

一個生物大分子，包括核酸、蛋白質(zhì)、多糖，具有生物活性的條件有兩個： 1）具有特定的空間結(jié)構(gòu)（三維結(jié)構(gòu)）；）在它發(fā)揮生物學(xué)功能的過程中必定存在著結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化。

結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)就是研究生物大分子特定的空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)的運(yùn)動變化與其生物學(xué)功能關(guān)系的科學(xué)。

它包括結(jié)構(gòu)的測定、結(jié)構(gòu)運(yùn)動變化規(guī)律的探索及結(jié)構(gòu)與功能間的相互關(guān)系 3 個主要研究方向。4.4 基因組、功能基因組與生物信息學(xué)

2001 年 2 月，Nature 和 Science 同時發(fā)表了人類基因組全序列，是人類歷史上最偉大的成就之一。

現(xiàn)已有數(shù)十種原核生物、酵母、果蠅、擬南芥等真核生物的基因組基本被破譯了，為人類認(rèn)識自然、改造自然打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

測定基因組序列是了解基因的第一步，只有知道了基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能和活性，才能指導(dǎo)人們利用這些基因產(chǎn)物。

于是，又提出了“蛋白組”計(jì)劃（又稱“后基因組計(jì)劃”或“功能基因組計(jì)劃”）, 目的是快速、高效、大規(guī)模鑒定基因的產(chǎn)物和功

能?；蚪M信息量龐大，如人細(xì)胞中攜帶 29 億多個堿基對。

依靠計(jì)算機(jī)快速高效運(yùn)算并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類和結(jié)構(gòu)功能預(yù)測的生物信息學(xué)相應(yīng)誕生了。有了生物信息學(xué)知識，人們可以最大限度地開發(fā)和運(yùn)用基因組學(xué)所產(chǎn)生的龐大數(shù)據(jù)。5.分子生物學(xué)展望）綿羊多利是核轉(zhuǎn)移克隆技術(shù)的第一次大的成功。在這一技術(shù)中，一個細(xì)胞的 DNA 被轉(zhuǎn)移到失去自身遺傳物質(zhì)的空的卵細(xì)胞中。然

后，卵細(xì)胞在轉(zhuǎn)移 DNA 的控制下進(jìn)行發(fā)育。成為克隆技術(shù)發(fā)展的一個里程碑。）Kind 的研究組在牛和豬的細(xì)胞中成功地使用了基因打靶技術(shù)的技術(shù)，并稱他們計(jì)劃培育“敲除”豬----這種豬將攜帶的一種

蛋白質(zhì)來幫助人體免疫系統(tǒng)接受移植的豬器官。3）人類基因組計(jì)劃與生物制藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景。

———人類基因組計(jì)劃（HGP）是人類科學(xué)史上的偉大工程，人類基因組序列的“工作框架圖”的繪就，是該計(jì)劃實(shí)施進(jìn)程中的一個重

要里程碑；——— HGP 從整體上解決腫瘤等疾病的分子遺傳學(xué)問題，6 千多種單基因遺傳病和多種多基因疾病的致病基因和相關(guān)基因 的定位、克隆和功能鑒定是 HGP 的核心部分，它將徹底改變傳統(tǒng)新藥開發(fā)的模式，并賦予基因技術(shù)的商業(yè)價值；

——— HGP 將進(jìn)一步深化生物制藥的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，引發(fā)基因診斷、基因疫苗、基因治療、基因芯片等新興產(chǎn)業(yè)；

——— HGP 完成后，人類基因序列將全部輸入公共基因數(shù)據(jù)庫，使我國的制藥工業(yè)在一個新的起點(diǎn)上與國外制藥企業(yè)展開競爭，從我國自主克隆的人類基因和公共數(shù)據(jù)庫的人類基因中開發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因組藥物，成為我國生物制藥擺脫困境的有效途徑；

———國內(nèi)上市公司已進(jìn)軍基因技術(shù)的相關(guān)產(chǎn)業(yè)，但尚處于初級階段，HGP 是國內(nèi)生物制藥公司進(jìn)行企業(yè)模式調(diào)整的重要契機(jī)，未來生

物制藥公司的競爭力主要取決于推出自主知識產(chǎn)權(quán)新藥的速度、數(shù)量和質(zhì)量。）人類基因組學(xué)的前途有關(guān)基因組的大量知識將擴(kuò)大我們對生物學(xué)過程的認(rèn)識，并帶來可評價患病危險性的新診斷手段，創(chuàng)立個人化

醫(yī)療學(xué)。基因組信息的利用會增進(jìn)對生物學(xué)過程的了解而變革生命科學(xué)，使科學(xué)家可以針對著影響健康和疾病的具體過程。

獲得利益的商業(yè)領(lǐng)域有藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)、醫(yī)學(xué)診斷、農(nóng)業(yè)，等等。

影響新藥開發(fā)的一個最重要的因素是可以用于開發(fā)新藥的已知目標(biāo)分子數(shù)量有限。疾病目標(biāo)分子可以受一種藥物影響并在人體內(nèi)引起后

續(xù)的所希望的生物學(xué)反應(yīng)。歷史上，發(fā)現(xiàn)新目標(biāo)分子的過程極慢，極費(fèi)錢，因?yàn)樗蕾囉谧龀霭l(fā)現(xiàn)的試驗(yàn)和糾正方法。基因組學(xué)研究將

使藥物設(shè)計(jì)人員直接針對有利害關(guān)系的分子，所以減少上述依賴。這樣不僅是生產(chǎn)出新的更好的藥物，而且縮短新藥上市周期，并降低 成本。

由于藥物的嚴(yán)重副作用，美國每年有 220 萬人入院，因這些副作用而死亡者超過 10 萬人。已有具體器官對藥物的基因表達(dá)分布圖，研

究人員可以更精確地研究新藥化合物的毒性。此外，基因表達(dá)數(shù)據(jù)與代謝途徑多態(tài)性信息結(jié)合起來，將為個別患者對不同劑量的反應(yīng)方

式提供重要指標(biāo)，因而明顯減少治療中產(chǎn)生的意外副作用。

受人類基因組數(shù)據(jù)影響的另一領(lǐng)域是制藥基因組學(xué)。這個學(xué)科的重點(diǎn)是找出患者內(nèi)可能影響藥療功效即個人對一具體藥物的吸收與代謝 的遺傳變異，發(fā)展更加個人化的藥物療法。因?yàn)樵絹碓蕉嗟淖C據(jù)說明，某一藥物并非對所有的人有同樣的作用，所以制藥基因組學(xué)對于

制藥和生物技術(shù)界來說已變得非常重要，以致幾乎所有制藥公司都在成立制藥基因組學(xué)機(jī)構(gòu)。以基因組學(xué)為基礎(chǔ)的新治療學(xué)將集中確定

某個人患某一種病的危險性，而留意該患者的具體基因以及與疾病相關(guān)的任何變化。這些新診斷手段可能對一患者患一具體病癥的潛在

危險性做出更準(zhǔn)確評價，給予更好的預(yù)防性治療。

農(nóng)業(yè)是可能得益于基因組學(xué)研究的另一領(lǐng)域。對動植物疾病進(jìn)行診斷并針對那些疾病發(fā)展處治方法的能力，應(yīng)能使農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改善，產(chǎn)

量提高。例如，來自疾病的遺傳信息的比較或抗蟲害植物品系和不抗蟲品質(zhì)的對比以及選育計(jì)劃中有利試驗(yàn)的運(yùn)用，將使可在世界各個

不同農(nóng)業(yè)區(qū)種植的新品系數(shù)量和成功率明顯增加。這樣不僅會增加食物數(shù)量，也提高其營養(yǎng)質(zhì)量。5）基因療法的典型例子是半乳糖血癥病人的基因治療。這種病人由于細(xì)胞內(nèi)缺少基因 G，不能產(chǎn)生半乳糖-1-磷酸干擾素基因，每 106 個細(xì)胞能生產(chǎn)干擾素 5x106 單位，并且 95 ％分泌至細(xì)胞外。

1985 年，美國加州大學(xué) Maeda 用桿狀病毒作載體，家蠶作表達(dá)系統(tǒng)，合成α干擾素基因在家蠶細(xì)胞及家蠶中的高表達(dá)”研究。他們用 PCR 技術(shù)從人染色體中擴(kuò)增出了 566bp α 1-干擾素基因，用

家蠶核型多角體病毒(BmNPV)轉(zhuǎn)移載體 pBF5 介導(dǎo)，在多角體基因強(qiáng)啟動子驅(qū)動下，分別在家蠶細(xì)胞和蟲體中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。采用微

載體 Cytodex3 高密度培養(yǎng)家蠶細(xì)胞(10L 規(guī)模)，α 1-干擾素效價達(dá)到 6.4x106 單位／ m1 ；當(dāng)用重組病毒注射感染 5 齡家蠶

時(3 萬條蟲規(guī)模)，表達(dá)效價平均達(dá)到 1x107 單位／條蠶。

α模板-dNMP 高能復(fù)合物。DNA 聚

合酶具有對此復(fù)合物核對的能力，看摻入的核苷酸是否正確。這個核苷酸（dNMP）這時可能被釋放的機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正確核苷酸。這 就是動力學(xué)校對模型。）DNA 聚合酶具有聚合酶活性，還具有 5 ' → 3 ' 和 3 ' → 5 ' 的外切酶活性。DNA 聚合酶的 3 ' → 5 ' 外切酶活性可以

隨時將已經(jīng)摻入的錯配的脫氧核糖核苷酸從生長的多核苷酸鏈上去除，保證了 DNA 復(fù)制的忠實(shí)性和準(zhǔn)確性。

1.DNA 的半保留復(fù)制機(jī)理

DNA 的復(fù)制是分別以親代 DNA 鏈為模板合成兩條子代 DNA 鏈；在子代 DNA 雙鏈中，一條是新合成的，一條是親代的，稱為 DNA 的半保留復(fù)制。

2.3.2 復(fù)制的起點(diǎn)、方向和速度

復(fù)制時，雙鏈 DNA 要解開兩股鏈分別進(jìn)行，所以這個復(fù)制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式 , 稱為復(fù)制叉。復(fù)制子（replicon）定義： DNA 分子上一個獨(dú)立的復(fù)制單位。一個復(fù)制子只含有一個復(fù)制起點(diǎn)（origin,ori）。

通常，細(xì)菌、病毒和線粒體的 DNA 分子都是作為單個復(fù)制子完成復(fù)制的，而真核生物基因組可以同時在多個復(fù)制起點(diǎn)上進(jìn)行雙向復(fù)制。

復(fù)制叉以 DNA 分子上某一特定順序?yàn)槠瘘c(diǎn)，向兩個方向等速生長前進(jìn)。一個復(fù)制原點(diǎn)連接到任一 DNA 分子上都支持其復(fù)制的能力。復(fù)

制原點(diǎn)一般由 A-T 豐富區(qū)組成。在真核細(xì)胞中，DNA 的復(fù)制屬于細(xì)胞周期的一部分。細(xì)菌中，DNA 復(fù)制與細(xì)胞生長相協(xié)調(diào)。首先是

復(fù)制周期的起始頻率被調(diào)整到與細(xì)胞生長 的速率相適應(yīng)，其次是復(fù)制周期的完成與細(xì)胞分裂相聯(lián)系。2.3.3 復(fù)制的幾種主要方式 2.3.3.1 線性 DNA 雙鏈的復(fù)制線性 DNA 先

在 ori 處形成復(fù)制眼，從復(fù)制眼開始可以單向或雙向復(fù)制，真核生物都是多復(fù)制眼起始的雙向復(fù)制。2.3.3.2 環(huán)狀 DNA 雙鏈的復(fù)制 1）θ型復(fù)制

環(huán)形 DNA 大多采用θ型復(fù)制，如 E.coli。

特點(diǎn)：從原點(diǎn) ori 開始，通常采用雙向等速復(fù)制，不斷擴(kuò)大復(fù)制泡，形成θ環(huán)。2）滾環(huán)型復(fù)制（rollingcircle）

某些環(huán)形的病毒 DNA，如θ x174、λ噬菌體都是以這種方式復(fù)制。這是一種單向復(fù)制類型。）D 環(huán)復(fù)制雙鏈環(huán)在固定點(diǎn)解開進(jìn)行復(fù)制。但兩條鏈的合成是高度不對稱的，一條鏈上迅速合成出互補(bǔ)鏈，另一條鏈則成為游離的 單鏈環(huán)（D-環(huán)）。

2.4 原核生物和真核生物 DNA 的復(fù)制特點(diǎn) 2.4.1 原核生物 DNA 的復(fù)制特點(diǎn) 2.4.1.1DNA 雙螺旋的解旋

DNA 復(fù)制時，雙鏈?zhǔn)紫冉忾_，形成復(fù)制叉

復(fù)制叉的形成過程有多種酶和蛋白質(zhì)參與。將主要的酶和蛋白質(zhì)介紹如下。1）單鏈結(jié)合蛋白（SSB 蛋白）SSB 蛋白可牢固地結(jié)合在單鏈 DNA 上，在原核生物中表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，如第一個 SSB 蛋白結(jié)合到

DNA 上去的能力為 1，第二個 SSB 蛋白結(jié)合能力則高達(dá) 103。SSB 蛋白的作用是保證被解鏈酶解開的單鏈在復(fù)制完成前能保持單

鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才掉下，重新循環(huán)。所以，SSB 蛋白只保持單鏈的存在，并不起解鏈的作用。

SSB 沒有催化功能，它可以特異性地結(jié)合在單鏈區(qū)，使之免被核酸酶水解，起到保護(hù)和維持單鏈的作用。2）DNA 解鏈酶（DNAhelicase）

用于把 DNA 雙鏈解開形成單鏈。具有 ATPase 活性，利用水解 ATP 釋放的能量，催化雙鏈 DNA 解鏈。大部分 DNA 解鏈酶（包括大腸

桿菌解鏈酶 II、III、T4 噬菌體 dda 基因、T4 基因 41 和人解鏈酶等）可沿滯后鏈模板的 5 '→ 3 '方向并隨著復(fù)制叉的前進(jìn)

而移動，只有另一種解鏈（Rep 蛋白）是沿前導(dǎo)鏈模板的 3 '→ 5 '方向移動。因此推測 Rep 蛋白和特定 DNA 解鏈酶分別在 DNA 的

兩條母鏈上協(xié)同作用，以解開雙鏈 DNA。

DNA 的解鏈過程，首先是在拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 的作用下解開負(fù)超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點(diǎn)處解開雙鏈。

參與解鏈的除一組解鏈酶外，還有 DNA 蛋白等。

一旦局部解開雙鏈，就必須有 SSB 蛋白來穩(wěn)定解開的單鏈，以保證局部結(jié)構(gòu)不會恢復(fù)成雙鏈。接著，由引發(fā)酶組成的引發(fā)體迅速作用

于兩條單鏈 DNA 上。不論是前導(dǎo)鏈還是滯后鏈，都需要一段 RNA 引物以開始子鏈 DNA 的合成 2.4.1.2 岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制在

DNA 的復(fù)制過程中，前導(dǎo)鏈?zhǔn)沁B續(xù)復(fù)制的，而滯后鏈?zhǔn)峭ㄟ^岡崎片段的連接來合成的，是不連續(xù)的，稱之為 DNA 的半不連續(xù)復(fù)制。所有

DNA 聚合酶的方向都是 5 '→ 3 '，而不是 3 '→ 5 '。為了解釋 3 '→ 5 '是如何合成滯后鏈的，岡崎提出了 DNA 的半不連續(xù)復(fù)制。

現(xiàn)在已知，一般原核生物的岡崎片段要長些，真核生物中的要短些。這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是有普遍性 的，因而稱之為 DNA 的半不連續(xù)復(fù)制。2.4.1.3 復(fù)制的引發(fā)和終止

復(fù)制起始時發(fā)生的事件：①雙鏈 DNA 在一個很小的區(qū)域內(nèi)打開，這是 oriC 區(qū)域特有的；②由解旋酶催化，開始解螺旋，并持續(xù)進(jìn)行

下去；③形成引物，第一個核苷酸裝配到引物上；這些事件對前導(dǎo)鏈只發(fā)生一次，而后滯鏈上每次開始合成岡崎片段時都要發(fā)生。

目前已知的 DNA 聚合酶都只能延長已存在的 DNA 鏈，而不能從頭合成 DNA 鏈。

研究發(fā)現(xiàn)，DNA 復(fù)制時，往往先由 RNA 聚合酶在 DNA 模板上合成一段 RNA 引物，再由 DNA 聚合酶從 RNA 引物 3 '端開始合成新的

DNA 鏈。對于前導(dǎo)鏈來說，這一引發(fā)過程比較簡單，只要有一段 RNA 引物，DNA 聚合酶就能以此為起點(diǎn)一直合成下去。但對于滯后鏈

來說，引發(fā)過程就十分復(fù)雜，需要多種蛋白質(zhì)和酶的協(xié)同作用，還牽涉到岡崎片段的形成和連接。滯后鏈的引發(fā)過程：

引發(fā)體：后滯鏈的引發(fā)過程往往由引發(fā)體（primosome）來完成。先是由 6 種蛋白： n,n ' ,n '' ,dnaB,C 和 I 構(gòu)成引發(fā)前體，而

后與引發(fā)酶（primase）結(jié)合進(jìn)一步組裝成引發(fā)體。

引發(fā)體像火車頭一樣在滯后鏈分叉的方向上前進(jìn)，并在模板上斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成滯后鏈的引物 RNA 短鏈，再由 DNA 聚合酶 III 作

用合成 DNA，直到遇到下一個引物或?qū)槠螢橹?。?RNaseH 降解 RNA 引物，并由 DNA 聚合酶 I 將缺口補(bǔ)齊，再由 DNA 連接酶

將兩個岡崎片段連在一起形成大分子 DNA。總結(jié)

前導(dǎo)鏈的連續(xù)合成和后滯鏈的不連續(xù)合成

a.旋轉(zhuǎn)酶（topoII）改變雙螺旋的構(gòu)象，解螺旋酶解開雙鏈。b.SSB 結(jié)合到解開的單鏈上。c.引發(fā)體合成 RNA 引物。d.DNA 聚合酶Ⅲ作用下合成先導(dǎo)鏈。e.滯后鏈開始合成，形成第一個岡崎片段。f.復(fù)制叉繼續(xù)前進(jìn)，前導(dǎo)鏈連續(xù)合成，滯后鏈上合成新 的 RNA 引物。g.第二個岡崎片段形成，DNA 聚合酶Ⅰ切去引物，并加上脫氧核苷三磷酸。h.間隙被 DNA 連接酶封閉。鏈的終止

除 Tus 蛋白以外，鏈的終止看起來不需要太多的蛋白質(zhì)參與。當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到 20bp 重復(fù)性終止子序列（Ter）時，Ter-Tus 復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶 IV 的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈（圖 2-23）。2.4.1.4DNA 聚合酶

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中存在 DNA 聚合酶 I、II、III。

1)DNA 聚合酶Ⅰ主要負(fù)責(zé) DNA 損傷的修復(fù)和岡崎片段之間間隙的填補(bǔ)。用枯草桿菌蛋白酶處理 DNA 聚合酶Ⅰ可得兩個片段，大片段

分子量 76kd，被叫作 klenow 片段，廣泛用于 DNA 序列分析中。

① 5' → 3' 聚合活性要求有雙鏈 DNA 模板和具有 3' 羥基的引物，活性很高，可達(dá) 1000 核苷酸 /min。② 3' → 5' 外切活性可

以對不配對的局部單鏈進(jìn)行識別，切除不配對堿基，又稱“校正功能”。③ 5' → 3' 外切活性主要功能是切除復(fù)制過程中的引物。

pol Ⅰ的 5' → 3' 外切活性有三個特點(diǎn)： a.必須有 5'-P 末端。b.被切除的核苷酸必須是氫鍵配對的。c.可以切除脫氧核糖

核苷酸，也可以切除核糖核苷酸。此酶被認(rèn)為在切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體中起著重要作用。它也可用以除去岡崎片段 5 '端 RNA 引物，使岡崎片段間缺口消失，保證連接酶將此片段連接起來。DNA 聚合酶 II 是一條 120kD 的肽鏈，催化 5 '→ 3 '方

向合成 DNA，也具有 3 '→ 5 '外切酶活性但沒有 5 '→ 3 '外切酶活性?？赡茉诋?dāng)細(xì)胞 DNA 受到化學(xué)或物理損傷時，DNA 聚合酶 II 在修復(fù)過程中起特殊作用。DNA 聚合酶Ⅲ pol Ⅲ是體內(nèi) DNA 復(fù)制的主要承擔(dān)者，是復(fù)制的主要酶類。全酶由多亞基

組成，至少有 10 種，共 22 個亞基：α 2 ε 2 θ 2 δ 2 γ 2 η 2 δ '2 χ 2 θ 2 β 2 其中α、ε、θ三種亞基組成核心酶，其它為輔助蛋白。

rRNA 的功能與蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)，可分別與 mRNA、tRNA 作用，催化肽鍵的形成。引物酶和 RNA 聚合酶引物酶：用于合成引物 的酶。利福平：抑制 RNA 的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)菌無法繁殖。用利福平處理發(fā)現(xiàn)：先導(dǎo)鏈不能合成，而后隨鏈能合成。

解螺旋酶用于把 DNA 雙鏈解開形成單鏈。具有 ATPase 活性，利用水解 ATP 釋放的能量，催化雙鏈 DNA 解鏈。

2.4.2 真核生物 DNA 的復(fù)制特點(diǎn)

真核生物 DNA 的復(fù)制與原核生物 DNA 的復(fù)制有很多不同。真核生物每條染色體上可以有多處復(fù)制起點(diǎn)，而原核生物只有一個起始點(diǎn)。

真核生物的染色體在全部完成復(fù)制之前，各個起點(diǎn)上 DNA 的復(fù)制不能再開始，而在快速生長的原核生物中，復(fù)制起點(diǎn)上可以連續(xù)開始

新的 DNA 復(fù)制，表現(xiàn)為雖只有一個復(fù)制單元，但可有多個復(fù)制叉。真核生物 DNA 的復(fù)制子稱為 ARS（autonomouslyreplicatingsequences），長約 150bp 左右，包括數(shù)個復(fù)制起始必需的保守區(qū)。真核生物 DNA 復(fù)制的起始需

要起始原點(diǎn)識別復(fù)合物（ORC）參與。真核生物 DNA 復(fù)制叉的移動速度大約只有 50bp/s，還不到大腸桿菌的 1/20，因此，人類

DNA 中每隔 3000 ～ 300000bp 就有一個復(fù)制起始位點(diǎn)。真核生物 DNA 復(fù)制必需的成份 1.染色體 DNA 復(fù)制必需三種核苷酸序列①復(fù)制起點(diǎn)②著絲粒③端粒。2.RNA 引物(RNAPrimer)，一般 8 ～ 14nt，帶游離 3'-OH 末端。

3.參加 DNA 復(fù)制的主要酶和蛋白質(zhì)。① DNA 聚合酶(DNAPolymerase)真核 DNA 復(fù)制的主要酶 DNAPola/ δ。功能 : 從 5' → 3'

方向延伸與模板互補(bǔ)的子代鏈。②引發(fā)酶(Primase)與其他多種蛋白組成多蛋白復(fù)合體-引發(fā)體(Primosome)，催化 RNA 引物合成

和復(fù)制起始。③ DNA 連接酶(DNALigase)，催化一個雙鏈 DNA 的 5 ' 磷酸與另一雙鏈 DNA 的 3 '-OH 形成磷酸二酯鍵。④ DNA

解鏈酶(DNAHelicase), 打開 DNA 雙鏈。⑤增殖細(xì)胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)，輔助催化前導(dǎo)鏈合成。

⑥端粒酶(Telomerase)末端復(fù)制問題。端粒酶負(fù)責(zé)染色體末端(端粒)復(fù)制 , 是由 RNA 和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白。其中的 RNA 成分是端粒復(fù)制的模板(因此端粒是逆轉(zhuǎn)錄酶)。作用 : 維持端粒長度。端粒酶活性可用基于 PCR 的“ TRAP ”（Telomeraserepeatamplificationprotocol）法測定（Kim,Netal.,science,266,2011-2014(1994)端粒與細(xì)胞壽命。端粒、端

粒酶與腫瘤的關(guān)系：絕大多數(shù)惡性腫瘤具有端粒酶活性但端粒縮短，但也有約 5% 的腫瘤無端粒酶活性且端粒較長。

端粒酶作為新的腫瘤標(biāo)志和腫瘤治療靶點(diǎn)。

真核生物中發(fā)現(xiàn)有 5 種 DNA 聚合酶，分別是：α、β、γ、δ、ε。

⑴ DNA 聚合酶α是 DNA 復(fù)制的主要酶類，由 4 個亞基組成。原因是：①所有強(qiáng)烈抑制α酶的抑制劑都能抑制細(xì)胞的復(fù)制。②α酶的

溫度敏感突變株使該細(xì)胞的 DNA 復(fù)制成呈溫度敏感型。③顯微注射α酶的抗體可以抑制 DNA 的復(fù)制。④α酶的活性隨細(xì)胞周期而變化，S 期活性最高。⑵ DNA 聚合酶δ具有 3 '→ 5 '外切酶活性，對于復(fù)制的真實(shí)性十分重要。同是也是前導(dǎo)鏈合成的主要酶類。聚合 酶γ負(fù)責(zé)線粒體基因組的復(fù)制。

目前認(rèn)為：α酶和δ酶都是真核 DNA 復(fù)制酶。δ酶在復(fù)制中合成前導(dǎo)鏈，α酶合成后滯鏈。δ和ε都具有 3 ‘→ 5 '外切核酸酶的

活性，說明二者都有校對功能。δ和ε之間的差別是：在催化持續(xù)的 DNA 合成時，δ需要一個輔助蛋白因子－－增值細(xì)胞核抗原

（proliferatingcellnuclearantigen,PCNA）, 而ε則不需要。β可能主要在 DNA 損傷的修復(fù)中起作用。ε的主要功能可能是在 去掉 RNA 引物后把缺口補(bǔ)全。2.4.3 DNA 復(fù)制的調(diào)控

原核細(xì)胞的生長和增殖速度取決于培養(yǎng)條件，但在生長、增殖速度不同的細(xì)胞中，DNA 鏈延伸的速度幾乎是恒定的，只是復(fù)制叉的數(shù) 量不同。

迅速分裂的細(xì)胞具有較多復(fù)制叉，而分離緩慢的細(xì)胞復(fù)制叉較少并出現(xiàn)復(fù)制的間隙。細(xì)胞內(nèi)復(fù)制叉的多少決定了復(fù)制起始頻率的高低，這可能是原核細(xì)胞復(fù)制的調(diào)控機(jī)制。復(fù)制起始頻率的直接調(diào)控因子是蛋白質(zhì)和 RNA。2.4.3.1 大腸桿菌染色體 DNA 的復(fù)制調(diào)控 原核生物 DNA 鏈的延伸速度是恒定的。與生長、增殖相配合協(xié)調(diào)的 DNA 的合成，主要依靠復(fù)制叉數(shù)量的不同。迅速分裂的細(xì)胞具有

較多的復(fù)制叉，分裂緩慢的細(xì)胞復(fù)制較細(xì)胞復(fù)制叉的多少取決于復(fù)制起始的頻率，這是原核細(xì)胞復(fù)制的調(diào)控點(diǎn)。復(fù)制子的調(diào)控由復(fù)制

起始因子和起始位點(diǎn)兩部分組成。E.coli 的起始位點(diǎn)主要是 oriC，與蛋白相互作用來啟動復(fù)制。主要的起始因子有 dnaA、dnaH 等蛋白質(zhì)，它們通過與始位點(diǎn)形成復(fù)合物相互作用，確定復(fù)制的起始頻率。研究發(fā)現(xiàn)： dnaA 對復(fù)制起正調(diào)控作用。

