第一篇：關于PCR技術及其應用實例和前景

PCR技術及其應用實例和前景

檢驗0905郭媛媛

PCR是我們研究 分子生物學的重要方法和工具，隨著醫(yī)學科技的不斷發(fā)展，這種技術越來越被人們看重，越來越多的應用到我們的科技研究之中，作為醫(yī)學檢驗工作者，這種技術也是我們必須掌握的從這篇文章中讓我們了解一下它在實踐之中的前景。

摘要：PCR(ploymerse chain reaction)技術[1]，即聚合酶鏈反應技術，又稱基因體外擴增技術或和核酸體外擴增技術，利用兩種與相反鏈雜交并利用附著于目標DNA兩端的寡核苷酸引物在高溫(95°C)使目標DNA片斷的DNA雙鏈變性，分解為單鏈，在較低溫度(37-63°C)與引物退火，然后變溫到72°C左右。在耐高溫DNA聚合物酶的作用下引物被沿樣板DNA單鏈延伸合成互補鏈，然后有變性→退火→延伸反復進行。引物大大過量，dNTP過量，酶在高溫中是較穩(wěn)定的，這樣經(jīng)過幾十個循環(huán)，目標DNA片斷就按2的n次方遞增，用此法可以從mRNA中，cDNA庫中擴出目標基因。總之，生物體內核酸的復制是半保留復制，PCR技術就是在體外對此進行復制模擬。

關鍵詞：PCR技術；DNA；應用；工程效益擴大 1 引言

人類利用微生物的實踐具有悠久的歷史，公元前，人類就已經(jīng)利用天然的微生物（酶）生產(chǎn)奶酪和酒。進入工業(yè)革命時代，人們開始對天然微生物進行篩選和誘變，生產(chǎn)某些簡單的代謝產(chǎn)物，氨基酸，維生素和抗生素。

20世紀60年代至今，隨著人類雖微生物認識的加深，DNA重組技術的出現(xiàn)，發(fā)酵技術的提高：更多的微生物可產(chǎn)生各種各樣的抗生素，應用于醫(yī)學微生物學(Medical Microbiology)中；更多微生物被發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生促生物質，有利于人和動植物的生長，對農(nóng)業(yè)科學(Agriculture)有著極重要的支持；還有些微生物的代謝產(chǎn)物是重要的化工原料，加速了化工產(chǎn)業(yè)(Chemical Industry)的完善；再有些微生物被廣泛應用于法醫(yī)鑒定(Forenic)、醫(yī)學(Medical Science)、環(huán)境監(jiān)測(Environment Supervise)分子克隆(Member Clone)、序列分析(Alignment Analysis)、考古研究(Archaeology Search)等重要學科，具有廣泛的應用前景，這就是我要介紹的PCR技術。2 PCR技術原理

下面我通過摘錄了一個實驗[2]，來介紹一下PCR技術的過程及其原理(至于它詳細的實驗過程和方法詳見參考文獻)。.在94°C高溫下雙鏈變性，分離出DNA單鏈的模板，然后降溫(55°C)，然添加的與DNA單鏈配對，緊接著溫度升高(72°C)，在DNA聚合酶的作用下，脫氧核苷三磷酸開始滲入，并從引物的結合端開始，按5ˊ-3ˊ方向延伸，合成出新生的DNA互補鏈，這一過程稱為一循環(huán)，然后重復該循環(huán)，模板DNA被大量復制。

在此，我要特別強調幾點注意事項，這也是這個實驗設計者提醒我們需要注意的地方：

(1)在配置PCR反映體系的過程中，Taq酶應在加入dNTP混合物后加入，因為有些酶的3ˊ-5ˊ的外切酶反應較強，反映體系如果不含dNTP，反應體系中的引物可能被分解。

(2)非特異性擴增產(chǎn)物，可能是模板有與引物同源性高的其他位點，其次是復性溫度太低，適當提高復性溫度就可以解決這些問題。

以上實驗可清楚明了地向我們展示PCR技術的原理。3 PCR技術分類

PCR技術自從1985年由Millus創(chuàng)立后，經(jīng)歷了20年的飛速發(fā)展，是傳統(tǒng)微生物學與現(xiàn)代基因學之間的完美結晶，已成為當今世界上不可或缺的一項重要的微生物應用技術，下面我將介紹幾種常用的PCR技術[3] 3.1反轉錄PCR 反轉錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)即以RNA分子為模板的擴增技術，主要用于克隆cDNA、檢測RNA病毒、合成cDNA探針機構建RNA高效轉錄系統(tǒng)。3.2定量PCR 定量PCR(quantitative PCR)的基本原理是。假定其反應產(chǎn)物的數(shù)量同反映混合物中起始模板的mRNA或DNA的量成正比，因此通過瓊脂糖電泳樣品條帶得比較，便可以確定兩種PCR產(chǎn)物之間的數(shù)量關系。另外定量PCR還有廣義和狹義之分[4]，在此就不詳細介紹了。3.3實時熒光定量PCR 所謂實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用映光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過校正曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，還具有特異性更強、有效解決了PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。3.4重組PCR 重組PCR(recombinant PCR RP-PCR)是指用PCR法在DNA片段上進行點突變，即擴增產(chǎn)物中含有域模板序列不同的堿基。利用重組PCR可造成DNA片段的堿基插入或缺失，從而研究目的基因片段的功能。3.5反向PCR 反向PCR(inverse PCR IP-CR)是對一個已知的DNA片斷序列兩側的未知序列進行擴增和研究的技術。3.6多重PCR 多重PCR(multiplex PCR)即在同一反應體系中加入多對引物，擴增同一模板的幾個區(qū)域。多重PCR可同時檢測多個突變位點或病原生物，有利于遺傳病和感染性疾病的診斷。3.7不對稱PCR 不對稱PCR(asymmetric PCR)即在擴增體系中加入不同濃度的引物，而得到單鏈DNA產(chǎn)物。

