第一篇：熒光定量PCR的應(yīng)用

熒光定量PCR 的原理及應(yīng)用

熒光定量PCR 是一種新的實(shí)時(shí)定量檢測特定核酸技術(shù),它是核酸探針技術(shù)、熒光共振能量傳遞技術(shù)和PCR 技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等特點(diǎn),是對原有PCR 技術(shù)的革新,擴(kuò)大了PCR 的應(yīng)用范圍。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ-PCR）作為熒光定量PCR技術(shù)的一種，是基于熒光能量傳遞技術(shù),通過受體發(fā)色團(tuán)之間偶極-偶極相互作用,能量從供體發(fā)色基團(tuán)轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色基團(tuán),受體熒光染料發(fā)射出的熒光信號強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比,檢測PCR 過程的熒光信號便可得知靶序列的初始濃度。它融匯PCR 技術(shù)的核酸高效擴(kuò)增、探針技術(shù)的高特異性、光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點(diǎn),直接探測PCR 過程中熒光信號的變化以獲得定量的結(jié)果。目前已在眾多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

1、FQ-PCR 在預(yù)防獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

PCR 技術(shù)的應(yīng)用有許多局限,不能準(zhǔn)確定量,假陽性率太高,只要有微量病原體存在就可以得到陽性結(jié)果,這不能完全作為診斷依據(jù),只有當(dāng)一定數(shù)量的病原體存在時(shí)才有臨床意義。FQ-PCR實(shí)現(xiàn)了PCR 從定性到定量的飛躍,有效解決PCR 污染和對模板定量不準(zhǔn)確等問題。

1.1在動(dòng)物病原菌檢測和鑒定中的應(yīng)用

炭疽桿菌作為人獸共患病的病原,尤其炭疽桿菌的芽胞可作為生物武器的病原。科學(xué)家在100 L 純化空氣中加入炭疽桿菌芽孢,進(jìn)行FQ-PCR檢測,1 h 內(nèi)炭疽桿菌的單個(gè)芽孢就被檢測到。

1.2在動(dòng)物病毒檢測和鑒定上的應(yīng)用

FQ-PCR已應(yīng)用于許多病原體的檢測,如對艾滋病病毒、乙型肝炎病毒DNA、尖銳濕疣皮損中HPVD-NA、與鼻咽癌關(guān)系密切的EB 病毒、結(jié)核分支桿菌、巨細(xì)胞病毒、A 型和B 型流感病毒等病原體的檢測。

3.3在動(dòng)物寄生蟲檢測和鑒定中的應(yīng)用

常用TaqMan 探針。如在被感染豬和鼠組織、全血、羊水以及腦脊髓液中的弓形蟲定量,其檢測極限相當(dāng)于套式PCR , 但準(zhǔn)確率大大提高。

2、FQ-PCR在畜牧業(yè)中的應(yīng)用

科學(xué)家采用TaqMan 探針檢測雞γ干擾素、采用RT-FQ-PCR 證明中國黃牛背最長肌中cap nl mRNA 表達(dá)量與宰后3 d 的牛肉嫩度高度相關(guān)等。

3、FQ-PCR在其他方面的應(yīng)用

3.1在動(dòng)物檢疫領(lǐng)域的應(yīng)用

FQ-PCR 可對動(dòng)物源性飼料、食品或其他日用品中牛羊源性成分的定量檢測。

3.2細(xì)胞因子表達(dá)定量檢測

常用FQ-PCR 測定細(xì)胞因子mRNA 表達(dá)情況,分析機(jī)體免疫狀態(tài)。利用FQ-PCR 測定雞、豬在注射疫苗、免疫增強(qiáng)劑以及在感染某種疾病情況下體內(nèi)細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá)水平。

3.3環(huán)境監(jiān)測

應(yīng)用FQ-PCR 對水資源及居家、辦公環(huán)境中的大腸埃希菌、藻青菌和一些寄生蟲進(jìn)行監(jiān)測。

3.4轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用

用一個(gè)已知拷貝數(shù)的內(nèi)源基因作為參照,同時(shí)對樣品作內(nèi)源基因和外源基因的FQ-PCR。兩者達(dá)到熒光閾值時(shí)的Ct 值可得到外源基因的拷貝數(shù);FQ-PCR 還可用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的純合性鑒定及對轉(zhuǎn)基因后外源基因表達(dá)情況進(jìn)行監(jiān)測。