2.4.3.2ColE1 質(zhì)粒 DNA 的復(fù)制

ColE1DNA 復(fù)制不依賴于其本身編碼的蛋白質(zhì)，而完全依靠宿主 DNA 聚合酶。質(zhì)粒 DNA 編碼兩個負(fù)調(diào)控因子 Rop 蛋白和反義 RNA（RNA1），它們控制了起始 DNA 復(fù)制所必須的引物合成.細(xì)胞內(nèi) RNA1 的濃度決定了 ColE1 質(zhì)粒的復(fù)制起始頻率。Rop 蛋白能

提高 RNA1 與引物前體的相互作用，從而加強(qiáng)了 RNA1 的負(fù)調(diào)控作用。（圖 2-24）

2.4.3.3 真核細(xì)胞 DNA 復(fù)制的調(diào)控真核細(xì)胞中 DNA 復(fù)制有三個調(diào)控點(diǎn)：①細(xì)胞生活周期水平的調(diào)控 也稱為限制點(diǎn)調(diào)控，即決定細(xì)胞停留在 G1 還是進(jìn)入 S 期。許多外部因素和細(xì)胞因子參與限制點(diǎn)調(diào)控。促細(xì)胞分裂劑、致癌劑、外科

切除、細(xì)胞質(zhì)因子等可誘發(fā) G1 進(jìn)入 S 期。②染色體水平的調(diào)控

決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序在 S 期起始復(fù)制，這種有序復(fù)制的機(jī)理還不清楚。

③復(fù)制子水平的調(diào)控。

決定復(fù)制的起始與否。這種調(diào)控從單細(xì)胞生物到高等生物是高度保守的。

此外，真核生物復(fù)制的起始還包括轉(zhuǎn)錄活化、復(fù)制起始復(fù)合物的合成和引物合成等階段，許多參與復(fù)制起始蛋白的功能與原核生物中類

似。2.5DNA 的修復(fù) DNA 修復(fù)(DNArepairing)是細(xì)胞對 DNA 受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使 DNA 結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新能執(zhí) 行它原來的功能。2.5.1 回復(fù)修復(fù)

這是較簡單的修復(fù)方式，一般都能將 DNA 修復(fù)到原樣。

1.光修復(fù) 這是最早發(fā)現(xiàn)的 DNA 修復(fù)方式。修復(fù)是由細(xì)菌中的 DNA 光復(fù)活酶來完成，此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相

鄰嘧啶共價結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應(yīng)不需要光；結(jié)合后如受 300 － 600nm 波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體

分解為兩個正常的嘧啶單體，然后酶從 DNA 鏈上釋放，DNA 恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。后來發(fā)現(xiàn)類似的修復(fù)酶廣泛存在于動植物中，人體細(xì)胞 中也有發(fā)現(xiàn)。

2.單鏈斷裂的重接 DNA 單鏈斷裂是常見的損傷，其中一部分可僅由 DNA 連接酶(ligase)參與而完全修復(fù)。此酶在各類生物各種

細(xì)胞中都普遍存在，修復(fù)反應(yīng)容易進(jìn)行。但雙鏈斷裂幾乎不能修復(fù)。

3.堿基的直接插入 DNA 鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點(diǎn)，能被 DNA 嘌呤插入酶(insertase)識別結(jié)合，在 K ＋存在的條件下，催化游離嘌呤或脫氧嘌呤核苷插入生成糖苷鍵，且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴(yán)格配對，使 DNA 完全恢復(fù)。

2.5.2 切除修復(fù)(excisionrepair)是修復(fù) DNA 損傷最為普遍的方式，對多種 DNA 損傷包括堿基脫落形成的無堿基位點(diǎn)、嘧啶二聚

體、堿基烷基化、單鏈斷裂等都能起修復(fù)作用。這種修復(fù)方式普遍存在于各種生物細(xì)胞中，也是人體細(xì)胞主要的 DNA 修復(fù)機(jī)制。修

復(fù)過程需要多種酶的一系列作用，基本步驟包括：

①首先由核酸內(nèi)切酶識別 DNA 的損傷位點(diǎn)，在損傷部位的 5 ′側(cè)切開磷酸二酯鍵。不同的 DNA 損傷需要不同的特殊核酸內(nèi)切酶來識

別和切割。②由 DNA 解鏈酶將有損傷的 DNA 片段解離。③在 DNA 聚合酶的催化下，以完整的互補(bǔ)鏈為模板，按 5 ′→ 3 ′方向合

成 DNA 鏈，填補(bǔ)已切除的空隙。④由 DNA 連接酶將新合成的 DNA 片段與原來的 DNA 斷鏈連接起來。這樣完成的修復(fù)能使 DNA 恢復(fù)

原來的結(jié)構(gòu)。2.5.3 重組修復(fù)(recombinationalrepair)主要用于 DNA 復(fù)制時的損傷修復(fù)。DNA 重組修復(fù)方式： ①受損傷的 DNA 鏈復(fù)制時，產(chǎn)生的子代 DNA 在損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。

②另一條母鏈 DNA 與有缺口的子鏈 DNA 進(jìn)行重組交換，將母鏈 DNA 上相應(yīng)的片段填補(bǔ)子鏈缺口處，而母鏈 DNA 出現(xiàn)缺口。

③以另一條子鏈 DNA 為模板，經(jīng) DNA 聚合酶催化合成一新 DNA 片段填補(bǔ)母鏈 DNA 的缺口，最后由 DNA 連接酶連接，完成修補(bǔ)。重

組修復(fù)不能完全去除損傷，損傷的 DNA 段落仍然保留在親代 DNA 鏈上，只是重組修復(fù)后合成的 DNA 分子是不帶有損傷的，但經(jīng)多次

復(fù)制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細(xì)胞中只有一個細(xì)胞是帶有損傷 DNA 的。2.5.4 SOS 修復(fù)

SOS 修復(fù)是指 DNA 受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時所誘導(dǎo)的一種 DNA 修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)

胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為錯誤傾向修復(fù)(error  pronerepair)，使細(xì)胞有較高的突變率。當(dāng) DNA 兩條鏈的損

傷鄰近時，損傷不能被切除修復(fù)或重組修復(fù)，這時在核酸內(nèi)切酶、外切酶的作用下造成損傷處的 DNA 鏈空缺，再由損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的一

整套的特殊 DNA 聚合酶-SOS 修復(fù)酶類，催化空缺部位 DNA 的合成，這時補(bǔ)上去的核苷酸幾乎是隨機(jī)的，但仍然保持了 DNA 雙鏈的

完整性，使細(xì)胞得以生存。但這種修復(fù)帶給細(xì)胞很高的突變率。應(yīng)該說目前對真核細(xì)胞的 DNA 修復(fù)的反應(yīng)類型、參與修復(fù)的酶類和修

復(fù)機(jī)制了解還不多，但 DNA 損傷修復(fù)與突變、壽命、衰老、腫瘤發(fā)生、輻射效應(yīng)、某些毒物的作用都有密切的關(guān)系。人類遺傳性疾病

已發(fā)現(xiàn) 4000 多種，其中不少與 DNA 修復(fù)缺陷有關(guān)，這些 DNA 修復(fù)缺陷的細(xì)胞表現(xiàn)出對輻射和致癌劑的敏感性增加。DNA 修復(fù)小結(jié)

環(huán)境和生物體內(nèi)的因素都經(jīng)常會使 DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。DNA 的復(fù)制會發(fā)生堿基的配對錯誤；體內(nèi) DNA 會有自發(fā)性結(jié)構(gòu)變化，包括

DNA 鏈上的堿基異構(gòu)互變、脫氨基、堿基修飾、DNA 鏈上的堿基脫落等。外界射線的照射等物理因素，烷化劑、堿基類似物、修飾

劑等化學(xué)因素都能損傷 DNA 的結(jié)構(gòu)，變化包括有相鄰嘧啶共價二聚體的形成、堿基、脫氧核糖和磷酸基團(tuán)的烷基化和其它修飾、堿 基脫落、DNA 單鏈斷裂、雙鏈斷裂、DNA 鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)、DNA 與周圍的蛋白質(zhì)交連等。最后能導(dǎo)致 DNA 的點(diǎn)突變、DNA 核苷酸的缺失、插入或轉(zhuǎn)位、DNA 鏈的斷裂等，結(jié)果可能影響生物細(xì)胞的功能和遺傳特性，這些改

變可能會導(dǎo)致細(xì)胞死亡、也有機(jī)會使細(xì)胞獲得新的功能或進(jìn)化，也可能細(xì)胞只有 DNA 結(jié)構(gòu)的遺傳性改變而沒有表型變化，視 DNA 結(jié)

構(gòu)變化的部位、類型和范圍不同而異。

生物在進(jìn)化過程中獲得的 DNA 修復(fù)功能，對生物的生存和維持遺傳的穩(wěn)定性是至關(guān)重要的。對有些 DNA 的損傷，細(xì)胞能將其完全修

復(fù)到原樣，如可將嘧啶二聚體切開、DNA 單鏈斷裂可重新連接、堿基缺失可再配對插入、加成的烷基可以移除、一條鏈上的堿基或核

苷酸的錯誤可以切除并依賴互補(bǔ)鏈作模板而復(fù)制重新修復(fù)等。對 DNA 較嚴(yán)重的損傷，細(xì)胞可采取重組修復(fù)、SOS 修復(fù)等方式進(jìn)行反

應(yīng)，以期提高細(xì)胞的存活率，但不能完全消除 DNA 的損傷，會帶給細(xì)胞較高的突變率。DNA 的損傷和修復(fù)與遺傳、突變、壽命、衰

老、輻射效應(yīng)、腫瘤發(fā)生、某些毒劑的作用、以及某些遺傳性疾病等有密切的關(guān)系。目前對 DNA 損傷修復(fù)的認(rèn)識還不透徹。2.6 DNA 的轉(zhuǎn)座

DNA 的轉(zhuǎn)座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposableelement）介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。與 DNA 的同源

重組相比，轉(zhuǎn)座作用發(fā)生的頻率雖然要低得多，但它仍然有著十分重要的生物學(xué)意義

1.轉(zhuǎn)座子（transposon,Tn）是存在于染色體 DNA 上可自主復(fù)制和位移的基本單位。插入序列（insertionsequence，IS）它

們是不含宿主基因的最簡單的轉(zhuǎn)座子，它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒 DNA 的正常組成部分。轉(zhuǎn)座子常常被定位到特定的基因中，造成該基 因的突變。

插入序列對插入點(diǎn)后的基因產(chǎn)生極性效應(yīng)。IS 序列都是可以獨(dú)立存在的單元 , 帶有介導(dǎo)自身移動的蛋白。IS 除帶有編碼轉(zhuǎn)座酶的 基因外，不帶任何其它遺傳信息。IS 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：①長度在 1000bp 左右。②末端具有倒置重復(fù)序列，轉(zhuǎn)座時常復(fù)制靶位點(diǎn)附近的一小段 DNA（4 ～ 15bp），形

成位于 IS 兩端的正向重復(fù)區(qū)。③具有編碼轉(zhuǎn)座酶的基因。復(fù)合式轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）是由兩個重復(fù)序列夾著一個或多個結(jié)構(gòu)基因組成的轉(zhuǎn)座單位，往往存在于 R 因子及其它

質(zhì)粒中。有的復(fù)合轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列就是 IS。

IS 序列插入到某個功能基因兩端時就可能產(chǎn)生復(fù)合式轉(zhuǎn)座子。

除了末端帶有 IS 序列的復(fù)合式轉(zhuǎn)座子以外，還存在一些沒有 IS 序列、體積龐大的轉(zhuǎn)座子—— TnA 家族，一般長 4500~200000bp。3 轉(zhuǎn)座機(jī)制

轉(zhuǎn)座時發(fā)生的插入作用有一個普遍的特征，即受體分子中有一段很短的（3 ～ 12bp）、被稱為靶序列的 DNA 會被復(fù)制，使插入的

轉(zhuǎn)座子位于兩個重復(fù)的靶序列之間。轉(zhuǎn)座可分為復(fù)制性和非復(fù)制性兩大類：）在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，整個轉(zhuǎn)座子被復(fù)制了，所移動和轉(zhuǎn)位的僅僅是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。轉(zhuǎn)座酶（transposase）和解離酶

（resolvase）分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。TnA 類轉(zhuǎn)座主要是這種形式。2）在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為

一個可移動的實(shí)體直接被轉(zhuǎn)位，IS 序列、Mu 及 Tn5 等都以這種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。2.6.3 轉(zhuǎn)座作用的遺傳學(xué)效應(yīng) 1）轉(zhuǎn)座引起插入突變

如果插入位于某操縱子的前半部分，就可能造成極性突變，導(dǎo)致該操縱子后半部分結(jié)構(gòu)基因表達(dá)失活。2）轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因 3）轉(zhuǎn)座產(chǎn)生染色體畸變 4）轉(zhuǎn)座引起生物的進(jìn)化

重點(diǎn)、難點(diǎn)及對學(xué)生的要求（掌握、熟悉、了解、自學(xué)）掌握 DNA 的組成及結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，了解核小體的裝配，了解原核生物基因組的特點(diǎn)和真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。掌握 DNA 分子復(fù)

制的一般特點(diǎn)。掌握真核生物 DNA 復(fù)制必需的成份。掌握 DNA 復(fù)制的調(diào)控。了解 DNA 的修復(fù)，掌握 DNA 的轉(zhuǎn)座的機(jī)理。

輔助教學(xué)情況（多媒體課件、板書、繪圖、標(biāo)本、示教等）復(fù)習(xí)思考題 1.核酸的組成 2.何為 C 值矛盾

3.真核細(xì)胞 DNA 序列大致上可分為哪 4 類

4.為什么說細(xì)胞對 DNA 損傷的修復(fù)能力對細(xì)胞的生存是至關(guān)重要的 ? 5.體內(nèi)那些因素會導(dǎo)致 DNA 結(jié)構(gòu)的變化 ? 細(xì)胞能采取那些辦法保持 DNA 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性 ? 6.那些環(huán)境因素容易損傷生物體內(nèi)的 DNA? 損傷有那些方式和類型 ? 結(jié)果對生物細(xì)胞會有些什么影響 ? 7.現(xiàn)在所知生物細(xì)胞對 DNA 損傷修復(fù)有那些方式 ? 修復(fù)反應(yīng)的結(jié)果會如何 ?8..真核生物基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

9.原核生物基因組的特點(diǎn) 10.描述 DNA 的二級結(jié)構(gòu)

11.DNA 分子復(fù)制的一般特點(diǎn)是什么 12.DNA 的半保留復(fù)制機(jī)理 13.真核生物 DNA 的復(fù)制特點(diǎn)

14.為什么說細(xì)胞對 DNA 損傷的修復(fù)能力對細(xì)胞的生存是至關(guān)重要的 ? 15.體內(nèi)那些因素會導(dǎo)致 DNA 結(jié)構(gòu)的變化 ? 細(xì)胞能采取那些辦法保持 DNA 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性 ? 16.那些環(huán)境因素容易損傷生物體內(nèi)的 DNA? 損傷有那些方式和類型 ? 結(jié)果對生物細(xì)胞會有些什么影響 ? 17.現(xiàn)在所知生物細(xì)胞對 DNA 損傷修復(fù)有那些方式 ? 修復(fù)反應(yīng)的結(jié)果會如何 ? 第三章 生物信息的傳遞（上）－轉(zhuǎn)錄

本單元或章節(jié)的教學(xué)目的與要求：掌握轉(zhuǎn)錄的基本過程、機(jī)制 授課主要內(nèi)容及學(xué)時分配 8 學(xué)時

DNA 序列是遺傳信息的貯存者，它通過自主復(fù)制得到永存，并通過轉(zhuǎn)錄生成信使 RNA、翻譯成蛋白質(zhì)的過程來控制生命現(xiàn)象?；虮磉_(dá)

包括轉(zhuǎn)錄（transcription）和翻譯（translation）兩個階段。轉(zhuǎn)錄是指以 DNA 的一條鏈為模板在 RNA 聚合酶催化下，按照堿基

配對原則，合成一條與 DNA 鏈的一定區(qū)段互補(bǔ)的 RNA 鏈的過程稱為轉(zhuǎn)錄。翻譯是指以新生的 mRNA 為模板，把核苷酸三聯(lián)遺傳密碼子

翻譯成氨基酸序列、合成多肽的過程，是基因表達(dá)的最終目的。

編碼鏈（有義鏈）：我們把與 mRNA 序列相同的那條 DNA 鏈稱為編碼鏈（coding strand）。反義鏈（無意義鏈，負(fù)鏈）：在 RNA 的轉(zhuǎn)錄中，用作模板的 DNA 鏈稱為反義鏈（antisense 3.1RNA 的轉(zhuǎn)錄 3.1.1 轉(zhuǎn)錄的基本過程

無論是原核細(xì)胞還是真核細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄的基本過程都包括：模板的識別、起始、延伸和終止。

啟動子：與 RNA 聚合酶特異性結(jié)合以起始轉(zhuǎn)錄的一段 DNA 序列。終止子：引起轉(zhuǎn)錄終止的一段 DNA 序列。增強(qiáng)子：調(diào)節(jié)啟動子，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率的一段 DNA 序列。）模板識別階段主要指 RNA 聚合酶與啟動子 DNA 雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。

轉(zhuǎn)錄起始前，啟動子附近的 DNA 雙鏈分開形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板 DNA 的配對。轉(zhuǎn)錄起始就是 RNA 鏈上第一個核苷酸 鍵的產(chǎn)生。）轉(zhuǎn)錄起始后直到形成 9 個核苷酸短鏈，是通過啟動子階段，此時 RNA 聚合酶一直處于啟動子區(qū)，新生的 RNA 鏈與 DNA 鏈的結(jié)合

不夠牢固，很容易從 DNA 鏈上掉下來并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開始。一旦 RNA 酶成功地合成 9 個以上核苷酸并離開啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄就進(jìn)入正

常的延伸階段。所以，通過啟動子的時間代表一個啟動子的強(qiáng)弱。一般來說，通過啟動子的時間越短，該基因轉(zhuǎn)錄起始的頻率也越高。3）延伸階段：當(dāng) RNA 聚合酶離開啟動子，沿 DNA 鏈移動并使新生 RNA 鏈不斷伸長的過程就是延伸階段。大腸桿菌 RNA 聚合酶的

活性一般是每秒鐘合成 50 ～ 60 個核苷酸）終止：當(dāng)終止反應(yīng) 包括識別特定的終止位點(diǎn)，堿基不再加到鏈上，轉(zhuǎn)錄復(fù)合物停止移動，酶和 RNA 從模板上釋放。當(dāng) RNA 鏈延

伸到轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)時，RNA 聚合酶不再形成磷酸二酯鍵，RNA-DNA 雜合物分離，轉(zhuǎn)錄泡瓦解，DNA 恢復(fù)成雙鏈狀態(tài)，而 RNA 聚合

酶和 RNA 鏈都被從模板上釋放出來，這就是轉(zhuǎn)錄的終止。真核細(xì)胞中模板的識別與原核細(xì)胞不同。

真核生物 RNA 聚合酶不能直接識別基因的啟動子區(qū)，所以，需要一些被稱為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的輔助蛋白質(zhì)按特定順序結(jié)合于啟動子上，RNA 聚合酶才能與之相結(jié)合并形成復(fù)雜的前起始復(fù)合物（preinitiation transcription complex，PIC）以保證有效地起始轉(zhuǎn)錄。

轉(zhuǎn)錄和翻譯的速度基本相等，37 ℃ 時，轉(zhuǎn)錄生成 mRNA 的速度大約是每分鐘 2 500 個核苷酸，即每秒鐘合成 14 個密碼子，而蛋

白質(zhì)的合成速度大約是每秒鐘 15 個氨基酸。

正常情況下，從一個基因開始表達(dá)到細(xì)胞中出現(xiàn)其 mRNA 的間隔約為 2.5 分鐘，而再過 0.5 分鐘就能在細(xì)胞內(nèi)檢測到相應(yīng)的蛋白質(zhì)。3.1.2 轉(zhuǎn)錄機(jī)器的主要成分 3.1.2.1 RNA 聚合酶

RNA 聚合酶主要以雙鏈 DNA 為模板（若以單鏈 DNA 為模板，則活性大大降低），以四種核苷三磷酸為活化前體，并以 Mg2+/Mn2+ 為

輔助因子，催化 RNA 的起始、延伸和終止，它不需要任何引物。RNA 聚合酶是轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵酶。

原核和真核生物的 RNA 聚合酶雖然都能催化 RNA 的合成，但在分子組成、種類和生化特性上不同。1.原核生物的 RNA 聚合酶

E.coliRNA 聚合酶的組成及各亞基的功能 E.coli 和其它原核細(xì)胞一樣，只有一種 RNA 聚合酶。大腸桿菌的 RNA 聚合酶全酶由 5 種亞基α 2 ββ' w ζ組成，ζ因子與其它

部分的結(jié)合不是十分緊密，它易于與β'βα 2 分離，含有α 2 ββ' w 的酶稱為核心酶，加上ζ亞基則成為全酶。五種亞基的功能

分別為：α亞基：可能與核心酶的組裝及啟動子識別有關(guān)，并參與 RNA 聚合酶和部分調(diào)節(jié)因子的相互作用。β亞基：含催化部位，起

催化作用，催化形成磷酸二酯鍵。w 亞基：在全酶中存在，功能不清楚。β'亞基：與 DNA 模板結(jié)合功能。ζ亞基：識別起始位點(diǎn)。

它負(fù)責(zé)模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始。

不同的原核生物，具有基本相同的核心酶，但其ζ亞基有所差別，決定了原核基因的選擇性表達(dá)。2.真核生物的 RNA 聚合酶真核生物中已發(fā)現(xiàn)有三種細(xì)胞核的 RNA 聚合酶，分別稱為 RNA 聚合酶 I、II、III，分子量大致都 在 50 萬道爾頓左右。

它們專一性地轉(zhuǎn)錄不同的基因，因此由它們催化的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也各不相同。RNA 聚 I 合成 RNA 的活性最顯著，它位于核仁中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)

錄編碼 rRNA 的基因。而細(xì)胞內(nèi)絕大部分 RNA 是 rRNA。

RNA 聚合酶 II，位于核質(zhì)中，負(fù)責(zé)核內(nèi)不均一 RNA 的合成，而 hnRNA 是 mRNA 的前體。RNA 聚合酶 III 負(fù)責(zé)合成 tRNA 和許多小的核內(nèi) snRNA。

鵝膏蕈堿是真核生物 RNA 聚合酶特異性抑制劑，三種真核生物 RNA 聚合酶對鵝膏蕈堿的反應(yīng)不同。不同生物 3 類聚合酶的亞基種類和大小各異，但共性是： 1）聚合酶中含有兩個相對分子質(zhì)量超過 1 × 105 的大亞基 ；）同種生物 3 類聚合酶有“共享”小亞基的傾向，即有幾個小亞基是其中 3 類或 2 類聚合酶所共有的。3.1.2.2 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物

轉(zhuǎn)錄可被分成 4 個階段： 啟動子的選擇（起始位點(diǎn)的識別）轉(zhuǎn)錄起始 鏈的延伸 轉(zhuǎn)錄終止 啟動子的選擇包括 RNA 聚合酶全酶對啟動子的識別，聚合酶與啟動子可逆性結(jié)合形成封閉復(fù)合物（closed complex）。此時，DNA 仍處于雙鏈狀態(tài)。

伴隨著 DNA 構(gòu)象上的重大變化，封閉復(fù)合物轉(zhuǎn)變成開放復(fù)合物（open complex），聚合酶全酶所結(jié)合的 DNA 序列中有一小段雙鏈 被解開。

對于強(qiáng)啟動子來說，從封閉復(fù)合物到開放復(fù)合物的轉(zhuǎn)變是不可逆的，是快反應(yīng)。開放復(fù)合物與最初的兩個 NTP 相結(jié)合并在這兩個核苷

酸之間形成磷酸二酯鍵后，即轉(zhuǎn)變成包括 RNA 聚合酶、DNA 和新生 RNA 的三元復(fù)合物。除了 RNA 聚合酶之外，真核生物轉(zhuǎn)錄過程中至少還需要 7 種輔助因子參與。因?yàn)椴簧佥o助因子本身就包含多個亞基，所以轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的分子量特別大。見表 3-4 真核生物 RNA 聚合酶 II 所形成的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物（p69）。一般情況下，該復(fù)合物可以進(jìn)入兩條不同的反應(yīng)途徑：

* 一是合成并釋放 2 ～ 9 個核苷酸的短 RNA 轉(zhuǎn)錄物，即所謂的流產(chǎn)式起始；

* 二是盡快釋放ζ亞基，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物通過上游啟動子區(qū)并產(chǎn)生由核心酶、DNA 和新生 RNA 所組成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物。

ζ因子的作用只是起始而已，一旦轉(zhuǎn)錄開始，它就脫離了起始復(fù)合物，而由核心酶負(fù)責(zé) RNA 鏈的延伸。因此，聚合酶全酶的作用是啟動子的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始，而核心酶的作用是鏈的延伸。

轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物是轉(zhuǎn)錄循環(huán)中十分重要的環(huán)節(jié)。與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物相比，延伸復(fù)合物極為穩(wěn)定，可長時間地與 DNA 模板相結(jié)合而不解

離。只有當(dāng)它遇到轉(zhuǎn)錄終止信號時，RNA 聚合酶才停止加入新的核苷酸，RNA-DNA 雜合物解離，釋放轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并導(dǎo)致聚合酶本身從 模板 DNA 上掉下來。

TF Ⅱ D 介導(dǎo)形成轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物(pre intitiationcomplex, PIC)RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合體的形成示意圖轉(zhuǎn)錄前先是 TF Ⅱ－ D 與 TATA 盒結(jié)合① TF Ⅱ－ A 結(jié)合在 TF Ⅱ－ D 上游② TF Ⅱ－ B 結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近③ RNA 聚合酶Ⅱ與 TF Ⅱ－ F 偶聯(lián)形成復(fù)合體結(jié)合到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)④ TF Ⅱ－ E 結(jié)合在 RNA 聚合酶Ⅱ的下游⑤ TF Ⅱ－ H 和 TF Ⅱ－ J 結(jié)合上去，形成完整的

轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物和 TF Ⅱ－ J 結(jié)合上去，形成完整的轉(zhuǎn)錄起 3.2 啟動子與轉(zhuǎn)錄起始

大腸桿菌 RNA 聚合酶與啟動子的相互作用主要包括啟動子區(qū)的識別、酶與啟動子的結(jié)合及ζ因子的結(jié)合與解離。

3.2.1 啟動子區(qū)的基本結(jié)構(gòu)

啟動子：是一段位于結(jié)構(gòu)基因 5 '端上游區(qū)的 DNA 序列，在轉(zhuǎn)錄起始之前被 RNA 聚合酶結(jié)合的 DNA 部位稱為啟動子。

轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵階段，而這一階段的重要問題是 RNA 聚合酶與啟動子的相互作用。啟動子的結(jié)構(gòu)影響了它與 RNA 聚合酶的親和力，從而影響了基因表達(dá)的水平。

轉(zhuǎn)錄單元（transcription unit）是一段從啟動子開始到終止子（terminator）結(jié)束的 DNA 序列，RNA 聚合酶從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)開始

沿著模板前進(jìn)，直到終止子為止，轉(zhuǎn)錄出一條 RNA 鏈。在細(xì)菌中，一個轉(zhuǎn)錄單元可以是一個基因，也可以是幾個基因。

轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)是指與新生 RNA 鏈第一個核苷酸相對應(yīng) DNA 鏈上的堿基，研究證實(shí)通常為一個嘌呤。常把起點(diǎn)前面，即 5 '末端的序列稱為上游（upstream）;而把其后面即 3 '末端的序列稱為下游（downstream）。

在描述堿基的位置時，起點(diǎn)為＋ 1，下游方向依次為＋ 2，＋ 3 ??，上游方向依次為－ 1，－ 2，－ 3 ??。

Pribnow 框（-10 序列）在轉(zhuǎn)錄開始位點(diǎn)上游-10 區(qū)域，大致在-4~-13 之間有一個典型的 6bp 序列，大多為 TATAAT 或稍有變化 的形式，稱為 Pribnow 框或-10 序列（TATA 區(qū)）。該共同序列的頻度為： T 89A 89T 50A 65A 65T100 目前認(rèn)為，Pribnow 框決