另外還有幾種新型的、最近興起的PCR技術[5]，雖不十分成熟，但發(fā)展前景十分廣闊。它們包括： 3.8原位PCR 原位PCR是指對組織細胞中特異DNA或RNA進行PCR擴增，然后再用原位PCR進行擴增，然后再用原位雜交對擴增產(chǎn)物進行定量分析的一種方法。目前有報道[6]用這種方法可檢測出組織細胞中的人乳頭瘤病毒、艾滋病毒、結核桿菌等。3.9巢式PCR 巢式PCR比常規(guī)PCR靈敏度大大提高，同時第二次擴增又可鑒定第一次擴增產(chǎn)物的特異性。所以這種方法用于臨床檢驗，目前血清中丙型肝炎的監(jiān)測多用這種方法。

4.PCR技術應用實例

PCR技術自從建立以來，由于其敏感、高效、操作簡便，在分子生物學研究、臨床醫(yī)學和其他很多領域中得到4.1分子生物學理論研究[7] 如：制備cDNA文庫與篩選，要較多的組織。但如果用PCR技甚至幾個細胞就可以構建cDNA高了工作效率。

再如：DNA測序、檢測突變堿基、基因重組與融合、用簡并引物法擴增未知序列，無不是PCR技術在分子生物學中的應用。4.2臨床醫(yī)學[8]

如：病原體診斷，利用PCR技術可以檢測標本中的病毒、細菌、支原體，直至寄生蟲等病原生物，標本可以是組織、血液、細胞、分泌物、排泄物等。以后還發(fā)展了遺傳病基因的診斷、組織器官移植的配型選擇、腫瘤的診斷轉移和確定、法醫(yī)學和其他臨床醫(yī)學領域。4.3考古學[9]

由于PCR技術對基因組的完整性要求不高，因而對分子考古學極為有幫助，科判定生物種類間的親緣關系、進化途徑等。

如：1997年德國慕尼黑大學動物研究所科學家宣稱[10]，他們對歐洲原始人——歐洲尼安德特人化石中的基因殘余物進行分析，結果表示著名的歐洲原始人尼安德特人不是歐洲現(xiàn)代人的祖先，這一結果又得到了英國、俄羅斯和瑞典科學家的進一步證實，為現(xiàn)代人的起源提供了新的論據(jù)。4.4 其他領域

PCR技術還在動植物研究領域、組織和群體生物學等領域已得到了廣泛的應用[11]。5.前景與總結

結合對以上PCR技術的了解，我認為PCR技術可以加快實現(xiàn)它的工程化，效

既費錢費時，又需術，只要很少組織文庫，并且大大提了廣泛應用。益化，如：應用在現(xiàn)代環(huán)境工程污水處理工程的微生物載體研究上[12]，PCR技術暫時只是致力于理論方面和研究方面，它并沒有像其他微生物技術那樣給人類社會帶來大規(guī)模的經(jīng)濟效益，假如可以實現(xiàn)這一設想，那么不但PCR技術本身可以得到更加快速的發(fā)展，而且我們還可以促進經(jīng)濟的發(fā)展。

比如說：在傳統(tǒng)的生物發(fā)酵技術上可以結合PCR技術，利用DNA在體外的復制和雜交，并實現(xiàn)表達，可以實現(xiàn)基因工程的超遠緣雜交的物種突破難進行的問題；再比如：可以通過PCR技術實現(xiàn)核酸雜交技術，核酸雜交法比抗原捕獲特異、敏感，但半衰期短，放射性污染不易處理，顯影時間長等缺點，目前國內外常用的生物素檢測標本中致癌物質[13]。

另外，還有很多微生物的PCR技術在工程上的應用，這里就不一一列舉了。關鍵是怎樣擴大在工程上的應用，以擴大經(jīng)濟效益。這是PCR技術的關鍵。

PCR技術運用傳統(tǒng)生物技術結合近代基因工程原理，包含反轉錄PCR技術、定量PCR技術、實時熒光定量PCR技術、重組PCR技術、反向PCR技術、多重PCR技術、不對稱PCR技術等多種傳統(tǒng)PCR技術和原位PCR技術、巢式PCR技術等一系列新興PCR技術。最新的進展如[14]：結核桿菌診斷PCR；病毒學PCR技術；HIV感染PCR；檢測人COX病；DMS/BMD基因；地中海貧血PCR；血友病A基因?

在工業(yè)在分子生物學、臨床醫(yī)學、考古學等眾多領域取得了巨大成就，不但只是局限于研究領域，而且還從實用角度證明了PCR技術是一項令人類值得自傲的技術。自從1985年由Millus創(chuàng)立之后，又得到了近二十年的發(fā)展，所以PCR技術的發(fā)展前景是不可估量的。它絕對是現(xiàn)代生物學技術中一項值得發(fā)展的技術，在當今社會乃至未來社會都會有它的立足之地，充分運用它，人類會在文明發(fā)展的進程中，發(fā)出更耀眼的光芒。參考文獻：

[1] 歐陽平凱,《》生物科技辭典,化學工業(yè)出版社,北京,2003.10:342 [2] 趙斌,何怡紅,《微生物實驗》,科學出版社,北京,2002,23(5):11-15 [3] 孫汶生,黃英才,馬曹紅等,《基因工程學》,科學出版社,北京,2004.8:131-136 [4] 魏平著,《關于定量PCR技術》,科學教育出版社,北京,2001.815:59 [5] 賀淹才,《簡明基因工程原理(第二版)),科學出版社,北京,2005,8:175-197 [6] 俞華,《PCR技術發(fā)展及應用前景》,人民日報,2003.12(5),第7版 [7] 馬中聲等,《分子生物學》,教育出版社,北京,2004,7:135 [8] 陸德如等,《現(xiàn)代生物醫(yī)學技術》,化學工業(yè)出版社,北京,2002,7:50-52 [9] 李立家,《PCR技術的應用及前景》,東北大學學報,2002,11:10-15 [10] Geoger White,《 Prospective of PCR Technology》, Science,2000,5(7):29-32