第二篇：關(guān)于購買實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀申請報(bào)告

關(guān)于購買實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀申請報(bào)告

尊敬的校領(lǐng)導(dǎo)：

自我校2012年提出“五大工程”以來，人才隊(duì)伍實(shí)力與水平得到顯著提升，同時(shí)我們也清醒地認(rèn)識到現(xiàn)在高校所面臨的生存危機(jī)，應(yīng)對危機(jī)唯有發(fā)展壯大我校的軟實(shí)力：大力發(fā)展特色學(xué)科、特色專業(yè)；大力開發(fā)研究秦巴山區(qū)優(yōu)勢生物資源，立足于秦巴山區(qū)，服務(wù)于全國。然而，我校在科研儀器設(shè)備配置方面還有待提高，我學(xué)科現(xiàn)需購置實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，申購理由如下：

高通量的檢測和定量核酸序列的實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光集團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。廣泛應(yīng)用于腫瘤的分子診斷，新藥篩選，基因表達(dá)研究，轉(zhuǎn)基因研究，單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析，病原體的分子檢測，遺傳分析等。

關(guān)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀功能介紹：我校位于秦巴山區(qū)，秦巴山區(qū)素有“天然藥庫”之稱，有著豐富的生物資源。隨著世界科研水平的發(fā)展，目前我校的儀器設(shè)備已不能滿足科研工作的要求。在對秦巴山區(qū)優(yōu)勢中藥材功能基因的研究中：（1）對功能基因的發(fā)育階段表達(dá)、組織表達(dá)情況分析；（2）檢測功能基因RNAi干擾效率：功能基因的作用研究中，要對功能基因沉默表達(dá)（RNAi）分析，檢測RNAi的干擾效率要用到實(shí)時(shí)熒光定量。（3）對功能基因相關(guān)基因表達(dá)模式分析。

作為一所

院校，擁有一臺性能良好的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，是學(xué)校發(fā)展和從業(yè)教師的需求?？尚行路治觯?/p>

（1）研究功能基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是必不可少的儀器設(shè)備；（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀操作簡單，經(jīng)過簡單培訓(xùn)即可學(xué)會；（3）試劑耗材費(fèi)

（4）應(yīng)用廣泛

科研領(lǐng)域都在用 主要技術(shù)指標(biāo)：

熱循環(huán)系統(tǒng)

新型半導(dǎo)體

96/384孔

可升級選配低密度芯片 光學(xué)系統(tǒng)

氬離子激光器 全波長光柵 冷CCD 掃描模式

全程掃描

軟件系統(tǒng)

Primer Express 3.0探針引物設(shè)計(jì)軟件 SDS 軟件 絕對定量 相對定量 等位基因分析 陰陽性結(jié)果自動(dòng)判斷

反應(yīng)系統(tǒng)

最低可在35分鐘內(nèi)完成PCR實(shí)驗(yàn)

5ul反應(yīng)體積（選配低密度芯片可至1ul）

配套試劑盒

30萬基因表達(dá)試劑盒 200萬SNP試劑盒 可代客定做引物模板 專業(yè)轉(zhuǎn)基因 致病菌篩選試劑盒 主要性能：

全波長光柵分光，添加新染料無需更換濾光片，同時(shí)檢測8種以上熒光染料，最大限度實(shí)現(xiàn)多重定量，SNP分析等應(yīng)用。

完備，多樣，專用的軟件，無需人工計(jì)算，完成定量實(shí)驗(yàn)

多組份熒光校正軟件，一體化硬件設(shè)計(jì)，輔助ROX熒光，保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性和高分辨率（裝機(jī)指標(biāo)，5000和10000達(dá)到2倍的拷貝數(shù)）

齊備的試劑盒 幫助客戶完成高要求的實(shí)驗(yàn)