定著轉(zhuǎn)錄的方向，是 RNA 聚合酶牢固結(jié)合的位置。

-35 序列（Sexfama box）在轉(zhuǎn)錄開始位點(diǎn)上游-35 區(qū)域也有一段保守序列，共同序列是 TTGACA，稱為-35 區(qū)。其保守頻度為： T85T 83G 81A 61C 69A 52 下降突變：啟動子里核苷酸的改變造成啟動子效率降低。突變后的-10 區(qū)和-35 區(qū)越接近共同序列，轉(zhuǎn)

錄的 RNA 就越多；越遠(yuǎn)離共同序列，轉(zhuǎn)錄的 RNA 就越少。

在真核生物中，Hogness 等先在珠蛋白基因中發(fā)現(xiàn)了類似 Pribnow 區(qū)的 Hogness 區(qū)（Hogness box），這是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上

游－ 25 ～－ 30bp 處的共同序列 TATAAA，也稱為 TATA 區(qū)。

另外，在起始位點(diǎn)上游－ 70 ～－ 78bp 處還有另一段共同序列 CCAAT，這是與原核生物－ 35bp 區(qū)相對應(yīng)的序列，稱為 CAAT 區(qū)（CAAT box）。3.2.2 啟動子區(qū)的識別

一般認(rèn)為，RNA 聚合酶并不直接識別堿基對本身，而是通過氫鍵互補(bǔ)的方式加以識別。

在啟動子區(qū) DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)中，腺嘌呤分子上的 N6、鳥嘌呤分子上的 N2、胞嘧啶分子上的 N4 都是氫鍵供體，而腺嘌呤分子上 的 N7、N3，胸腺嘧啶分子上的 O4、O2，鳥嘌呤分子上的 N7、O6、N3 和胞嘧啶分子上的 O2 都是氫鍵受體。

由于它們分別處于 DNA 雙螺旋的大溝和小溝內(nèi)，因此都具有特定的方位，而酶分子中也有處于特定空間構(gòu)象的氫鍵受體與供體，當(dāng)它

們與啟動子中對應(yīng)的分子在一定距離內(nèi)互補(bǔ)時，就形成氫鍵，相互結(jié)合。這種氫鍵互補(bǔ)學(xué)說較為圓滿地解釋了啟動子功能既受 DNA 序

列的影響，又受其構(gòu)象影響這一事實(shí)。3.2.3 酶與啟動子區(qū)的結(jié)合

在 RNA 聚合酶與啟動子相互作用過程中，聚合酶首先與啟動子區(qū)閉合雙鏈 DNA 相結(jié)合，形成二元閉合復(fù)合物，然后經(jīng)過解鏈得到二

元開鏈復(fù)合物（圖 3-8，p74）。

解鏈區(qū)一般在－ 9 ～＋ 13 之間，而酶與啟動子結(jié)合的主要區(qū)域在其上游。一旦開鏈區(qū)解鏈，酶分子能以正確的取向與解鏈后的有關(guān) 單鏈相互作用，形成復(fù)合物。

因此，RNA 聚合酶既是雙鏈 DNA 結(jié)合蛋白，又是單鏈 DNA 結(jié)合蛋白。DNA 開鏈?zhǔn)前凑?DNA 模板序列正確引入核苷酸底物的必要條件。3.2.4 － 10 區(qū)和－ 35 區(qū)的最佳距離

在原核生物中，－ 35 區(qū)和－ 10 區(qū)的距離大約是 16 ～ 19bp，小于 15bp 或大于 20bp 都會降低啟動子的活性。

保持啟動子這兩段序列以及它們之間的距離是十分重要的，否則就會改變它所控制的基因表達(dá)水平。在細(xì)菌中常見兩種啟動子突變：

下降突變（down mutation）：如果把 Pribnow 其從 TATAAT 變成 AATAAT，就會大大降低其結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平；

上升突變（up mutation）: 即增加 Pribnow 區(qū)共同序列的同一性。

突變后的-10 區(qū)和-35 區(qū)越接近共同序列，轉(zhuǎn)錄的 RNA 就越多；越遠(yuǎn)離共同序列，轉(zhuǎn)錄的 RNA 就越少。例如，在乳糖操縱子的啟動子中，將其 Pribnow 區(qū)從 TATGTT 變成 TATATT，就會提高啟動子的效率，提高乳糖操縱子基因的轉(zhuǎn)錄水平。3.2.5 增強(qiáng)子及其功能

增強(qiáng)子（enhancer）：能強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄起始的序列稱為增強(qiáng)子或強(qiáng)化子

在 SV40 的轉(zhuǎn)錄單元上存在增強(qiáng)子，它位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約 200bp 處，為兩段 72bp 的重復(fù)序列，它們不是啟動子的一部分，但

能增強(qiáng)或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始，除去這兩段序列會大大降低這些基因的轉(zhuǎn)錄水平，若保留其中一段或?qū)⑵淙〕霾逶?DNA 分子的任何部位，就能保持基因的正常轉(zhuǎn)錄。

除 SV40 外，還在反轉(zhuǎn)錄病毒基因、免疫球蛋白基因、胰島素基因、胰麋蛋白酶基因等許多基因的啟動子區(qū)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子的存在

增強(qiáng)子很可能通過影響染色質(zhì) DNA-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或改變超螺旋的密度而改變模板的整體結(jié)構(gòu)，從而使得 RNA 聚合酶更容易與模板 DNA 相結(jié)合，起始基因轉(zhuǎn)錄。

增強(qiáng)子的作用有以下特點(diǎn)： ①增強(qiáng)效應(yīng) 非常明顯②增強(qiáng)子提高同一條 DNA 鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可以遠(yuǎn)距離作用，通常可距離 ～ 4kb、個別情況下離開所調(diào)控的基因 30kb 仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。③增強(qiáng)子作用與其序列的正反 方向無關(guān)，將增強(qiáng)子方向倒置依然能起作用。④增強(qiáng)子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強(qiáng)子不能表現(xiàn)活性。⑤但增強(qiáng)

子對啟動子沒有嚴(yán)格的專一性，同一增強(qiáng)子可以影響不同類型啟動子的轉(zhuǎn)錄。⑥增強(qiáng)子必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強(qiáng)

轉(zhuǎn)錄的作用。⑦增強(qiáng)子一般具有組織或細(xì)胞特異性。⑧大多為重復(fù)序列。沉默子 最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，以后在 T 淋巴細(xì)胞的

T 抗原受體基因的轉(zhuǎn)錄和重排中證實(shí)這種負(fù)調(diào)控順式元件的存在。目前對這種在基因轉(zhuǎn)錄降低或關(guān)閉中起作用的序列研究還不多，但

從已有的例子看到：沉默子的作用可不受序列方向的影響，也能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用，并可對異源基因的表達(dá)起作用。

3.2.6 真核生物啟動子對轉(zhuǎn)錄的影響

啟動子是指確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始的 DNA 序列。

它是在 DNA 序列 5 '上游區(qū)有一段與原核生物 Pribnow 區(qū)相似的富含 TA 的保守序列。由于該序列前 4 個堿基為 TATA 區(qū)，所以又 稱為 TATA 區(qū)（TATA box）。

真核基因的啟動子在－ 25 ～－ 35 區(qū)含有 TATA 序列，在－ 70 ～－ 80 區(qū)含有 CCAAT 序列（CAAT box），在－ 80 ～－ 110 含有 GCCACACCC 或 GGGCGGGG 序列（GC box）。

習(xí)慣上，將 TATA 區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動子元件(upstream promoter element，UPE)或稱上游激活序列（upstream activating sequence，UAS）。

原核和真核基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游區(qū)的結(jié)構(gòu)有很大差別（圖 3-9，p76）：）原核基因啟動區(qū)范圍很小，一般情況下，TATAAT（Pribnow 區(qū)）的中心位于－ 7 ～－ 10，上游－ 30 ～－ 70 區(qū)為正調(diào)控

因子結(jié)合序列，＋ 1 ～－ 20 區(qū)為負(fù)調(diào)控因子結(jié)合序列；

真核基因的調(diào)控區(qū)較大，TATAA/TA 區(qū)位于－ 20 ～－ 30，而上游－ 40 ～－ 110 區(qū)為上游激活區(qū)。2）除 Pribnow 區(qū)之外，原核基因啟動子上游只有 TTGACA 區(qū)（－ 30 ～－ 40）作為 RNA 聚合酶的主要結(jié)合位點(diǎn)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控； 而真核基因除了含有可與之相對應(yīng)的 CAAT 區(qū)之外，大多數(shù)基因還擁有 GC 區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)。TATA 區(qū)和其它兩個 UPE 區(qū)的作用有所不同： TATA 區(qū)：使轉(zhuǎn)錄精確地起始

UPE 區(qū)：對啟動子的生物活性有很大影響

CAAT 區(qū)和 GC 區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始頻率，基本不參與起始位點(diǎn)的確定。

CAAT 區(qū)對轉(zhuǎn)錄起始頻率的影響最大，該區(qū)任一堿基的改變都將極大地影響靶基因的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。TATA 區(qū)和相鄰的 UPE 區(qū)之間插入核苷酸也會使轉(zhuǎn)錄減弱。

GC 區(qū)、CAAT 區(qū)和 TATA 區(qū)都有重要功能，但不不是每個基因的啟動子區(qū)都包含這三種序列。（表 3-5，p77）

基因轉(zhuǎn)錄實(shí)際上是 RNA 聚合酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種調(diào)控元件相互作用的結(jié)果。3.3 原核生物和真核生物 mRNA 的特征比較

信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）在大腸桿菌細(xì)胞中占總 RNA 的 2 ％左右（tRNA 占 16 ％，rRNA80 ％以上）。

許多基因的 mRNA 在體內(nèi)還是相當(dāng)穩(wěn)定的，半衰期從幾個小時到幾天不等。原核和真核細(xì)胞內(nèi) mRNA 的生物合成過程和成熟的 mRNA 的結(jié)構(gòu)不同：

真核細(xì)胞 mRNA 的最大特點(diǎn)是它往往以一個較大相對分子質(zhì)量的前體 RNA 出現(xiàn)在核內(nèi)，只有成熟的、相對分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)過化

學(xué)修飾的 mRNA 才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的合成。所以，真核細(xì)胞 mRNA 的合成和功能表達(dá)發(fā)生在不同的空間和時間范疇內(nèi)。

原核生物中，mRNA 的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個細(xì)胞空間里，而且這兩個過程幾乎是同步進(jìn)行的，蛋白質(zhì)合成往往在 mRNA 剛 開始轉(zhuǎn)錄時就被引發(fā)了。

一個原核細(xì)胞的 mRNA（包括病毒）有時可以編碼幾個多肽，而一個真核細(xì)胞的 mRNA 最多只能編碼一個多肽。

原核生物常以 AUG（有時 GUG，甚至 UUG）作為起始密碼子，而真核生物幾乎永遠(yuǎn)以 AUG 作為起始密碼子。3.3.1 原核生物 mRNA 的特征）原核生物 mRNA 的半衰期短：轉(zhuǎn)錄開始 1min 后，降解就開始了，即當(dāng)一個 mRNA 的 5 ' 端開始降解時，其 3 ' 端可能仍在合 成或被翻譯。

mRNA 降解的速度大概只有轉(zhuǎn)錄或翻譯速度的一半。

因?yàn)榛蜣D(zhuǎn)錄和多肽鏈延伸的速度基本相同，所以細(xì)胞內(nèi)某一基因產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）的多少決定于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始效率。）許多原核生物 mRNA 以多順反子的形式存在： 細(xì)菌 mRNA 可以同時編碼不同的蛋白質(zhì)。

單順反子（monocistronic mRNA）: 只編碼一個蛋白質(zhì)的 mRNA。多順反子（polycistronic mRNA）：編碼多個蛋白質(zhì)的 mRNA。

操縱子（operon）：多順反子 mRNA 是一組相鄰或相互重疊基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，這樣的一組基因稱為一個操縱子，它是生物體內(nèi)的重 要遺傳單位。

幾乎所有 mRNA 都可以被分成 3 部分：編碼區(qū)、位于 AUG 之前的 5 '端上游非編碼區(qū)以及位于終止密碼子之后不翻譯的 3 '端下游 非編碼區(qū)。

對于第一個順反子來說，一旦 mRNA 的 5 '端被合成，翻譯起始位點(diǎn)即可與核糖體相結(jié)合，而后面幾個順反子翻譯的起始就會受到 其上游順反子結(jié)構(gòu)的調(diào)控。

一種情況是，第一個蛋白質(zhì)合成終止以后，核糖體分解成大、小亞基，脫離 mRNA 模板，第二個蛋白的翻譯必須等到新的小亞基和大

亞基與該蛋白起始密碼子相結(jié)合后才可能開始（圖 3-12a,p80）。

另一種情況是，當(dāng)前一個多肽翻譯完成后，核糖體分解成大、小亞基，小亞基也可能不離開 mRNA 模板，而是迅速與游離的大亞基結(jié)

合，啟動第二個多肽的合成（圖 3-12b,p80）。）原核生物 mRNA 的 5 ' 端無帽子結(jié)構(gòu)，3 ' 端沒有或只有較短的 poly（A）結(jié)構(gòu)。原核生物起始密碼子 AUG 上游 7 ～ 12 個核苷酸處有一個 SD 序列（Shine-DNAlgarno sequence）的保守區(qū)，因?yàn)樵撔蛄信c

16SrRNA3 '端反相互補(bǔ)，所以被認(rèn)為在核糖體-mRNA 的結(jié)合過程中起作用。

所有已知大腸桿菌 mRNA 的翻譯起始區(qū)都含有 4 ～ 5 個（至少 3 個）對應(yīng)于 SD 序列的核苷酸。表 3-6 SD 序列的例子（p80）。

細(xì)菌 16SrRNA 的 3 '末端既非常保守，又高度自我互補(bǔ)，能形成“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)（圖 3-14，p82）。3.3.2 真核生物 mRNA 的特征

“基因”的分子生物學(xué)定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能 RNA 所必須的全部核苷酸序列。真核生物 mRNA 結(jié)構(gòu)上的最大特征是 5 '端的帽子及 3 '端的 poly（A）結(jié)構(gòu)。）真核生物 mRNA 的 5 ' 端的帽子結(jié)構(gòu)，真核生物 mRNA 的 5 ' 端大多具有 m7GPPPN 的帽子結(jié)構(gòu)。5 ' 終端是在一個 mRNA 轉(zhuǎn)

錄后加上去甲基化的鳥嘌呤（G）。

mRNA 5 ' 端加“ G ”的反應(yīng)是由腺苷酸轉(zhuǎn)移酶完成的，這個反應(yīng)非常迅速。

據(jù)測算，在新生的 mRNA 鏈達(dá)到 50 個核苷酸之前，甚至可能在 RNA 聚合酶 II 離開轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之前，帽子結(jié)構(gòu)就已加到 mRNA 的

第一個核苷酸上了。這就是說，mRNA 幾乎一出生就戴上了帽子。

一般認(rèn)為，帽子結(jié)構(gòu)是 GTP 和原 mRNA5 '三磷酸腺苷（或鳥苷）縮合反應(yīng)的產(chǎn)物，新加上的 G 與 mRNA 鏈上所有其它核苷酸方向

正好相反，像一頂帽子倒扣在 mRNA 鏈上，故而得名。

帽子結(jié)構(gòu)可能使 mRNA 免遭核酸酶的破壞，而且，有帽子結(jié)構(gòu)的 mRNA 更容易被蛋白質(zhì)合成的起始因子所識別，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的

合成。mRNA 的帽子結(jié)構(gòu)常常被甲基化，由尿苷酸-7-甲基轉(zhuǎn)移酶來催化。帽子結(jié)構(gòu)的功能： ? 對翻譯起識別作用。②可以保護(hù) mRNA 免遭核酸酶降解。不是所有的真核生物 mRNA 都有 5 '端帽子結(jié)構(gòu)。2）絕大多數(shù)真核生

物 mRNA 具有 poly（A）尾巴。除組蛋白基因外，真核生物 mRNA 的 3 '末端都有 poly（A）序列，長度為 40 ～ 200bp。幾 乎所有真核基因的 3 '末端轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)上游 15 ～ 30bp 處的保守序列 AAUAAA 對于初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準(zhǔn)確切割及加 poly（A）是

必須的。poly（A）是 mRNA 由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必須的形式，它大大提高了 mRNA 在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。當(dāng) mRNA 剛從細(xì)胞核

進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時，其 poly（A）尾巴一般較長，隨著 mRNA 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)逗留時間的延長，poly（A）逐漸變短消失，mRNA 進(jìn)入

降解過程。真核生物 mRNA 大都有 poly（A）尾巴這一特性，廣泛用于分子克隆。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。盡管大部分真核 mRNA 大都有

poly（A）尾巴，細(xì)胞中仍有多達(dá) 1/3 沒有 poly（A）尾巴的 mRNA。真核 mRNA 中 poly(A)化必要的 2 個序列信號和切斷位點(diǎn)：

human α-globin UUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAGCCUGUGUGUGCCUGGGUUCUCU human β-globin CCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCAAUGAUGUAUUUAAAUUAU human growth hormoneCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAUUGUCUGACUAGGUGUCCUC 真核基因大多是斷裂的，也就是說，一個基因可由多個內(nèi)含子和外顯子間隔排列而成。研究表明，內(nèi)含子在真核基因中所占的比例很高，甚至超過 99 ％。

由 DNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物－－核不均一 RNA（hnRNA,heterogeneous nuclear RNA），即 mRNA 的前體，經(jīng)過 5 '加帽

和 3 '酶切加 poly（A）尾，再經(jīng) RNA 的剪接，編碼蛋白質(zhì)的外顯子部分就連接成為一個連續(xù)的可讀框（open reading frame, ORF），通過核孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，就能作為蛋白質(zhì)合成的模板了。3.4 終止和抗終止

一般情況下，RNA 聚合酶起始基因轉(zhuǎn)錄后，它就會沿著模板 5 '→ 3 '方向不停地移動，合成 RNA 鏈，直到碰上終止信號時才與模

板 DNA 相脫離并釋放新生 RNA 鏈。

終止發(fā)生時，所有參與形成 RNA-DNA 雜合體的氫鍵都必須被破壞，模板 DNA 鏈才能與有義鏈重新組合成 DNA 雙鏈。

3.4.1 不依賴于ρ因子的終止

模板 DNA 上存在終止轉(zhuǎn)錄的特殊信號－－終止子，每個基因或操縱子都有一個啟動子和一個終止子。

第二篇：分子生物學(xué)教案

《分子生物學(xué)》教案

一、課程性質(zhì)

必修課

二、教學(xué)目的要求

分子生物學(xué)是一門近年來發(fā)展迅速并且在生命科學(xué)領(lǐng)域里應(yīng)用越來越廣泛、影響越來越深遠(yuǎn)的一個學(xué)科。從學(xué)科角度來講，分子生物學(xué)函蓋面非常廣，與生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等生命科學(xué)主干課程有一些交叉。在學(xué)習(xí)本課程之前，要求學(xué)生已掌握了必要的數(shù)、理、化知識，并學(xué)習(xí)了植物學(xué)、動物學(xué)、微生物學(xué)與生物化學(xué)等基礎(chǔ)課程。

通過對本課程的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握基因概念在分子水平上的發(fā)展與演變、基因的分子結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)、基因的復(fù)制、基因表達(dá)（在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平）的基本原理、基因表達(dá)調(diào)控的基本模式、基因發(fā)生突變與交換及DNA遺傳多型性檢測的分子生物學(xué)原理，了解新興起的基因組學(xué)和后基因組學(xué)研究現(xiàn)狀。通過與實(shí)驗(yàn)課相結(jié)合，系統(tǒng)地介紹與基因克隆相關(guān)的DNA技術(shù)，使學(xué)生們掌握一些基本的分子生物學(xué)技術(shù)。

三、教材及有關(guān)參考書

朱玉賢等，《現(xiàn)代分子生物學(xué)》高等教育出版社，2002 Benjamin Lewin編著

余龍等主譯，《Gene Ⅷ》科學(xué)出版社，2005 趙壽元等，《現(xiàn)代遺傳學(xué)》高等教育出版社，2001 孫乃恩等，《分子遺傳學(xué)》南京大學(xué)出版社，1990

四、適用專業(yè)

生物科學(xué)、生物技術(shù)、生物工程、科學(xué)教育等專業(yè)

五、授課學(xué)時

36學(xué)時

六、課程內(nèi)容

第一章

緒論

教學(xué)目的：使學(xué)生對分子生物學(xué)的發(fā)展簡史、分子生物學(xué)的研究內(nèi)容及發(fā)展前景有較全面的了解。

教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：基因概念的發(fā)展與演變；對現(xiàn)代遺傳學(xué)各發(fā)展階段的認(rèn)識。課時安排：4學(xué)時 教學(xué)內(nèi)容：

一、什么是分子生物學(xué)？

分子生物學(xué)是研究核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)。

二、分子生物學(xué)的發(fā)展簡史

從1847年Schleiden和Schwann提出“細(xì)胞學(xué)說”，證明動、植物都是由細(xì)胞組成的到今天，雖然不過短短一百多年時間，我們對生物大分子--細(xì)胞的化學(xué)組成卻有了深刻的認(rèn)識。孟德爾的遺傳學(xué)規(guī)律最先使人們對性狀遺傳產(chǎn)生了理性認(rèn)識，而Morgan的基因?qū)W說則進(jìn)一步將“性狀”與“基因”相耦聯(lián)，成為分子遺傳學(xué)的奠基石。Watson和Crick所提出的脫氧核糖酸雙螺旋模型，為充分揭示遺傳信息的傳遞規(guī)律鋪平了道路。在蛋白質(zhì)化學(xué)方面，繼Sumner在1936年證實(shí)酶是蛋白質(zhì)之后，Sanger利用紙電泳及層析技術(shù)于1953年首次闡明胰島素的一級結(jié)構(gòu)，開創(chuàng)了蛋白質(zhì)序列分析的先河。而Kendrew和Perutz利用X射線衍射技術(shù)解析了肌紅蛋白（myoglobin）及血紅蛋白（hemoglobin）的三維結(jié)構(gòu)，論證了這些蛋白質(zhì)在輸送分子氧過程中的特殊作用，成為研究生物大分子空間立體構(gòu)型的先驅(qū)。

總結(jié)與分子生物學(xué)相關(guān)的諾貝爾獎。

三、分子生物學(xué)的主要研究內(nèi)容 1． DNA重組技術(shù)------基因工程

基因工程指將不同DNA片段（如某個基因或基因的一部分）按照人們的設(shè)計(jì)定向連接起來，在特定的受體細(xì)胞中與載體同時復(fù)制并得到表達(dá)，產(chǎn)生影響受體細(xì)胞的新的遺傳性狀。

DNA重組技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用前景：

① 在生物技術(shù)制藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。如：利用基因工程技術(shù)改造傳統(tǒng)的制藥工業(yè)；利用克隆的基因表達(dá)生產(chǎn)有用的肽類和蛋白質(zhì)藥物或疫苗。

②定向改造某些生物的基因組結(jié)構(gòu)，使它們具備某些特殊的經(jīng)濟(jì)價值。③在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用。如：基因的克隆與分析；啟動子分析。2．基因表達(dá)調(diào)控

因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子參與并控制了細(xì)胞的一切代謝活動，而決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和合成時序的信息都由核酸（主要是脫氧核糖核酸）分子編碼，表現(xiàn)為特定的核苷酸序列，所以基因表達(dá)實(shí)質(zhì)上就是遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在個體生長發(fā)育過程中生物遺傳信息的表達(dá)按一定的時序發(fā)生變化（時序調(diào)節(jié)），并隨著內(nèi)外環(huán)境的變化而不斷加以修正（環(huán)境調(diào)控）。

原核生物的基因組和染色體結(jié)構(gòu)都比真核生物簡單，轉(zhuǎn)錄和翻譯在同一時間和空間內(nèi)發(fā)生，基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。真核生物有細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄和翻譯過程在時間和空間上都被分隔開，且在轉(zhuǎn)錄和翻譯后都有復(fù)雜的信息加工過程，其基因表達(dá)的調(diào)控可以發(fā)生在各種不同的水平上?；虮磉_(dá)調(diào)控主要表現(xiàn)在信號傳導(dǎo)研究、轉(zhuǎn)錄因子研究及RNA剪輯3個方面。

3．生物大分子結(jié)構(gòu)功能----結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)

生物大分子的結(jié)構(gòu)功能研究（又稱結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)）一個生物大分子，無論是核酸、蛋白質(zhì)或多糖，在發(fā)揮生物學(xué)功能時，必須具備兩個前提:首先，它擁有特定的空間結(jié)構(gòu)（三維結(jié)構(gòu)）；其次，在它發(fā)揮生物學(xué)功能的過程中必定存在著結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的變化。

結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)就是研究生物大分子特定的空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)的運(yùn)動變化與其生物學(xué)功能關(guān)系的科學(xué)。它包括結(jié)構(gòu)的測定、結(jié)構(gòu)運(yùn)動變化規(guī)律的探索及結(jié)構(gòu)與功能相互關(guān)系的建立3個主要研究方向。最常見的研究三維結(jié)構(gòu)及其運(yùn)動規(guī)律的手段是X射線衍射的晶體學(xué)（又稱蛋白質(zhì)晶體學(xué)），其次是用二維核磁共振和多維核磁研究液相結(jié)構(gòu)，也有人用電鏡三維重組、電子衍射、中子衍射和各種頻譜學(xué)方法研究生物高分子的空間結(jié)構(gòu)。

4．功能基因組學(xué)與生物信息學(xué)研究

先后完成了包括從大腸桿菌、釀酒酵母到線蟲等十余種模式生物基因組全序列的測定工作，并于2002年2月12日完成人類基因組測序工作。世界兩大最著名的學(xué)術(shù)刊物－nature和science同時發(fā)表了人類基因組全序列。

基因組測序工作的進(jìn)展是非常令人振奮的。但是也隨之產(chǎn)生了新問題。大

量涌出的新基因數(shù)據(jù)迫使我們不得不考慮這些基因編碼的蛋白質(zhì)有什么功能這個問題。在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。因此讀懂基因組稱為后基因組時代的生命科學(xué)領(lǐng)域面臨的巨大的挑戰(zhàn)。

在功能基因組時代，應(yīng)用生物信息學(xué)方法，高通量地注釋基因組所有編碼產(chǎn)物的生物學(xué)功能是一個重要的特征。生物信息學(xué)是在各種“組學(xué)”研究的推動下發(fā)展起來的.傳統(tǒng)的研究方法是只研究某一個基因或蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而“組學(xué)“的研究是采用高通量的技術(shù)分析細(xì)胞中全部的基因和蛋白質(zhì)，這樣勢必會產(chǎn)生海量的信息，因此，人們必須尋求一種高速度、高效率、大規(guī)模的方式積累數(shù)據(jù)處理分析方法。

四、分子生物學(xué)展望 未來的發(fā)展方向：

不同模式生物基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的比較分析；RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；表觀遺傳（epigenetic）信息的整合；從數(shù)據(jù)整合到系統(tǒng)生物學(xué)（systems biology）。

第二章 遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)－DNA 教學(xué)目的：使學(xué)生了解并掌握DNA的結(jié)構(gòu)與功能

教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：DNA的一級結(jié)構(gòu)的測定，DNA的二級結(jié)構(gòu)及超螺旋結(jié)構(gòu)。課時安排：4學(xué)時 教學(xué)內(nèi)容：

第一節(jié)DNA的一級結(jié)構(gòu) 一、一級結(jié)構(gòu)的構(gòu)成

所謂DNA的一級結(jié)構(gòu)，就是指4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該DNA分子的化學(xué)構(gòu)成。核苷酸序列對DNA高級結(jié)構(gòu)的形成有很大影響，如B-DNA中多聚（G-C）區(qū)易出現(xiàn)左手螺旋DNA（Z-DNA），而反向重復(fù)的DNA片段易出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)等。

二、一級結(jié)構(gòu)的序列測定

目前所用的DNA測序方法是在末端終止法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。由英國科學(xué)家Sanger提出的。Sanger在生物大分子的序列測定方面做出了杰出貢獻(xiàn)。他曾在1953年利用小片段重迭法成功測定了胰島素51個氨基酸序列，并獲得諾貝爾獎。1977年又利用末端終止法測定了?X174噬菌體得DNA序列，第二次獲得諾貝爾獎。