[11] Michael Brand, Methods in Molecular Medicine, Vol.26“《Quantitative PCR Protocols》” Edited by: B.kochanowski and V.Reischi, Humana press Inc.Totowa, NJ, 1999

[12] 李彥春,《關于廢水處理的現(xiàn)代技術應用》,環(huán)境技術通報,2005,5(4):25-30 [13] 二雄吉平,吳濤譯,《關于PCR技術的一些看法》,東京大學學報現(xiàn)代基因技術譯叢, 2004,11(4):10-15

[14] Tess.M.Jission etc.《Toward routine diagnosis of hepatitis B virus desoxyribonucleic acid》.Clinical Biochemistry, 1993, 26:289.

第二篇：PCR技術的法醫(yī)學應用

PCR技術的法醫(yī)學應用

PCR技術可以從一滴血、一個細胞中擴增出足量 DNA產(chǎn)物供分析檢驗。PCR技術的應用解決了許多以往血清學方法無能為力的問題，而且離體蛋白質在自然界中的穩(wěn)定性遠不如核酸。所以 DNA的PCR檢驗具有獨到的優(yōu)越性。目前，人們已建立了各種生物樣品如血液、血斑、精液、性交混合物、肌肉、單根毛發(fā)、上皮細胞、牙齒、骨骼中制備 DNA的實驗方法。目前PCR技術的法醫(yī)學應用主要有： 1．VNTR多態(tài)性

該方法擴增位點靶基因多態(tài)性串聯(lián)重復核心序列數(shù)目不同而形成。目前報道有十幾種，比較成熟的有APOB、PMCT118、P33.6、P33.4、PYNZ22等位點。該方法簡單，結

果易分析，缺點是在片段長度差異較大時，長片段可能被漏擴增，引起錯誤判斷。2．性別鑒定

PCR性別鑒定目前應用于各種生物檢材檢驗。通過擴增y染色體特異位點鑒定，用Alu序列作對照，也可以同時擴增x、y染色體特異性片段進行鑒定。3．STR分型檢驗

STR為短串聯(lián)重復序列（Short Tandom Repeat）,形成多態(tài)性原理與VNTR相似，只是重復單位數(shù)3-6bp，片段長度100-400 bp。STR與VNTR分布也不同，VNTR主要分布在染色體端粒，而STR則存在于整個基因組，估計人類基因組有50萬個STR位點，因此是巨大的遺傳差異研究對象。

STR位點的突出特點是基因組內基因座多，多態(tài)片段短，在生物性檢材個人識別鑒定中實用價值極高，高度腐敗的檢材只要保存了靶DNA，STR位點就可能擴增成功。STR的PCR擴增時間短，變性、退火和延伸每步只需30~60S，可在一個半小時左右完成30個循環(huán)。檢測方法靈敏度高，甚至<1ng模板DNA都可擴增出多態(tài)片段。STR的擴增產(chǎn)物經(jīng)高分辨聚丙烯酰胺凝膠電泳，用等位基因梯階分子量標準物，即可準確的判斷等位基因長度?？色@得不連續(xù)的基因頻率分布，便于Hardy-Weinberg平衡檢驗和偶合概率計算。

1993年在英國Colin等報導用復合擴增對12個STR位點進行研究，總排除率達1x10-14，表明STR復合擴增可以認定同一。STR在法醫(yī)學中應用優(yōu)點在于：

(1)操作方便簡便，通過多位點累計，可以同一認定；(2)靈敏度高，復合擴增可以節(jié)約檢材；(3)片段較小，適宜部分降解DNA的擴增。

4．線粒體測序技術

線粒體是真核細胞中與 能量代謝有關的細胞器，一個細胞中線粒體數(shù)的范圍約為1000~10000個，所以線粒體DNA分析比細胞核DNA分析要靈敏得多，線粒體測序分析另一特點是可以對無核細胞檢材，如毛干、紅細胞骨頭、指甲等進行分析，而且細胞核DNA進行測序分析必須用克隆的方法純化出單一的DNA分子才能進行測序分析，而線粒體DNA可直接經(jīng)PCR擴增測序。進一步研究表明，線粒體是母系遺傳方式遺傳的，所以一母所生子女應有相同的線粒體DNA序列。線粒體多變區(qū)在D區(qū)。擴增D區(qū)多態(tài)片段測序，就可以進行個體識別。

目前，世界上絕大多數(shù)法醫(yī) DNA鑒定實驗室主要工作就是應用STR-PCR分型檢驗技術進行個體識別、親權鑒定等工作。

第三篇：PCR技術在食品工業(yè)中的應用

PCR技術在食品工業(yè)中的應用

姓名

專業(yè)

翟揚威 學號 11042106

食品科學與工程 班級 11-1

[摘要]: 如今食品營養(yǎng)、安全問題備受關注，是關系到人們健康和國家發(fā)展的重大課題，有關食品安全檢測的技術受到重視,其中 PCR技術以其靈敏度高、特異性強以及快速準確等優(yōu)勢在食品檢測領域得到廣泛的認可.現(xiàn)主要介紹一下PCR技術檢測食品微生物的優(yōu)點，且分析了PCR技術在食品檢測中的應用及一些新的PCR檢測技術，并說明了這些技術在食品微生物檢測中的發(fā)展。