9、可為客戶提供安裝操作鑒定（IQ/OQ）驗(yàn)證文件服務(wù)，以符合GLP/GMP對生產(chǎn)設(shè)備的要求。

技術(shù)參數(shù)：

（1）色熒光，可用于多重PCR檢測（2）激發(fā)光源壽命

（3）檢測器：

成像系統(tǒng)，無時(shí)間差，保證結(jié)果的準(zhǔn)確（4）溫度控制系統(tǒng)：半導(dǎo)體控溫（5）溫度準(zhǔn)確性≤±0.05℃（6）溫度控制范圍：

（7）動(dòng)力學(xué)線性范圍：

個(gè)數(shù)量級，區(qū)分

拷貝兩倍差異濃度的樣本，其致信度高達(dá)多少99.7%（8）支持ROX或其它染料用做參比熒光，同時(shí)，軟件支持無參比染料設(shè)置（9）試劑開放，耗材開放，（10）儀器性能有原廠裝機(jī)試劑盒驗(yàn)證（11）靈敏度：

（12）激發(fā)/發(fā)射濾光片：是否支持客戶自行添加染料。（13）可檢測450～750nm連續(xù)波長

（14）數(shù)據(jù)分析：可同時(shí)分析

色熒光PCR數(shù)據(jù)；有無絕對定量、相對定量功能；可否選擇多個(gè)看家基因進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；可否自動(dòng)根據(jù)擴(kuò)增效率對數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理，得到更加準(zhǔn)確可靠的結(jié)果；軟件支持分析無限制數(shù)量的數(shù)據(jù)文件，增大反應(yīng)通量；具有等位基因、熔解曲線分析功能；軟件支持進(jìn)行加樣重復(fù)及生物學(xué)重復(fù)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)。

（15）配置專業(yè)引物探針設(shè)計(jì)軟件，用于基因引物探針設(shè)計(jì)，并且保證退火溫度一致性。

第三篇：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測限的統(tǒng)計(jì)推斷

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測限的統(tǒng)計(jì)推斷

來源：中國論文下載中心

作者：王文清，王昌富，袁琳，彭長華，常武

【摘要】 檢測限是檢測方法的重要性能指標(biāo)，用Poisson分布的概率函數(shù)分式計(jì)算一次抽樣檢測出現(xiàn)的結(jié)果推論總體出現(xiàn)該結(jié)果的概率。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQPCR)檢測乙型肝炎病毒DNA結(jié)果為例，計(jì)算可知，一次抽樣反應(yīng)管的檢測結(jié)果≥4時(shí)，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(P<0.05)。因而檢測血清中病原體時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)管中的檢測限是4拷貝/ul計(jì)算也可知，1拷貝/ul表示一次抽樣的結(jié)果為0的概率可達(dá)0.368，結(jié)果在0拷貝/ul～4拷貝/ul的概率為0.996，而1000拷貝/ml表示一次抽樣結(jié)果為0的概率為0。結(jié)果在905拷貝/ml～1 095拷貝/ml的概率為0.997；而100 000拷貝/L表示一次抽樣結(jié)果在997 000拷貝/L～1 003 000拷貝/L的概率為0.997。抽樣單位ul不能隨意放大為ml甚至L。

【關(guān)鍵詞】 實(shí)時(shí)熒光定量PCR；檢測限；統(tǒng)計(jì)推斷

Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Realtime Fluorescence Quantitative PCR

Abstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in Realtime Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results≥4,significance of difference(P<0.05)could be deduced between population and blank.So limit of quantitation is 4 copies/ul denoting 0 in one sample drawing is 0,and Possibility of results between 905 copies/ml to 1095 copies/ml is 0.997.Possibility of 100 000 copies/L denoting results between 997 000 copies/L to 1 003 000 copies/L in one sample drawing is 0.997.Sample drawing unit ul could not be replace by ml or L.Key words：Realtime Fluorescence quantitative PCR；Limit of quantitation;Statistical conclusion

檢測限是檢測方法的重要性能指標(biāo)，只有在檢測報(bào)告中明確表達(dá)了檢測方法的檢測限，該檢測報(bào)告在各實(shí)驗(yàn)間及同一項(xiàng)目的各種檢測方法間才可進(jìn)行比較。能檢測到的最低分析物濃度為檢測系統(tǒng)的檢測限。當(dāng)前，檢測限術(shù)語混亂，如：靈敏度(sensitivity)、分析靈敏度(analllytical sensitivity)、定量限度(limit of quantitqtion)等［1］。每個(gè)詞語的實(shí)際含義中包含有各自的實(shí)驗(yàn)方式、數(shù)據(jù)處理方式及由數(shù)據(jù)作出的推論等。我們采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，以期得到一致的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQPCR)檢測限，現(xiàn)介紹如下。