末端終止法又稱為雙脫氧法，基本原理是模擬體內(nèi)DNA的復(fù)制過程在體外合成DNA，通過測定DNA片段的相對長度來推斷核苷酸序列。

至于成分大家不要死記，可以回憶一下DNA復(fù)制過程需要哪幾種組分：模板、dNTP、引物、DNA聚合酶，其中一種dNTP的磷酸基團(tuán)用P32標(biāo)記。除此之外還需要每個管中分別加入一種ddNTP。DDNTP是雙脫氧核苷酸，由于在3?位上缺少-OH，無法與下一個單體之間形成磷酸二酯鍵，因此，一旦摻入DNA鏈的延伸后，便終止DNA的合成這樣，在DNA聚合酶的作用下核苷酸鏈不斷延伸，我們可以調(diào)整dNTP和ddNTP的濃度，使ddNTP在每個位置上都有一個摻入的機(jī)會。每個管都會產(chǎn)生一系列長短不一的DNA片段，其共同特征是末端的最后一個堿基是相同的。我們將所得的所有DNA片段進(jìn)行凝膠電泳，長度不同，泳動的速度不同。8%-20%的聚丙烯酰胺可將相差一個堿基的DNA片段區(qū)

分開，由于dCTP是放射性標(biāo)記的，我們將凝膠放射自顯影后，有DNA片段的位置就會顯示出相應(yīng)的信號帶。自下而上依次將堿基序列讀出。

第二節(jié)DNA的二級結(jié)構(gòu) 一、二級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)

DNA不僅具有嚴(yán)格的化學(xué)組成，還具有特殊的高級結(jié)構(gòu)，它主要以有規(guī)則的雙螺旋形式存在，其基本特點(diǎn)是：

1、DNA分子是由兩條互相平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的；

2、DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)；

3、兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結(jié)合，形成堿基對，它的組成有一定的規(guī)律。這就是嘌呤與嘧啶配對，而且腺嘌呤（A）只能與胸腺嘧啶（T）配對，鳥嘌呤（G）只能與胞嘧啶（C）配對。如一條鏈上某一堿基是C，另一條鏈上與它配對的堿基必定是G。堿基之間的這種一一對應(yīng)的關(guān)系叫堿基互補(bǔ)配對原則。組成DNA分子的堿基雖然只有4種，它們的配對方式也只有A與T，C與G兩種，但是，由于堿基可以任何順序排列，構(gòu)成了DNA分子的多樣性。例如，某DNA分子的一條多核苷酸鏈有100個不同的堿基組成，它們的可能排列方式就是4100。

二、變性、復(fù)性及雜交

變性：指雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，只涉及次級鍵的破壞。常用的DNA變性方法：熱變性和用變性劑處理。

如何判斷DNA是否發(fā)生變性了呢？常用的方法是測定DNA的光吸收值。在堿基的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)中存在共扼雙鍵，在240－290nm波長有一強(qiáng)烈的吸收峰，最大吸收值在260nm。（蛋白質(zhì)由于存在肽鍵，在280nm有明顯的吸收峰）當(dāng)DNA變性時，有序的堿基排列被破壞，光吸收值顯著增加，該現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。當(dāng)緩慢增加DNA溶液的溫度時，記錄不同溫度下的A260的數(shù)值，即繪制成DNA的變性曲線。以溫度為橫坐標(biāo)，以A260為縱坐標(biāo)。當(dāng)A260增加到最大值的一半時，這時的溫度稱為DNA的溶解溫度或熔點(diǎn)，Tm表示。

除此之外，光吸收法也是實(shí)驗(yàn)室定量測定DNA和RNA濃度和純度的一種方法。從某種樣品中提取了基因組DNA，可根據(jù)A260/A280的比值判斷其純度。

復(fù)性：變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)條件下重新締合成雙螺旋的過程。

雜交：在退火條件下，帶有互補(bǔ)核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應(yīng)的互補(bǔ)區(qū)段會形成雙鏈結(jié)構(gòu)。分子雜交是分子生物學(xué)常用的技術(shù)，可用來檢測某一特定基因的時空表達(dá)情況和在基因組中的。

分子雜交最初是由Southern設(shè)計(jì)出來的。當(dāng)時是用DNA探針檢測的DNA，也就是DNA與DNA的雜交，人們就將這種方法稱為是Southern blotting。在此基礎(chǔ)上，人們設(shè)計(jì)出DNA探針檢測RNA，稱為Northern blotting。

基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法（southern、northern）是一致的，都是探針和互補(bǔ)的靶基因結(jié)合，通過隨后的信號檢測進(jìn)行定性與定量分析?；蛐酒―NA microarray）指將N個目的DNA用自動化設(shè)備點(diǎn)在固體支持物上，DNA經(jīng)固化后，用不同顏色的熒光標(biāo)記的探針對這些DNA同時進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交結(jié)果呈現(xiàn)的不同顏色，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析后得到關(guān)于N個基因表達(dá)情況的數(shù)據(jù)。

第三節(jié)DNA的高級結(jié)構(gòu)

一、超螺旋結(jié)構(gòu)及拓?fù)洚悩?gòu)體

雙螺旋DNA進(jìn)一步扭曲盤繞則形成其三級結(jié)構(gòu)，超螺旋是DNA三級結(jié)構(gòu)的主要形式。自從1965年Vinograd等人發(fā)現(xiàn)多瘤病毒的環(huán)形DNA的超螺旋以來，現(xiàn)已知道絕大多數(shù)原核生物都是共價封閉環(huán)(covalently closed circle,CCC)分子，這種雙螺旋環(huán)狀分子再度螺旋化成為超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)。有些單鏈環(huán)形染色體(如φ×174)或雙鏈線形染色體(如噬菌體入)，在其生活周期的某一階段，也必將其染色體變?yōu)槌菪问健τ谡婧松飦碚f，雖然其染色體多為線形分子但其DNA均與蛋白質(zhì)相結(jié)合，兩個結(jié)合點(diǎn)之間的DNA形成一個突環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)，類似于CCC分子，同樣具有超螺旋形式。超螺旋按其方向分為正超螺旋和負(fù)超螺旋兩種。真核生物中，DNA與組蛋白八聚體形成核小體結(jié)構(gòu)時，存在著負(fù)超螺旋。研究發(fā)現(xiàn)，所有的DNA超螺旋都是由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶產(chǎn)生的。

二、拓?fù)洚悩?gòu)變化的生物學(xué)意義

DNA拓?fù)洚悩?gòu)的變化是DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程所必須的。

一個閉合的DNA 分子可以用其連環(huán)數(shù)進(jìn)行描述，連環(huán)數(shù)(Linking number)

是指一條鏈空間跨越另一條鏈的次數(shù)。順序相同的閉合DNA 分子可能有不同的連環(huán)數(shù)，這反映了超螺旋程度的差異。連環(huán)數(shù)不同的相同DNA 分子稱為拓?fù)洚悩?gòu)體(Topological isomers)。

連環(huán)數(shù)由兩個成分組成：纏繞數(shù)(Writhing number ,W)和扭轉(zhuǎn)數(shù)(Twisting number, T)。扭轉(zhuǎn)數(shù)T 是雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)自身的一種性質(zhì)，代表一條鏈繞另一條鏈旋轉(zhuǎn)的雙螺旋總?cè)?shù)。它由每一圈配對的堿基數(shù)決定。對于平放在平面上的一個松弛的閉合環(huán)狀DNA 來說，用堿基對的總數(shù)除以每一圈的堿基對數(shù)就是它的扭轉(zhuǎn)數(shù)。

纏繞數(shù)W 代表雙螺旋軸在空間上的彎曲，在直觀上與超螺旋的概念相對應(yīng)，但并非具有完全相同的數(shù)量上的定義或衡量。對于一個松弛分子，W=0 時連環(huán)數(shù)等于扭轉(zhuǎn)數(shù)。我們經(jīng)常用下面的公式計(jì)算連環(huán)數(shù)的變化量：

ΔL=ΔW+ΔT

第三章 染色體和基因

教學(xué)目的：使學(xué)生掌握基因組的概念、原核生物基因組的特點(diǎn)和真核生物染色體及基因組特點(diǎn)。

教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：真核生物染色體的基本特征；衛(wèi)星DNA及在分子標(biāo)記中的應(yīng)用；斷裂基因；基因家族及串連重復(fù)基因簇。

課時安排：4學(xué)時 教學(xué)內(nèi)容：

第一節(jié)基因組大小與C值矛盾

一、基因組概念

一個物種單倍體的染色體的數(shù)目，稱為基因組?；蚪M中DNA 的總量是物種所特有的，稱為C 值(C-value)。C 值的范圍變化很大，從微生物中的<106 到一些植物和兩棲類的>1011。圖3.1 總結(jié)了進(jìn)化中不同門類生物的C 值范圍。隨著復(fù)雜度增加，每組中最小基因組大小也會隨著增加。

三、C值矛盾現(xiàn)象

單倍體基因組DNA 含量在低等真核生物中與形態(tài)復(fù)雜性有一定的正相關(guān)，但在高等真核生物中卻非如此，它們的單倍體基因組DNA 含量變化不定?；蚪M大小與遺傳復(fù)雜性并非線性相關(guān)，稱為C 值矛盾(Paradox)。它涉及到真核基因組絕對和相對的DNA 數(shù)量。例如，蟾蜍Xenopus 和人類基因組大小差不多，但是人類遺傳發(fā)育上更為復(fù)雜。在表面復(fù)雜程度相似的種屬間(見圖)也存在C 值矛盾，這個問題局限于一些種族內(nèi)，昆蟲、兩棲和植物最為明顯。在兩棲中，最小的基因組<109bp，但是最大的基因組大約1011bp。這些兩棲類間的差別似乎并不需要基因間這么大的差別，表明在大的基因組中有非編碼DNA 的大量增加。目前我們并不清楚為什么自然選擇允許這些DNA 的聚集(在其他種族中這種情況并不發(fā)生，基因組的分布是窄的。鳥類、爬蟲類和哺乳類只允許小的偏差，其差異在基因組大小兩倍范圍之內(nèi))。

第二節(jié)原核生物染色體及基因

原核生物的DNA與稀疏的蛋白質(zhì)結(jié)合，存在于類核體上，沒有核膜包被。原核生物DNA分子小，基因排列緊密，空間利用率高。

1．功能上相關(guān)的幾個結(jié)構(gòu)基因前后相連，再加上一個共同的調(diào)節(jié)基因和一組共同的控制位點(diǎn)（啟動子promoter、操縱子operator），在基因轉(zhuǎn)錄時協(xié)同動作，組成操縱元（operon）。介紹乳糖操縱元的結(jié)構(gòu)、調(diào)控機(jī)制。2．絕大部分為編碼基因，并通常以單拷貝形式存在。3．重疊基因

第三節(jié)真核生物的染色體

一、染色體的基本組成單位－核小體

真核生物的染色體(chromasome)在細(xì)胞生活周期的大部分時間里都是以染色質(zhì)(chromatin)的形式存在的。

核小體是構(gòu)成染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，使得染色質(zhì)中DNA、RNA和蛋白質(zhì)組織成為一種致密的結(jié)構(gòu)形式。核小體由核心顆粒(core particle)和連接區(qū)DNA(linker DNA)二部分組成，在電鏡下可見其成捻珠狀，前者包括組蛋白H2A，H2B，H3和H4各兩分子構(gòu)成的致密八聚體(又稱核心組蛋白)，以及纏繞其上一又四分之三圈長度為146bp的DNA鏈；后者包括兩相鄰核心顆粒間約60bp的連接DNA和位于連接區(qū)DNA上的組蛋白H1(見圖），連接區(qū)使染色質(zhì)纖維獲得彈性。核小體是DNA緊縮的第一階段，在此基礎(chǔ)上，DNA鏈進(jìn)一步折疊成每圈六個核小體，直徑30nm的纖維狀結(jié)構(gòu)，這種30nm纖維再扭曲成襻，許多襻環(huán)繞染色體骨架(Scaffold)形成棒狀的染色體，最終壓縮將近一萬倍。這樣，才使每個染色體中幾厘米長(如人染色體的DNA分子平均長度為4cm)的DNA分子容納在直徑數(shù)微米(如人細(xì)胞核的直徑為6－7μm)的細(xì)胞核中。

二、染色體的基本特征－端粒、著絲粒 1．著絲粒

在有絲分裂中，姊妹染色單位向細(xì)胞相反的兩極移動。它們的運(yùn)動依賴于染色體與微管(Microtubule)的接觸，在另一端與極相連接(微管組成細(xì)胞的纖絲體系，在有絲分裂期間它們把染色體與細(xì)胞的極相連)。在微管端部的兩個區(qū)域連接著微管組織中心(Microtubule organizing centers，MTOCs)，它位于染色體中心粒附近和兩個極上。染色體上負(fù)責(zé)其在有絲分裂和減數(shù)分裂時分離的區(qū)域稱為著絲粒

著絲粒的DNA順序稱為CEN順序。CEN 區(qū)域中存在三種類型的序列元件(圖)： CDE-Ⅰ是所有中心粒左側(cè)邊界變化很少的9bp 保守序列。CDE-Ⅱ是所有中心粒中都存在的A?T 比例大于90% 的80-90bp 長序列，其功能依賴于其長度而非準(zhǔn)確序列，其成份是一些真核生物中短的隨機(jī)重復(fù)(衛(wèi)星)DNA 序列的遺跡，其堿基成分可能產(chǎn)生一些DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)上的特征性的彎曲。CDE-Ⅲ是所有中心粒右側(cè)邊界的11bp 長的高度保守序列，此類元件的兩側(cè)序列保守性較低，對于中心粒功能可能是必需的(CDE-Ⅲ在側(cè)翼序列必需的情況下可能長于11bp)。2．端粒

通過斷裂產(chǎn)生的染色體末端，會與其它染色體發(fā)生作用，然而天然染色體是穩(wěn)定的，因此，染色體末端一定具有某種特殊結(jié)構(gòu)，可以穩(wěn)定染色體，該結(jié)構(gòu)稱為端粒。

我們可以用兩個性質(zhì)來定義端粒序列：必需存在于染色體的端部(或至少在線性DNA 分子的末端)；它必需賦予線性分子穩(wěn)定性。

許多低等真核生物基因組中的線性DNA 分子，其端粒結(jié)構(gòu)都是已知的。同樣類型的序列也在植物和人類中發(fā)現(xiàn)，所以端粒的構(gòu)建似乎遵循著普遍的規(guī)律。每個端粒由一系列短的隨機(jī)重復(fù)序列組成。所有端粒序列能寫成Cn(A/T)m 的一般形式，其中n>1 而m 為1-4 ；3?端具有單鏈尾，且富含GT。

端粒一方面可保護(hù)線性DNA免受核酸酶攻擊，另一方面，利用用從頭合成的方式加入重復(fù)，能抵消在染色體端部無法復(fù)制所導(dǎo)致的重復(fù)丟失。

討論端粒與壽命的關(guān)系。

第四節(jié)真核生物的基因

一、真核生物基因組中包含非重復(fù)序列和重復(fù)序列

1．重復(fù)序列 在單倍體基因組里，這些序列一般只有一個或幾個拷貝，它占DNA總量的40%－80%。多為結(jié)構(gòu)基因。

2．中度重復(fù)序列 這類重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在10－104之間，占總DNA的10%－40%。各種rRNA、tRNA 及組蛋白基因等都屬這一類。該類基因一般不編碼。3．高度重復(fù)序列——衛(wèi)星DNA 這類DNA只在真核生物中發(fā)現(xiàn)，占基因組的10%—60%，由6—100個堿基組成，在DNA鏈上串聯(lián)重復(fù)幾百萬次。由于堿基 的組成不同，在CsCl密度梯度離心中易與其他DNA分開，形成含量較大的主峰及高度重復(fù)序列小峰，后者又稱衛(wèi)星區(qū)帶（峰）。該類基因一般不轉(zhuǎn)錄。

小衛(wèi)星和微衛(wèi)星序列是由比衛(wèi)星序列的重復(fù)序列單位更短的單位構(gòu)成，其重復(fù)單位的長度分別為10~100bp和10bp，而重復(fù)序列單位的數(shù)目通常為5~50個，不同個體間重復(fù)序列單位數(shù)目變化很大。

在人類中小衛(wèi)星位點(diǎn)是1－5kb的順序，此順序由長15-100nt的重復(fù)單位組成。當(dāng)將人類的總DNA提出后，用限制性內(nèi)切酶切成不同長度的片斷（各種小衛(wèi)星上都沒有酶切位點(diǎn)），然后以小衛(wèi)星DNA中的特異順序?yàn)樘结樳M(jìn)行Southern雜交，可發(fā)現(xiàn)陽性片斷的長度各不相同。由于不同個體的這種串聯(lián)重復(fù)的數(shù)目和位置都不相同，所以小衛(wèi)星DNA的Southern雜交帶譜就具有高度的個體特異性，人們就稱其為DNA指紋分析技術(shù)（DNA fingerprints）。

二、斷裂基因

大多數(shù)真核生物的基因（包括編碼蛋白質(zhì)、rRNA、tRNA的基因）由間隔的外顯子（表現(xiàn)在最終RNA產(chǎn)物中的序列）和內(nèi)含子（從初始轉(zhuǎn)錄物中去除的序列）組成。

“一條基因，一種蛋白質(zhì)”應(yīng)修正為“一種蛋白質(zhì)，一條基因”。因?yàn)橐恍〥NA序列編碼一種以上蛋白質(zhì)。

三、基因家族與基因簇

真核生物的基因組中有許多來源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的基因，這樣一組基因稱為基因家族（gene family）。

同一基因家族的不同成員緊密排列在一起，稱為基因簇（gene cluster）。但更多情況下是散布在不同染色體上。如：珠蛋白基因α、β、γ、δ。同一家族成員是由同一個祖先基因經(jīng)過復(fù)制和變異傳遞下來的。

四、串連重復(fù)基因簇

串連重復(fù)基因出現(xiàn)在其產(chǎn)物被極度需要的情況下，如組蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因。如：組蛋白基因，編碼H1/H2A/H2B/H3/H4五種組蛋白的基因彼此靠近構(gòu)成一個重復(fù)單位，這樣的重復(fù)單位串連在一起。rRNA基因，真核生物中的5.8S/18S/28S rRNA（主體rRNA）基因組成重復(fù)單位，轉(zhuǎn)錄出一個45S

rRNA前體，然后通過轉(zhuǎn)錄后處理。此外，還有，tRNA基因也是串連重復(fù)排列，但各重復(fù)單位中的各tRNA可以不同。

五、假基因

基因組中因突變而失活的基因，它和同一家族的活躍基因在結(jié)構(gòu)和DNA序列上有相似性。

第三章DNA復(fù)制

教學(xué)目的：使學(xué)生掌握DNA復(fù)制的機(jī)理及一般過程、復(fù)制的各階段的主要生物學(xué)事件、復(fù)制的方式、復(fù)制的調(diào)控、DNA修復(fù)系統(tǒng)。

教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：復(fù)制的機(jī)理；復(fù)制的起始；端粒的復(fù)制。課時安排：6學(xué)時 教學(xué)內(nèi)容：

第一節(jié)DNA復(fù)制的機(jī)理及一般過程

一、半保留復(fù)制

半保留復(fù)制：Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時即推測，DNA在復(fù)制時首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻?，這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。

1957年，梅塞爾和斯塔爾利用大腸桿菌（E．Coli）研究遺傳物質(zhì)DNA。在這項(xiàng)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)中，他們先將大腸桿菌放入只含有既氮15（氮14的同位素）的營養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將這些大腸桿菌轉(zhuǎn)移到只含氮14的營養(yǎng)基中。提取不同培養(yǎng)代數(shù)細(xì)菌的DNA，用CsCl密度梯度離心。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在全部由15N標(biāo)記的培養(yǎng)基中得到的15N-DNA顯示為一條重密度帶位于離心管的管底。當(dāng)轉(zhuǎn)入14N標(biāo)記的培養(yǎng)基中繁殖后第一代，得到了一條中密度帶，這是15N-DNA和14N-DNA的雜交分子。第二代有中密度帶及低密度帶兩個區(qū)帶，這表明它們分別為15N14N－DNA和14N14N-DNA。隨著以后在14N培養(yǎng)基中培養(yǎng)代數(shù)的增加，低密度帶增強(qiáng)，而中密度帶逐漸減弱，離心結(jié)束后，從管底到管口，CsCl溶液密度分布從高到低形成密度梯度，不同重量的DNA分子就停留在與其相當(dāng)?shù)腃sCl密度處，在紫外光下可以看到DNA分子形成的區(qū)帶。為了證實(shí)第一代雜交分子確實(shí)是一半15N-DNA－半14N－DNA，將這種雜交分子經(jīng)加熱變性，對于變性前后的DNA分別進(jìn)行CsCl密度梯度離心，結(jié)果變性前的雜交分子為一條中密度帶，變性后則分為兩條區(qū)帶，即重密度帶(15N－DNA)及低密度帶(14N－DNA)。它們的實(shí)驗(yàn)只有用半保留復(fù)制的理論才能得到圓滿的解釋。

二、半不連續(xù)復(fù)制

DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，因此，在?fù)制起點(diǎn)處兩條DNA鏈解開

成單鏈時，一條是5'→3'方向，另一條是3'→5'方向。當(dāng)以這兩條鏈為模板時，新生鏈延伸方向一條為3'→5'，另一條為5'→3'。但生物細(xì)胞內(nèi)所有催化DNA聚合酶都只能催化5'→3'延伸，這是一個矛盾。岡崎片段(Okaxaki fragments)的發(fā)現(xiàn)使這個矛盾得以解決。在復(fù)制起點(diǎn)兩條鏈解開形成復(fù)制泡(replication bubbles)，DNA向兩側(cè)復(fù)制形成兩個復(fù)制叉(replication forks)。以復(fù)制叉移動的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，一條模板鏈?zhǔn)?'→5'，以此為模板而進(jìn)行的新生DNA鏈的合成沿5'→3'方向連續(xù)進(jìn)行，這條鏈稱為前導(dǎo)鏈(leading strand)。另一條模板鏈的方向?yàn)?'→'3'，以此為模板的DNA合成也是沿5'→3'方向進(jìn)行，但與復(fù)制叉前進(jìn)的方向相反，而且是分段，不連續(xù)合成的，這條鏈稱為滯后鏈(lagging strand)，合成的片段即為岡崎片段。這些岡崎片段以后由DNA連接酶連成完整的DNA鏈。這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物是普遍存在的，稱為DNA合成的半不連續(xù)復(fù)制。

第二節(jié)復(fù)制的過程

復(fù)制的過程總的說來包括起始、延伸和終止三個階段。

一、復(fù)制的起始

1．復(fù)制的起始原點(diǎn)

很多實(shí)驗(yàn)都證明：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點(diǎn)(originof replication)常用ori或O表示。細(xì)胞中的DNA復(fù)制一經(jīng)開始就會連續(xù)復(fù)制下去，直至完成細(xì)胞中全部基因組DNA的復(fù)制。DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開始直到終點(diǎn)為止，每個這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。在原核細(xì)胞中，每個DNA分子只有一個復(fù)制起始點(diǎn)，因而只有一個復(fù)制子，而在真核生物中，DNA的復(fù)制是從許多起始點(diǎn)同時開始的，所以每個DNA分子上有許多個復(fù)制子。

DNA復(fù)制起始點(diǎn)有結(jié)構(gòu)上的特殊性，例如：大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起始點(diǎn)Oric由422個核苷酸組成，是一系列對稱排列的反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)，其中有9個核苷酸或13個核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白識別的位置，大腸桿菌染色體DNA是環(huán)狀雙鏈DNA，它的復(fù)制是典型的“ζ”型復(fù)制(由于形狀像希臘字母ζ，見下圖)。從一個起點(diǎn)開始，同時向兩個方向進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)兩個復(fù)制方向相遇時，復(fù)制就停止。而有些生物的DNA復(fù)制起始區(qū)是一段富含A·T的區(qū)段。這些特殊的結(jié)構(gòu)對于在DNA復(fù)制起

始過程中參與的酶和許多蛋白質(zhì)分子的識別和結(jié)合都是必須的。

2．復(fù)制的方向

3．DNA復(fù)制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì)

解鏈酶：DNA開始復(fù)制時首先在起始點(diǎn)處解開雙鏈，反應(yīng)是在一種解鏈酶(helicase)的催化下進(jìn)行的。解鏈酶需要ATP分解供給能量。大腸桿菌中DnaB蛋白就有介鏈酶活性，與隨從鏈的模板DNA結(jié)合，沿5'→3'方向移動，還有一種叫做Rep蛋白和前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿3'→5'方向移動。解鏈酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。

單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)：它與解開的單鏈DNA結(jié)合，使其穩(wěn)定不會再度螺旋化并且避免核酸內(nèi)切酶對單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時的伸展?fàn)顟B(tài)，SSBP可以重復(fù)利用。

DNA復(fù)制起始的關(guān)健步驟是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，所以它的起始相對簡單，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以引發(fā)階段比較復(fù)雜。大腸桿菌的引發(fā)前體由DnaB.DnaC和單鏈結(jié)合蛋白組成。

引物酶

是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短RNA片段一般十幾個至數(shù)十個核苷酸不等，它們在DNA復(fù)制起始處做為引物。RNA引物的3'-OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個磷酸二酯鍵的位置。高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質(zhì)因子形成的引發(fā)前體促進(jìn)引物酶結(jié)合上來，共同形成引發(fā)體，引發(fā)體主要在DNA隨從鏈上開始，它連續(xù)地與引物酶結(jié)合并解離，從而在不同部位引導(dǎo)引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3'-OH末端接下去合成DNA片段，這就是隨從鏈不連續(xù)合成的開始。

二、DNA的延伸

由DNA聚合酶催化完成。1957年，Arthur kornberg首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ，(DNA polymerase Ⅰ,簡寫DNA polⅠ)后來又相繼發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，其中主要的復(fù)制酶是DNA聚合酶Ⅲ。當(dāng)聚合酶的一個亞基連續(xù)合成先導(dǎo)鏈時，另一個亞基在模板鏈所形成的大單鏈環(huán)中，循環(huán)式起始、終止后隨鏈上岡崎片段的合成。真核生物的NA聚合酶可分為復(fù)制所需的

酶如：α、δ、ε、γ和損傷修復(fù)所需的酶β、δ、ε、η、θ，其中，DNA聚合酶α起始DNA鏈的合成，DNA聚合酶δ延伸先導(dǎo)鏈，另一個DNA聚合酶δ或ε延伸后隨鏈。DNA聚合酶γ負(fù)責(zé)線粒體DNA的復(fù)制。

真核生物線性DNA末端的端粒是怎樣合成的呢？四膜蟲抽提物中有一種酶，稱端粒酶(Telomerase)，它使用端粒鏈的G+T 的3?-OH 作為引物合成隨機(jī)的TTGGGG 重復(fù)。此反應(yīng)只需要dGTP 與dTTP。端粒酶是一個大的核糖核蛋白，它含有一個短RNA 組分，四膜蟲中長159nt 而在Euplotes 中長192nt。每個RNA 都含有一個15-22nt 的序列和一個富含C 的重復(fù)序列的重復(fù)相同。這種RNA 為合成富含G 的重復(fù)序列提供模板。

三、復(fù)制的終止

當(dāng)子鏈延伸達(dá)到terminus region（ter，帶有多個20bp序列）時，DNA復(fù)制就終止了。Ter有點(diǎn)像一個陷井（trap），使復(fù)制叉只能進(jìn)入，不能出來。Ter的功能主要是由Ter-Tus復(fù)合物（ter utilization substance）來完成的。

第三節(jié) 復(fù)制的方式

一、線狀DNA的復(fù)制方式 1．中間起始：如前所述.2．末端起始：腺病毒的形態(tài)是特征性的二十面體病毒殼體，腺病毒基因組是一個線性的雙鏈DNA，其5’端與一種末端蛋白（TP）共價結(jié)合（Rekosh et al., 1977），5’端上還具有末端反向重復(fù)序列（ITRs）。