[關鍵詞]: 多聚酶鏈式反應 PCR 食品檢測 微生物

近年來，PCR技術在食品工業(yè)中倍受重視，例如：基因克隆、轉基因食品檢測、微生物檢測、食品成分及產(chǎn)地的檢測等，推進了基因工程在食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

首先，我們得了解PCR技術是什么？作用原理是什么？

PCR即聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)，是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內將所要研究 的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫(yī)學領域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。

PCR技術的基本原理：該技術是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補序列結合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補鏈。

參加pcr反應的物質主要有五種即引物、酶、D-NTP、模板和Mg2+ 引物：引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則： ①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

PCR 技術檢測微生物的基本原理是在被檢測微生物核酸序列, 在PCR 體系下經(jīng)高溫變性、低溫退火、適溫延伸三步循環(huán)將單個核酸分子序列以2的指數(shù)進行大量復制擴增的過程。即在檢測時, 被檢測微生物雙鏈DNA 序列在94℃變性解鏈成雙鏈, 55℃特異性引物與單鏈DNA 結合, 72℃在引物的引導延伸復制檢測微生物DNA 序列。以上三步進行循環(huán)擴增得到大量的被檢測微生物DNA 序列, 最后一般在凝膠電泳下檢測目的DNA。理論上只要樣品中有一個分子的微生物就可以在短時間內用PCR 技術檢測到。食品中污染微生物種類很多, 即使是同一種食品中微生物種類也有很多, 用傳統(tǒng)的方法檢測食品中微生物要分離出所有的微生物很困難。特別是在檢測食品中的弱勢菌時, 可能很難用傳統(tǒng)的方法檢測出來, 特別是有些微生物很難培養(yǎng), 而用PCR 技術檢測這些微生物可以避免這些問題, 因此, 利用PCR 技術能夠比較準確地檢測食品中微生物。

PCR技術在食品成分測定方面的應用也倍受關注，如動物源性成分的測定等。

近年來，瘋牛病、羊癢病及禽流感等疾病通過食品的傳播，由于食品安全性與質量監(jiān)督的需要及宗教信仰等問題，有必要對食品中的動物源成分進行檢測，僅靠傳統(tǒng)的外觀鑒別，無法準確判定其實際成分。PCR 技術已被廣泛應用于動物肉類的物種檢測與飼料中的動物成分檢測。陳文炳[20]等，應用了PCR技術檢測12種加工食品中豬、牛、羊、雞等動物源性成分，并開發(fā)了真核生物所共有的18S核糖體DNA(18S R-DNA)與食品中多種動物物種特異性基因片段之間的二重PCR檢測方法，以提高檢測效率與準確性，節(jié)約檢測成本。王麗媛[21]等，利用單重PCR和多重PCR對部分市售肉制品進行檢測，以確定食品中是否含有動物源性成分及其含量。此方法操作簡便，快速準確，節(jié)省費用。植物源性成分的測定

我國是一個農(nóng)產(chǎn)品出口大國，加入WTO后，隨著農(nóng)產(chǎn)品出口量的增加，國外對出口食品質量的要求也隨之提高。為確保食品的品質和安全，為我國食品的進出口貿易嚴格把關，保證我國人民日常生活的食品安全和生命健康。因此，開發(fā)出準確方便的鑒定食品有效成分的方法，具有重大意義。陳文炳[22]等本研究以豆粉與豆奶粉中的大豆成分(內源Lectin基因)、食品中的玉米(IVR 基因)、馬鈴薯(PATA基因)、番茄(PG基因)等成分以及真核生物中普遍存在的核糖體DNA(18S R-DNA)片段為研究對象，進行單一與二重PCR擴增，以擴增產(chǎn)物作為分子標記，建立加工食品中植物源性有效成分的分子生物學鑒定技術，為食品質量與安全管理提供技術支持。

參考文獻

[1]張玉霞，黃鳴.食品檢驗中多重PCR技術的應用.中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [2]陳師勇、莫照蘭、徐永立.水產(chǎn)養(yǎng)殖病原微生物檢測技術研究進展.海洋科學,2002.26(9)P31-35 [3]楊衛(wèi)軍,張小軍,張坤朋,張光杰.PCR技術在食品微生物檢測中的應用.安陽工學院學報,2004(4)p16-18 [4]張玉霞，黃鳴.食品檢驗中多重PCR技術的應用.中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2008年5月第18卷第5期 P958-960 [5]陳師勇、莫照蘭、徐永立.水產(chǎn)養(yǎng)殖病原微生物檢測技術研究進展.海洋科學,2002.26(9)P31-35 [6]楊衛(wèi)軍,張小軍,張坤朋,張光杰.PCR技術在食品微生物檢測中的應用.安陽工學院學報,2004(4)p16-18

第四篇：pcr檢測技術

《食品安全學》綜述

PCR快速檢測技術綜述

1．前言

聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍，是肉眼能直接觀察和判斷；可從一根頭發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾個星期才能做到的事情，用PCR幾個小時便可完成。PCR技術是生物醫(yī)學領域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。

該酶促反應最基本的3個環(huán)節(jié)是：[1]模板DNA的變性，即在94℃下模板雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA；[2]引物與模板鏈的特異性復性；[3]引物鏈的延伸。

2.研究的目的與意義

聚合酶鏈反應（PCR）技術建立以來，定性技術不斷改進和完善，可以達到檢測單個靶序列的水平、但實際工作中常需要定量檢測標本中核酸，而不是某一特定序列存在與否，借助PCR對基因快速、敏感、特異而準確定量成為目前分子生物學技術研究的熱點之一。定量PCR旨在評估樣品中靶分子數(shù)，此測定可以是絕對的，如每微克樣本中靶DNA的分子數(shù)；也可以是相對定量，即與設定的內參照或外參照比較而言。鑒于PCR方法主要有5個，即對PCR產(chǎn)物的直接定量、極限稀釋法、靶基因與參照基因的同步擴增、競爭性PCR和熒光定量PCR[1]。這幾種放啊各有利弊，對其選擇取決于靶基因的特性、對PCR產(chǎn)量的期望值、對準確度的要求、需要相對還是絕對定量。

