第一篇：臨床中PCR擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

臨床基因擴(kuò)增（PCR）實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

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介紹了什么叫做基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室以及基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室是如何保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的安全性和可靠性的。并從平面布置、通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、污染的預(yù)防與控制幾個(gè)方面探討了基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的主要特點(diǎn)和應(yīng)注意的問(wèn)題。

★概述

臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)又稱PCR實(shí)驗(yàn)，是專門用來(lái)檢驗(yàn)艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測(cè)手段。它可以通過(guò)將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測(cè)出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。由于該檢測(cè)方法可以測(cè)出普通檢驗(yàn)難以檢測(cè)出的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對(duì)樣品要求低等優(yōu)點(diǎn)，因此被臨床醫(yī)生廣為認(rèn)可，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測(cè)部門的禽疫病診斷。但是，這種實(shí)驗(yàn)需要有能保證絕對(duì)安全、配置合理的實(shí)驗(yàn)室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來(lái)對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)越來(lái)越得到重視，因?yàn)樗鼘?duì)檢測(cè)結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性和安全性起到至關(guān)重要的作用。本文主要從臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的平面布局，空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制和污染的防制幾個(gè)方面對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)中的主要特點(diǎn)進(jìn)行了闡述。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問(wèn)題是如何避免污染。因此，實(shí)驗(yàn)室的平面布局、空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制等都是圍繞這個(gè)核心問(wèn)題進(jìn)行的。下面就對(duì)這幾個(gè)方面分別進(jìn)說(shuō)明。

PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過(guò)傳遞窗進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及壓力控制

PCR實(shí)驗(yàn)室并沒(méi)有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。1.試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過(guò)其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。對(duì)與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒(méi)有嚴(yán)格的要求。2.標(biāo)本制備區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。

3.擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來(lái)自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開(kāi)反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。

本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此對(duì)本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。

污染的預(yù)防與控制

PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問(wèn)題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見(jiàn)的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。1.工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分

（1）各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理；

（2）各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記（如，醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個(gè)不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。2.合理的系統(tǒng)設(shè)置

（1）合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；（2）嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。3.規(guī)范的操作（1）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的工作；

（2）在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施；

（3）清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，必須立即對(duì)本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體對(duì)表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對(duì)一些實(shí)驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。4.嚴(yán)格的管理

（1）嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的門；

（2）在各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服（如，不同顏色），當(dāng)工作人員離開(kāi)時(shí)不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；

（3）盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性。（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過(guò)的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；

（5）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

5.完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施

完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是保證實(shí)驗(yàn)工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如，超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、加樣器等。

第二篇：臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

臨床基因擴(kuò)增（PCR）實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)探討

核心提示:摘要：介紹了什么叫做基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室以及基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室是如何保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的安全性和可靠性的。并從平面布置、通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、污染的預(yù)防與控制幾個(gè)方面探討了基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的主要特點(diǎn)和應(yīng)注意的問(wèn)題。關(guān)鍵詞：基因擴(kuò)增 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室 1 概述 臨

摘要：介紹了什么叫做基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室以及基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室是如何保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的安全性和可靠性的。并從平面布置、通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、污染的預(yù)防與控制幾個(gè)方面探討了基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的主要特點(diǎn)和應(yīng)注意的問(wèn)題。

關(guān)鍵詞：基因擴(kuò)增 基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室概述

臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)又稱PCR實(shí)驗(yàn)，是專門用來(lái)檢驗(yàn)艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測(cè)手段。它可以通過(guò)將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測(cè)出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。由于該檢測(cè)方法可以測(cè)出普通檢驗(yàn)難以檢測(cè)出的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對(duì)樣品要求低等優(yōu)點(diǎn)，因此被臨床醫(yī)生廣為認(rèn)可，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)院的臨床診斷和各防疫檢測(cè)部門的禽疫病診斷。但是，這種實(shí)驗(yàn)需要有能保證絕對(duì)安全、配置合理的實(shí)驗(yàn)室和非常規(guī)范的操作為前提。近年來(lái)對(duì)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)越來(lái)越得到重視，因?yàn)樗鼘?duì)檢測(cè)結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性和安全性起到至關(guān)重要的作用。本文主要從臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的平面布局，空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制和污染的防制幾個(gè)方面對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)中的主要特點(diǎn)進(jìn)行了闡述。

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問(wèn)題是如何避免污染。因此，實(shí)驗(yàn)室的平面布局、空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制等都是圍繞這個(gè)核心問(wèn)題進(jìn)行的。下面就對(duì)這幾個(gè)方面分別進(jìn)說(shuō)明。PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個(gè)單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

各實(shí)驗(yàn)區(qū)之間的試劑及樣品傳遞應(yīng)通過(guò)傳遞窗進(jìn)行。

PCR實(shí)驗(yàn)室平面布置示意圖如圖1所示。

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圖1 PCR實(shí)驗(yàn)室平面布置示意圖實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及壓力控制

PCR實(shí)驗(yàn)室并沒(méi)有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時(shí)，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。

3.1 試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過(guò)其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。

對(duì)與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒(méi)有嚴(yán)格的要求。

3.2 標(biāo)本制備區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì)發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)。

3.3 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來(lái)自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。在巢式PCR測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開(kāi)反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

本區(qū)的壓力梯度要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

3.4 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。

本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，因此對(duì)本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。污染的預(yù)防與控制

PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問(wèn)題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見(jiàn)的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不但耗時(shí)而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。

4.1 工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分

（1）各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理；

（2）各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個(gè)不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。

4.2 合理的系統(tǒng)設(shè)置

（1）合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；

（2）嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。

4.3 規(guī)范的操作

（1）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的工作；

（2）在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施；

（3）清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，必須立即對(duì)本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體對(duì)表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對(duì)一些實(shí)驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。

4.4 嚴(yán)格的管理

（1）嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的門；

（2）在各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服（如不同顏色），當(dāng)工作人員離開(kāi)時(shí)不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域；

（3）盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性。

（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過(guò)的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；

（5）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。

4.5 完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施

完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是保證實(shí)驗(yàn)工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同

配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、加樣器等。

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第三篇：臨床基因擴(kuò)增(PCR)診斷實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范(試行)

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2臨床基因擴(kuò)增（PCR）診斷實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范（試行）

為使基因擴(kuò)增診斷技術(shù)規(guī)范有效的用于臨床，保證檢測(cè)質(zhì)量，更好地為臨床疾病的診療服務(wù)，特制定本規(guī)范。

1．臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置：和儀器設(shè)備

臨床PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分為四個(gè)隔開(kāi)的工作區(qū)域，每一區(qū)域都應(yīng)有專用的儀器設(shè)備。即1）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；2）標(biāo)本制備區(qū)；3）擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)和的擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)同時(shí)完成的熒光定量PCR方法或全自動(dòng)分析儀如Cobas－T（Anplicor）等，則3）和4）兩個(gè)區(qū)可合并。