在腺病毒的每個5?末端都共價連接一個55Kda的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)稱為末端蛋白質(zhì)（terminal protein TP），以其絲氨酸羥基通過磷酸二酯鍵與5?端的胞嘧啶共價連接。TPC核苷酸的自由末端3-OH通過DNA聚合酶引導(dǎo)延伸反應(yīng)。這就產(chǎn)生了一條新鏈，其5‘末端與起始核苷酸C共價相連。

二、環(huán)狀DNA的復(fù)制方式

1．?復(fù)制：具有雙鏈環(huán)狀DNA分子的細(xì)菌和病毒所采用的復(fù)制方式。DNA在復(fù)制原點(diǎn)解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補(bǔ)鏈，則出現(xiàn)兩個叉子狀的生長點(diǎn)，叫做復(fù)制叉，因此也稱為復(fù)制叉式復(fù)制。可雙向or單向，若是雙向，可等速or不等速。

2．滾環(huán)復(fù)制：隨后缺口產(chǎn)生的自由3’-OH末端被聚合酶延伸。新合成的鏈取代

原母鏈。

這種結(jié)構(gòu)被稱為滾環(huán)，因?yàn)檠由禳c(diǎn)圍繞環(huán)形模板鏈滾動，形成一個多聚單鏈的尾巴。當(dāng)這條鏈甩到一定程度時開始以半不連續(xù)的方式合成其互補(bǔ)鏈。

滾環(huán)復(fù)制在噬菌體中普遍存在。例如：噬菌體φX174含有單鏈環(huán)形DNA，稱為正（+）鏈。在復(fù)制前首要合成其互補(bǔ)鏈即負(fù)（-）鏈，產(chǎn)生了雙鏈環(huán)形DNA分子，以滾環(huán)方式復(fù)制。

噬菌體的基因組編碼的A蛋白結(jié)合在復(fù)制原點(diǎn)，在正鏈上產(chǎn)生切斷磷酸二酯鍵。切割后A蛋白仍然與5’末端相連，而3’末端則在DNA聚合酶的作用下延伸。SSB蛋白不斷地結(jié)合到甩出的單鏈上，并改變其構(gòu)型，趨向環(huán)化。當(dāng)被置換鏈達(dá)到一個單位長度時，A蛋白可識別復(fù)制原點(diǎn)，將鏈切斷，進(jìn)一步將切下的單位的長度的DNA環(huán)化。A蛋白釋放，開始另一循環(huán)。環(huán)化后被取代的正（＋）鏈可以作為模板合成互補(bǔ)負(fù)（—）鏈或被包裹到病毒體中。

另外，滾環(huán)復(fù)制為基因擴(kuò)增提供了一種方式。見《分子遺傳學(xué)》P109-110。3．D環(huán)復(fù)制：

真核生物線粒體DNA的復(fù)制方式。線粒體的H和L鏈上各有一個復(fù)制原點(diǎn)，在復(fù)制開始時，H鏈起始位點(diǎn)的復(fù)制像通常一樣通過轉(zhuǎn)錄激活過程。RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出的RNA可作為引物，再由DNA聚合酶在引物的3’末端進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)。隨著鏈的延伸，新合成的L鏈取代了親本L鏈，而產(chǎn)生一個替換環(huán)，稱為D環(huán)。D環(huán)不斷伸展，當(dāng)伸展到環(huán)三分之二處時，被取代的L鏈上的復(fù)制起始點(diǎn)暴露出來，隨后由特異的引發(fā)酶在該位點(diǎn)合成一段RNA引物，開始H鏈的復(fù)制。由于啟動的延遲，當(dāng)新L鏈合成結(jié)束時，新H鏈合成僅繞環(huán)三分之一圈。這樣就釋放出一個完整的雙鏈環(huán)和一個開環(huán)結(jié)構(gòu)。

第四節(jié) 復(fù)制的調(diào)控

一、原核生物復(fù)制的調(diào)控

原核生物復(fù)制的起始主要是由起始位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)來控制的。起始位點(diǎn)的A可被Dam甲基化酶所甲基化。在復(fù)制之前，起始位點(diǎn)的兩條鏈都被甲基化，而復(fù)制后產(chǎn)生的DNA是半甲基化的。半甲基化的子鏈起始點(diǎn)只有在它們重新全部甲基化后才有起始功能。

二、真核生物復(fù)制的調(diào)控

在真核生物中，DNA的復(fù)制同樣受到細(xì)胞周期的嚴(yán)格控制。在每一個起始點(diǎn)都需要執(zhí)照因子來起始復(fù)制。執(zhí)照因子是一種特殊的蛋白質(zhì)，不能隨意的穿越核膜。它在復(fù)制之前就已存在于細(xì)胞核中，一輪復(fù)制就會將這個因子失活或破壞。而細(xì)胞質(zhì)中的執(zhí)照因子也不能進(jìn)入，因此DNA的復(fù)制不會被重復(fù)起始。只有在細(xì)胞發(fā)生有絲分裂期間，核膜發(fā)生破裂，執(zhí)照因子才趁機(jī)進(jìn)入核內(nèi)，DNA的復(fù)制才可被起始。這樣，就保證了復(fù)制的起始必須在經(jīng)歷整個細(xì)胞分裂過程之后才能重新發(fā)生。

第五節(jié)DNA的修復(fù)系統(tǒng)一、復(fù)制修復(fù)

1、錯配修復(fù)系統(tǒng)：錯配矯正酶、Pol Ⅰ、DNA連接酶

2、尿嘧啶糖基酶系統(tǒng)：尿嘧啶－N－糖基酶、AP內(nèi)切酶、Pol Ⅰ、DNA連接酶

二、損傷修復(fù)

1、光復(fù)活：在可見光的活化之下由光復(fù)活酶催化胸腺嘧啶二聚體分解成單體的過程。

2、切除修復(fù)：修復(fù)內(nèi)切酶能識別引起DNA雙螺旋變性的損傷，由UvrA、UvrB和UvrC三種亞基構(gòu)成

3、重組修復(fù)：RecA具有催化DNA分子之間同源聯(lián)會和交換單鏈的功能。

4、SOS修復(fù)：允許新生的DNA鏈越過TT二聚體而生長，其代價時保真度極大降低。SOS修復(fù)是導(dǎo)致突變的修復(fù),它的介入時紫外線誘導(dǎo)突變的主要原因。

第五章 轉(zhuǎn)錄

教學(xué)目的：使學(xué)生掌握RNA合成的酶學(xué)特征、啟動子的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄的過程、轉(zhuǎn)錄后加工過程及逆轉(zhuǎn)錄。

教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：啟動子結(jié)構(gòu)；RNA的剪接；核酶。課時安排：6學(xué)時 教學(xué)內(nèi)容：

第一節(jié)RNA合成的酶學(xué)

執(zhí)行生命功能、表現(xiàn)生命特征的主要物質(zhì)是蛋白質(zhì)分子。DNA貯存著決定生物特征的遺傳信息，只有通過蛋白質(zhì)才能表達(dá)出它的生命意義，直接決定蛋白質(zhì)合成及蛋白質(zhì)特征的不是RNA而是DNA，因而人們確定DNA是遺傳信息貯存者后就推測DNA是通過RNA去決定蛋白質(zhì)合成的。50年代末RNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)開始證實(shí)了這一推測。

以DNA為模板合成RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄（transcription），由RNA聚合酶催化完成。

一、RNA合成的基本特征

RNA的轉(zhuǎn)錄合成從化學(xué)角度來講類似于DNA的復(fù)制，多核苷酸鏈的合成都是以5'→3'的方向，在3'-OH末端與加入的核苷酸磷酸二酯鍵，但是，由于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的目的不同，轉(zhuǎn)錄又具有其特點(diǎn)：（1）對于一個基因組來說，轉(zhuǎn)錄只發(fā)生在一部分基因，而且每個基因的轉(zhuǎn)錄都受到相對獨(dú)立的控制；（2）轉(zhuǎn)錄是不對稱的；（3）轉(zhuǎn)錄時不需要引物，而且RNA鏈的合成是連續(xù)的；（4）都以四種三磷酸核苷的底物；（4）RNA聚合酶缺乏3'→5'外切酶活性，所以沒有校正功能。

二、原核生物的RNA聚合酶

大腸桿菌RNA聚合酶的研究得比較透徹的，這是一個分子量達(dá)50多萬，全酶由五咱亞基組成，去掉δ亞基的部分稱為核心酶，核心酶本身就能催化苷酸間磷酸二酸鍵形成。利福平和利福霉素能結(jié)合在β亞基上而對此酶發(fā)生強(qiáng)烈的抑制作用。β亞基似乎是酶和核苷酸底物結(jié)合的部位。細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄是在DNA特定的起始點(diǎn)上開始的，δ亞基的功能是辨認(rèn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的。β'亞基是酶與DNA模板結(jié)合的主要成分。α亞基可能與轉(zhuǎn)錄基因的類型和種類有關(guān)。

二、真核生物的RNA聚合酶

真核生物中已發(fā)現(xiàn)有四種RNA聚合酶，分別稱為RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和線粒體RNA聚合酶，分子量大致都在50萬道爾頓左右，它們專一性地轉(zhuǎn)錄不同的基因，因此由它們催化的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也各不相同。RNA聚Ⅰ合成RNA的活性最顯著，它位于核仁中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄編碼rRNA的基因。而細(xì)胞內(nèi)絕大部分RNA是rRNA是RNA。RNA聚合酶Ⅱ，位于核質(zhì)中，負(fù)責(zé)核內(nèi)不勻一RNA的合成，而hnRNA是mRNA的前體。RNA聚合酶Ⅲ負(fù)責(zé)合成tRNA和許多小的核內(nèi)RNAs。鵝膏蕈堿是真核生物RNA聚合酶特異性抑制劑，三種真核生物RNA聚合酶對鵝膏蕈堿的反應(yīng)不同。原核生物靠RNA聚合酶就可完成從起始、延長、終止的轉(zhuǎn)錄全過程，真核生物轉(zhuǎn)錄除RNA聚合酶外還需另一此叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子參與轉(zhuǎn)錄的全過程，第二節(jié)控制轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列－啟動子的結(jié)構(gòu)

一、原核生物啟動子的結(jié)構(gòu)

Pribnow框：在起始點(diǎn)上游，幾乎在所有啟動子都存在一個6 bp富含A/T區(qū)域TATAAT。通常位于－18位到－9位，稱為Pribnow框。該區(qū)域是RNA聚合酶牢固結(jié)合位點(diǎn)，RNA聚合酶結(jié)合后，這一富含A/T的DNA雙鏈解開。

Sextama框：位于－35區(qū)附近有一TTGACA序列，是RNA聚合酶中的ζ因子識別位點(diǎn)。以上這兩個位點(diǎn)對于轉(zhuǎn)錄起始都是非常重要的。ζ因子識別－35區(qū)并與之結(jié)合。由于RNA聚合酶分子覆蓋面積能達(dá)到70bp，因此酶分子上的一個合適部位能接觸－10區(qū)。酶分子一旦與－10區(qū)結(jié)合以后，就從識別位點(diǎn)上解離下來。此外，－35序列的重要性還在于在很大程度上決定了啟動子的強(qiáng)度。

在－35區(qū)和－10區(qū)之間的堿基序列不特別重要，但是這兩個序列之間的距離卻十分重要，是決定啟動子強(qiáng)度的因素之一大多為15 bp～20 bp。

二、真核生物啟動子的結(jié)構(gòu)

有三種類型的啟動子，其中Ⅱ類啟動子最為復(fù)雜。

Ⅱ類啟動子由核心元件（core element）和上游啟動子元件（upstream promoter element，UPE）組成。核心元件包括TATA框和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。mRNA的第一個堿基傾向A，另一側(cè)翼由Py組成。TATA框合又稱Hogness框，Goldberg-Hogness框，其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50，常在起始位點(diǎn)的上游-25左右，相當(dāng)于原核的-10序列。

上游元件包括CAAT box、GC box、等。如CAAT box一般位于上游-75bp左右，緊靠-80，其功能是控制轉(zhuǎn)錄起始活性。遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)較常見的是增強(qiáng)子。

啟動子Ⅲ位于起始位點(diǎn)的下游的轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)，因此稱為下游啟動子（downstream promoter）或基因內(nèi)啟動子（intragenenic promoter）。轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄因子TFⅢA、B和C的參與。

三、鑒定啟動子的方法

1、足跡法：是一種測定ＤＮＡ結(jié)合蛋白在ＤＮＡ上的結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)方法，其根據(jù)是ＤＮＡ的這些區(qū)域在結(jié)合有蛋白質(zhì)時可被保護(hù)而免受核酸內(nèi)切酶的作用．酶切后產(chǎn)生片段與對照的酶切片段經(jīng)凝膠電泳分離后進(jìn)行比較，即找出ＤＮＡ與蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)。

2、缺失分析和點(diǎn)突變：對以上所獲得的DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)一步做缺失分析和點(diǎn)突變。

第三節(jié)轉(zhuǎn)錄的過程

一、轉(zhuǎn)錄起始

轉(zhuǎn)錄是從DNA分子的特定部位開始的，這個部位也是RNA聚合酶全酶結(jié)合的部信這就是啟動子。為什么RNA聚合酶能夠僅在啟動子處結(jié)合呢？顯然啟動子處的核苷酸序列具有特殊性，為了方便，人們將在DNA上開始轉(zhuǎn)錄的第一個堿基定為+1，沿轉(zhuǎn)錄方向順流而下的核苷酸序列均用正值表示；逆流而上的核苷酸序列均用負(fù)值表示。

在原核生物中，當(dāng)RNA聚合酶的δ亞基發(fā)現(xiàn)其識別位點(diǎn)時，全酶就與啟動子的-35區(qū)序列結(jié)合形成一個封閉的啟動子復(fù)合物。由于全酶分子較大，其另一端可在到-10區(qū)的序列，在某種作用下，整個酶分子向-10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合，在此處發(fā)生局部DNA12-17r 的解鏈形成全酶和啟動子的開放性復(fù)合物。在開放性啟動子復(fù)合物中起始位點(diǎn)和延長位點(diǎn)被相應(yīng)的核苷酸前體充滿，在RNA聚合酶β亞基催化下形成RNA的第一個磷酸二酸鍵。RNA合成的第一個核苷酸總有GTP或ATP，以GTP常見，此時δ因子從全酶解離下來，靠核心酶在DNA鏈上向下游滑動，而脫落的δ因子與另一個核心酶結(jié)合成全酶反復(fù)利用。

真核生物轉(zhuǎn)錄起始十分復(fù)雜，往往需要多種蛋白因子的協(xié)助，已經(jīng)知道，在

所有的細(xì)胞中有一類叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子，它們與RNA聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過程。真核生物基因中，有專門為蛋白質(zhì)編碼的基因，這些基因由RNA聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵性作用。根據(jù)這些轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)可大致分為二類；第一類為普遍轉(zhuǎn)錄因子它們與RNA聚合酶Ⅱ共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄才能在正確的位置上開始。普遍轉(zhuǎn)錄因子是由多種蛋白質(zhì)分子組成的，其中包括特異結(jié)合在TATA盒上的蛋白質(zhì)，叫做TATA盒結(jié)合蛋白，還有至成一組復(fù)合物叫做轉(zhuǎn)錄因子ⅡD。TFⅡD再與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。除TFⅡD以外，在細(xì)胞核提取物中還發(fā)現(xiàn)TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它們在轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組裝的不同階段起作用。從中也不難看出真核細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的起始是基因的表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵，這么多蛋白質(zhì)分子之間相互作用，以及這些蛋白質(zhì)分子DNA調(diào)控?zé)o件相結(jié)合，構(gòu)成控制基因轉(zhuǎn)錄開始的復(fù)雜體系。第二類轉(zhuǎn)錄因子為組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子或者叫可誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，這些TF是在特異的組織細(xì)胞或是受到一些類固醇激素，生長因子或其它刺激后，開始表達(dá)某些特異蛋白質(zhì)分子時，才需要的一類轉(zhuǎn)錄因子。

二、轉(zhuǎn)錄延伸

RNA鏈的延長靠核心酶的催化，在起始復(fù)合物上第一個GTP的核糖3'-OH上與DNA模板能配對的第二個三磷酸核苷起反應(yīng)形成磷酸二酯鍵。聚合進(jìn)去的核苷酸又有核糖3'-OH游離，這樣就可按模板DNA的指引，一個接一個地延長下去。因此RNA鏈的合成方面也是5'→3'。由于DNA鏈與合成的RNA鏈具有反平行關(guān)系，所以RNA聚合酶是沿著DNA鏈3'→5'方向移動。整個轉(zhuǎn)錄過程是由同一個RNA聚合酶來完成的一個連續(xù)下斷的反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄本RNA生成后，暫時與DNA模板鏈形成DNA·RNA雜交體，長度約為12個堿基對，形成一個轉(zhuǎn)錄泡（見圖）。

轉(zhuǎn)錄速度大允是每秒鐘30-50個核苷酸，但并不是以恒定速度進(jìn)行的。

三、轉(zhuǎn)錄終止

提供終止信號的序列稱為終止子（terminator）。內(nèi)源性終止子的回文結(jié)構(gòu)中富含GC，且回文結(jié)構(gòu)的下游有連續(xù)6～8個AT堿基對；弱終止子有回文結(jié)構(gòu)，但不具有強(qiáng)終止子的兩點(diǎn)特征，需要依賴于ρ因子實(shí)現(xiàn)終止作用。

ρ因子（終止因子）：是協(xié)助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子，屬于ATP依賴的解旋酶家族，具有一個RNA結(jié)合域和ATP水解域。

第四節(jié)轉(zhuǎn)錄后加工

轉(zhuǎn)錄后加工是指將各種前體RNA分子加工成各種成熟RNA的過程。

一、真核生物mRNA的5?Cap 真核生物細(xì)胞mRNA的5 ￠端加帽是在鳥苷轉(zhuǎn)移酶的催化下通過5?－ 5?鍵把一個G加到轉(zhuǎn)錄物的末端堿基形成的，隨后，進(jìn)行甲基化產(chǎn)生Cap0，Cap1，Cap2。

5?帽子的生物學(xué)功能：在翻譯過程中起識別作用以及對mRNA起穩(wěn)定作用。

二、真核生物mRNA的3?Tail 有這種特征的mRNA 稱為poly(A)+，不具有的稱為poly(A)－。mRNA 3?端的多聚A是由poly(A)聚合酶所催化添加的。注意：多聚A尾巴不是添加在轉(zhuǎn)錄終止的3?端。

三、RNA的拼接

內(nèi)含子剪接和剪切（clearvage）是mRNA轉(zhuǎn)錄后加工中最為復(fù)雜的一環(huán)，也是近年來發(fā)展很快的研究領(lǐng)域之一。不同內(nèi)含子的剪切和剪接，其機(jī)制，類型和酶都不完全相同，現(xiàn)分述如下。

1、Ⅰ類內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：①其邊界序列為5′ U↓?? G↓3′（↓表示剪切位點(diǎn)）；②具有中部核心結(jié)構(gòu)（Central core strucature）。③具有內(nèi)部引導(dǎo)序列（internal guide sequence IGS）。

首先是GTP進(jìn)入G結(jié)合位點(diǎn)，左邊外顯子的3′端通過和引導(dǎo)序列的互補(bǔ)配對進(jìn)入底物位點(diǎn)。GTP的3′-OH作用左邊外顯子和內(nèi)含子交界處的磷酸二酯鍵，本身結(jié)合到內(nèi)含子的5′末端，被切下的5′外顯子仍保持在底物位點(diǎn)上，并未游離。第二步內(nèi)含子的G414（即3′交界序列上的G）又進(jìn)入了G-結(jié)合位點(diǎn)，切下的外顯子的3′-OH又對G-結(jié)合位點(diǎn)上的G與3′外顯子之間的磷酸二酯鍵發(fā)動親核進(jìn)攻，切開磷酸二酯鍵，而其3′-OH和3′外顯子的P重新形成磷酸二酯鍵而連接起來，這樣就完成內(nèi)含子的剪接。內(nèi)含子成為線形的413nt的RNA分子。第三步，內(nèi)含子5′端和引導(dǎo)序列相鄰的序列通過引導(dǎo)序列互補(bǔ)配對，進(jìn)入底物位點(diǎn)。仍然留在G結(jié)合位點(diǎn)上的G414其3′-OH再作用底物位點(diǎn)

上的序列，切下19nt的內(nèi)含子5′端，并和余下內(nèi)含子的5′-P形成二酯鍵，形成414nt的環(huán)狀內(nèi)含子。

2、Ⅱ型內(nèi)含子在植物和低等真核生物的細(xì)胞器基因組中發(fā)現(xiàn)。Ⅱ類內(nèi)含子的剪接和I類內(nèi)含子不同。

結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是列為5′↓GUGCG??YnAG↓，符合GT-AG法則，在內(nèi)含子的近3′端具有分支點(diǎn)順序（branch-point seguence），內(nèi)部具有二級結(jié)構(gòu)。

II型內(nèi)含子的剪切無需鳥苷的輔助，但需鎂離子的存在。首先是分枝點(diǎn)A的2′-OH對5′端外顯子和內(nèi)含子交界處的磷酸二酯鍵發(fā)動親核進(jìn)攻（圖13-28）切下外顯子1，內(nèi)含子5′的邊界序列上的G與5′磷酸和分枝點(diǎn)A的2′-OH形成磷酸二酯鍵，從而產(chǎn)生了套索（lariat）結(jié)構(gòu)；第二步是切下的外顯子1，其3′-OH繼續(xù)對內(nèi)含子3′端的交界序列進(jìn)行親核進(jìn)攻，切下的外顯子2′的5′磷酸和外顯子1的3′-OH形成磷酸二酯鍵，連接在一起，同時釋放出套索狀的內(nèi)含子。

通過對以上兩種內(nèi)含子的研究，提出“核酶”概念。

核酶(Ribozyme)有的譯成為核糖擬酶，核酶等，目前尚無統(tǒng)一的譯法，暫以核酶稱之，既簡單明確，也能反映其酶的本質(zhì)。核酶是T.Cech等（1981年）在研究四膜蟲rRNA時發(fā)現(xiàn)的，1982年T.Cech將核糖核酸（ribonucleic acid）和酶（enzyme）這兩個詞“重組”成一個新的詞：“Ribozyme”,它是指本質(zhì)為RNA或以RNA為主含有蛋白質(zhì)輔基的一類物質(zhì)，這類物質(zhì)具有催化功能，但和酶又有區(qū)別，主要表明在兩個方面：①一般的酶是純的蛋白質(zhì)，而核酶是RNA或帶有蛋白的RNA；②核酶既是催化劑又是底物，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，本身也消失了。而酶卻不同，僅催化反應(yīng)，反應(yīng)前后其本身的質(zhì)和量都不發(fā)生改變。

3、核mRNA的剪接

結(jié)構(gòu)和Ⅱ類內(nèi)含子十分相似，符合GU-AG法則，具有分支位點(diǎn)。但根本的不同點(diǎn)是核mRNA前體的剪接本身不能形成二級結(jié)構(gòu)，必需依賴于snRNP（U1，U2，U4，U5，U6）的幫助才能形成剪接體，進(jìn)行自我剪接。它們自己本身不能象I類及Ⅱ類內(nèi)含子那樣依賴核心結(jié)構(gòu)，形成莖環(huán)，將5′和3′剪切點(diǎn)拉在一起。和snRNA的結(jié)合是相當(dāng)復(fù)雜的，但剪接反應(yīng)的第一步5′位點(diǎn)的剪接是由U6催化的，3′位點(diǎn)是由5′外顯子1的3′-OH對內(nèi)含子3′端切點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)酯

反應(yīng)來完成。

4．相關(guān)概念

可變剪接；反式剪接；RNA編輯

第五節(jié)逆轉(zhuǎn)錄

逆轉(zhuǎn)錄：RNA指導(dǎo)的DNA合成，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下完成，如AMV, MLV。主要存在于RNA病毒中。

第六章 翻譯

教學(xué)目的：使學(xué)生掌握tRNA的結(jié)構(gòu)、遺傳密碼的特征、核糖體的結(jié)構(gòu)及肽鏈的合成過程。

教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：肽鏈的合成過程；rRNA在肽鏈合成中的催化作用。課時安排：6學(xué)時 教學(xué)內(nèi)容：

基因的遺傳信息在轉(zhuǎn)錄過程中從DNA轉(zhuǎn)移到mRNA，再由mRNA將這種遺傳信息表達(dá)為蛋白質(zhì)中氨基酸順序的過程叫做翻譯。翻譯的過程也就是蛋白質(zhì)分子生物合成的過程，在此過程中需要200多種生物大分子參加，其中包括核糖體、mRNA、tRNA及多種蛋白質(zhì)因子。

第一節(jié)tRNA和遺傳密碼

一、tRNA的結(jié)構(gòu)

tRNA在蛋白質(zhì)生物合成過程中起關(guān)鍵作用。mRNA推帶的遺傳信息被翻譯成蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，但是mRNA分子與氨基酸分子之間并無直接的對應(yīng)關(guān)系。這就需要經(jīng)過第三者“介紹”，而tRNA分子就充當(dāng)這個角色。tRNA是類小分子RNA，長度為73-94個核苷酸，tRNA分子中富含稀有堿基和修飾堿基，tRNA分子3'端均為CCA序列，氨基酸分子通過共價鍵與A結(jié)合，此處的結(jié)構(gòu)也叫氨基酸臂。每種氨基酸都有2-6種各自特異的tRNA，它們之間的特異性是靠氨基酰tRNA合成酶來識別的。這樣，攜帶相同氨基酸而反密碼子不同的一組tRNA稱為同功tRNA，它們在細(xì)胞內(nèi)合成量上有多和少的差別，分別稱為主要tRNA和次要tRNA。主要tRNA中反密碼子識別tRNA中的高頻密碼子，而次要tRNA中反密碼子識別mRNA中的低頻密碼子。每種氨基酸都只有一種氨基酰tRNA合成酶。因此細(xì)胞內(nèi)有20種氨基酰tRNA合成酶。

tRNA分子中還有一個反密碼環(huán)，此環(huán)上的三個反密碼子的作用是與mRNA分子中的密碼子靠堿基配對原則而形成氫鍵，達(dá)到相互識別的目的。但在密碼子與反密碼子結(jié)合時具有一定擺動性，即密碼子的第3位堿基與反密碼子的第1位堿基酸對時并不嚴(yán)格。配對擺動性完全是由tRNA反密碼子的空間結(jié)構(gòu)所決定的。反密碼的第1位堿基常出現(xiàn)次黃嘌呤I，與A、C、U之間皆可形成氫鍵而結(jié)合，這是最常見的擺動現(xiàn)象。這種擺動現(xiàn)象使得一個tRNA所攜帶的氨基酸可

排列在2-3個不同的密碼子上，因此當(dāng)密碼子的第3位堿基發(fā)生一定程度的突變時，并不影響tRNA帶入正確的氨基酸。

在蛋白質(zhì)生物合成過程中，特異識別mRNA上起始密碼子的tRNA被稱為起始tRNA，它們參加多肽鏈合成的起始，其它在多肽鏈延伸中運(yùn)載氨基酸的tRNA，統(tǒng)稱為延伸tRNA。

二、遺傳密碼的特征

mRNA分子上以5'→3'方向,從AUG開始每三個連續(xù)的核苷酸組成一個密碼子,mRNA中的四種堿基可以組成64種密碼子。這些密碼不僅代表了20種氨基酸，還決定了翻譯過程的起始與終止位置。每種氨基酸至少有一種密碼子，最多的有6種密碼子。

遺傳密碼具有以下幾種特點(diǎn)：

1、起始密碼子與終止密碼子（Initiation codon and termination codon）密碼子AUG是起始密碼，代表合成肽鏈的第一個氨基酸的位置，它們位mRNA5′末端，同時它也是蛋氨酸的密碼子，因此原核生物和真核生物多肽鏈合成的第一個氨基酸都是蛋氨酸，當(dāng)然少數(shù)細(xì)菌中也用GUG做為起始碼。在真核生物CUG偶爾也用作起始蛋氨酸的密碼。密碼子UAA，UAG，UGA是肽鏈成的終止密碼，不代表任何氨基酸，它們單獨(dú)或共同存在于mRNA3'末端。因此翻譯是沿著mRNA分子5′→3′方向進(jìn)行的。