人類對于核酸的研究已經(jīng)有100多年的歷史。20世紀60年代末70年代初，人們致力于研究基因的體外分離技術。但是，由于核酸的含量較少，一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想。但是，當時的基因序列分析方法尚未成熟，對熱具有較強穩(wěn)定性的DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動合成階段，這種想法似乎沒有任何實際意義。

1985年，美國科學家Kary Mullis在高速公路的啟發(fā)下，經(jīng)過兩年的努力，發(fā)明了PCR技術，并在Science雜志上發(fā)表了關于PCR技術的第一篇學術論文。從此，PCR技術得到了生命科學界的普遍認同，Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學獎。

但是，最初的PCR技術相當不成熟，在當時是一種操作復雜、成本高昂、“中看不中用”的實驗室技術。1988年初，Keohanog通過對所使用的酶的改進，提高了擴增的真實性。爾后，Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內提取到一種耐熱的DNA聚合酶，使得PCR技術的擴增效率大大提高。也正是由于此酶的發(fā)現(xiàn)使得PCR技術得到了廣泛地應用，使該技術成為遺傳與分子生物學 分析的根本性基石。在以后的幾十年里，PCR方法被不斷改進：它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測定；從原先只能擴增幾個kb的基因到目前已能擴增長達幾十個kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術已有十幾種之多，例如，將PCR與反轉錄酶結合，成為反轉錄PCR，將PCR與抗體等相結合就成為免疫PCR等。3.國內外研究現(xiàn)狀

3.1.基礎研究方面的應用

目前從事分子生物學的實驗室和研究人員，幾乎每天都在使用PCR，可以說幾乎沒有一個分子生物學家沒有使用過PCR。因此，PCR與分子克隆一樣是分子生物學實驗室的常規(guī)方法，可用于達到以下目的：

[1] 擴增目的基因和鑒定重組子； [2]克隆基因；

[3]基因功能和表達調控的研究； [4]基因組測序； [5]制備單鏈模板； [6]致突變；

3.2.PCR在臨床上的應用[2]

[1]在遺傳學上的應用：人類的遺傳性疾病是因為某一堿基序列發(fā)生了突變，使之缺失或形成某一限制性內切酶的識別位點，通過PCR結合限制片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP），就可以從基因的水平對遺傳性疾病進行分析。例如，血友病甲是一種常見的遺傳性出血性疾病，患者體內缺乏凝血因子FVIII這是由于基因第14個外顯子的第336位氨基酸的編碼基因發(fā)生了突變，產(chǎn)生了一個新的PstI酶切點，因此可以使用PCR-RFLP對血友病進行診斷。PCR還可以用來檢測遺傳性耳聾和Leber遺傳性視神經(jīng)病。

[2]在腫瘤研究中的應用：PCR已日益廣泛應用于腫瘤的病因與發(fā)病機理研究以及腫瘤診斷與治療的研究中。例如，差異顯示PCR技術能針對不同腫瘤尋找其特異而敏感的標志物，并用于腫瘤早期診斷、判斷預后及療效評估。另一方面，在使用普通放療、化療的同時可結合定量PCR技術檢測微小殘留病灶，以進一步改進治療方案。此外，由于癌癥的發(fā)生在一定意義上是單個細胞分子發(fā)生變化，因而可以使用單細胞PCR技術對癌癥的發(fā)病機理進行研究。[3]在基因分型中的應用：當進行器官移植時并須先組織配型工作，此時常應用序列特異性寡核苷酸多態(tài)性PCR（PCR-sequence specific oilgonucleotide polymorphism,PCR-SSOP）對人類白細胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）進行分型，使移植成功率大大提高。此外PCR-限制性片段長度多態(tài)性也可以用于對HLA的分型。3．3.在法醫(yī)學中的應用[3]

例如：最早應用DNA限制性片段長度多態(tài)性結合PCR-RFLP來進行法醫(yī)學個體識別和親子鑒定。目前發(fā)現(xiàn)在真核生物基因組編碼和非編碼序列中的短串聯(lián)重復序列的重復次數(shù)在個體間存在著差異，因此可以使用短串聯(lián)重復PCR技術對其進行分析。使用PCR技術進行法醫(yī)鑒定的優(yōu)點是樣品用量小并且適于對高度降解材料的檢測。除剛才提到的之外，可變數(shù)目串聯(lián)重復序列（variable number tandem repeat,VN-TR）PCR也可以用于法醫(yī)學個體識別和親子鑒定。所以，綜上所述，PCR的確是一種分子生物學研究的基礎技術。在它30多年的發(fā)展中衍生出了諸如PCR-RFLP、PCR-SSOP、VN-TR，以及免疫PCR、致突變PCR和定量PCR等十幾種不同的技術方法。PCR技術可以為基因工程提供目的基因，并廣泛地應用于個體識別、親子鑒定、免疫配型、疾病診斷等方面?？梢哉f，PCR已經(jīng)滲透到了生命科學的各個領域。21世紀是生物工程的世紀。我相信，在今后的發(fā)展中PCR技術會不斷地得到擴充和完善，PCR技術也將4.相關檢測技術 4.1.技術原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫下也能發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，并設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，并逐步應用于臨床。4.2.工作原理

類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR 擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍 4.3.工作步驟

標準的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′ 端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度 5.研究方案

醫(yī)學檢驗大致可分為形態(tài)學、生物化學、血清免疫學和分子生物學幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術。60年代DNA雙螺旋結構及半保留復制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術、分子雜交技術的應用使分子生物學在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應（PCR）技術，使醫(yī)學界真正興起了基因診斷技術熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術與經(jīng)典的PCR反應在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應臨床微量、快速的特點。另外PCR反應體系中各組成成份往往都預分裝到反應管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學等廣泛領域中有相當高的實際應用價值。5.1研究方法