與上述特定實(shí)驗(yàn)區(qū)有關(guān)的各個(gè)房間必須有明確的標(biāo)記，以避免不同工作區(qū)內(nèi)的設(shè)備物品如加樣器、試劑等的移出或不同的工作區(qū)間發(fā)生混淆。進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)必須遵循一嚴(yán)格的）順序，只能按單一方向進(jìn)行，即從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)～標(biāo)本制備區(qū)～擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)～擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)必須使用不同的工作服，可以不同的顏色來(lái)區(qū)別。此外，當(dāng)工作人員離開(kāi)各工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。

1．l．試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)

本區(qū)用于貯存溶液的制條、溶液的分裝和主反應(yīng)混合液的制各。本區(qū)儀器設(shè)備配置：（l）4 冰箱和一20 冰柜；（2）混勻器；（3）微量加樣器若干支（覆蓋1～1000pl）；（5）專用工作服和工作鞋；（6）專用辦公用品；（7）消耗品： 一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離。心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（8）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。

1．2．標(biāo)本制備區(qū)

標(biāo)本貯存、核酸提取及貯存均在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。RNA測(cè)定時(shí)的單鍵。cDNA合成也在本區(qū)進(jìn)行。本區(qū)儀器設(shè)備自己置：（l）4冰箱、－20 或-70 冰柜三（2）高達(dá)臺(tái)式冷凍離心機(jī)；（3）混勻器；（4）水浴箱或加熱模塊；（5）微量如排器若干支（覆蓋l～1000μl）；（6）專用工作服和工作鞋；（7）專用辦公用品；（8）消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（9）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）；（10）超凈工作臺(tái)；（11）超聲波水?。ㄌ幚泶蠓肿覦NA適用）。

1．3．?dāng)U增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

模板材料（來(lái)自標(biāo)本制備區(qū)）和主反應(yīng)混合液（來(lái)自試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)）的加入以及擴(kuò)增反應(yīng)等專門在本二．作區(qū)內(nèi)近行。本區(qū)儀器設(shè)備自己置：（l）核酸擴(kuò)增僅三（2）微量加樣器（覆蓋1～1000 μl）；（3）專用工作服和工作鞋；（4）專用辦公用品；（5）消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（6）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。

1．4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

本區(qū)面積應(yīng)為6～8m。擴(kuò)增嚴(yán)物的分析在本區(qū)進(jìn)行。本區(qū)儀器設(shè)備配置：視檢測(cè)方法不同而定，如為PCR�ELISA，則需（l）微量加樣器若干支（覆蓋l～2s（2）酶標(biāo)權(quán)、洗報(bào)機(jī)和恒溫箱;（3）專用工作服和工作鞋；（4）專用辦么，用品；（5）消耗品：～次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）；（6）可移動(dòng)紫外燈（近工作臺(tái)面）。

2．臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證

臨床基因擴(kuò)增診斷實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢測(cè)的所有階段，即測(cè)定分析前的標(biāo)本來(lái)集處理、測(cè)定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測(cè)定后的結(jié)果報(bào)告等。

2．1．標(biāo)本的采集

常用于基因擴(kuò)增檢測(cè)的臨床標(biāo)本包括EDTA或拘檬酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿．痰、腦普液、尿及分泌物等。采樣容器最好是密閉的一次性的，如真空系血管。一次性塑料容器使用時(shí)無(wú)需進(jìn)一步預(yù)處理。當(dāng)使用非密鬧采樣系統(tǒng)時(shí)，如尿、分泌物和骨髓的采禪，必須注意防止來(lái)自來(lái)樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣者采樣時(shí)起碼要談．一次性手套?？芍貜?fù)使用的玻璃器〔應(yīng)高壓處理，因?yàn)椴Ａ鳎ǔ：胁灰资Щ畹腁NA酶。RNA酶的主要來(lái)源是實(shí)驗(yàn)人員的手。最好是熱滅菌，250 烘烤 4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標(biāo)本必須進(jìn)行抗凝處理。通常EDTA和拘檬酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因?yàn)楦嗡厥荰aq酶的強(qiáng)抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除肝素。臨床用于RNA（如HCV RNA）測(cè)定的血標(biāo)本最好進(jìn)行抗凝處理，并盡快（3小時(shí)以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則物血后，必須在1小時(shí)內(nèi)分離血清。

2．2．標(biāo)本的穩(wěn)定化處

DNA分析，標(biāo)本采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室。由于RNA易于降解，因此用于RNA測(cè)定的標(biāo)本的穩(wěn)定化處理有時(shí)是必不可少的，Chaotropic物質(zhì)[特別是異硫氨酸抓鹽（Guanidine thiocyanate，GITC）]可使DNAse和RNAse立即失活。在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿加入含有GITC的試劑管中進(jìn)行穩(wěn)定化處理。GITC可使RNAse不可逆失活的適合濃度為5mol/L。如果GITC濃度小于 4mol／L；RNA會(huì)很快降解。在適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。如果溫度低于室溫，GITC即會(huì)結(jié)晶，所以在加入標(biāo)本前應(yīng)使之完全溶解。如標(biāo)本不能及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室，最好選用 GITC處理方法以穩(wěn)定標(biāo)本。

2．3標(biāo)本的運(yùn)送

標(biāo)本來(lái)集后應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過(guò)適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過(guò)郵寄運(yùn)送。如用于 DNA提取的含 EDTA的全血標(biāo)本及用于 RNA提取的經(jīng) GITC 穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。是否冷藏取決于標(biāo)本的用途，較長(zhǎng)時(shí)間在室溫貯存會(huì)導(dǎo)致靈敏度大大降低。通常應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。用于RNA檢測(cè)的標(biāo)本，如果在未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運(yùn)送。

2．4．標(biāo)本的貯存

臨床體液標(biāo)本如血清／血漿等可于-70 下長(zhǎng)時(shí)間貯存。用于DNA測(cè)定的核酸樣本應(yīng)在 10mmol／L Tris，lmmol／L EDTA緩沖液（pH 7．5－8．0）中 4 保存。用于RNA測(cè)定的核酸樣本應(yīng)在緩沖液中一80 C或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在一20OC即可。用 GIT（：穩(wěn)定化處理的 RNA標(biāo)本在室溫可保存 7天，如貯存時(shí)間較長(zhǎng)，則RNA測(cè)定敏感性略有下降。