文獻(xiàn)中FQPCR檢測限的描述

檢測乙型肝炎病毒DNA的文獻(xiàn)中檢測限使用了“最低檢出量”［2，3］、靈敏度［5～7］等術(shù)語，它等于已知的高拷貝HBV DNA血清10倍系列稀釋后能檢測到擴(kuò)增曲線的最大稀釋倍數(shù)管濃度。表述有：陰性HBV DNA≤106拷貝/升［4］；熒光定量PCR法檢測靈敏度102拷貝/ml［5］、104拷貝/ml［6］、8.6×102拷貝/ml［7］；HCⅡ法檢測靈敏度1.4×105拷貝/ml［7］；103 Eq/ml理論值時(shí)到達(dá)檢測極限［3］；PCRFP檢測HBV DNA的最低檢測出量1×101拷貝［2］；bDNA在105 Eq/ml時(shí)到達(dá)檢測極限［3］。以上檢測限術(shù)語各不相同，且同一方法檢測HBV DNA在上述各實(shí)驗(yàn)室發(fā)出同樣的“HBV DNA低于檢測下限”的報(bào)告時(shí)其實(shí)際HBV DNA拷貝數(shù)相差可達(dá)100倍。

FQPCR檢測過程簡介

以測定血清乙型肝炎病毒DNA為例：將40 μl血清樣本加40 μl DNA提取液處理后，將其中2 μl（相當(dāng)于1 μl血清）加入主反應(yīng)液（含DNA引物、酶、DNA構(gòu)件分子dNTP等）管中，在自動(dòng)熱循環(huán)上進(jìn)行溫度循環(huán)，自動(dòng)熱循環(huán)儀記錄每一反應(yīng)管在每一次溫度循環(huán)的熒光強(qiáng)度，記30次溫度循環(huán)后結(jié)束。在PCR循環(huán)過程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值（Cyclethreshold),它與反應(yīng)管中DNA起始拷貝數(shù)的對數(shù)值（lgN)呈非常顯著的直線相關(guān)關(guān)系。自動(dòng)熱循環(huán)儀對標(biāo)準(zhǔn)樣品自動(dòng)生成一條Ct值對于起始拷貝數(shù)值（lgN)的工作曲線，并通過該工作曲線來確定待測未知樣品反應(yīng)管的起始拷貝數(shù)（N）。當(dāng)30次循環(huán)后某一待測管仍檢測不到高于基線水平的熒光信號時(shí)，儀器默認(rèn)Ct值為30，不計(jì)算起始拷貝。確定FQPCR檢測限的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理

如果被檢物的含量和檢測方法的空白響應(yīng)量的波動(dòng)服從正態(tài)分布規(guī)律，則檢測限可用多次檢測空白的方法來確定?？尚畔逓?5%時(shí)檢測限＝x空白+2.s空白；可信限為99.7%時(shí)檢測限=x空白+3.s空白。這是目前多數(shù)檢測限的確定方法。對核酸檢測方法的檢測限的理解可能與此有差別，但是原理應(yīng)是一致的［1］，F(xiàn)QPCR檢測限也應(yīng)是推論總體與空白有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的最小抽樣結(jié)果。

FQPCR檢測限的統(tǒng)計(jì)推斷

假設(shè)病原體在血液等體液中的分布是隨機(jī)的，則單位體積中(如1.0 μl)病原顆粒數(shù)的分布服從Poisson分布。以Poisson分布的概率函數(shù)公式計(jì)算一次抽樣檢測出現(xiàn)的結(jié)果推論總體概率。從理論上來說，使用PCR測定技術(shù)測定病原體核酸序列的量可低至1個(gè)拷貝［2］。例如：血清標(biāo)本中加入等量的DNA提取液，于離心管中煮沸，4 ℃放置，離心，吸取上清液2 μl作模板 進(jìn)行擴(kuò)增檢測(2 μl上清液相當(dāng)于抽樣1 μl血清)［2］，其中至少有1個(gè)拷貝的HBV DNA才能有典型擴(kuò)增反應(yīng)，這時(shí)檢測結(jié)果是1拷貝/μl。由Poisson分布的概率函數(shù)公式可計(jì)算出1次抽樣檢測結(jié)果出現(xiàn)0時(shí)，推斷總體為1～9的概率見表1。