2、密碼的簡并性（Degemeracy）

一種氨基酸有幾組密碼子，或者幾組密碼子代表一種氨基酸的現(xiàn)象稱為密碼子的簡并性，這種簡并性主要是由于密碼子的第三個堿基發(fā)生擺動現(xiàn)象形成的，也就是說密碼子的專一性主要由前兩個堿基決定，即使第三個堿基發(fā)生突變也能翻譯出正確的氨基酸，這對于保證物種的穩(wěn)定性有一定意義。如：GCU，GCC，GCA，GCG都代表丙氨酸。

3、密碼的通用性

大量的事實(shí)證明生命世界從低等到高等，都使用一套密碼，也就是說遺傳密碼在很長的進(jìn)化時期中保持不變。因此這張密碼表是生物界通用的。然而，出乎人們預(yù)料的是，真核生物線粒體的密碼子有許多不同于通用密碼，例如人線粒體中，UGA不是終止碼，而是色氨酸的密碼子，AGA，AGG不是精氨酸的密碼子，而是終止密碼子，加上通用密碼中的UAA和UAG，線粒體中共有四組終止碼。

內(nèi)部甲硫氨酸密碼子有兩個，即AUG和AUA；而起始甲硫氨酸密碼子有四組，即AUN。

第二節(jié)肽鏈的合成

一、核糖體的活性部位

任何生物的核糖體都是由大、小兩個亞基組成。1968年已在體外對大腸桿菌小亞基進(jìn)行了自我裝配研究，加入16s rRNA和21種蛋白質(zhì)，即可形成有天然活性的30s小亞基。通過這些研究使人們能夠進(jìn)一步認(rèn)識小亞基和大亞基中rRNA與蛋白質(zhì)的特異功能。核糖體是高度復(fù)雜的體系，它的任何個別組分或局部組分都不能起整體的作用，因此必須研究核糖體中蛋白質(zhì)和RNA的空間結(jié)構(gòu)和位置，才能更完全地了解蛋白質(zhì)合成的具體過程。核蛋白體作為蛋白質(zhì)的合成場所具有以下結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用：

1、具有mRNA結(jié)合位點(diǎn)

位于30s小亞基頭部，此處有幾種蛋白質(zhì)構(gòu)成一個以上的結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與mRNA的結(jié)合，特別是16srRNA3'端與mRNA AUG之前的一段序列互補(bǔ)是這種結(jié)合必不可少的。

2、具有P位點(diǎn)（peptidyl tRNA site）

又叫做肽?；?tRNA位或P位。它大部分位于小亞基，小部分位于大亞基，它是結(jié)合起始 tRNA 并向A位給出氨基酸的位置。

3、具有A位點(diǎn)（Aminoacyl-tRNA site）

又叫做氨基酰-tRNA 位或受位。它大部分位于大亞基而小部分位于小亞基，它是結(jié)合一個新進(jìn)入的氨基酰 tRNA 的位置。

5、結(jié)合參與蛋白質(zhì)合成的因子

如起始因子（Initiation Factor,IF）、延長因子(Elengation Factor,EF)和終止因子或釋放因子(Release Factor,RF)。

二、肽鏈的合成過程

1、起始階段：

起始tRNA：合成的起始密碼子是AUG，對應(yīng)的氨基酸是Met。原核細(xì)胞中存在兩種攜帶Met的tRNAfMettRNAmMet，真核細(xì)胞tRNAiMettRNAmMet

起始因子：IF1、IF2、IF3

過程：IF3+30S亞基

16SrRNA結(jié)合SD序列，使P位點(diǎn)正好對準(zhǔn)起始密碼子AUG。（真核生物識別帽子結(jié)構(gòu)）

在IF2的協(xié)助下起始tRNA（甲硫氨酰tRNA）進(jìn)入P位點(diǎn)。GTP結(jié)合，50S亞基結(jié)合，GTP水解，改變亞基構(gòu)象，促進(jìn)70S核糖體形成，同時釋放IF2和IF3。在IF1的作用下，IF2釋放，因此IF1是IF2的循環(huán)因子。這時，P位點(diǎn)被tRNA占據(jù)，而A位點(diǎn)空著。

2、延伸階段：

EF-Tu+GTP，＋氨?；鵷RNA，三元復(fù)合物進(jìn)入A位點(diǎn)（GTP是必須的）。GTP水解，EF-Tu釋放，這時肽基轉(zhuǎn)移酶將甲酰甲硫氨酰基轉(zhuǎn)移到A位，形成第一個肽鍵。當(dāng)肽鍵在A位形成之后，EF-G與GTP結(jié)合，將A位形成的肽基轉(zhuǎn)移到P位，同時將原來P位的tRNA逐出核糖體。由此可見，延伸因子是交替進(jìn)入核糖體的。EF-Ts使EF-Tu—GDP轉(zhuǎn)變?yōu)镋F-Tu+GTP。

3、終止

終止因子：RF1/2/3 經(jīng)過運(yùn)輸、定位和翻譯后處理后才能稱為有功能的蛋白質(zhì)。

三、rRNA在肽鏈合成中的作用 1、16SrRNA的作用：rRNA 的3?端在起始時與mRNA 直接相互作用； 16S rRNA 上的專一區(qū)域與A 位點(diǎn)及P 位點(diǎn)上tRNA 反密碼子區(qū)直接相互作用；與23S rRNA 相互作用。2、23SrRNA的作用：具有肽基轉(zhuǎn)移酶的活性

第七章 原核生物基因表達(dá)調(diào)控

教學(xué)目的：使學(xué)生掌握原核生物基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的主要方式。

教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：操縱子；衰減子；反義RNA；RNA干擾。課時安排：4學(xué)時 教學(xué)內(nèi)容：

第一節(jié)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

一、操縱元

操縱元是原核基因表達(dá)調(diào)控的一種重要的組織形式，大腸桿菌的基因多數(shù)以操縱元的形式組成基因表達(dá)調(diào)控的單元。

操縱元中被調(diào)控的編碼蛋白質(zhì)的基因可稱為結(jié)構(gòu)基因(structural gene, SG)。一個操縱元中含有2個以上的結(jié)構(gòu)基因，多的可達(dá)十幾個。每個結(jié)構(gòu)基因是一個連續(xù)的開放讀框(open reading frame)，5'端有翻譯起始碼(DNA存儲鏈上是ATG，轉(zhuǎn)錄成mRNA就是AUG)，3'端有翻譯終止碼(DNA存儲鏈上是TAA、TGA或TAG，轉(zhuǎn)錄成mRNA就是UAA、UGA或UAG)。各結(jié)構(gòu)基因頭尾銜接、串連排列，組成結(jié)構(gòu)基因群。至少在第一個結(jié)構(gòu)基因5'側(cè)具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site, RBS)，因而當(dāng)這段含多個結(jié)構(gòu)基因的DNA被轉(zhuǎn)錄成多順反子mRNA，就能被核糖體所識別結(jié)合、并起始翻譯。核糖體沿mRNA移動；在合成完第一個編碼的多肽后，核糖體可以不脫離mRNA而繼續(xù)翻譯合成下一個基因編碼的多肽，直至合成完這條多順反子mRNA

二、基因轉(zhuǎn)錄的翻譯調(diào)控－衰減子

色氨酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的組分，一般的環(huán)境難以給細(xì)菌提供足夠的色氨酸，細(xì)菌要生存繁殖通常需要自己經(jīng)過許多步驟合成色氨酸，但是一旦環(huán)境能夠提供色氨酸時，細(xì)菌就會充分利用外界的色氨酸、減少或停止合成色氨酸，以減輕自己的負(fù)擔(dān)。細(xì)菌所以能做到這點(diǎn)是因?yàn)橛猩彼岵倏v元(trp operon)的調(diào)控。

合成色氨酸所需要酶類的基因E、D、C、B、A等頭尾相接串連排列組成結(jié)構(gòu)基因群，受其上游的啟動子Ptrp和操縱子o的調(diào)控，調(diào)控基因trpR的位置遠(yuǎn)離P-O-結(jié)構(gòu)基因群，在其自身的啟動子作用下，以組成性方式低水平表達(dá)分子量為47000的調(diào)控蛋白R。R并沒有與o結(jié)合的活性，當(dāng)環(huán)境能提供足夠濃度的

色氨酸時，R與色氨酸結(jié)合后構(gòu)象變化而活化，就能夠與o特異性親和結(jié)合，阻遏結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，因此這是屬于一種負(fù)性調(diào)控的、可阻遏的操縱元(repressible operon)，即這操縱元通常是開放轉(zhuǎn)錄的，當(dāng)有效應(yīng)物(色氨酸為阻遏劑)作用時，則阻遏關(guān)閉轉(zhuǎn)錄。細(xì)菌不少生物合成系統(tǒng)的操縱元都屬于這種類型，其調(diào)控可使細(xì)菌處在生存繁殖最經(jīng)濟(jì)最節(jié)省的狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)觀察表明：當(dāng)色氨酸達(dá)到一定濃度，但還沒有高到能夠活化R使其起阻遏作用的程度時，產(chǎn)生色氨酸合成酶類的量已經(jīng)明顯降低，而且產(chǎn)生的酶量與色氨酸濃度呈負(fù)相關(guān)。仔細(xì)研究發(fā)現(xiàn)這種調(diào)控現(xiàn)象與色氨酸操縱元特殊的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

在色氨酸操縱元Ptrp-O與第一個結(jié)構(gòu)基因trpE之間有162bp的一段先導(dǎo)序列(leadingsequence, L)。實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)色氨酸達(dá)一定濃度時，RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄會終止在這里。這段序列中含有編碼由14個氨基酸組成的短肽的開放讀框，其序列中有2個色氨酸相連，在此開放讀框前有核糖體識別結(jié)合位點(diǎn)(RBS)序列，提示這段短開放讀框在轉(zhuǎn)錄后是能被翻譯的。在先導(dǎo)序列的后半段含有3對反向重復(fù)序列(見圖)，在被轉(zhuǎn)錄生成mRNA時都能夠形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，但由于B的序列分別與A和C重疊，所以如果B形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，A和C都不能再形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；相反，當(dāng)A形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，B就不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，卻有利于C生成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。C后面緊跟一串A(轉(zhuǎn)錄成RNA就是一串U)，C實(shí)際上是一個終止子，如果轉(zhuǎn)錄mRNA時它形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，就能使RNA聚合酶停止轉(zhuǎn)錄而從mRNA上脫離下來

在色氨酸未達(dá)到能起阻遏作用的濃度時，從Ptrp起始轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶沿DNA轉(zhuǎn)錄合成mRNA，同時核糖體就結(jié)合到新生成的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)上開始翻譯。當(dāng)色氨酸濃度低時，生成的tRNAtrp色氨酸量就少，能擴(kuò)散到核糖體mRNA形成的翻譯復(fù)合體中供給合成短肽的幾率低，使核糖體沿mRNA翻譯移動的速度慢，趕不上RNA聚合酶沿DNA移動轉(zhuǎn)錄的速度，這時核糖體占據(jù)短開放讀框的機(jī)會較多，使A不能生成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，于是B就形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，阻止了C生成終止信號的結(jié)構(gòu)，RNA聚合酶得以沿DNA前進(jìn)，繼續(xù)去轉(zhuǎn)錄其后trpE等基因，trp操縱元就處于開放狀態(tài)。當(dāng)色氨酸濃度增高時，tRNAtrp色氨酸濃度隨之升高，核糖體沿mRNA翻譯移動的速度加快，占據(jù)到B段的機(jī)會增加，B生

成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的機(jī)會減少，C形成終止結(jié)構(gòu)的機(jī)會增多，RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄的的幾率增加，于是轉(zhuǎn)錄減弱。如果當(dāng)其他氨基酸短缺(注意：短開放讀框編碼的14肽中多數(shù)氨基酸能由環(huán)境充分供應(yīng)的機(jī)會是不多的)或所有的氨基酸都不足時，核糖體翻譯移動的速度就更慢，甚至不能占據(jù)A的序列，結(jié)果有利于A和C發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，于是RNA聚合酶停止轉(zhuǎn)錄，等于告訴細(xì)菌：“整個氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白質(zhì)，不如不合成以節(jié)省能量 ”。

由此可見，先導(dǎo)序列起到隨色氨酸濃度升高降低轉(zhuǎn)錄的作用，這段序列就稱為衰減子attenuator)。在trp操縱元中，對結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控起到粗調(diào)的作用，而衰減子起到細(xì)調(diào)的作用。細(xì)菌其他氨基酸合成系統(tǒng)的許多操縱元(如組氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸等操縱元)中也有類似的衰減子存在。

第二節(jié) 翻譯水平的調(diào)控

一、反義RNA的調(diào)控作用

反義RNA通過與特定的mRNA結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)通常是mRNA上的SD序列及N端的密碼子，從而抑制mRNA的翻譯。

二、mRNA自身的二級結(jié)構(gòu)影響翻譯過程

終止子、衰減子和反義RNA 都是mRNA通過二級結(jié)構(gòu)的改變在不同水平上對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。除此之外，mRNA自身的二級結(jié)構(gòu)還能影響核糖體的結(jié)合以及mRNA的壽命從而影響翻譯。

三、四、蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控 嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)

細(xì)菌處于極差的生長條件下，由于缺乏足夠的氨基酸，蛋白質(zhì)合成受到抑制，因而會關(guān)閉大量的代謝過程，這就是應(yīng)急反應(yīng)(Stringent response)或應(yīng)急調(diào)控。

第八章 真核生物基因表達(dá)調(diào)控

教學(xué)目的：讓學(xué)生理解真核生物基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，并掌握在各水平上的調(diào)控機(jī)制。

教學(xué)重點(diǎn)、難點(diǎn)：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因轉(zhuǎn)錄的影響；轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。課時安排：4學(xué)時 教學(xué)內(nèi)容：

盡管我們現(xiàn)在對真核基因表達(dá)調(diào)控知道還不多，但與原核生物比較它具有一些明顯的特點(diǎn)。

第一節(jié)真核生物基因調(diào)控的特點(diǎn)

一、真核基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)更多

如前所述，基因表達(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的整個過程。同原核生物一樣，轉(zhuǎn)錄依然是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的主要環(huán)節(jié)。但真核基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核(線粒體基因的轉(zhuǎn)錄在線粒體內(nèi))，翻譯則多在胞漿，兩個過程是分開的，因此其調(diào)控增加了更多的環(huán)節(jié)和復(fù)雜性，轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控占有了更多的分量。

真核細(xì)胞在分化過程中會發(fā)生基因重排(gene rearrangement)，即胚原性基因組中某些基因會再組合變化形成第二級基因。例如編碼完整抗體蛋白的基因是在淋巴細(xì)胞分化發(fā)育過程中，由原來分開的幾百個不同的可變區(qū)基因經(jīng)選擇、組合、變化，與恒定區(qū)基因一起構(gòu)成穩(wěn)定的、為特定的完整抗體蛋白編碼的可表達(dá)的基因。這種基因重排使細(xì)胞可能利用幾百個抗體基因的片段，組合變化而產(chǎn)生能編碼達(dá)108種不同抗體的基因，其中就有復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理。

此外，真核細(xì)胞中還會發(fā)生基因擴(kuò)增(gene amplification)，即基因組中的特定段落在某些情況下會復(fù)制產(chǎn)生許多拷貝。最早發(fā)現(xiàn)的是蛙的成熟卵細(xì)胞在受精后的發(fā)育過程中其rRNA基因(可稱為rDNA)可擴(kuò)增2000倍，以后發(fā)現(xiàn)其他動物的卵細(xì)胞也有同樣的情況，這很顯然適合了受精后迅速發(fā)育分裂要合成大量蛋白質(zhì)，需要有大量核糖體。又如MTX(methotrexate)是葉酸的結(jié)構(gòu)類似物，一些哺乳類細(xì)胞會對含有利用葉酸所必需的二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)基因的DNA區(qū)段擴(kuò)增40-100倍，使DHFR的表達(dá)量顯著增加，從而提高對MTX的抗性。基因的擴(kuò)增無疑能夠大幅度提高基因表達(dá)產(chǎn)物的量，但這種調(diào)控機(jī)理至今還不清楚。

真核基因組DNA絕大部分都在細(xì)胞核內(nèi)與組蛋白等結(jié)合成染色質(zhì)，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、染色質(zhì)中NA1、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄

細(xì)胞分裂時染色體的大部分到間期時松開分散在核內(nèi)，稱為常染色質(zhì)(euchromatin)，松散的染色質(zhì)中的基因可以轉(zhuǎn)錄。染色體中的某些區(qū)段到分裂期后不像其他部分解旋松開，仍保持緊湊折疊的結(jié)構(gòu)，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱為異染色質(zhì)(heterochromatin)，其中從未見有基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)；原本在常染色質(zhì)中表達(dá)的基因如移到異染色質(zhì)內(nèi)也會停止表達(dá)；哺乳類雌體細(xì)胞2條X染色體，到間期一條變成異染色質(zhì)者，這條X染色體上的基因就全部失活。可

2、組蛋白的作用

早期體外實(shí)驗(yàn)觀察到組蛋白與DNA結(jié)合阻止DNA上基因的轉(zhuǎn)錄，去除組蛋基因又能夠轉(zhuǎn)錄。組蛋白是堿性蛋白質(zhì)，帶正電荷，可與DNA鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基相結(jié)合，從而遮蔽了DNA分子，妨礙了轉(zhuǎn)錄，可能扮演了非特異性阻遏蛋白的作用；染色質(zhì)中的非組蛋白成分具有組織細(xì)胞特異性，可能消除組蛋白

發(fā)現(xiàn)核小體后，進(jìn)一步觀察核小體結(jié)構(gòu)與基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)活躍轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)區(qū)段，有富含賴氨酸的組蛋白(H1組蛋白)水平降低，H2A·H2B組蛋白二聚體不穩(wěn)定性增加、組蛋白乙?；?acetylation)和泛素化(ubiquitination)，以及H3組蛋白巰基化等現(xiàn)象，這些都是核小體不穩(wěn)定或解體的因素或指征。轉(zhuǎn)錄活躍的3、轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域?qū)怂崦缸饔妹舾卸仍黾?/p>

染色質(zhì)DNA受DNase Ⅰ作用通常會被降解成100、400??bp的片段，反映了完整的核小體規(guī)則的重復(fù)結(jié)構(gòu)。但活躍進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)區(qū)域受DNase Ⅰ消化常出現(xiàn)100－200bp的DNA片段，且長短不均一，說明其DNA受組蛋白掩蓋的結(jié)構(gòu)有變化，出現(xiàn)了對DNase Ⅰ高敏感點(diǎn)(hypersensitive site)。這種高敏感點(diǎn)常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄基因的5′側(cè)區(qū)(5′ flanking region)、3′末端或在基因上，多在調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)的附近，分析該區(qū)域核小體的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可能有利于調(diào)控

蛋白

4、DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化

天然雙鏈DNA的構(gòu)象大多是負(fù)性超螺旋。當(dāng)基因活躍轉(zhuǎn)錄時，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄方向前方DNA的構(gòu)象是正性超螺旋，其后面的DNA為負(fù)性超螺旋。正性超螺旋會拆散核小體，有利于RNA聚合酶向前移動轉(zhuǎn)錄；而負(fù)性超螺旋則有利于核

5、DNA堿基修飾變化

真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytidine,m5C)，而活躍轉(zhuǎn)錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。這種甲基化最常發(fā)生在某些基因5'側(cè)區(qū)的CpG序列中，實(shí)驗(yàn)表明這段序列甲基化可使其后的基因不能轉(zhuǎn)錄，甲基化可能阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA特定部位的結(jié)合從而影響轉(zhuǎn)錄。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常發(fā)育而死亡，可見DNA

由此可見，染色質(zhì)中的基因轉(zhuǎn)錄前先要有一個被激活的過程，但目前對激活機(jī)制還缺乏認(rèn)識。

真核RNA聚合酶對啟動子的親和力很低，基本上不依靠自身來起始轉(zhuǎn)錄，需要依賴多種激活蛋白的協(xié)同作用。真核基因調(diào)控中雖然也發(fā)現(xiàn)有負(fù)性調(diào)控元件，但其存在并不普遍；真核基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有兩種作用者，但總的是以激活蛋白的作用為主。即多數(shù)真核基因在沒有調(diào)控蛋白作用時是不轉(zhuǎn)錄的，需要表達(dá)時就要有激活的蛋白質(zhì)來促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。換言之：真核基因表達(dá)以正性調(diào)控為主導(dǎo)。

第二節(jié) 真核基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

真核細(xì)胞的三種RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中，只有RNA聚合酶Ⅱ能轉(zhuǎn)錄生成mRNA，以下主要討論RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

一、順式作用元件(cis－acting elements)

真核基因的順式調(diào)控元件是基因周圍能與特異轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而影響轉(zhuǎn)錄的DNA序列。其中主要是起正性調(diào)控作用的順式作用元件，包括啟動子(promoter)、增強(qiáng)子(enhancer)；近年又發(fā)現(xiàn)起負(fù)性調(diào)控作用的元件如沉默子(silencer)

1、啟動子

與原核啟動子的含義相同，是指RNA聚合酶結(jié)合并起動轉(zhuǎn)錄的DNA序列。但真核同啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以結(jié)合DNA而起動轉(zhuǎn)錄，而是需要多種蛋白質(zhì)因子的相互協(xié)調(diào)作用，不同蛋白質(zhì)因子又能與不同DNA序列相互作用，不同基因轉(zhuǎn)錄起始及其調(diào)控所需的蛋白因子也不完全相同，因而不同啟動子序列也很不相同，要比原核更復(fù)雜、序列也更長。真核啟動子一般包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其上游約100－200bp序列，包含有若干具有獨(dú)立功能的DNA序列元件，每個元件約長7－30bp。

啟動子中的元件可以分為兩種：核心啟動子元件(core promoter element)和上游啟動子元件(upstream promoter element)（見第五章）。

2、增強(qiáng)子

增強(qiáng)子是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)的長約200bp的一段DNA，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子。增強(qiáng)子通常占100－200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構(gòu)成，基本核心組件常為8－12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。增強(qiáng)子的作用有以下特點(diǎn)：

1）增強(qiáng)子提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可以遠(yuǎn)距離作用，通?？删嚯x1－4kb、個別情況下離開所調(diào)控的基因30kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。

2）增強(qiáng)子作用與其序列的正反方向無關(guān)，將增強(qiáng)子方向倒置依然能起作用。

3）增強(qiáng)子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強(qiáng)子不能表現(xiàn)活性。但增強(qiáng)子對動子沒有嚴(yán)格的專一性，同一增強(qiáng)子可以影響不同類型啟動子的轉(zhuǎn)錄。例如當(dāng)含有增強(qiáng)子的病毒基因組整合入宿主細(xì)胞基因組時，能夠增強(qiáng)整合區(qū)附近宿主某些基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)增強(qiáng)子隨某些染色體段落移位時，也能提高移到的新位置周圍基因的轉(zhuǎn)錄。使某些癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)，可能是腫瘤發(fā)生的因素

4）增強(qiáng)子的作用機(jī)理雖然還不明確，但與其他順式調(diào)控元件一樣，必須與特定的蛋白質(zhì)因結(jié)合后才能發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。增強(qiáng)子一般具有組織或細(xì)胞特

異性，許多增強(qiáng)子只在某些細(xì)胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細(xì)胞或組織中具有

3、沉默子

最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，以后在T淋巴細(xì)胞的T抗原受體基因的轉(zhuǎn)錄和重排中證實(shí)這種負(fù)調(diào)控順式元件的存在。目前對這種在基因轉(zhuǎn)錄降低或關(guān)閉中起作用的序列研究還不多，但從已有的例子看到：沉寂子的作用可不受序列方向的影響，也能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用，并可對異源基因的表達(dá)起作用。

二、反式作用因子

以反式作用影響轉(zhuǎn)錄的因子可統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors, TF)。RNA聚合酶是一種反式作用于轉(zhuǎn)錄的蛋白因子。在真核細(xì)胞中RNA聚合酶通常不能單獨(dú)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用，而需要與其他轉(zhuǎn)錄因子共同協(xié)作。與RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子分別稱為TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ，對TFⅡ研究最多。

以前認(rèn)為與TATA盒結(jié)合的蛋白因子是TFⅡ－D，后來發(fā)現(xiàn)TFⅡ－D實(shí)際包括兩類成分：與TATA盒結(jié)合的蛋白是TBP(TATAbox binding protein)，是唯一能識別TATA盒并與其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，是三種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄時都需要的；其他稱為TBP相關(guān)因子(TBP

associated factors TAF)，至少包括8種能與TBP緊密結(jié)合的因子。轉(zhuǎn)錄前先是TFⅡ－D與TATA盒結(jié)合；繼而TFⅡ－B以其C端與TBP－DNA復(fù)合體結(jié)合，其N端則能與RNA聚合酶Ⅱ親和結(jié)合，接著由兩個亞基組成的TFⅡ－F加入裝配，TFⅡ－F能與RNA聚合酶形成復(fù)合體，還具有依賴于ATP供給能量的DNA解旋酶活性，能解開前方的DNA雙螺旋，在轉(zhuǎn)錄鏈延伸中起作用。這樣，啟動子序列就與TFⅡ－D、B、F及RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合形成一個“最低限度”能有轉(zhuǎn)錄功能基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合物(preintitiation complex, PIC)，能轉(zhuǎn)錄mRNA。TFⅡ－H是多亞基蛋白復(fù)合體，具有依賴于ATP供給能量的DNA解旋酶活性，在轉(zhuǎn)錄鏈延伸中發(fā)揮作用；TFⅡ－E是兩個亞基組成的四聚體，不直接與DNA結(jié)合而可能是與TFⅡ－B聯(lián)系，能提高ATP酶的活性；TFⅡ－E和TFⅡ－H的加入就形成完整的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，能轉(zhuǎn)錄延伸生成長鏈RNA，TFⅡ－A能穩(wěn)定TFⅡ－D與TATA盒的結(jié)合，提高轉(zhuǎn)錄效率，但不是轉(zhuǎn)錄復(fù)合體一定需要的。

以上所述是典型的啟動子上轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成，但有的真核啟動子不含

TATA盒或不通過TATA盒開始轉(zhuǎn)錄。例如有的無TATA盒的啟動子是靠TFⅡ－I和TFⅡ－D共同組成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體開始轉(zhuǎn)錄的。由此可以看到真核轉(zhuǎn)錄起始的復(fù)雜性。

不同基因由不同的上游啟動子元件組成，能與不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，這些轉(zhuǎn)錄因子通過與基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄復(fù)合體作用而影響轉(zhuǎn)錄的效率?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有許多不同的轉(zhuǎn)錄因子，看到的現(xiàn)象是：同一DNA序列可被不同的蛋白因子所識別；能直接結(jié)合DNA序列的蛋白因子是少數(shù)，但不同的蛋白因子間可以相互作用，因而多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子是通過蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間作用與DNA序列聯(lián)系并影響轉(zhuǎn)錄效率的。轉(zhuǎn)錄因子之間或轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合都會引起構(gòu)象的變化，從而影響轉(zhuǎn)錄的效率。

作為蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子從功能上分析其結(jié)構(gòu)可包含有不同區(qū)域：1）DNA結(jié)合域(DNA binding domain)，多由60－100個氨基酸殘基組織的幾個亞區(qū)組成；2）轉(zhuǎn)錄激活域(activating domain)，常由30－100氨基酸殘基組成，這結(jié)構(gòu)域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同種類，以酸性結(jié)構(gòu)域最多見；3）連接區(qū)，即連接上兩個結(jié)構(gòu)域的部分。不與DNA直接結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子沒有DNA結(jié)合域，但能通過轉(zhuǎn)錄激活域直接或間接作用于轉(zhuǎn)錄復(fù)合體而影響轉(zhuǎn)錄效率。

與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子大多以二聚體形式起作用，與DNA結(jié)合的功能域常見有以下幾種：