2．5．標(biāo)本的處理（核酸提?。?/p>

核酸提取是決定擴(kuò)增檢測(cè)成敗的關(guān)鍵性步驟。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致。抑制物可能來(lái)源于標(biāo)本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）或核酸提取過(guò)程中確．留的有機(jī)溶劑（如酚、氯份等），這些物質(zhì)對(duì)其后的酶反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測(cè)定。如在 HBVDNA PCR測(cè)定中。采用對(duì)血清杯水煮沸裂解以釋放DNA的方法時(shí)，肉眼觀察不明顯的溶血也會(huì)對(duì)擴(kuò)增測(cè)定有很強(qiáng)的抑制作用，應(yīng)使用正規(guī)的核酸提取方法（如經(jīng)典的酚一氯份提取方法、硅吸附法等）。當(dāng)標(biāo)本為疾時(shí)，則必須先進(jìn)行液化處理。再提取核酸。需注意的是；液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。此外，當(dāng)靶核酸為 RNA時(shí)，降解是一個(gè)主要問(wèn)題。RT－PCR測(cè)定失敗的常見(jiàn)原因是標(biāo)本在運(yùn)送前來(lái)經(jīng)充分的穩(wěn)定化處理．及核酸提取試劑的RNase的污染。對(duì)于前者，要核查測(cè)定分析前的步驟，如果沒(méi)．現(xiàn)RNA降解的證據(jù)。實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒絕接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對(duì)運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。對(duì)于后者，建議常規(guī)使用高質(zhì)量的商品核酸提取試劑。

2．6靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增

2．6.l靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄

cDNA合成為RT-PCR中的第一個(gè)酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的 cDNA為靶RNA的反向互補(bǔ)鏈。為后面擴(kuò)增的模板。下述因素通常影響cDNA合成的效率：

l）RT活性的降低或完全缺乏。必須排除由于酶質(zhì)量不高、試劑降解或加樣錯(cuò)誤而引起的 cDNA合成不充分。

2）RT或熱穩(wěn)定聚合酶的抑制物（如酚、血紅素）。當(dāng)RNA明顯為完整而沒(méi)有擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)懷疑有此類抑制物。

3）RNA的降解。

2．6．2影響擴(kuò)增的因素

有多種因素可引起PCR的假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，如抑制劑或酶活性喪失（見(jiàn)上）、遲大溫度不對(duì)、晚十十濃度不佳、患者標(biāo)本或試劑受污染等。反應(yīng)孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，循環(huán)儀的溫度控制和加熱塊中熱傳導(dǎo)的一致性必須有常規(guī)的檢查以避免假陰性結(jié)果。

2．7污染

在實(shí)際工作中，常見(jiàn)有以下幾種污染類型：PCR片段的污染（產(chǎn)物污染）三天然基因組DNA的污染；試劑污染（貯存液或工作液）：以及交及污染（如氣溶膠從一個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)散到原本陰性的標(biāo)本）。對(duì)于所有的擴(kuò)增技術(shù)，由于圍繞實(shí)驗(yàn)室來(lái)尋找污染源不僅耗時(shí)而且還很繁瑣，所以防止污染重在預(yù)防。一旦發(fā)生了污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止。如果沒(méi)有例外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，即使平行的污染質(zhì)控中僅有一管顯示出有PCR片段污染。

2．7．l．測(cè)定分析前的污染源。

測(cè)定分析前實(shí)驗(yàn)材料的污染主要來(lái)自非病人標(biāo)本來(lái)源的核酸。

2．7．2．測(cè)定分析階段的污染源。

通常，測(cè)定分析階段的每一步都可能發(fā)生對(duì)樣本的污染。反應(yīng)混合液的任何成分及核酸的制備和反應(yīng)建立階段所涉及到的實(shí)驗(yàn)設(shè)備的任何部位都是可能的污染源。如受污染的試劑（例如今血清白蛋白，明腋成礦物油）；商品酶制劑；消耗品（如反應(yīng)管，吸頭）和實(shí)驗(yàn)設(shè)備（如加樣器、離心機(jī)）。污染的來(lái)源之一是許多樣本在同時(shí)制備時(shí)的交及污染，但最主要的污染來(lái)源為以前擴(kuò)增產(chǎn)生的特異產(chǎn)物DNA片段。在前面三個(gè)工作區(qū)中，不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作

會(huì)引起所使用的試劑、消耗品或?qū)嶒?yàn)設(shè)備的污染。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取PCR產(chǎn)物用于檢測(cè)時(shí)，非常容易引起污染，因此必須制定并嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作程序。

2．7．3．污染的避免。

要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防而不是排除污染，前面所述工作區(qū)的嚴(yán)格劃分的目的正是為了預(yù)防污染。為避免以前測(cè)定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。如在擴(kuò)增反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP：從而產(chǎn)生的特異擴(kuò)增片段含有尿嘧啶，這樣擴(kuò)增前在反應(yīng)混合液中加入尿嘧啶糖激酶（UNG），可破壞來(lái)自以前測(cè)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免其對(duì)將要進(jìn)行的擴(kuò)增測(cè)定的污染。另外一種方法是持續(xù)的長(zhǎng)波紫外燈照射，通過(guò)異補(bǔ)骨脂素光化；單產(chǎn)生DNA加合物，由于DNA加合物對(duì)擴(kuò)增沒(méi)有反應(yīng)但又不妨礙PCR后雜交過(guò)程，所以這些方法也能防止污染。由于上面提到的方法會(huì)給人一種假的安全感，所以不能以其來(lái)替代嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和管理，尤其是這些方法不能防止外來(lái)非擴(kuò)增的天然 DNA的污染。

2．7．4．去除污染的措施。

工作完后必須定期采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同的方法可達(dá)到最佳效果。去污染措施包括但不僅限下面幾種：用100ml／L次氨酸鈉清潔表面；試驗(yàn)了后長(zhǎng)時(shí)間的紫外照射實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)和其他表面；實(shí)驗(yàn)設(shè)備如加樣器的高壓消毒。

2．8．?dāng)U增產(chǎn)物的分析

擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)定有各種方法。如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、雜交、測(cè)序、分光光度法定量等。但臨床PCR測(cè)定項(xiàng)目基本上都使用探針雜交方法。

2．8．l．與雜交檢測(cè)有關(guān)的干擾。

雜交結(jié)果不充分的原因可能是基因探針不合適、標(biāo)記方法不對(duì)、對(duì)探針的標(biāo)記不夠、雜交或洗滌方法不合適。最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的尊核普酸和體外的轉(zhuǎn)錄本（反義 RNA探針）。探針的標(biāo)記物常用的有生物素、地高辛、熒光景和同位素等。在擴(kuò)增后的雜交檢測(cè)中，應(yīng)該嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強(qiáng)度太高都會(huì)降低雜交的嚴(yán)格性。還會(huì)給檢測(cè)信號(hào)的特異性帶來(lái)負(fù)面影響。相反，提高潤(rùn)度和／或降低離子強(qiáng)度會(huì)增加雜交的嚴(yán)格性。因此，嚴(yán)密控制溫度和試劑是避免假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的先決條件，要注意的是，溫度和離子強(qiáng)度不能同時(shí)改變。

2．9．質(zhì)量控制

如上所述，應(yīng)該開(kāi)展各種質(zhì)控來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)定分析當(dāng)中各步驟的質(zhì)量，如RNA的完整性、對(duì)擴(kuò)增是否合適和敏感。