① 早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內的病毒長期低復制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。

③ 療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標。在治療過程中通過監(jiān)測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現(xiàn)及動態(tài)變化與病人病情無線性相關關系。RT－PCR技術使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉錄為cDNA（RT）后再進行PCR擴增，這種技術稱之為逆轉錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內復制的動態(tài)狀況。RNA純化要求嚴格，是RT－PCR的技術關鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉錄酶，如AMV/MLV逆轉錄酶，高溫逆轉錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實現(xiàn)單管單酶單人份的擴增要求，這樣就在不降低擴增敏感性的條件下，一步完成擴增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準確性。國內本公司已采用這種技術推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國胃炎發(fā)病率之高估計比乙型肝炎更嚴重，對HP的檢測應受到廣大醫(yī)務工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進行細菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP.PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，5.2.技術路線

PCR技術

聚合酶鏈式反應技術（PCR）是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法。具有特異性強、敏感性高、快速、簡便、可擴增RNA或cDNA、對起始材料質量要求低等優(yōu)點。5.3.所用儀器與材料

引物: PCR產(chǎn)物的特異性主要取決于引物鏈的特異性。由于存在同源序列，隨意設計的引物鏈，其PCR產(chǎn)物在電泳分析時可能出現(xiàn)多條鏈，因此在設計引物鏈時應充分考慮引物特異性。引物長度一般為15-30個堿基,G+C含量為40-60%,濃度0.1-1umol/L。TaqDNA聚合酶：濃度為1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶單位用量增長可能導致非特異DNA擴增。模板DNA：應避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、堿變性法、SDS裂解法等多種。

4×dNTPs ： dNTP儲存液pH應為7.0，在反應體系中，4種dNTP的濃度應相同，每種dNTP的濃度以50-200 umol/L為宜。緩沖液及其他成份：PCR反應體系中，一般采用Tris-HCl緩沖液。適宜的Mg2+濃度為高于dNTP總濃度0.2-2.5 mmol/L。

6．研究內容

PCR技術的出現(xiàn)對法醫(yī)學的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠比血清學或等方法確實可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個內含子中的串聯(lián)重復序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術成功地應用于個人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當樣本DNA數(shù)量不足時或DAN嚴重降解則不能正常檢出。且雜交技術常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護措施。PCR技術的出現(xiàn)，可以對極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構成的串聯(lián)重復DNA序列，具有單位點特征的稱為VNTR結構，多位點串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。6．1.檢測對象

常見的傳染性疾病有細菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。[4]乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細胞或外周血白細胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能 6．2檢測內容

PCR反應混合物經(jīng)過循環(huán)擴增后，所需做的工作就是檢測反應液中是否存在預期擴增產(chǎn)物及產(chǎn)物的特異性。目前已經(jīng)發(fā)展了許多檢測分析PCR擴增產(chǎn)物的方法。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構型多態(tài)性分析、核酸序列分析。

PCR技術類型[5]

免疫PCR技術 原位PCR技術 不對稱PCR技術 巢式PCR技術 反向PCR技術 逆轉錄PCR技術

復合PCR技術

彩色PCR技術

抗原捕獲PCR技術 增敏PCR技術

酶標PCR技術

二溫式PCR技術

錨定PCR技術

定量PCR技術

毛細管PCR技術

多重PCR技術

巢式或套式PCR技術 7.預期目標PCR 技術在大腸桿菌O157: H7檢測中

（1)簡單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎設計了一對引物,擴增產(chǎn)物為633bp的DNA片段。其退火溫度為60℃－63℃, 應用煮沸法與基因釋放法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測時間為3h。Thomas等用PCR擴增了slt基因片段。引物： 正鏈5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3', 反鏈5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR產(chǎn)物由凝膠電泳測定,檢測時間為ld。

徐建國等根據(jù)O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設計了PCR引物,產(chǎn)物為338bp。

PCR技術在大腸桿菌O157: H7檢測中（2）多重PCR:由于鑒定O157: H7血清型不能僅僅依靠簡單PCR,近年來國外學者對多重PCR方法在大腸桿菌O157: H7的診斷價值方面進行了研究。Meng等同時擴增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長度分別為633、210、484bp。此引物設計可有效區(qū)別O157: H7血清型與O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一個單一反應中同時擴增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質粒保守序列,其產(chǎn)物分別為1087、227、224、166bp。嚴笠選用針對大腸桿菌O157: H7志賀樣毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三對引物,在同一擴增體系中進行PCR,檢測12株不同來源的O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌、志賀菌15株。結果復合PCR方法較單一PCR方法具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩(wěn)定、可靠的陽性結果。能迅速、有效地與其它致病性大腸桿菌及沙門氏菌、志賀菌相鑒別。

PCR技術在大腸桿菌O157: H7檢測中的應用（3）原位PCR: kurokawa等不用培養(yǎng)過程,直接用原位PCR技術結合落射顯微鏡,在單細胞水平快速檢測O157: H7。

4.23SrRNA在大腸桿菌O157: H7分型、檢測中

傳統(tǒng)的細菌分類方法主要依賴于細菌的形態(tài)學、代謝產(chǎn)物、酶活性和表面抗原等特征。隨著現(xiàn)代分子生物學理論和技術的迅速發(fā)展，微生物檢測進入了基因時代，以核糖體核糖核酸序列為基礎的分類方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學方法。[6]如16srRNA、23srRNA、16-23srRNA區(qū)間序列分析等等，它完全不同于傳統(tǒng)方法，具有快速、簡便、敏感和特異等優(yōu)點。