1、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix, HTH)及螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix，HLH)

這類結(jié)構(gòu)至少有兩個α螺旋，其間由短肽段形成的轉(zhuǎn)角或環(huán)連接，兩個這樣的motif結(jié)構(gòu)以二聚體形式相連，距離正好相當(dāng)于DNA一個螺距(3.4nm)，兩個α螺旋剛好分別嵌入DNA的深溝。

2、鋅指(zinc finger)

每個重復(fù)的“指”狀結(jié)構(gòu)約含23個氨基酸殘基，鋅以4個配價鍵與4個半胱氨酸、或2個半胱氨酸和2個組氨酸相結(jié)合。整個蛋白質(zhì)分子可有20個這樣的鋅指重復(fù)單位。每一個單位可以其指部伸入DNA雙螺旋的深溝，接觸5個核苷酸。例如與GC盒結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子SP1中就有連續(xù)的3個鋅指重復(fù)結(jié)構(gòu)。）堿性－亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)，該結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是蛋白質(zhì)分子的肽鏈上每隔6個氨基酸就有一個亮氨酸殘基，結(jié)果就導(dǎo)致這些亮氨酸殘基都在α螺旋的同一個方向出現(xiàn)。兩個相同結(jié)構(gòu)的兩排亮氨酸殘基就能以

疏水鍵結(jié)合成二聚體，該二聚體的另一端的肽段富含堿性氨基酸殘基，借其正電荷與DNA雙螺旋鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)結(jié)合。若不形成二聚體則對DNA的親和結(jié)合力明顯降低。在肝臟、小腸上皮、脂肪細(xì)胞和某些腦細(xì)胞中有稱為C/EBP家族的一大類蛋白質(zhì)能夠與CAAT盒和病毒增強(qiáng)子結(jié)合，其特征就是能形成bZIP二聚體結(jié)構(gòu)（如右圖）。

從上述可見：轉(zhuǎn)錄調(diào)控的實(shí)質(zhì)在于蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，構(gòu)象的變化正是蛋白質(zhì)和核酸“活”的表現(xiàn)。但對生物大分子間的辨認(rèn)、相互作用、結(jié)構(gòu)上的變化及其在生命活動中的意義，人們的認(rèn)識和研究還只在起步階段，其中許多內(nèi)容甚至重要的規(guī)律我們可能至今還一無所知，有待于努力探索。

第三節(jié) 轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控

一、hnRNA的選擇性加工運(yùn)輸

二、mRNA前體的選擇性拼接

第三節(jié)翻譯水平的調(diào)控

一、mRNA的穩(wěn)定性二、三、mRNA翻譯起始的調(diào)控

真核生物蛋白質(zhì)合成的自體調(diào)控

第三篇：《分子生物學(xué)》教案(精)

《分子生物學(xué)》教案

O

RNA加工與核糖核蛋白復(fù)合體 教學(xué)目的和要求 了解RNA加工類型

2理解真核生物mRNA加工

3掌握原核生物rRNA和 tRNA的加工 O1 rRNA加工與核糖體

RNA加工類型

常見的類型有：內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶對核苷酸的切除；3/ 端和5/ 端添加核苷酸；對堿基或糖苷的修飾

原核生物的 rRNA加工

轉(zhuǎn)錄物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)并與蛋白質(zhì)結(jié)合成核糖核蛋白復(fù)合物（RNP），然后進(jìn)行修飾（如對A的甲基化修飾），隨之由RNA聚合酶Ⅲ剪切釋放5S、16S、23S前體分子，再由RNA酶M5、M16、M23分別在每一前體分子的3/ 端和5/ 端進(jìn)行進(jìn)一步剪切，釋放出成熟的全長RNA分子

真核生物的 rRNA加工

哺乳動物47S前 rRNA經(jīng)歷了一系列剪切，先切去外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，再切去內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，釋放32S和20S兩個前RNA，最后釋放18S、5.8S、28S rRNA。嗜熱四膜蟲 rRNA在加工過程中，其內(nèi)含子可被自身RNA所切除，這種具有酶活性的RNA稱為核酶

核糖核蛋白復(fù)合體（RNP）特定蛋白與特定RNA形成的復(fù)合體叫RNP 原核生物核糖體

大腸桿菌70S核糖體由30S（21種蛋白質(zhì)和5S rRNA）小亞基和50S（31種蛋白質(zhì)和 23S、5S rRNA）大亞基構(gòu)成

真核生物核糖體

80S核糖體包含60S大亞基（45種蛋白質(zhì)、一個5S rRNA、一個5.8S rRNA和一個28S rRNA）和40S小亞基（30種蛋白質(zhì)和18S rRNA）O2 tRNA的加工、RNA酶P和核酶

原核生物的 tRNA加工

轉(zhuǎn)錄物前體形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)→RNase E、F切割3/ 端→RNase D對3/ 端修剪→RNaseP 對5/ 端切除→RNase D再除去3/端的兩個核苷酸→ tRNA進(jìn)行堿基修飾

真核生物的 tRNA加工

內(nèi)切酶先切去5/ 端的前導(dǎo)區(qū)和2個額外的3/ 端核苷酸，再由 tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶將5/-CCA-3/ 序列加到3/ 端，切除內(nèi)含子

核糖核酸酶P 剪切前 tRNA產(chǎn)生成熟的5/ 端。其RNA組分可單獨(dú)行使內(nèi)切核酸酶功能

核酶

可催化特定生化反應(yīng)的RNA。RNaseP是可使 tRNA成熟的核酶。O3 mRNA加工、hnRNP、snRNP

mRNA加工

原核生物的 mRNA不需要加工。真核生物的RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的基因大小長度不一，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的群體統(tǒng)稱為核內(nèi)不均一RNA（hnRNA），將被加工的 mRNA為前RNA，其加工包括：5/ 端加帽；3/ 端剪切及加polyA尾；剪接和甲基化

hnRNP 前RNA被蛋白質(zhì)（主要是A、B、C）包裹形成核內(nèi)不均一RNP（hnRNP）snRNP顆粒

富含U的核內(nèi)小分子RNA與蛋白質(zhì)形成snRNP顆粒，大部分參與前rRNA加工的甲基化位點(diǎn)定位

5/ 端加帽

5/ 端加上7-甲基鳥苷，GMP以反方向加到RNA轉(zhuǎn)錄物上，形成5/-5/ 三磷酸橋。帽子結(jié)構(gòu)對5/ 外切核酸酶形成屏障

3/ 端剪切和加尾

3/ 端經(jīng)過剪切再由聚腺苷酸聚合酶（PAP）加上poly（A）尾。可抵抗3/-外切核酸酶的攻擊，也助于 mRNA的翻譯

剪接

切除內(nèi)含子將外顯子連接一起的過程，由U1、U2、U4、U5、U6snRNP催化。內(nèi)含子有5/ GC和AG-3/及一端分支點(diǎn)序列

前 mRNA的甲基化

常見的是A上N6的甲基化 O4 可變 mRNA加工

可變加工

在特定前mRNA上形成一種以上的mRNA。它包括可變剪接和可變poly（A）加工

可變poly（A）位點(diǎn)

采用不同的poly（A）位點(diǎn)可導(dǎo)致采用不同的剪接方式 可變剪接

利用不同的5/位、3/位剪接位點(diǎn)產(chǎn)生不同的mRNA RNA編輯

改變、插入或刪除初始轉(zhuǎn)錄物特定部位的堿基而改變其核苷酸序列。

P 遺傳密碼與tRNA 教學(xué)目的和要求

1了解遺傳密碼的特性 掌握tRNA的結(jié)構(gòu)和功能 P1 遺傳密碼

特性

4種核苷酸組成的三聯(lián)體密碼有64種，氨基酸只有20種，大多數(shù)氨基酸有多個密碼子，因此遺傳密碼具有簡并性

破譯

利用隨機(jī)共聚物加入無細(xì)胞體系來合成mRNA，可以確定密碼子的構(gòu)成 特征

編碼同一氨基酸的密碼子為同義密碼子（蛋氨酸和色氨酸只有一個密碼子），通常只是第3個堿基不同

突變效應(yīng)

第3位的轉(zhuǎn)換通常不改變氨基酸，第3位的顛換一半以上也是無效的。第2位的轉(zhuǎn)換導(dǎo)致相似氨基酸的轉(zhuǎn)變，顛換則改變氨基酸類型 通用性

密碼子在所有生物都通用

可讀框

始于ATG止于終止密碼的連續(xù)密碼子區(qū)域，沒有已知的蛋白產(chǎn)物，該區(qū)域?yàn)榭勺x框，確定有蛋白產(chǎn)物時叫編碼區(qū)

重疊基因

一個基因的編碼區(qū)和另一個編碼區(qū)重疊，病毒可利用該方式增加基因組的編碼能力

P2 tRNA的結(jié)構(gòu)和功能

tRNA的一級結(jié)構(gòu)

含有許多修飾堿基，常見有4種：胸苷，假尿苷，二氫尿苷和肌苷。從5/ 到3/ 端分別形成D環(huán)、反密碼子環(huán)、T環(huán)和接受臂

tRNA的二級結(jié)構(gòu)

三葉草結(jié)構(gòu)：氨基酸結(jié)合臂與氨基酸結(jié)合；D環(huán)—含二氫尿嘧啶；反密碼子環(huán)—肌苷（I）可與同義密碼子配對；可變臂；TψC臂和環(huán)；3/ 端有CCA結(jié)構(gòu) tRNA的三級結(jié)構(gòu) 倒L 型

功能及氨?；?/p>

tRNA與氨基酸結(jié)合為氨酰-tRNA，由氨酰-tRNA合成酶催化 氨酰tRNA合成酶 依賴

tRNA上的鑒別元件來識別不同

tRNA

第四篇：分子生物學(xué)原理教案

核酸的結(jié)構(gòu)與功能

教學(xué)要求：

1．掌握核苷酸的分子結(jié)構(gòu)，了解連接鍵及分子表達(dá)式 2．重點(diǎn)掌握DNA、RNA的結(jié)構(gòu)特征及主要功能 3．了解DNA的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的關(guān)系 4．了解DNA的高級結(jié)構(gòu)

課時安排：總學(xué)時 4.0

第一節(jié)

核酸的化學(xué)組成及一級結(jié)構(gòu)

1.0 第二節(jié)

DNA的空間結(jié)構(gòu)與功能

1.0 第三節(jié)

RNA的結(jié)構(gòu)和功能

1.0 第四節(jié)

核酸的理化性質(zhì)

0.8 第五節(jié)

核酸酶

0.2

重點(diǎn)：

1． 核酸的化學(xué)組成 2． DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu) 3． RNA的結(jié)構(gòu)和功能 4． 核酸的理化性質(zhì)

難點(diǎn)：

1． DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu) 2． 核酸的理化性質(zhì)

教學(xué)內(nèi)容：

一、核酸的化學(xué)組成及一級結(jié)構(gòu)

1．核苷酸

嘌呤與嘧啶，DNA和RNA分子中核苷酸組成上的特點(diǎn)，核苷酸各組分之間的連接方式 2．脫氧核苷酸的連接 3．核苷酸的連接 4．核酸的一級結(jié)構(gòu)

二、DNA的空間結(jié)構(gòu)與功能

1．DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)

Chargaff規(guī)則、B-雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和Z-DNA。2．DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)

染色質(zhì)、核小體、組蛋白、基因 3．DNA是遺傳信息的物質(zhì)基礎(chǔ)

三、RNA的結(jié)構(gòu)和功能

1．mRNA 模板、hnRNA 2．tRNA

稀有堿基、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、反密碼環(huán) 3．rRNA

核糖體、多核糖體

四、核酸的理化性質(zhì)

紫外吸收、變性、復(fù)性、增色效應(yīng)、減色效應(yīng)、解鏈溫度、雜交、探針。

五、核酸酶

思考題：

1． 核酸紫外測定的分子基礎(chǔ)是什么？

2． DNA和RNA的紫外測定結(jié)果有何不同？為什么？ 3． DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點(diǎn)是什么？

核苷酸代謝

教學(xué)要求：

1．了解食物核酸的消化吸收和體內(nèi)核苷酸合成的途徑。

2．掌握嘌呤和嘧啶核苷酸的合成原料，合成反應(yīng)特點(diǎn)，分解代謝的產(chǎn)物。

3．掌握核糖單核苷酸向脫氧核糖核苷酸的轉(zhuǎn)變。

4．了解核苷酸類抗代謝作用的生化環(huán)節(jié)。

課時安排：總學(xué)時 4.0 第一節(jié)

嘌呤核苷酸的合成與分解代謝

2.0 第二節(jié)

嘧啶核苷酸的合成與分解代謝

2.0 重點(diǎn)：

1．嘌呤和嘧啶核苷酸的合成原料 2．嘌呤和嘧啶核苷酸分解代謝的產(chǎn)物

3．脫氧核糖核苷酸的生成 難點(diǎn)：

嘌呤和嘧啶核苷酸的合成過程 教學(xué)內(nèi)容：

一、嘌呤核苷酸的合成與分解代謝

1．嘌呤核苷酸的從頭合成IMP的合成原料及關(guān)鍵酶，AMP和GMP的轉(zhuǎn)變，嘌呤核苷酸合成的調(diào)節(jié)，嘌呤核苷酸的的補(bǔ)救合成和相互轉(zhuǎn)變，脫氧核苷酸的生成，嘌吟核苷酸的抗代謝物。

2．嘌呤核苷酸的分解代謝

磷酸核苷、核苷及嘌呤的降解，尿酸的生成。

二、嘧啶核苷酸的合成與分解代謝

1．嘧啶核苷酸的從頭合成UMP的合成原料及關(guān)鍵酶，UMP向CTP和TMP的轉(zhuǎn)變，嘧啶核苷酸補(bǔ)救合成，嘧啶核苷酸的抗代謝物。2．嘧啶核苷酸的分解代謝

α-氨基異丁酸的排泄。

思考題：

1． 核苷酸抗代謝物分幾類？試分析其抗腫瘤作用的分子基礎(chǔ)。2． 試小結(jié)嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)中個原子的分子來源。

DNA的生物合成

教學(xué)要求：

1．熟悉遺傳信息流向的中心法則。

2．掌握DNA復(fù)制方式、逆轉(zhuǎn)錄作用及相關(guān)酶系的特征。

3．了解DNA修復(fù)系統(tǒng)及特點(diǎn)。

課時安排：總學(xué)時 4.0 第一節(jié)

復(fù)制的基本規(guī)律

0.5 第二節(jié)

DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化

1.0 第三節(jié)

DNA生物合成過程

1.5第四節(jié)

逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式

0.5 第五節(jié)

DNA損傷(突變)與修復(fù)

0.5

重點(diǎn)： 1．遺傳信息流向的中心法則。

2．原核生物DNA半保留復(fù)制方式及相關(guān)酶系。難點(diǎn)：

1． 真核生物的DNA生物合成 2． 端粒和端粒酶 教學(xué)內(nèi)容：

一、復(fù)制的基本規(guī)律

1．半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及意義

2．雙向復(fù)制

3．半不連續(xù)復(fù)制

二、DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化

1．復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)

2．DNA聚合酶

原核生物與真核生物的DNA聚合酶

3．復(fù)制高保真性的酶學(xué)依據(jù)

4．復(fù)制中的解鏈伴有DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化

解螺旋酶、拓?fù)涿?、SSB。

引物酶和引發(fā)體。

5．DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口

三、DNA生物合成過程

1．原核生物的DNA生物合成復(fù)制的起始：DNA解成單鏈，引發(fā)體的形成；復(fù)制的延長：復(fù)制延長的生化過程，復(fù)制的半不連續(xù)性及岡崎片段；復(fù)制的終止：切除引物、填補(bǔ)空缺和連接切口。

2．真核生物的DNA生物合成復(fù)制的起始與原核基本相似；復(fù)制的延長發(fā)生DNA聚合酶α/δ轉(zhuǎn)換；復(fù)制的終止：端粒和端粒酶。

四、逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式

1．逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組是RNA，其復(fù)制方式是逆轉(zhuǎn)錄 2．逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn)發(fā)展了中心法則 3．滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制

五、DNA損傷(突變)與修復(fù)

1．突變的意義。

2．引發(fā)突變的因素。

3．突變分子改變的類型

錯配，缺失、插入和框移突變，重排。

4．DNA損傷的修復(fù)：光修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)、SOS修復(fù)。思考題：

1．試簡述DNA復(fù)制的特征和參與DNA復(fù)制的酶系。

2．什么是逆轉(zhuǎn)錄？試簡述逆轉(zhuǎn)錄的基本過程。

3．試簡述DNA突變的類型及DNA損傷的修復(fù)類型。

RNA的生物合成

教學(xué)要求：

1．掌握轉(zhuǎn)錄是RNA生物合成及信息流動的重要環(huán)節(jié)。

2．掌握轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)及三類RNA轉(zhuǎn)錄后的加工。

3．了解轉(zhuǎn)錄酶的特征。

4．熟悉核酶及其功能。

課時安排：總學(xué)時 4.0 第一節(jié)

原核生物轉(zhuǎn)錄的模板和酶

1.0 第二節(jié)

原核生物的轉(zhuǎn)錄過程

1.0 第三節(jié)

真核生物RNA的生物合成1.0

第四節(jié)

真核生物RNA的加工

1.0 重點(diǎn)：

1． 原核生物轉(zhuǎn)錄的模板和酶 2． 原核生物的轉(zhuǎn)錄過程 3． 真核生物RNA的加工

難點(diǎn)：

真核生物mRNA的加工中內(nèi)含子的剪接方式、mRNA編輯。

教學(xué)內(nèi)容：

一、原核生物轉(zhuǎn)錄的模板和酶

1．原核生物轉(zhuǎn)錄的模板

2．RNA聚合酶

全酶、核心酶

3．RNA聚合酶結(jié)合到DNA的啟動子上啟動轉(zhuǎn)錄

二、原核生物的轉(zhuǎn)錄過程

1．轉(zhuǎn)錄起始

轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，開放轉(zhuǎn)錄復(fù)合體。

2．原核生物轉(zhuǎn)錄延長時蛋白質(zhì)的翻譯也同時進(jìn)行。

3．轉(zhuǎn)錄終止

依賴ρ因子、非依賴ρ因子兩大類。

三、真核生物RNA的生物合成1．真核生物有三種DNA依賴性RNA聚合酶

2．轉(zhuǎn)錄起始需要啟動子、RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的參與 3．真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程中沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象 4．真核生物轉(zhuǎn)錄終止和加尾修飾同時進(jìn)行

四、真核生物RNA的加工

1．真核生物mRNA的加工

首尾修飾及剪接、內(nèi)含子的其它剪接方式及功能、斷裂基因、mRNA編輯。

2．真核前體rRNA的加工

3．真核生物前體tRNA的加工包括把核苷酸的堿基修飾為稀有堿基。

思考題：

1． 試比較原核生物與真核生物RNA聚合酶有何區(qū)別？ 2． 試舉例說明什么是mRNA編輯？ 3． 試小結(jié)真核生物mRNA的加工過程。

蛋白質(zhì)的生物合成

教學(xué)要求：

1．掌握遺傳信息、遺傳密碼與mRNA的關(guān)系，遺傳密碼的特征。

2．掌握蛋白質(zhì)生物合成體系中主要RNA、三種酶和多種蛋白質(zhì)因子的功能和作用特點(diǎn)，生物合成過程及能量變化。

3．了解翻譯后蛋白質(zhì)的加工方式。

4．了解蛋白質(zhì)合成的干擾和抑制。

課時安排：總學(xué)時 4.0 第一節(jié)

蛋白質(zhì)生物合成體系

1.0 第二節(jié)

氨基酸的活化

1.0 第三節(jié)

蛋白質(zhì)的生物合成過程

1.0

第四節(jié)

蛋白質(zhì)翻譯后修飾和靶向運(yùn)輸

0.6 第五節(jié)

蛋白質(zhì)生物合成的干擾和抑制

0.4

重點(diǎn)： 1.遺傳密碼與mRNA的關(guān)系及其特征

2.蛋白質(zhì)生物合成體系 3.氨基酸的活化

難點(diǎn)： 蛋白質(zhì)的生物合成過程 教學(xué)內(nèi)容：

一、蛋白質(zhì)生物合成體系

1．mRNA是蛋白質(zhì)生物合成的直接模板

遺傳密碼的方向性、連續(xù)性、簡并性、通用性和擺動性。

2．核糖體是蛋白質(zhì)生物合成的場所。

3．tRNA是氨基酸的運(yùn)載工具及蛋白質(zhì)生物合成的適配器

氨基酸臂、反密碼子

4．蛋白質(zhì)生物合成需要酶類、蛋白質(zhì)因子等

二、氨基酸的活化

1．氨基酰tRNA 氨基酰tRNA合成酶

2．真核生物起始氨基酰tRNA是Met-tRNAiMet

三、蛋白質(zhì)的生物合成過程

1．原核生物的肽鏈合成過程

起始：起始因子；延長：延長因子，注冊、成肽、轉(zhuǎn)位，核糖體循環(huán)；終止：終止密碼子。2．真核生物的肽鏈合成過程

四、蛋白質(zhì)翻譯后修飾和靶向運(yùn)輸

1．多肽鏈折疊為天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)

分子伴侶、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、肽-脯氨酸順反異構(gòu)酶。

2．蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)修飾主要是肽鍵水解和化學(xué)修飾

3．蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)修飾包括亞基聚合和輔基連接 4．合成后蛋白質(zhì)可被靶向輸送至細(xì)胞特定部位

五、蛋白質(zhì)生物合成的干擾和抑制 1．抗生素對翻譯的抑制作用

2．其他干擾蛋白質(zhì)生物合成的物質(zhì)

思考題：

1．試簡述蛋白質(zhì)生物合成體系及3種RNA在蛋白質(zhì)生物合成中的作用。2．試小結(jié)原核生物復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的基本過程。

基因表達(dá)調(diào)控

教學(xué)要求：1．掌握原核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控方式和機(jī)理。

2．熟悉基因表達(dá)調(diào)控基本概念與原理。3．了解真核生物的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式。

課時安排：總學(xué)時 4.0 第一節(jié)

基因表達(dá)調(diào)控的基本概念

1.0 第二節(jié)

基因表達(dá)調(diào)控的基本原理

1.0 第三節(jié)

原核基因表達(dá)調(diào)節(jié)

1.5第四節(jié)

真核基因表達(dá)調(diào)節(jié)

0.5 重點(diǎn)： 原核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控方式

乳糖操縱子調(diào)控模式

難點(diǎn)： 真核生物的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式 教學(xué)內(nèi)容：

一、基因表達(dá)調(diào)控的基本概念

1．基因表達(dá)是指基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的過程

2．基因表達(dá)具有時間特異性和空間特異性

3．基因表達(dá)的方式及調(diào)節(jié)存在很大的差異

組成性表達(dá)、誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)。

4．基因表達(dá)調(diào)控為生物體學(xué)生長、發(fā)育所必需

適應(yīng)環(huán)境、維持生長和增殖、維持個體發(fā)育與分化。

二、基因表達(dá)調(diào)控的基本原理

1．基因表達(dá)調(diào)控呈現(xiàn)多層次和復(fù)雜性

2．基因轉(zhuǎn)錄激活受到轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白與啟動子相互作用的調(diào)節(jié)

三、原核基因表達(dá)調(diào)節(jié)

1．原核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特點(diǎn)

σ因子決定RNA聚合酶識別特異性、操縱子調(diào)控模型和阻遏蛋白與阻遏機(jī)制的普遍性。

2．操縱子調(diào)控模式在原核基因轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)中具有普遍性

乳糖操縱子結(jié)構(gòu)、阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)、cAMP-CAP的正調(diào)節(jié)、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)。3．原核生物具有不同的轉(zhuǎn)錄終止調(diào)節(jié)機(jī)制

4．原核生物在翻譯水平同樣受到多個環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)

四、真核基因表達(dá)調(diào)節(jié)

1．真核基因組具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

2．真核基因表達(dá)調(diào)控更為復(fù)雜

3．RNA PolI和PolIII轉(zhuǎn)錄體系的調(diào)節(jié)相對簡單

4．RNA PolII轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)非常復(fù)雜

順式作用元件、反式作用因子、mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)。

5．RNA PolII轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚

6．轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)也是基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)

7．基因表達(dá)在翻譯水平以及翻譯后階段仍然可以受到調(diào)節(jié)

思考題：

1．原核生物基因表達(dá)調(diào)控的基本原理是什么？ 2．乳糖操縱子是如何實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控的？

3．順式作用元件、反式作用因子在真核基因表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用是什么？

基因重組與基因工程

教學(xué)要求：

1．掌握自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組。

2．熟悉重組DNA技術(shù)的相關(guān)概念。

3．掌握重組DNA技術(shù)的基本原理。

4．了解重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系。

課時安排：總學(xué)時 4.0 第一節(jié)

自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的1.5 第二節(jié)

重組DNA技術(shù)

2.0 第三節(jié)

重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系

0.5

重點(diǎn)：

1． 自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組

2． 重組DNA技術(shù)的基本原理及步驟

難點(diǎn)：

重組DNA技術(shù)的基本原理

教學(xué)內(nèi)容：

一、自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移是經(jīng)常發(fā)生的 1．同源重組

2．細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組

3．特異位點(diǎn)重組

4．轉(zhuǎn)座重組。

二、重組DNA技術(shù)

1．重組DNA技術(shù)相關(guān)概念

DNA克隆，工具酶，基因載體。

2．重組DNA技術(shù)基本原理及操作步驟

目前基因的獲取、克隆載體的選擇和構(gòu)建、外源基因與載體的連接、重組DNA導(dǎo)入受體菌、重組體篩選、克隆基因的表達(dá)。

三、重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系

1．疾病基因的發(fā)現(xiàn) 2．生物制藥

3．基因診斷與治療 4．遺傳病的預(yù)防

思考題：

1． 簡述基因工程的基本條件和基本過程。

2． 舉例說明基因工程在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

細(xì)胞信息轉(zhuǎn)導(dǎo)

教學(xué)要求：

1．掌握細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的概念。

2．掌握各種受體的分子結(jié)構(gòu)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

3．了解信息傳遞途徑的交互聯(lián)系。

4．了解細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系。

課時安排：總學(xué)時 4.0 第一節(jié)

細(xì)胞信息轉(zhuǎn)導(dǎo)概述

1.0 第二節(jié)

細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子

1.0 第三節(jié)

各種受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)基本信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

1.5第四節(jié)

細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與醫(yī)學(xué)

0.5 重點(diǎn)：

1． 細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的概念

2． 各種受體的分子結(jié)構(gòu)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

難點(diǎn)：

1． 各種受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)基本信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 2． G蛋白的結(jié)構(gòu)

教學(xué)內(nèi)容：

一、細(xì)胞信息轉(zhuǎn)導(dǎo)概述

1．細(xì)胞外化學(xué)信號有可溶性和膜結(jié)合型兩種形式 2．細(xì)胞經(jīng)由特異性受體接受細(xì)胞外信號

3．細(xì)胞內(nèi)信號分子結(jié)構(gòu)、含量和分布變化是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)工作的基礎(chǔ)

二、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)分子

1．第二信使的濃度和分布變化是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式

2．蛋白質(zhì)作為細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子

三、各種受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)基本信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

1．細(xì)胞內(nèi)受體多屬于轉(zhuǎn)錄因子

2．離子通道型膜受體是化學(xué)信號與電信號轉(zhuǎn)換器 3．七跨膜受體依賴G蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號

4．單跨膜受體依賴酶的催化作用傳遞信號 5．細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的特點(diǎn)和規(guī)律

四、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與醫(yī)學(xué)

1．信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的結(jié)構(gòu)改變是許多疾病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ) 2．細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子是重要的藥物作用靶位

思考題：

1．按照作用方式的不同，細(xì)胞內(nèi)信號分子有哪些？各有何特點(diǎn)？ 2．試述信號分子與受體結(jié)合的特點(diǎn)。

3．各類型的膜受體結(jié)構(gòu)和功能上有什么特點(diǎn)？

4．簡述G蛋白的結(jié)構(gòu)，并說明其活化型和非活化型如何互變。

糖蛋白、蛋白聚糖和細(xì)胞外基質(zhì)