2．9．1．室內(nèi)質(zhì)量控制

必須對(duì)DNA和RNA分析的各步進(jìn)行質(zhì)量控制，以避免假陽(yáng)性和假陰性，保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于PCR測(cè)定的高敏感性，所以試劑的生產(chǎn)、實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備、PCR本身和實(shí)驗(yàn)中的每一步都要求有質(zhì)控。擴(kuò)增反應(yīng)前后的酶反應(yīng)各步也應(yīng)有質(zhì)控，只不過(guò)在質(zhì)控細(xì)節(jié)上稍有不同。

2．9．1．1．與實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備有關(guān)的質(zhì)控。

對(duì)DNA提取試劑的效果最常用球脂糖凝膠電冰來(lái)檢測(cè)?？芍崛〉腄NA是否發(fā)生降解。用常規(guī)的手工提取方法制備的DNA的平均長(zhǎng)度一般為～100kb，用適合PCR的DNA

提取試劑盒制備的DNA的長(zhǎng)度平均范圍為30�40kb。然而；明顯出現(xiàn)降解的DNA（在1和10kb的低分子量范圍內(nèi)）在經(jīng)瓊脂糖凝膠電冰分離和用溴化乙錠染色后也可見(jiàn)有強(qiáng)的熒光信號(hào)。用對(duì)甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶（如EcoRI）消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M(jìn)行質(zhì)控（在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切）。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測(cè)定來(lái)估計(jì)，好的 DNA提取物，A260/A280 比值應(yīng)該在 1． 75--2．0之間；否則，污染（殘留的蛋白或酚）可能會(huì)很高。僅用光度計(jì)比色方法不能對(duì)DNA的完整性下結(jié)論。

最快的對(duì)總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電冰，這一點(diǎn)跟DNA分離相同，然而，如果對(duì)結(jié)果產(chǎn)生懷疑，就應(yīng)該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)RNA的完整性。在理想情況下，三種主要的核糖體RNA(28S、18s和 5S）在凝膠上出現(xiàn)的帶相對(duì)較窄。如發(fā)生RNA的降解。則帶被拖向低分子量或出現(xiàn)帶的缺失。測(cè)定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對(duì)RNA制備的質(zhì)量評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)向低分子量拖尾的、不對(duì)稱性的峰的評(píng)估也是RNA完整性的合適的指標(biāo)。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨(dú)的光電比色不能對(duì)RNA的完整性下結(jié)論。

2．9．1．2．對(duì)cDNA合成和擴(kuò)增的質(zhì)控。

本部分包括陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。

2．．9．l．2．l．cDNA的合成。

對(duì)CDNA合成的效率進(jìn)行監(jiān)控的關(guān)鍵性的質(zhì)控是使用一個(gè)內(nèi)反應(yīng)質(zhì)控。cDNA的合成可以從存在子每一個(gè)RNA提取物中的cRNA 轉(zhuǎn)錄本開(kāi)始(即普遍表達(dá)的mRNA，如核糖體蛋白轉(zhuǎn)錄本這一類的所謂的管家基因），也可從在制備時(shí)加入樣本中的作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的 RNA開(kāi)始。cDNA合成的內(nèi)質(zhì)控是能夠產(chǎn)生確定產(chǎn)物的陽(yáng)性質(zhì)控；如果擴(kuò)增不成功，質(zhì)控就顯示出有RNA的降解、cDNA合成的過(guò)程中錯(cuò)誤啟動(dòng)或酶活性喪失。

加入確定量的擴(kuò)增質(zhì)控物可以檢測(cè)RT�PCR的靈敏度。對(duì)于RT－PCR方法 所必須的污染質(zhì)控為無(wú)逆轉(zhuǎn)錄靶RNA的陰性質(zhì)控。

2．9．1．2．2．PCR反應(yīng)。

內(nèi)反應(yīng)質(zhì)控是陽(yáng)性質(zhì)控。可使用對(duì)有機(jī)體存活所必須的靶基因作質(zhì)按，這些基因至少以豐臺(tái)子狀態(tài)存在，因?yàn)槿绻蚪M缺失這些基因，將使有機(jī)體致死（所謂的致死因子），一個(gè)比較好的例子就是維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因；在世界范圍內(nèi)的許多種族已發(fā)現(xiàn)其廣泛的多態(tài)性，并且還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因活性的同源性丟失，因此，通過(guò)PCR共同擴(kuò)增這種基因的一個(gè)片段，在所有患者中均可獲得成功，并且也會(huì)證明擴(kuò)增反應(yīng)是成功的。

在測(cè)定血清／血漿病原體核酸如HBV DNA、HCV RNA等時(shí)，應(yīng)使用已知的弱陽(yáng)性血清／血漿作為質(zhì)控樣本，與持測(cè)臨床標(biāo)本等同處理提取核酸及擴(kuò)增，以判斷擴(kuò)增檢測(cè)的有效性。

使用這些外加弱陽(yáng)性質(zhì)控不但可檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR檢測(cè)下限和特異性的信息。這些質(zhì)控必須使用與診斷實(shí)驗(yàn)（即患者的標(biāo)本）所使用的相同的主反應(yīng)混合液。如果懷疑方法的檢測(cè)下限不足以檢測(cè)出產(chǎn)物時(shí)，則每一個(gè)反應(yīng)管都必須加擴(kuò)增質(zhì)控。

外加陰性質(zhì)控（污染質(zhì)控）在每一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)中都必須設(shè)有，應(yīng)該包括幾種陰性質(zhì)控。通常，這些質(zhì)控是民來(lái)指明PCR過(guò)程中污染出現(xiàn)的階段。包括在樣品制備的整個(gè)過(guò)程中所帶的空白反應(yīng)管、含有樣品制備時(shí)所用的所有反應(yīng)液但不含可擴(kuò)增的模板（所謂的模擬制備）的反應(yīng)管等。模擬質(zhì)援可以評(píng)估PCR實(shí)驗(yàn)的綜合質(zhì)量。

此外，為對(duì)吸樣過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控，可以水質(zhì)控樣本來(lái)代替核酸樣本加入至反應(yīng)管，反應(yīng)管中含所有的反應(yīng)成分。實(shí)際工作中僅通過(guò)水樣本來(lái)檢測(cè)污染是否存在的方法是不可取的，因?yàn)樗荒馨l(fā)現(xiàn)樣本處理過(guò)程中的污染源，水僅可作為擴(kuò)增試劑的質(zhì)控。

在擴(kuò)增靶RNA的PCR實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過(guò)這種方法，可發(fā)現(xiàn)以前擴(kuò)增的DNA片段所引起的污染。