表1 總體為1～9時(shí)抽樣為0的概率及總體（略）

在FQPCR檢測HBV DNA中，當(dāng)30次循環(huán)后某一待測管仍檢測不到高于基線水平的熒光信號(即當(dāng)Ct≥30)，反應(yīng)管檢測結(jié)果為0時(shí)，推論總體拷貝數(shù)為1～9的概率之和>0.581 92，總體為其他的概率之和<0.5(此時(shí)報(bào)告0拷貝的可信限度低于50%)。總體為1時(shí)一次抽樣結(jié)果分別為1～9時(shí)的概率見表1。當(dāng)一次抽樣結(jié)果≥4時(shí)，推論總體為1的概率≤0.015 33，所以對于病原體的檢測，一次抽樣反應(yīng)管檢測結(jié)果≥4拷貝時(shí)，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性(P<0.05)。因而上述檢測血清中病原體時(shí)一次抽樣反應(yīng)管的檢測限是4拷貝/μl。當(dāng)總體為1、2、3時(shí)一次抽樣結(jié)果為0的概率分別是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室間質(zhì)量評價(jià)樣本靶值選擇1拷貝/μl、2拷貝/μl、3拷貝/μl時(shí)，無論實(shí)驗(yàn)室實(shí)際檢測質(zhì)量如何高，都將有36.79%、13.53%、4.98%的實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果為0而被判為不符合［按靶值的對數(shù)值GM±0.5 log(10)［9］作為可接受的定量范圍］。2005年衛(wèi)生部室間質(zhì)量評價(jià)中靶值為1.51拷貝數(shù)/μl的樣本符合率僅35.2%；Mancini C 等［9］報(bào)道一些實(shí)驗(yàn)室對檢測下限附近的樣本(3.00 log IU/ml)準(zhǔn)確定量有困難；Raggi CC等［10］也報(bào)道28.6%的實(shí)驗(yàn)室(12/42)對最低濃度的樣本不能定量。這些都是因?yàn)闄z測下限附近的樣本一次抽樣結(jié)果為0的概率太大所致，對此我們將另文詳細(xì)討論。造成上述文獻(xiàn)中檢測限差異較大的可能原因如下：用于10倍系列稀釋的已知高拷貝HBV DNA血清本身拷貝數(shù)的差異；對檢測限的理解差異，由一次抽樣沒能檢測到典型擴(kuò)增的稀釋血清管推論總體濃度為0的可信度太低(<50%)；抽樣單位的任意放大：在上述HBV DNA檢測中，抽樣單位是1 μl血清［如血清前處理過程中有抽提(濃縮)過程，取2 μl上清液相當(dāng)于實(shí)際含12.5 μl血清，則抽樣單位也只是12.5 μl］，而報(bào)告結(jié)果的單位是ml甚至L。當(dāng)總體為1拷貝/μl時(shí)表示一次抽樣結(jié)果為0的概率達(dá)0.368，結(jié)果在0拷貝/μl～4拷貝/μl的概率為0.996；而總體為1 000拷貝/ml時(shí)表示一次抽樣結(jié)果為0的概率為0，結(jié)果在905拷貝/ml～1 095拷貝/ml的概率為0.997(Poisson分布總體>50時(shí)近似正態(tài)分布，范圍是X±uα*√X，可信限為99.7%時(shí)uα=3);總體為100 000拷貝/L時(shí)表示一次抽樣結(jié)果在997 000拷貝/L～1 003 000拷貝/L的概率為0.997。文中推理以HBVDNA的FQPCR檢測為例，其他病源體核酸的FQPCR檢測也與其相同，檢測限是抽樣反應(yīng)管的檢測限4拷貝/反應(yīng)管；如反應(yīng)管中加入模板量相當(dāng)于12.5 μl血清則檢測限相當(dāng)于0.32拷貝/ μl。此推斷僅是針對FQPCR技術(shù)本身的檢測限度，未就臨床上有意義的最小病源體核酸的拷貝數(shù)進(jìn)行討論。【參考文獻(xiàn)】