教學(xué)要求：

1．掌握糖蛋白、蛋白聚糖和細(xì)胞外基質(zhì)的概念及糖蛋白的分類。2．熟悉膠原蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。3．熟悉糖蛋白寡糖鏈的功能。

4．了解纖連蛋白和層粘連蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。

課時安排：總學(xué)時 4.0 第一節(jié)

糖蛋白

2.0 第二節(jié)

蛋白聚糖

1.0 第三節(jié)

細(xì)胞外基質(zhì)

1.0

重點(diǎn)： 糖蛋白、蛋白聚糖和細(xì)胞外基質(zhì)的概念

糖蛋白的分類 難點(diǎn)：糖蛋白分子中聚糖的功能 教學(xué)內(nèi)容：

一、糖蛋白

1．糖蛋白的結(jié)構(gòu)

N連接糖蛋白：高甘露糖型、復(fù)雜型、雜合性；O連接糖蛋白。

2．糖蛋白分子中聚糖的功能

二、蛋白聚糖

1．重要的糖胺聚糖。

2．核心蛋白。

3．蛋白聚糖的生物合成。

4．蛋白聚糖的功能。

三、細(xì)胞外基質(zhì)

1．膠原。

2．纖連蛋白。

3．層粘連蛋白。

思考題：

1． 試簡述糖蛋白N連接聚糖的分類及其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。2． 試簡要說明糖蛋白分子中聚糖的功能。

癌基因、抑癌基因與生長因子

教學(xué)要求：

1．掌握癌基因、抑癌基因及生長因子的基本概念。2．熟悉原癌基因產(chǎn)物及其功能。

3．了解癌基因活化機(jī)制及抑癌基因作用機(jī)制。

課時安排：總學(xué)時 4.0 第一節(jié)

癌基因

2.0 第二節(jié)

抑癌基因

1.0 第三節(jié)

生長因子

1.0

重點(diǎn)：

1． 癌基因、抑癌基因及生長因子的基本概念 2． 原癌基因產(chǎn)物及其功能

難點(diǎn)：

癌基因活化機(jī)制及抑癌基因作用機(jī)制

教學(xué)內(nèi)容：

一、癌基因

1．病毒癌基因

DNA病毒、RNA病毒

2．細(xì)胞癌基因

src家族、ras家族、myc家族、sis家族、myb家族。

3．癌基因活化的機(jī)制

獲得啟動子、染色體易位、原癌基因擴(kuò)增、點(diǎn)突變。

4．原癌基因的產(chǎn)物與功能

生長因子、跨膜生長因子受體、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)體、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子。

二、抑癌基因

1．抑癌基因的基本概念

2．常見的抑癌基因

3．抑癌基因的作用機(jī)制

三、生長因子

1．概述

2．生長因子的作用機(jī)制

3．生長因子與疾病

細(xì)胞凋亡、心血管疾病

思考題：

1． 什么是病毒癌基因？什么是細(xì)胞癌基因？兩者有何區(qū)別？ 2． 什么是生長因子？是舉例說明其作用機(jī)制。

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

教學(xué)要求：

1．掌握分子雜交、印跡技術(shù)及PCR原理。

2．熟悉印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用，PCR基本過程。3．了解核酸序列分析。

4．熟悉基因診斷的概念，常用技術(shù)方法及其應(yīng)用。5．了解基因治療的概念及其應(yīng)用。

課時安排：總學(xué)時 6.0 第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

1.0 第二節(jié)

PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用

1.0 第三節(jié)

核酸序列分析

0.4 第四節(jié)

基因文庫

0.4 第五節(jié)

生物芯片技術(shù)

0.4 第六節(jié)

生物大分子相互作用研究技術(shù)

1.0 第七節(jié)

遺傳修飾動物模型的建立與應(yīng)用

0.4 第八節(jié)

疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定

0.4 第九節(jié)

基因診斷和基因治療

1.0 重點(diǎn)：

1．分子雜交、印跡技術(shù)的分類及應(yīng)用。2．PCR原理及PCR基本過程。

3．基因診斷的概念，常用技術(shù)方法及其應(yīng)用。

難點(diǎn)：

1． 核酸序列分析

2． 疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定

教學(xué)內(nèi)容：

一、分子雜交與印跡技術(shù)

1．分子雜交和印跡技術(shù)的原理

印跡技術(shù)、探針技術(shù)

2．印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用

DNA印跡、RNA印跡、蛋白質(zhì)的印跡分析

二、PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用

1．PCR技術(shù)的工作原理。

2．PCR技術(shù)的的主要用途。

3．幾種重要的PCR衍生技術(shù)

逆轉(zhuǎn)錄PCR、原位PCR、實(shí)時PCR、三、核酸序列分析

1．DNA鏈末端終止法化學(xué)裂解法

2．DNA自動測序

四、基因文庫

1．基因組DNA文庫 2．c DNA文庫

五、生物芯片技術(shù) 1．基因芯片 2．蛋白質(zhì)芯片

六、生物大分子相互作用研究技術(shù) 1．蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

2．DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)

七、遺傳修飾動物模型的建立與應(yīng)用 1．轉(zhuǎn)基因技術(shù) 2．核轉(zhuǎn)移技術(shù) 3．基因剔除技術(shù)

4．基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)發(fā)展中的作用

八、疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定 1．功能克隆 2．定位克隆

九、基因診斷和基因治療

1．基因診斷

DNA序列分析、PCR技術(shù)、基因芯片。2．基因治療

基因治的基本策略、基因治療的基本程序

思考題：

1．印跡技術(shù)有哪幾類？試比較他們在原理及操作過程中的不同點(diǎn)。2．PCR的原理是什么？試小結(jié)其基本過程。3．什么是基因診斷？常用的技術(shù)方法有哪些？

第五篇：分子生物學(xué)電子教案第二章

第二章 核酸的結(jié)構(gòu)和功能

1、主要內(nèi)容

v 細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)

v 核酸的化學(xué)組成與共價結(jié)構(gòu)

v DNA的二級結(jié)構(gòu)

v DNA分子的高級結(jié)構(gòu)

v 真核生物的染色體及其組裝

v RNA的結(jié)構(gòu)與功能

v 核酸的變性、復(fù)性與分子雜交

2、教學(xué)要求

v 掌握遺傳物質(zhì)的只要特點(diǎn)和種類；

v 掌握DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，核酸的變性、復(fù)性和分子雜交原理；

v 熟悉核酸的物理化學(xué)性質(zhì)

v 熟悉DNA 多種高級結(jié)構(gòu)

第一節(jié) 細(xì)胞的遺傳物質(zhì)

一、DNA攜帶兩類不同的遺傳信息

1.遺傳物質(zhì)必須具有的特性

a.貯存并表達(dá)遺傳信息

b.能把信息傳遞給子代

c.物理和化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定

d.具有遺傳變化的能力

l DNA的特征

a)各異的堿基序列儲存大量的遺傳信息

b)堿基互補(bǔ)是其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄表達(dá)遺傳信息的基礎(chǔ)

c)生理狀態(tài)下物理、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定

d)有突變和修復(fù)能力，可穩(wěn)定遺傳是生物進(jìn)化的基礎(chǔ)

！遺傳物質(zhì)核酸是如何被證明的？

2、DNA攜帶兩種遺傳信息

a、編碼蛋白質(zhì)和RNA的信息(編碼tRNA、rRNA)：64個三聯(lián)體密碼子：3個終止密碼子，編碼氨基酸的61個密碼子具有簡并性、通用性

b、編碼基因選擇性表達(dá)的信息

¨原核生物的結(jié)構(gòu)基因占Genome的比例很大，Φx174phage 5386bp，結(jié)構(gòu)基因用去5169bp比例達(dá)96％。

¨真核生物的結(jié)構(gòu)基因占Genome的比例很小，哺乳動物中結(jié)構(gòu)基因只占10％～15％。

¨其余80％以上的DNA起什么作用目前還無法精確解釋，但可以肯定其中大部分DNA序列是編碼基因選擇性表達(dá)的遺傳信息。

¨表現(xiàn)在：細(xì)胞周期的不同時相中

個體發(fā)育不同階段

不同的器官和組織

不同的外界環(huán)境下各種基因的表達(dá)與否以及量的差異

¨所以又稱－－調(diào)控序列

二、RNA也可作為遺傳物質(zhì)

n RNA病毒：傳染媒介是病毒顆粒（病毒基因組RNA、蛋白質(zhì)外殼）

n Tobacco Mosaic Virus

(TMV)

n 類病毒（viroid）: 使高等植物產(chǎn)生疾病的傳染性因子，只由RNA組成。

三、是否存在核酸以外的遺傳物質(zhì)

n Prion(proteinaccous infections particle)引起的**

n 朊病毒－－－蛋白質(zhì)樣的感染因子

1)羊搔癢病(scripie)

2)人類庫魯（kuru）病

3)牛海綿狀腦炎(瘋牛病)

n 均由傳染性病原蛋白顆粒引起，統(tǒng)稱Prion(朊病毒)資料：1982年，美國加利福尼亞大學(xué)教授斯坦利?普利西納提出雅克氏病的病原體是一種“蛋白質(zhì)性質(zhì)的感染顆粒”，并用prion（普利昂）一詞表示這種因子，國內(nèi)曾譯為朊病毒或鋸蛋白。但這種蛋白質(zhì)粒子缺乏核酸，稱為病毒并不妥當(dāng)，故現(xiàn)在稱為朊毒體。

瘋羊病、瘋牛病及人類所患的新型雅克氏癥等海綿狀腦病，都是由朊毒體發(fā)生變異引起的。包括人在內(nèi)的哺乳動物體內(nèi)都存在朊毒體，它在正常形態(tài)下呈折疊狀，但變異時會張開如同鋸齒狀，在大腦中撐出大量的小洞，引起人或動物患上癡呆型的傳染性海綿狀腦病。

朊毒體的致病過程是：首先經(jīng)一定傳播途徑（如進(jìn)食患病動物的肉和內(nèi)臟）侵入機(jī)體并進(jìn)入腦組織，其后沉積于不同的神經(jīng)元溶酶體內(nèi)，導(dǎo)致被感染的腦細(xì)胞受損、壞死，釋出的朊毒體又侵犯其它腦細(xì)胞，使病變不斷發(fā)展；病變的神經(jīng)細(xì)胞死亡后，腦組織中留下大量小孔呈海綿狀，并出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀，這就是眾所周知的海綿狀腦病。

普利西納學(xué)說公布之初，在學(xué)術(shù)界曾遭到猛烈反對，多數(shù)人持否定態(tài)度。因?yàn)榉肿由飳W(xué)的中心命題是“生物的遺傳基因以核糖核酸和脫氧核糖核酸為本體”，在此之前，人們普遍認(rèn)為，不存在沒有核酸的病原體，這已成為常識，但普利西納的學(xué)說卻與這種認(rèn)識背道而馳。經(jīng)過10多年的研究和爭論，大量事實(shí)確證了朊毒體的存在，普利西納的學(xué)說最終得到了認(rèn)可。鑒于這一發(fā)現(xiàn)的重大科學(xué)價值，普利西納榮獲1997諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成一、含氮堿基、核苷、核苷酸

l DNA is a nucleotide polymer with covalent bonds between the sugar and Phosphate groups.l A long molecular chain containing a sugar, a phosphate and one of four different nucleotide bases.l Chemical Composition（化學(xué)組成）:

Sugar(糖): Deoxyribose(ribose核糖in RNA)Phosphate(磷酸):-phosphodiester

Bases(堿基):(G)guanine

(C)cytosine

(A)adenine

(T)thymine！稀有堿基：假尿苷（?）、二氫尿嘧啶（DHU）、2`-O-甲基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷。

名稱與縮寫(1)? RNA：ribonucleic acid

核糖核酸

? DNA：deoxyribonucleic acid

脫氧核糖核酸

? pyrimidine：

cytosine(Cyt)

胞嘧啶

嘧啶

thymine(Thy)

胸腺嘧啶

uracil(Ura)

尿嘧啶

? purine：

adenine(Ade)

腺嘌呤

嘌呤

guanine(Gua)

鳥嘌呤

名稱與縮寫(2)? ribonucleoside

核糖核苷（不帶磷酸）

adenosine(Ado)

腺(嘌呤核)苷

guanosine(Guo)

鳥(嘌呤核)苷

cytidine(Cyd)

胞(嘧啶核)苷

thymidine(Thd)

胸(腺嘧啶脫氧核)苷

uridine

(Urd)

尿(嘧啶核)苷

? ribonucleotide

核糖核苷酸（帶磷酸）

adenosine 5’-mono(di, tri)phosphaste；

AMP, ADP, ATP ? deoxyribonucleoside

脫氧核糖核苷

deoxyadenosine(dAdo)…… ? deoxyribonucleotide

脫氧核糖核苷酸

dAMP, dADP, dATP……dNTP

二、DNA分子的一級結(jié)構(gòu)

1.多聚核苷酸鏈主鏈?zhǔn)呛颂呛土姿幔瑐?cè)鏈為堿基，由3’,5’磷酸二酯鍵連接

2.鏈的方向：同一個磷酸基的5’酯鍵到3’酯鍵的方向(5’→3’)

3、DNA一級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)

a.脫氧核糖是其顯著特點(diǎn)－－－－DNA極其穩(wěn)定的根本原因

b、磷酸呈四面體構(gòu)型，脫氧核糖呈折疊的五元環(huán)，堿基是平面的c、主鏈?zhǔn)怯H水的，側(cè)鏈（堿基）是疏水的

n 主鏈的脫氧核糖的羥基能與水形成氫鍵，而磷酸基團(tuán)在生理?xiàng)l件下離解為負(fù)離子, 這些特點(diǎn)保證了多核苷酸鏈可形成穩(wěn)定的構(gòu)象。

4、一級結(jié)構(gòu)的概念

n 指DNA分子中的核苷酸排列順序

n 不同生物借此貯存遺傳信息

n 決定DNA的二級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)

第三節(jié) 核酸二級結(jié)構(gòu)

一、DNA雙螺旋模型的提出

依據(jù)

n a.1938.W.T.Astbury 首次用X－射線分析DNA

n b.1950 Chargaff

A + G / T + C = 1

A+T ≠

G + C n c.1952 Alexander Todd

發(fā)現(xiàn)了核苷酸和核苷酸之間由磷酸二酯鍵聯(lián)接

n d.1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin

得到了高度定向的DNA纖維的X-射線照片

發(fā)現(xiàn)原子長軸存在0.34和3.4nm兩種周期性

n 此外，之前的密度測定表明螺旋由兩條多核苷酸鏈組成，且直徑恒定（2nm)。

Watson-Crick的DNA雙螺旋

n 兩條相互獨(dú)立的單鏈DNA分子以螺旋方式相互纏繞，形成右手雙螺旋；

n 帶有負(fù)電的戊糖-磷酸骨架在分子的外側(cè)；

n 堿基則平面堆積于螺旋的內(nèi)部；

n 由于骨架雙鏈在螺旋軸上的間距不相等，從而在分子表面形成大溝和小溝。大溝和小溝。雙螺旋表面的溝對DNA和蛋白質(zhì)的相互識別是很重要的，因?yàn)樵跍蟽?nèi)才能覺察到堿基的順序，而在雙螺旋的表面，是脫氧核糖和磷酸重復(fù)結(jié)構(gòu)，沒有信息可言。（蛋白質(zhì)

核酸，核酸

核酸、鋅指結(jié)構(gòu)）

n

雙螺旋模型參數(shù)

n 直徑20?

n 螺距為34?(任一條鏈繞軸一周所升降的距離)n 每圈有10個核苷酸(堿基)

n 兩個堿基之間的垂直距離是3.4?。螺旋轉(zhuǎn)角是36度。

n 有大溝和小溝，配對堿基并不充滿雙螺旋空間，且堿基對占據(jù)的空間不對稱。

二、影響雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素

氫鍵

范德華力（Van de waals force）

疏水作用力(Hydrophobic interaction)* 不穩(wěn)定因素

n 磷酸基團(tuán)間的靜電斥力

n 堿基內(nèi)能增加(溫度), 使氫鍵因堿基排列有序狀態(tài)的破壞而減弱

三、雙螺旋結(jié)構(gòu)多樣性

B-DNA：資料來自相對濕度為92％所得到的DNA鈉鹽纖維。

此外人們還發(fā)現(xiàn)了A、C、D、E等右手雙螺旋和左手雙螺旋Z構(gòu)象等形式。

DNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性：幾種不同的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)以及同一種雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)參數(shù)存在差異的現(xiàn)象。

原因：多核苷酸鏈的骨架含有許多可轉(zhuǎn)動的單鍵，磷酸二酯鍵的兩個P-O鍵、糖苷鍵、戊糖環(huán)各個鍵。

第四節(jié) DNA的高級結(jié)構(gòu)

1、反向重復(fù)序列與二級結(jié)構(gòu)

n 反向重復(fù)序列（inverted repeatitive sequence or inverted

repeats, IR）,又稱回文序列（廻文）：指兩段同樣的核苷酸序列同時存在于一個分子中，但具有相反的方向。有時也有不完全相同的情況。

¨RNA和DNA中都可能存在

n 此外還可有directed repeatitive sequence---正向重復(fù)序列

n 較短的回文序列可能是作為一種信號

n

如：限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)

n

一些調(diào)控蛋白的識別位點(diǎn)

n 例如限制性內(nèi)切酶 EcoRⅠ的識別位點(diǎn)

5′－－GAATTC－－3′

3′－－CTTAAG－－5′

2.DNA(Trible Helix DNA, T.S DNA)的三股螺旋結(jié)構(gòu)

（1）發(fā)現(xiàn)和證實(shí)

1953年，Watson & Crick D.S DNA model證明沿大溝存在多余的氫鍵給體與受體

潛在的專一與DNA(蛋白質(zhì))結(jié)合的能力

形成T.S DNA 可能性

1957 年Felsenfeld等發(fā)現(xiàn)一股為嘌呤，另一股為嘧啶的核苷酸雙鏈能夠形成三鏈

如： polyA/polyU

polydA/polydT

polyd(AG)/polyd(CT)——三螺旋DNA的概念提出

1987年Mirkin.S.M證明plasmid DNA在 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在，這些發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了三螺旋DNA的研究

（2）組成形式

a、D.S.DNA + D.S.DNA→T.S.DNA + S.S.DNA b、分子組成

☆ PY/PU + PU(偏堿性介質(zhì)中穩(wěn)定)

G＊G、A＊A、G＊C＋

☆ PY/PU + PY(偏酸性介質(zhì)中穩(wěn)定)常見類型

G＊C＋

A＊T

3、四股螺旋DNA(tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：基本結(jié)構(gòu)單元－－鳥嘌呤四聯(lián)體

可能的功能：

A、穩(wěn)定真核生物染色體結(jié)構(gòu)

B、保證DNA末端準(zhǔn)確復(fù)制

C、與DNA分子的組裝有關(guān)

D、與染色體的meiosis & mitosis 有關(guān)

4、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)

⑴超螺旋(superhelix

OR

supercoil)的形成和類型

l形成

松馳態(tài)DNA（relax form）

低能量

常態(tài)

超螺旋（Supercoied）DNA

正超螺旋

負(fù)超螺旋

DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)

正超螺旋（positive supercoiled）緊纏overwinding(右旋)負(fù)超螺旋（Negative Supercoiled）

松纏unwinding(左旋)原核生物DNA的三級結(jié)構(gòu)：

n 絕大多數(shù)原核生物的DNA都是共價封閉的環(huán)狀雙螺旋。如果再進(jìn)一步盤繞則形成麻花狀的超螺旋三級結(jié)構(gòu)。

⑵超螺旋的定量描述

n White方程： L=T+W

n 連接數(shù)L（Linking nnmber）：指cccDNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數(shù)。其特點(diǎn)是

(1)L是整數(shù)；

(2)在cccDNA的任何拓?fù)鋵W(xué)狀態(tài)中其值保持不變；

(3)右手螺旋對L取正值。

n T（Twisting number）：盤繞數(shù)，即DNA分子中Watson-Crick螺旋數(shù)，初級螺旋圈數(shù)。其特點(diǎn)是：

(1)可以是非整數(shù)；

(2)是變量；

(3)右手螺旋時T為正值。

n W（Writhing number）：超盤繞數(shù)，即超螺旋數(shù)，直觀上為雙螺旋在空間的轉(zhuǎn)動數(shù)。其特點(diǎn)是：

(1)可以是非整數(shù)；

(2)是變量；

l(3)右手螺旋時，W取負(fù)值。

l 拓?fù)洚悩?gòu)酶解超螺旋的特點(diǎn)。

第五節(jié) 真核生物的染色體及其組裝

一、真核細(xì)胞染色體組成

1、組成：DNA和蛋白質(zhì),以及少量的 RNA.2、染色體體和染色質(zhì)的概念

v 染色質(zhì)(chromatin)：是指細(xì)胞周期間期細(xì)胞核內(nèi)由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成的復(fù)合結(jié)構(gòu)，因其易被堿性染料染色而得名。

v 染色體(chromosome)：是指在細(xì)胞分裂期出現(xiàn)的一種能被堿性染料強(qiáng)烈染色，并具有一定形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征的物體。攜帶很多基因的分離單位。只有在細(xì)胞分裂中才可見的形態(tài)單位。

！分類：

v 常染色質(zhì)(euchromatin)

（間期纖絲的包裝密度度比分裂期染色體的要小很多）

v 異染色質(zhì)(heterochromatin)

（間期纖絲染色質(zhì)區(qū)的包裝密度十分致密，可與有絲分裂期染色體相比）

組成型異染色質(zhì)(constitutive

heterochromatin)

兼性異染色質(zhì)(facultative heterochromatin)

3、染色體中的蛋白質(zhì)

組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3和H4。其特性：

v 進(jìn)化上的極端保守性

不同種生物組蛋白的氨基酸組成是十分相似的，特別是H3和H4。

v 無組織特異性

到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)鳥類、魚類及兩棲類紅細(xì)胞不含H1而帶有H5，精細(xì)胞染色體的組蛋白是魚精蛋白兩個例外。

v 肽鏈上氨基酸分布不對稱性

堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。

v 組蛋白的修飾作用

包括甲基化、乙?；?、磷酸化及ADP核糖基化等。

v 富含賴氨酸的組蛋白H5

非組蛋白：

(1)HMG 蛋白（high mobility group protein）, 這類蛋白可能與DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)。

(2)DNA結(jié)合蛋白

可能是一些與DNA復(fù)制或轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶或調(diào)節(jié)物質(zhì)。

(3)A24非組蛋白

位于核小體內(nèi)功能不詳。

4、核小體的形成

八聚體在中間，DNA盤繞在外而H1則在核小體的外面，每個核小體只有一個H1。所以核小體中組蛋白和DNA的比例是每200bpDNA有H2A，H2B，H3，H4各兩個，H1各一個。

5、染色體的高級包裝

v 核小體的形成是染色體壓縮的第一階段，約1/7；

v 螺旋管的每個螺旋包含6個核小體，壓縮比為6；

v 中期的染色質(zhì)是一個細(xì)長中空的圓筒，為400nm, 由30nm螺旋管纏繞而成，壓縮比為40;

v 這個超螺旋圓筒進(jìn)一步壓縮1/5便成為染色單體，總壓縮比是7x6x40x5，將近10000倍。

第六節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能

一、RNA 的功能：

l 信息分子

遺傳信息由DNA到蛋白質(zhì)的中間體 的核心作用。

l 功能分子

1.作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成的主要參與者，參與在蛋白質(zhì)合成中核蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)組成和功能發(fā)揮；

2.具有生物催化的功能，作用于初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接加工；

3.與生物機(jī)體的生長發(fā)育密切相關(guān)，參與基因的表達(dá)調(diào)控；

4.與生物體的進(jìn)化有很大的關(guān)系。

5.核糖體

6.信息體

7.拼接體

8.編輯體

二、RNA的分類

v mRNA的結(jié)構(gòu)

v tRNA的結(jié)構(gòu)

v rRNA的結(jié)構(gòu)

v snRNA v snoRNA

v 非編碼mRNA！每種RNA的基本結(jié)構(gòu)和功能！?。?/p>

第七節(jié) 核酸的物理化學(xué)性質(zhì)

DNA雙股鏈的互補(bǔ)是其結(jié)構(gòu)和功能上的一個基本特征，也是DNA研究中一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基礎(chǔ)。

一、DNA分子的變性

1、條件：加熱，極端pH，有機(jī)溶劑（尿素、酰胺)，低鹽濃度等

2、變性過程的表現(xiàn)

¤ 是一個爆發(fā)式的協(xié)同過程，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍

¤ 導(dǎo)致一些理化性質(zhì)發(fā)生劇烈變化

3、熔解曲線與Tm值

緩慢而均勻地增加DNA 溶液的溫度（現(xiàn)可做到 0.1 ℃／分）可根據(jù)各點(diǎn)的A260值繪制成DNA的熔解曲線。

Tm=℃ of Ct = C0/2 = OD增加值的中點(diǎn)溫度(一般為85-95℃)或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度

這也是一般PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中把變性溫度定為94 ℃的原因。

4、影響 Tm值的因素

（1）在 A, T, C, G 隨機(jī)分布的情況下，決定于GC含量

n GC%愈高

→

Tm值愈大

n GC%愈低

→

Tm 值愈小

（2）GC%含量相同的情況下

AT形成變性核心，變性加快，Tm 值小。

堿基排列對Tm值具有明顯影響

?生物體內(nèi)僅UAA為最有效的終止密碼子

n 因?yàn)椋篣AA、AUU的Tm值是最低的一個，即使生理溫度下也不穩(wěn)定。

二、DNA分子的復(fù)性

（anneal or renaturation）

n 概念：變性DNA在適當(dāng)條件下，兩條彼此分開的鏈又可以 重新地合成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程（退火）。

根據(jù)復(fù)性動力學(xué)公式我們可以知道什么？

(1)單鏈濃度隨著時間的增大而減?。?/p>

(2)反應(yīng)速率取決于初始的單鏈濃度Co；

(3)以反應(yīng)濃度和COt1/2為座標(biāo)可繪復(fù)性曲線;(4)通過COt1/2值可測原核生物基因組的大小;

已知大腸桿菌的基因組為4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec

則

(5)原核生物基因組大小不同，復(fù)性曲線也不同;(6)可用以區(qū)分真核生物和原核生物基因組。

在復(fù)性反應(yīng)中如何知道單鏈已經(jīng)結(jié)合成雙鏈了呢？可以通過哪些法來檢測？

(1)減色效應(yīng)（hpochromic effcef）

測定光密度，即OD值(optical density），DNA從單鏈變成雙鏈，OD260減少30%(2)羥基磷灰石柱層析

羥基磷灰石對雙鏈DNA吸附較牢，不易吸附單鏈。

四、核酸分子雜交（hybridization）※ 雜交形式：

n 液相雜交

n 固相雜交(濾膜雜交)¨1975 E.M.Southern ¨Southern blot

S.S.DNA × S.S.DNA ¨1977.J.C.Alwine ¨Northern blot

S.S.RNA × S.S.DNA ¨1978.Hany Towbin ¨Western blot

Protein(antigen)× antibody ＊固相分子雜交(1975 E.M.Southern)

！復(fù)習(xí)思考題

1、堿基、核苷、核苷酸的化學(xué)組成2、核酸的一級結(jié)構(gòu)

書寫方向

3、Watson ＆ Crick 的Double Helix Model

參數(shù)

大小溝

二級結(jié)構(gòu)的多態(tài)性

4、影響二級結(jié)構(gòu)的作用力：

穩(wěn)定因素

不穩(wěn)定因素

5、DNA的不尋常結(jié)構(gòu)：

反向重復(fù)序列

三螺旋DNA

四鏈DNA

6、真核生物的染色體：核小體的組成和組裝

染色體的多級包裝

7、RNA的種類及其相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能與及應(yīng)用

8、變性：溶解曲線

Tm

影響因素（GC、化學(xué)試劑、鹽、pH）

9、復(fù)性

C0t曲線

C0t（1／2）

10、核酸分子雜交的類型

11、DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)

形成、類型

組蛋白和非組蛋白