2．9．l．3．對(duì)測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)的質(zhì)控．

2．9．1．3．1．板上來(lái)交和膜上斑點(diǎn)印跡雜交的質(zhì)控。

在板上雜交和斑點(diǎn)雜交時(shí)，陽(yáng)性和陰性質(zhì)控應(yīng)該在同一板或膜上與病人標(biāo)本平行進(jìn)行分析，這可排除不同反應(yīng)中使用了不同雜交條件而造成的對(duì)結(jié)果的錯(cuò)誤解釋。

2． 9． 2．室間質(zhì)量評(píng)價(jià)能力驗(yàn)證，proficiency testing）

所有開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)參加由衛(wèi)生部臨床控驗(yàn)中心組織的全國(guó)臨床基因擴(kuò)增項(xiàng)目的空間質(zhì)量評(píng)價(jià)，并作為開(kāi)展臨床基因擴(kuò)增診斷的依據(jù)之一。

本工作規(guī)范自公布之日起實(shí)施。

衛(wèi)生部醫(yī)政司

第四篇：臨床基因擴(kuò)增PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量手冊(cè)的書(shū)寫

臨床基因擴(kuò)增PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量手冊(cè)的書(shū)寫

許

斌

（江蘇省臨床檢驗(yàn)中心）質(zhì)量管理的歷史

1950年代臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始質(zhì)量控制（Quality Control,QC）;1980年代參照工業(yè)的GMP管理思路建立良好實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐準(zhǔn)則（Good Laboratory Practice,GLP）；進(jìn)入質(zhì)量保證（Quality assurance,QA）；1990年代實(shí)驗(yàn)室引入質(zhì)量體系認(rèn)證及實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可制度，實(shí)現(xiàn)全面質(zhì)量管理（TQM，Total Quality Management）。質(zhì)量體系認(rèn)證——ISO9000（2000版）；實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可——ISO/IEC標(biāo)準(zhǔn)17025-2000《校準(zhǔn)和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室資格的通用要求》；ISO/DIS標(biāo)準(zhǔn)15189-1999“醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理?！? 美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證

?發(fā)證機(jī)構(gòu)：HCFA（Health Gare Financing Administrations）,衛(wèi)生保健署 ?認(rèn)證依據(jù)，CLOA38，行業(yè)認(rèn)可，強(qiáng)制，體系+能力 ?認(rèn)證中介機(jī)構(gòu)：

*JCAHO（Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations）衛(wèi)生機(jī)構(gòu)認(rèn)可聯(lián)合委員會(huì)

*CAP(College of American Pathologist)美國(guó)病理家學(xué)會(huì)

*COLA（Commission on Office Laboratory Accred-itation）

醫(yī)生實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可委員會(huì) 我國(guó)實(shí)驗(yàn)室合格評(píng)定

?認(rèn)可

*依據(jù)：ISO/IEC 17025，15189 *國(guó)家評(píng)審，自愿，體系+能力 ?認(rèn)證

*依據(jù)：ISO 9000：2000版 *中介機(jī)構(gòu)，自愿，體系 ?行業(yè)技術(shù)驗(yàn)收

*《臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》，《江蘇省醫(yī)院檢驗(yàn)科建設(shè)與管理規(guī)范》 *省、市臨床檢驗(yàn)中心，強(qiáng)制，體系+能力 4 PCR驗(yàn)收意義及驗(yàn)收依據(jù)

2002年開(kāi)始的PCR實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收工作開(kāi)創(chuàng)臨床檢驗(yàn)技術(shù)準(zhǔn)入的先河、推動(dòng)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)、規(guī)范檢測(cè)市場(chǎng)、建立醫(yī)療事故預(yù)防機(jī)制。其依據(jù)為： 《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào) 《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》衛(wèi)檢字[2002]8號(hào) 《關(guān)于成立臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)專家組的通知》蘇衛(wèi)醫(yī)[2002]42號(hào) 規(guī)定應(yīng)具有的SOP（13個(gè)）

儀器設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)程序、儀器設(shè)備的校準(zhǔn)程序、儀器設(shè)備的操作程序、臨床標(biāo)本收集程序、臨床標(biāo)本的處理（核酸純化）程序、臨床標(biāo)本的保存程序、試劑的質(zhì)檢操作程序、消耗品購(gòu)置驗(yàn)收和儲(chǔ)存程序、廢棄物的處理程序、內(nèi)務(wù)管理程序、室內(nèi)質(zhì)量控制程序、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物分析檢測(cè)的操作程序、抱怨處理程序。質(zhì)量管理體系

6.1 定義 在質(zhì)量方面指揮和控制組織的管理體系。（Quality Management System）管理體系是指建立方針和目標(biāo)并實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)的體系。實(shí)驗(yàn)室通過(guò)把組織機(jī)構(gòu)、職責(zé)、工作程序、質(zhì)量活動(dòng)過(guò)程和各類資源、信息等協(xié)調(diào)統(tǒng)一起來(lái)所形成的有機(jī)整體即為實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量體系。

6.2 質(zhì)量體系的文件構(gòu)成 第一層：質(zhì)量手冊(cè)（綱領(lǐng)性文件）；第二層：程序性文件（體系要素的規(guī)定）；第三層：作業(yè)指導(dǎo)書(shū)（具體項(xiàng)目的操作指導(dǎo)）；第四層：記錄包括表格、簽名、原始記錄、報(bào)告等質(zhì)量記錄和技術(shù)記錄。

6.3 質(zhì)量手冊(cè)定義

GB/T6583定義：質(zhì)量手冊(cè)是闡明一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量方針，并描述質(zhì)量體系的文件。它既是質(zhì)量體系的表征形式，又是質(zhì)量體系建立和運(yùn)行的綱領(lǐng)。它對(duì)實(shí)驗(yàn)室的組織結(jié)構(gòu)（含職責(zé)）、程序、活動(dòng)能力（過(guò)程）和資源作出規(guī)定，是實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期遵循的文件。

6.4 質(zhì)量手冊(cè)的分類

根據(jù)手冊(cè)的內(nèi)容和用途分為二類：質(zhì)量保證手冊(cè)——用于證明，供客戶使用，質(zhì)量管理手冊(cè)——用于運(yùn)行，供實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部使用。

6.5 質(zhì)量手冊(cè)的作用

編寫質(zhì)量手冊(cè)的健全和完善質(zhì)量體系的首要環(huán)節(jié)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)外因素合理調(diào)整、選擇體系要素，分配和落實(shí)質(zhì)量職責(zé)，理順管理關(guān)系，明確管理責(zé)任，合理安排各類文件的層次，把實(shí)驗(yàn)室積累的經(jīng)驗(yàn)變成法規(guī)性文件。協(xié)調(diào)各工作環(huán)節(jié)的準(zhǔn)則。

內(nèi)部質(zhì)量審核的依據(jù)；對(duì)外證實(shí)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量保證能力，提高客戶的信任度。

6.6 質(zhì)量手冊(cè)的特征

?以客戶為關(guān)注焦點(diǎn)：以病人為中心，為臨床服務(wù) ?領(lǐng)導(dǎo)作用：創(chuàng)造使員工能夠充分參與實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的環(huán)境 ?全員參與：各負(fù)其責(zé)