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第四篇：豬源TTV論文：豬源TTV ORF 熒光定量PCR 多克隆抗體

豬源TTV論文：豬源TTV轉(zhuǎn)錄本的鑒定及熒光定量PCR檢測方法的建立

【中文摘要】TTV(Torque teno virus)屬于環(huán)病毒科指環(huán)病毒屬成員,為單股、環(huán)狀、負(fù)鏈的DNA病毒,正20面體對稱結(jié)構(gòu),無囊膜。人源TTV基因組大小約為3900bp,豬源TTV約2700bp。到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)豬源TTV與任何一種豬病有必然聯(lián)系,但是與一些豬病的發(fā)生有一定的相關(guān)性,如斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥、豬皮炎腎炎綜合癥等,因此,研究豬源TTV對于預(yù)防其潛在的致病性有重要意義。

1、由于還沒有找到適合在體外培養(yǎng)TTV的細(xì)胞系,其基因組結(jié)構(gòu)及復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)制尚不清楚。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含有TTV2基因組三種不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒pSK+1TTV2(含有1個(gè)TTV2基因組拷貝的pSK載體)、pSK+1.3TTV2(含有1.3個(gè)TTV2基因組拷貝的pSK載體)、pSK+2TTV2(含有2個(gè)TTV2基因組拷貝的pSK載體),將其轉(zhuǎn)染至張氏肝細(xì)胞,48小時(shí)后,提取總的RNA,用DpnI消化其中可能存在的DNA,然后利用預(yù)測的閱讀框ORF1、ORF2、ORF3的擴(kuò)增引物,確證其中的DNA已經(jīng)消除干凈。RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后,用這三對引物擴(kuò)增基因片段,經(jīng)克隆和測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn):ORF1確實(shí)發(fā)生了轉(zhuǎn)錄,但轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物并非O...【英文摘要】TTV(Torque teno virus), a small, non-enveloped virus, has a single-stranded circular DNA genome and is currently classified into the family Anelloviridae.Viral DNA of both porcine TTV species(TTV1 and TTV2)has a high

prevalence in both healthy ans diseased pigs worldwide and multiple infection of porcine TTV species with distinct genotypes or subtypes of the same species has been documented in China.Human TTV genome has 3900bp and porcine TTV 2700bp.So far, no porcine diseases have been found a reason...【關(guān)鍵詞】豬源TTV ORF 熒光定量PCR 多克隆抗體

【英文關(guān)鍵詞】porcine TTV ORF fluorescence quantitative PCR polyclonal antibody 【索購全文】聯(lián)系Q1：138113721 Q2：139938848 同時(shí)提供論文寫作一對一輔導(dǎo)和論文發(fā)表服務(wù).保過包發(fā)

【目錄】豬源TTV轉(zhuǎn)錄本的鑒定及熒光定量PCR檢測方法的建立摘要6-817-29

Abstract8-9

第一章 緒論

1.2 人TTV 的研

1.2.2 1.1 TTV 的發(fā)現(xiàn)及概況17-19究進(jìn)展19-251.2.1 人TTV 流行情況的調(diào)查19人TTV 的分子生物學(xué)特征19-242

41.2.3 人TTV 的致病性

1.3 豬源TTV 研1.2.4 人TTV 感染的診斷24-25究現(xiàn)狀25-272

51.3.1 豬源TTV 的流行病學(xué)調(diào)查

1.3.3 豬源TTV 1.3.2 豬源TTV 的基因型25-26

26的分子生物學(xué)特征26-27

1.3.4 豬源TTV 的致病性

1.3.6 TTV 研究第二章 豬源TTV

2.1.1 質(zhì)1.3.5 豬源TTV 的檢測方法

1.4 目的和意義的前景展望2727-29轉(zhuǎn)錄本的鑒定29-472.1 材料與方法29-37

粒、菌株和細(xì)胞2929-3030

2.1.2 試驗(yàn)試劑和主要儀器設(shè)備2.1.3 CaCl_2 法制備大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞2.1.4 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞30