參考文獻

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[2] 徐煥賓,賁昆龍,曾濤,李勁光;檢測HIV-1載量的熒光實時定量PCR技術的建立及其應用[J];中國病毒學;2001年02期

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第五篇：PCR技術在臨床檢驗中的應用

PCR技術在臨床檢驗中的應用

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醫(yī)學檢驗大致可分為形態(tài)學、生物化學、血清免疫學和分子生物學幾大類，其分別代表幾代實驗診斷技術。60年代DNA雙螺旋結構及半保留復制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術、分子雜交技術的應用使分子生物學在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應（PCR）技術，使醫(yī)學界真正興起了基因診斷技術熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗的PCR技術與經(jīng)典的PCR反應在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應臨床微量、快速的特點。另外PCR反應體系中各組成成份往往都預分裝到反應管中，既減少操作者的工作強度而且也減少了污染的機會，具有極高的使用價值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學等廣泛領域中有相當高的實際應用價值。

常見的傳染性疾病有細菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細胞或外周血白細胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能。PCR法檢測乙肝的優(yōu)勢表現(xiàn)在：①早期診斷，因為PCR擴增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。②對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內的病毒長期低復制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③療效跟蹤及病程判斷，因為PCR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標。在治療過程中通過監(jiān)測血清或白細胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時血清中抗體的出現(xiàn)及動態(tài)變化與病人病情無線性相關關系。RT－PCR技術使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉錄為cDNA（RT）后再進行PCR擴增，這種技術稱之為逆轉錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內復制的動態(tài)狀況。RNA純化要求嚴格，是RT－PCR的技術關鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉錄酶，如AMV/MLV逆轉錄酶，高溫逆轉錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實現(xiàn)單管單酶單人份的擴增要求，這樣就在不降低擴增敏感性的條件下，一步完成擴增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準確性。國內本公司已采用這種技術推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國胃炎發(fā)病率之高估計比乙型肝炎更嚴重，對HP的檢測應受到廣大醫(yī)務工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進行細菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系統(tǒng)感染性疾病主要的有肺結核、非典型性肺炎等。結核桿菌感染曾給人類健康帶來很大威脅，一度是較嚴重的致死性疾病之一。解放以后由于對結核病的預防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現(xiàn)，使結核病流行基本被控制。近來結核病有抬頭的趨勢，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現(xiàn)，其二是對結核預防重視不足。結核菌痰涂片鏡檢陽性率太低，酶標法又因抗原交叉反應易出現(xiàn)假陽性，結核檢測的金標準是結核菌培養(yǎng)法。但培養(yǎng)法費時昂貴并且受到用藥的影響，在實際應用中受到限制。PCR在結核菌檢測方面有簡便、敏感、特異的優(yōu)點。一般認為樣本中內要有100個左右的結核菌即可被檢出。目前用于結核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設計的引物擴增產(chǎn)物為245BP，研究表明這一基因對人型結核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認為這一基因對人型結核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測。結核菌痰標本的PCR檢測應注意以下幾種常見的問題。其一，多條帶。即擴增產(chǎn)物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產(chǎn)物帶，這與插入序列本身各片段長度有差異、結核菌在治療過程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關。這種擴增結果的判斷應特別注意，凡在陽性對照相應位置有明顯條帶的判陽性，否則應為陰性，或建議病人過一些時間后再復檢一次；其二，結核痰樣本PCR檢測時，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴增效果，甚至會導致嚴重非特異性擴增，電泳結果呈霧狀；基三，結核痰樣本PCR檢測結果可能表現(xiàn)為陽性、陰性交替出現(xiàn)，這與結核病灶的不規(guī)律排菌有關。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結進入血液，最終可定位于心肌細胞中導致心肌炎。目前對這些病毒的血液樣本檢測往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測時因其是RNA病毒所以應注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測的血清常溫下不應超過24小時，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR檢測在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應用。經(jīng)典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。梅毒是由梅毒螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經(jīng)血行播散到全身，最嚴重的是波及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。感染早期，梅毒螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測，其敏感性及特異性極高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺體其取樣方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般無螺旋體存在，因此III病人及部分無皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血檢測。淋病是目前發(fā)病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內寄生，常見的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對分泌物拭子進行涂片鏡檢時，常導致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發(fā)病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養(yǎng)法準確但費時且費用高，受用藥的影響。PCR法簡便、快捷、準確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設計的引物特異性高但其敏感性低；隱性質粒設計的引物敏感性高但偶爾出現(xiàn)多條帶的擴增產(chǎn)物，判斷結果時應以陽性對照為標準，凡在陽性對照相應部位有明顯條帶的為陽性，其余均為陰性。以往對沙眼衣原體及解脲支原體的檢測主要靠培養(yǎng)法，費時且昂貴，簡便快速的PCR檢測對其有極高的使用價值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴增的抑制劑，因此每次采樣時盡量避免采集過多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉采集宮頸脫落細胞送檢，其準確性更高。PCR也可以用檢測單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統(tǒng)感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關系并不密切，經(jīng)常有交叉或多型民時感染。為簡化操作，對其基因對比分析尋找共同序列設計的簡并引物可以同時檢出這幾種型別的病毒既簡化操作又減少費用是一種極理想的方法。