?過(guò)程方法：將資源和活動(dòng)作為過(guò)程進(jìn)行有效管理 ?管理的系統(tǒng)方法：各個(gè)過(guò)程的有效連接 ?持續(xù)改進(jìn)：根據(jù)實(shí)際不斷完善

?基于事實(shí)的決策方法：遵循科學(xué)，實(shí)事求是出報(bào)告 ?與供方互利的關(guān)系：相互協(xié)作，共同獲利

6.7 質(zhì)量手冊(cè)的結(jié)構(gòu) ?封面

?批準(zhǔn)頁(yè)：包括實(shí)驗(yàn)室名稱、標(biāo)志，發(fā)行版次，生效日期，批準(zhǔn)人簽名，手冊(cè)編號(hào)，受控狀態(tài)。

?實(shí)驗(yàn)室公正性聲明

?修訂頁(yè)：以表格描述修訂序號(hào)、修訂的章節(jié)條款和簡(jiǎn)要內(nèi)容、批準(zhǔn)人及日期。?目錄：各章節(jié)條款的名稱及頁(yè)碼

?前言：介紹實(shí)驗(yàn)室的一般情況和手冊(cè)的適用范圍以及手冊(cè)中術(shù)語(yǔ)或縮略語(yǔ)的定義 ?手冊(cè)的管理：對(duì)手冊(cè)的保存、分發(fā)、評(píng)審、修訂以及保密作出規(guī)定 ?質(zhì)量方針及目標(biāo)

?組織結(jié)構(gòu)及人員責(zé)權(quán)利關(guān)系

?要素描述：由系列SOP文件對(duì)溯源、人、機(jī)、料、樣、法、測(cè)等質(zhì)量諸要素的陳述 ?支持性文件：包括實(shí)驗(yàn)室平面圖、人員一覽表、儀器設(shè)備一覽表、引用標(biāo)準(zhǔn)及參考文獻(xiàn)等

6.8 標(biāo)準(zhǔn)操作程序

Standard Operational Procedure,簡(jiǎn)稱SOP。程序的定義為：為進(jìn)行某項(xiàng)活動(dòng)所規(guī)定的途徑。SOP是臨床實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部以文件的形式對(duì)質(zhì)量活動(dòng)用規(guī)定的方法進(jìn)行連續(xù)而恰當(dāng)?shù)目刂?。?shí)驗(yàn)室的SOP應(yīng)涵蓋所有的質(zhì)量活動(dòng)，包括檢測(cè)或校準(zhǔn)計(jì)劃、管理性程序、技術(shù)性程序、項(xiàng)目操作程序和記錄表格等。由于影響每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量活動(dòng)的條件和因素不一樣，一個(gè)SOP只在某個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有效，而不一定適用于其他實(shí)驗(yàn)室。

6.9 標(biāo)準(zhǔn)操作程序的一般要求

?對(duì)完成各項(xiàng)質(zhì)量活動(dòng)的方法作出規(guī)定，每個(gè)SOP都應(yīng)對(duì)一個(gè)或一組相互關(guān)系的活動(dòng)進(jìn)行描述；

?每個(gè)SOP應(yīng)說(shuō)明該項(xiàng)質(zhì)量各環(huán)節(jié)的輸入、轉(zhuǎn)換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關(guān)活動(dòng)的接口關(guān)系；

?規(guī)定開(kāi)展質(zhì)量活動(dòng)的各個(gè)環(huán)節(jié)的物資、人員、信息和環(huán)境等方面應(yīng)具備的條件； ?明確每個(gè)環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)換過(guò)程中各項(xiàng)因素的要求，即由誰(shuí)做、做什么、做到什么程序、達(dá)到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報(bào)告，以及相應(yīng)的審批手續(xù)； ?規(guī)定在質(zhì)量活動(dòng)中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施； ?SOP應(yīng)簡(jiǎn)練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴(yán)格遵守。

6.10 推薦PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量手冊(cè)目錄 1.質(zhì)量方針和宗旨 2.工作制度

2.1 實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置、布局及組織結(jié)構(gòu) 2.2 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)務(wù)管理制度 2.3 實(shí)驗(yàn)室的人員配置及管理制度 2.4 生物防護(hù)與安全制度 2.5 實(shí)驗(yàn)室廢棄物處理制度 2.6 實(shí)驗(yàn)室清潔消毒制度 2.7 儀器設(shè)備的管理制度

2.8 儀器、試劑、耗材購(gòu)置程序及管理制度 2.9 臨床標(biāo)本的管理制度 2.10 實(shí)驗(yàn)室記錄的管理制度 2.11 質(zhì)量控制工作管理制度 2.12 結(jié)果報(bào)告管理制度 2.13 崗位責(zé)任制 2.14 抱怨制度 3.操作指導(dǎo)書(shū)（SOP）3.1 消毒標(biāo)準(zhǔn)操作程序

3.2 超凈工作臺(tái)使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.3 超凈工作臺(tái)維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.4 PCR儀使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.5 PCR儀維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.6 臺(tái)式離心機(jī)使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.7 高速冷凍離心操作標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.8 移液器使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.9 加樣器校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.10 冰箱維護(hù)和保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.11 電熱恒溫水浴箱操作程序 3.12 電子天平使用和校正操作程序 3.13 可移動(dòng)紫外消毒車使用操作程序 3.14 溫度計(jì)校準(zhǔn)程序 3.15 試劑的質(zhì)檢操作程序 3.16 標(biāo)本唯一標(biāo)識(shí)編號(hào)編制規(guī)則 3.17 臨床標(biāo)本的采集及處理操作程序 3.18 臨床標(biāo)本的保存程序

3.19 乙肝病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.20 室內(nèi)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)操作程序 3.21 室間質(zhì)評(píng)標(biāo)準(zhǔn)操作程序 4.引用圖表

4.1 實(shí)驗(yàn)室組織結(jié)構(gòu)圖 4.2 實(shí)驗(yàn)室工作人員一覽表 4.3 人員培訓(xùn)計(jì)劃及培訓(xùn)記錄表 4.4 主要儀器設(shè)備一覽表 4.5 臨床送檢標(biāo)本流程圖 4.6 PCR擴(kuò)增可接受標(biāo)本記錄表 4.7 PCR擴(kuò)增拒收標(biāo)本記錄表 4.8 室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果記錄表 4.9 室間質(zhì)控記錄表 4.10 消耗性材料驗(yàn)收記錄表 4.11 試劑驗(yàn)收記錄表 4.12 故障處理表 4.13 儀器設(shè)備使用記錄表 4.14 儀器設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)記錄表 4.15 實(shí)驗(yàn)室清潔消毒記錄表 4.16 工作區(qū)溫度、濕度記錄表 4.17 抱怨記錄表