312.1.6 陽性質(zhì)粒的酶切鑒定

2.1.8 陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)

2.1.5 小量制備陽性質(zhì)粒312.1.7 大量制備陽性質(zhì)粒31-33

33-3

42.1.9 提取總?cè)局翉埵细渭?xì)胞系RNA34-3535段362.1.10 總RNA 中殘余DNA 的檢測

2.1.12 PCR 擴(kuò)增目的基因片

2.1.14 目的基因2.2.1 含TTV2 2.1.11 反轉(zhuǎn)錄35-362.1.13 PCR 產(chǎn)物的回收36-37

2.2 結(jié)果37-45片段的克隆與測序FJ2 基因組不同拷貝數(shù)的三種質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果37-382.2.2 含TTV2 FJ2 基因組不同拷貝數(shù)的三種質(zhì)粒的大

2.2.3 總RNA 反轉(zhuǎn)錄后目的基因的擴(kuò)增結(jié)

2.3 討論量抽提結(jié)果38-39果39-4145-4747-614747-48482.2.4 測序結(jié)果分析41-45第三章 豬源TTV2 ORF1 和ORF2 的多克隆抗體制備3.1 材料與方法47-543.1.2 試劑與儀器47

3.1.1 質(zhì)粒、菌株與載體3.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3.1.4 TSS 法制備BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞3.1.5 ORF1 全長的體外表達(dá)48-49

3.1.6 ORF1 的3.1.7 B 細(xì)胞表位富集區(qū)和ORF2 全長的體外表達(dá)49-53ORF1a 和ORF2 的多克隆抗體的制備53-54ORF2 多克隆抗體的ELISA 效價(jià)測定54

3.1.8 ORF1a 和3.2 結(jié)果

54-593.2.1 ORF1 的抗原性分析結(jié)果54-553.2.2 ORF1a 和ORF2 基因的PCR 擴(kuò)增5555-5656-5959

3.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定3.2.4 ORF1a 和ORF2 重組蛋白的表達(dá)與純化3.2.5 ORF1a 和ORF2 多克隆抗體的ELISA 效價(jià)測定3.3 討論59-61

第四章 豬源TTV 熒光定量PCR 檢4.1 材料與方法61-644.1.2 試劑和儀器61-62

4.1.1 病4.1.3 引物

4.1.5 測方法的建立61-69料與核酸樣品61和探針設(shè)計(jì)62陽性標(biāo)準(zhǔn)模板的制備63636464-65驗(yàn)結(jié)果67結(jié)果67-6869-7081

4.1.4 病毒基因組DNA 的提取6262-63

4.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

4.1.8 敏感性試驗(yàn)4.1.7 特異性試驗(yàn)634.1.9 重復(fù)性試驗(yàn)63-644.2 結(jié)果64-68

4.1.10 病料的的檢測

4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

4.2.3 敏感性試4.2.5 樣品檢測4.2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果65-674.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果4.3 討論68-69參考文獻(xiàn)70-80

第五章 全文結(jié)論 致謝80-81

作者簡歷

第五篇：熒光PCR檢測原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，利用熒光信號來實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板濃度進(jìn)行定量分析。其特點(diǎn)有：

(1)用產(chǎn)生熒光信號的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測，避免終點(diǎn)定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。

(2)熒光信號通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測物等方法獲得，打打提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性。Real-time O-PCR可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測、單核苷酸多態(tài)性的測定、細(xì)胞因子的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長。儀器可以自動(dòng)檢出，利用熒光信號積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，在PCR循環(huán)中，測量的信號將作為熒光閾值的坐標(biāo)。并且引入一個(gè)——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測到得熒光信號所需的最小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過程中熒光信號由本底開始進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號的平均信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測出的熒光信號是一個(gè)可信的信號，可以用于定義一個(gè)樣本的Ct值。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對方程式。

方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個(gè)高相關(guān)系數(shù)（R2＞0.99），這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動(dòng)地計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用 1.基因工程研究領(lǐng)域

① 基因表達(dá)研究：對β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進(jìn)行檢測，其結(jié)果特異性強(qiáng)、定量準(zhǔn)確，為了解β地中海貧血的分子病理機(jī)制及其臨床診斷提供了可靠的檢測數(shù)據(jù)。