我國惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60％以上。引起腫瘤的原因非常復雜包括外界環(huán)境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類即化學、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關的證據(jù)越來越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網(wǎng)膜細胞瘤、腎母細胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導致細胞增殖調控失調終形成腫瘤。癌基因是指在自然或實驗條件下具有潛在誘導細胞惡性轉化的基因，它們是在研究逆轉錄病毒時發(fā)現(xiàn)的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據(jù)Rous(1911)的實驗，在小雞肉瘤濾液中發(fā)現(xiàn)一種能誘導宿主細胞轉化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來又在其它哺乳動物基因中發(fā)現(xiàn)與病毒癌基因同源序列，這種正常的細胞基因表達產(chǎn)物與細胞生長、增殖、分化有關。但若被某種因素激活就會轉化為有活力的癌基因，通常稱之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區(qū)分，分別用V-Onc及C-Onc基因來代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細胞中，并表達生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導細胞轉化，可能的原癌基因活化機理有：①點突變，受到射線、化學因素、生物因素的誘導，這樣微小的變化，就會活化癌基因，活化的基因產(chǎn)物僅有極微的結構差異，但在功能在卻有很大的區(qū)別。②獲得啟動子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動子而活化。③基因易位，內外界因素能導致染色體的某些基因易位、重排使原來無活性的原癌基因移至某些強的啟動因子或增強子附近而被活化。④原癌基因的過量擴增，原癌基因產(chǎn)物一般與生長因子、生長因子受體、跨膜信息蛋白有關或功能相近，過度表達時，會因調控失常而引起細胞癌變。另一類與腫瘤相關的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因較復雜，作用機理不太清楚。癌基因檢測中常用的分子生物學技術有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴增及序列分析。PCR擴增簡便、快捷有較強的實用性，甚至可從病人體液樣本中檢測活化的癌基因而不需取活組織，對癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱細胞細胞癌中檢出有轉化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱C-H-ras基因，后從肺細胞癌中發(fā)現(xiàn)了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經(jīng)母細胞中又發(fā)現(xiàn)了N-ras基因。Ras基因激活的最常見方式是點突變。人類原發(fā)腫瘤時點突變主要發(fā)生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據(jù)其點突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性內切酶消化或產(chǎn)物測序法檢測基因的突變情況即可用診斷。P53是抑制癌基因的代表，位于17號染色體短臂上，其產(chǎn)物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。1979年Cane發(fā)現(xiàn)了P53蛋白Eliyahu發(fā)現(xiàn)了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產(chǎn)物突變蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期較野生型基因產(chǎn)物長，在細胞內堆積，可以用免疫組化法測出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡單、快速、特異性高，更具有實用價值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導致構型改變，在進行凝膠電泳時，其泳動速率發(fā)生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區(qū)分開，統(tǒng)計表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達97％，300-450bp標出率可達69％，因此大于400bp的片段多態(tài)性應采用其它方法檢測。

遺傳病是由于遺傳基礎異常而引起的疾病，人類遺傳病約有3000多種，患者占總人口數(shù)的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學發(fā)展，基因診斷愈來愈表現(xiàn)出其優(yōu)越性，PCR技術是基因診斷的主要技術之一，為快速、準確地檢測人類遺傳病開辟了一個新的途徑，預計與遺傳相關的疾病的檢測有80％將在3-5年內被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應用中，可以利用引物直接擴增變化的基因產(chǎn)物，也可以結合應用限制內切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進行診斷。應用較為廣泛的有PCR法檢測中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見的單基因遺傳病，不有同類型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見。a珠蛋白基因位于11號染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現(xiàn)溶血性貧血，肝脾腫大，在我國發(fā)病率為0.66％，貴州、四川等地高發(fā)可達2.2％。應用PCR技術可以直接檢測突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria,PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴重缺乏使苯丙氨酸不能轉化為酷氨酸血癥，出現(xiàn)腦組織損傷，智力障礙。此病患者出生時正常，出生后一經(jīng)確診立即停止母乳喂養(yǎng)，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價之昂貴是一般家庭所不能承受的，關鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結合斑點雜交能有效診斷PKU。遺傳性疾病的基因變化很復雜，單基因固定位點變異布致病的情況很少，因此基因診斷過程中往往需要PCR技術與限制性內切酶、斑點雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴增產(chǎn)物序列分析結合，作綜合判斷。

優(yōu)生學包括基礎優(yōu)生學、社會優(yōu)生學、臨床優(yōu)生學及環(huán)境優(yōu)生學。孕期檢查及產(chǎn)前診斷是臨床優(yōu)生學的最重要內容之一。孕期檢查除一般項目外還能及時了解孕婦是患有某些對胎兒發(fā)育有嚴重影響的疾病如風疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、弓體感染等，及時發(fā)現(xiàn)及時治療并采取有效措施預防發(fā)展成為宮內感染。PCR技術對這些病原體的檢測簡便而確實，另外利用PCR技術可以對地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進行宮內診斷?？梢奝CR在優(yōu)生優(yōu)育方面有很高的應用價值。

PCR技術的出現(xiàn)對法醫(yī)學的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠比血清學或等方法確實可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個內含子中的串聯(lián)重復序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術成功地應用于個人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當樣本DNA數(shù)量不足時或DAN嚴重降解則不能正常檢出。且雜交技術常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護措施。PCR技術的出現(xiàn)，可以對極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構成的串聯(lián)重復DNA序列，具有單位點特征的稱為VNTR結構，多位點串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。由于VNTR在等位基因中的多態(tài)性便構成了遺傳標記。使用PCR技術對其進行擴增結合對擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜分析即可進行個人識別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復串聯(lián)序列稱為微衛(wèi)星。在人類基因組中，微衛(wèi)星更加豐富。微衛(wèi)星的重復序列比VNTR短，擴增分型簡便，易于自動化，在VNTR或微衛(wèi)星不僅重復片段的數(shù)量不同而且重復片段的核苷酸也具有多態(tài)性。在VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性分析時，如再結合堿基配對分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術可以完成替代早期的Southern印跡法進行多態(tài)性分析而且操作簡便，敏感性及準確性都有大幅度的提高。當然PCR技術在法醫(yī)中的應用仍在起步階段有許多技術問題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報告?zhèn)CR擴增污染等。想念隨著PCR技術的不斷完善它將在法醫(yī)學領域中有更加廣泛的應用。