4.18 標(biāo)本超低溫保存記錄表 4.19 應(yīng)急處理記錄表 4.20 垃圾處理記錄表 4.21 冰箱溫度記錄表 4.22 水浴箱溫度記錄表 4.23 移動(dòng)紫外消毒車記錄表 4.24 設(shè)備校正記錄表 4.25 檢測(cè)結(jié)果報(bào)告流程 4.26 報(bào)告單樣張 6.11 文件格式 一 目的 二 范圍 三 職責(zé) 四 工作流程 五 引用文件及表格

6.12 寫作技巧

?目的：WHY，為什么要開(kāi)展這項(xiàng)活動(dòng) ?范圍：WHAT，活動(dòng)涉及的方面 ?職責(zé)：WHO+WHAT，誰(shuí)做，誰(shuí)負(fù)責(zé)

?工作流程：列出活動(dòng)順序和細(xì)節(jié)，明確各環(huán)節(jié)“輸入——轉(zhuǎn)換——輸出”，即做何事（WHAT）、何人做（WHO）、何時(shí)做（WHEN）、何地做（WHERE）、如何做（HOW）?引用文件和表格：

開(kāi)展此項(xiàng)活動(dòng)涉及的文件、標(biāo)準(zhǔn)以及使用的表格、證明文件和記錄保存期 評(píng)審中常見(jiàn)問(wèn)題

7.1 手冊(cè)

文件不全，無(wú)系統(tǒng)性；質(zhì)量要素描述不全；格式不對(duì)；與實(shí)際工作脫節(jié)；無(wú)現(xiàn)行有效性（無(wú)手簽，各區(qū)無(wú)相應(yīng)手冊(cè)）；記錄不全、不規(guī)范

7.2 人員

人員檔案：每人一個(gè)檔案袋，有關(guān)資格證書(shū)（如上崗證）、培訓(xùn)、技能和經(jīng)歷等。培訓(xùn)計(jì)劃及實(shí)施記錄：每人有、季度、月的培訓(xùn)內(nèi)容及實(shí)施記錄；內(nèi)容包括外出學(xué)習(xí)、進(jìn)修，內(nèi)部質(zhì)量手冊(cè)學(xué)習(xí)、業(yè)務(wù)學(xué)習(xí)、新項(xiàng)目引進(jìn)等。

7.3 設(shè)施與環(huán)境

通風(fēng)、紫外、清潔、消毒的程序及記錄、生物安全防護(hù)的程序及記錄、生物垃圾的處理。

7.4 儀器設(shè)備

采購(gòu)程序及驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)；校準(zhǔn)程序及狀態(tài)標(biāo)識(shí)，使用、維護(hù)、保養(yǎng)的程序及記錄；檔案：每個(gè)與檢測(cè)質(zhì)量相關(guān)的設(shè)備均應(yīng)建檔，內(nèi)容包括：設(shè)備的名稱；制造商名稱、型號(hào)、序號(hào)或其它唯一性標(biāo)識(shí)；接收日期和啟用日期；）目前放置地點(diǎn)；接收時(shí)的狀態(tài)（例如全新的、經(jīng)改裝的）；儀器使用說(shuō)明書(shū)或其復(fù)印件；校準(zhǔn)和/或檢測(cè)的日期和結(jié)果以及下次校準(zhǔn)和/或檢測(cè)的日期；迄今所進(jìn)行的維護(hù)和今后維護(hù)計(jì)劃的細(xì)節(jié)；損壞、故障、改裝或修理的歷史。

7.4 料（試劑、耗品）

采購(gòu)程序及領(lǐng)用記錄，質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)、程序及記錄，應(yīng)急程序；缺貨、試劑變質(zhì)；室內(nèi)質(zhì)控品。

7.5 樣（品）

標(biāo)本唯一編號(hào)，年月日項(xiàng)目順序號(hào)；標(biāo)本采集標(biāo)準(zhǔn)操作程序；標(biāo)本接受（拒收）標(biāo)準(zhǔn)、交接記錄；標(biāo)本保存、銷毀的程序及記錄；標(biāo)本處理標(biāo)準(zhǔn)操作程序

7.6（方）法

方法學(xué)的有效性——依據(jù)；SOP的合理性——生搬硬套；分區(qū)操作的協(xié)作——流程合理；質(zhì)控點(diǎn)的安排——提取效率、擴(kuò)增效率；基線的調(diào)整——CT值、本底熒光值。

7.7（檢）測(cè)

?室內(nèi)質(zhì)控的SOP：耗品質(zhì)檢，試劑質(zhì)檢，質(zhì)控方法（糾錯(cuò)措施），質(zhì)控圖。?室間質(zhì)評(píng)的SOP：糾偏措施

7.8 報(bào)告

?發(fā)放范圍：門診、病區(qū)、外單位 ?發(fā)放方式：保密、電子、郵件

?報(bào)告單的格式：唯一編號(hào)、檢測(cè)下限、實(shí)驗(yàn)室申明 ?審核、標(biāo)準(zhǔn)、不合格報(bào)告的處理

7.9 抱怨

?實(shí)驗(yàn)室服務(wù)、質(zhì)量改進(jìn)的依據(jù)

?對(duì)象：病人、醫(yī)生、工作人員。SOP應(yīng)明確方式、職責(zé)、反饋、記錄。

摘自《2003年華東區(qū)臨床檢驗(yàn)中心協(xié)作線臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理

及新技術(shù)應(yīng)用高級(jí)研討會(huì)資料匯編》

第五篇：臨床定量PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)及管理

臨床定量PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)及管理SICOLAB

一、近年來(lái)，PCR技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中得以快速應(yīng)用，特別是在肝炎、結(jié)核、艾滋病、性病、SARS等病原微生物診斷以及部分遺傳性疾病診斷和癌癥的輔助診斷等方面的應(yīng)用。

二、臨床定量PCR實(shí)驗(yàn)室管理

臨床定量PCR實(shí)驗(yàn)室由衛(wèi)生部管理，依據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部頒發(fā)的《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)）《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》、（衛(wèi)檢字[2002]8號(hào)）、《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》（2002-1-14）、《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室申請(qǐng)表》及《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)收表》執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)室申辦程序包括：

（1）填寫調(diào)查表，由省臨檢中心審核；

（2）正式填寫申請(qǐng)表，上報(bào)衛(wèi)生部臨檢中心；

（3）評(píng)審由衛(wèi)生部、省專家參加，并報(bào)省衛(wèi)生廳備案；（4）合格單位名單由衛(wèi)生行政部門在媒體公示。臨床定量PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備以下條件：標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)設(shè)置、專業(yè)的技術(shù)人員、標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）和質(zhì)量管理文件等。