② 轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)閾值，擴(kuò)增一個(gè)轉(zhuǎn)移后的基因和一個(gè)對照基因，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。該方法為45個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測，同型結(jié)合的異質(zhì)接合動(dòng)物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。這項(xiàng)技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中將有很大的用途。③ 單核苷酸多態(tài)性（SNP）及突變分析：實(shí)時(shí)熒光定量PCR一個(gè)誘人的應(yīng)用前景是用于檢測基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性。基因突變基于兩條探針，一條探針橫跨突變點(diǎn)，另一條為錨定探針，與無突變位點(diǎn)的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如靶序列中無突變，探針雜交便完全配對，如有突變，則探針與靶序列不完全配對，會降低雜交體得穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。2.醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域

① 病原體檢測：由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可靠性和重復(fù)性好，并且操作簡便、快速、結(jié)果判斷客觀，目前，人們用此方法對人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、結(jié)核桿菌、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原體的檢測。熒光定量PCR問世后的幾年中，積累了大量有關(guān)病原體核酸量與感染性疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后之間關(guān)系的資料，這些研究資料不斷豐富，將形成感染性疾病的臨床分子診斷標(biāo)準(zhǔn)。

② 藥物療效考核：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測臨床樣品中與抗藥性相關(guān)的基因的表達(dá)。結(jié)果證明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)是定量檢測抗藥基因表達(dá)的可靠方法，應(yīng)用這種技術(shù)可以預(yù)測化療將引起的反應(yīng)。

③ 腫瘤基因檢測：腫瘤的本質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)基因發(fā)生了變化，是一種多基因異常的疾病，這些異常變化用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法都可以檢測出來。

目前用此方法進(jìn)行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細(xì)胞性白血病bcr/abl融合基因、腫瘤MDRI基因、白血病WTI基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達(dá)檢測。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)。熒光定量PCR技術(shù)將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。3.其他領(lǐng)域

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對免疫組分進(jìn)行分析是其應(yīng)用的重要方面。

所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。檢測方法

1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖

PCR產(chǎn)物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性）2.TaqMan探針法：

探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。服務(wù)流程

1.客戶認(rèn)真寫好訂單，提供待檢基因相關(guān)信息； 2.簽訂技術(shù)服務(wù)合同，支付預(yù)付款（30-50%)；

3.設(shè)計(jì)合成定量PCR引物（或客戶提供文獻(xiàn)引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反轉(zhuǎn)錄；

5.PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)，主要檢測引物的特異性和擴(kuò)增效率； 6.正式定量實(shí)驗(yàn)：對所有樣品上機(jī)檢測； 7.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)分析，形成報(bào)告。收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)

優(yōu)惠包干價(jià)：120元/樣/基因（SYBRgreenI法，相對定量）

（含RNA提取，反轉(zhuǎn)錄，引物合成費(fèi)用，上機(jī)測試費(fèi)用（3個(gè)重復(fù)）；一個(gè)內(nèi)參免費(fèi)（內(nèi)參3個(gè)重復(fù)）Ct值（Cycle threshold，循環(huán)閾值）的含義為：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

（如圖1所示）。

1.熒光閾值（threshold）的設(shè)定

PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的缺省（默認(rèn)）設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15 2.Ct值與起始模板的關(guān)系

每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，公式如下。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。

起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下： 1.TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的首選技術(shù)平臺。

2.SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。3.分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光。1．傳統(tǒng)定量PCR方法簡介

1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。2．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用

由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測，即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時(shí)，檢測重現(xiàn)性極差。同一個(gè)模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。3．內(nèi)標(biāo)對定量PCR的影響

若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時(shí)，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)。也正是這個(gè)原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo)，但仍然只是一種半定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的： 1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。各級各類醫(yī)療機(jī)構(gòu)、大學(xué)及研究所、CDC、檢驗(yàn)檢疫局、獸醫(yī)站、食品企業(yè)及乳品廠等。

由于qPCR是實(shí)時(shí)定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學(xué)發(fā)光、時(shí)間分辨、蛋白芯片等免疫學(xué)方法更具獨(dú)到優(yōu)勢。