1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及人員管理在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)上，建立單流向、一體化的臨床定量PCR實(shí)驗(yàn)室是安全準(zhǔn)確進(jìn)行基因擴(kuò)增檢驗(yàn)和保障生物安全的重要措施。其具有理想的布局結(jié)構(gòu)、標(biāo)準(zhǔn)的風(fēng)向設(shè)置、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆雷o(hù)措施、簡(jiǎn)明潔凈的外觀、合適的環(huán)境條件與參數(shù)等。它具體包括建設(shè)好“3個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)”（試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)及其各自緩沖區(qū)）和“3個(gè)系統(tǒng)”（單向氣流控制系統(tǒng)、單向物品傳送系統(tǒng)、生物安全控制系統(tǒng)）。對(duì)于人員管理，首先應(yīng)制定一系列規(guī)章制度。檢驗(yàn)人員要嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，制定日常工作中的質(zhì)量控制流程，嚴(yán)格執(zhí)行查對(duì)制度和考核制度，具有實(shí)事求是的工作作風(fēng)。檢驗(yàn)人員必須滿足以下條件：

（1）經(jīng)有資質(zhì)的單位培訓(xùn)，考試合格取得上崗證后持證上崗。（2）專業(yè)主管為本科以上學(xué)歷和中級(jí)以上職稱3a以上工作經(jīng)歷。（3）工作人員須有專業(yè)技術(shù)職稱。

（4）培訓(xùn)單位須由省衛(wèi)生廳指定，經(jīng)衛(wèi)生部臨檢中心認(rèn)可。

2、實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程的規(guī)范化建立符合當(dāng)今實(shí)驗(yàn)室的管理模式，形成管理文件，包括質(zhì)量手冊(cè)、質(zhì)量體系程序文件和標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）等。質(zhì)量手冊(cè)主要包括目錄、批準(zhǔn)頁(yè)、前言、質(zhì)量方針、組織結(jié)構(gòu)、人員管理、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施環(huán)境、儀器設(shè)備、生物防護(hù)措施、標(biāo)準(zhǔn)操作程序、標(biāo)本管理、記錄、報(bào)告、應(yīng)急處理及實(shí)驗(yàn)室的工作制度等。SOP文件是最具體、最具可操作性，也是使用頻率最高的文件，其精髓就是使所有與實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)質(zhì)量有關(guān)的環(huán)節(jié)都有章可循，要讓每一個(gè)操作人員都了解并嚴(yán)格遵照?qǐng)?zhí)行管理制度和標(biāo)準(zhǔn)操作程序。此外，所有實(shí)驗(yàn)的原始資料均應(yīng)存檔；所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊(cè)；原始登記表應(yīng)記錄試劑來(lái)源、批號(hào)，質(zhì)控血清的來(lái)源及測(cè)定值，并注明是否在控；檢驗(yàn)者及審核者應(yīng)簽名。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床診斷有決定意義，其樣本應(yīng)留存，至少要與病歷的保存期一致。規(guī)范化的管理和操作保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，而且便于各項(xiàng)數(shù)據(jù)資料的核實(shí)。

三、臨床定量PCR實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制

PCR技術(shù)自Mullis創(chuàng)立以來(lái)廣泛應(yīng)用于多種疾病檢測(cè)，但PCR測(cè)定不同于一般臨床檢測(cè)，由于其靈敏性很高，即使有極少量DNA污染也會(huì)造成假陽(yáng)性，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求非常嚴(yán)格。檢驗(yàn)者在操作過(guò)程中必需牢固樹(shù)立“無(wú)基因觀念”，嚴(yán)格操作規(guī)程，防止一切可能的污染，包括以前的擴(kuò)增產(chǎn)物、天然基因組DNA、試劑配置、氣溶膠、實(shí)驗(yàn)所用的器具等。一旦發(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)即不能進(jìn)行，而且查找污染源非常困難，因此避免發(fā)生污染重在預(yù)防，并貫穿于PCR檢測(cè)的全過(guò)程。因此質(zhì)量控制在PCR檢測(cè)過(guò)程中尤為重要。

室內(nèi)質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)量控制是指一個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)（藎藎下轉(zhuǎn)第87頁(yè)藎藎）部對(duì)所有影響質(zhì)量的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行系統(tǒng)控制。目的是控制本試驗(yàn)室常規(guī)工作的精密度，提高常規(guī)工作前后的一致性。臨床PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)開(kāi)展所有檢驗(yàn)項(xiàng)目的室內(nèi)質(zhì)量控制，并做好記錄和分析[5]。PCR檢測(cè)包括標(biāo)本采集、核酸提取、基因擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測(cè)等步驟，每個(gè)步驟都應(yīng)有相應(yīng)的質(zhì)控措施。其中最關(guān)鍵的是標(biāo)本采集和核酸提取，按照衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》嚴(yán)格執(zhí)行。室內(nèi)質(zhì)控貴在堅(jiān)持，重在不斷總結(jié)提高。3.2室間質(zhì)量評(píng)價(jià)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制體系中的重要部分，是保證患者檢驗(yàn)結(jié)果及其報(bào)告的準(zhǔn)確性和可靠性，以及各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果可比性的重要手段。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的全國(guó)性室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)現(xiàn)已擴(kuò)展到細(xì)菌、免疫、血液、體液、治療藥物監(jiān)測(cè)、分子診斷等領(lǐng)域。臨床PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積極參加省、市及衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的各項(xiàng)活動(dòng)，如實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量評(píng)價(jià)、質(zhì)量評(píng)價(jià)總結(jié)會(huì)議、研討會(huì)和學(xué)習(xí)班，各醫(yī)院間相互學(xué)習(xí)、溝通和交流，不斷改進(jìn)和完善本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理。實(shí)事求是地匯報(bào)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果，認(rèn)真地研究反饋的評(píng)價(jià)信息。接受衛(wèi)生部或省臨檢中心的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查，如果1個(gè)質(zhì)評(píng)項(xiàng)目連續(xù)2次成績(jī)不合格，整改并停止項(xiàng)目收費(fèi)3個(gè)月。及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，做好失控分析和記錄，找出問(wèn)題所在，采取相應(yīng)措施，力求實(shí)驗(yàn)室結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、及時(shí)、可比，更好地服務(wù)于臨床。

隨著PCR實(shí)驗(yàn)室管理方法的不斷完善，新試劑盒的相繼推出，實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的改良及實(shí)驗(yàn)方法的不斷改進(jìn)，定量PCR技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為日益強(qiáng)大和用途廣泛的技術(shù)。此外，PCR技術(shù)不同于常規(guī)的檢驗(yàn)技術(shù)，必須按照PCR實(shí)驗(yàn)室的一系列要求開(kāi)展工作才能保證操作的安全性和結(jié)果的可靠性?？梢灶A(yù)計(jì)，PCR技術(shù)將會(huì)給臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方法帶來(lái)一場(chǎng)巨大的變革，并逐步進(jìn)入我國(guó)衛(wèi)生機(jī)構(gòu)的各級(jí)實(shí)驗(yàn)室，更好地為臨床某些疾病的早期診斷和治療提供服務(wù)。