第一篇：PCR技術(shù)將在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域迎來新契機(jī)

PCR技術(shù)將在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域迎來新契機(jī)

來源：廣東醫(yī)學(xué)2010年2月第31卷第3期

周高英，葉鋒

北京鑫諾美迪基因檢測技術(shù)有限公司(北京100176)

1985年，Mullis發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)在醫(yī)學(xué)界掀起了基因診斷技術(shù)的熱潮，PCR技術(shù)憑借快速、簡便、靈敏等優(yōu)點(diǎn)以驚人的速度廣泛應(yīng)用于臨床基因診斷等領(lǐng)域，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。但十多年的臨床實(shí)踐表明，PCR技術(shù)本身在工作流程標(biāo)準(zhǔn)化、PCR儀器標(biāo)準(zhǔn)化和PCR產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化等方面還存在著若干弊端，這導(dǎo)致檢測結(jié)果上的差異，這已經(jīng)成為當(dāng)前困擾臨床醫(yī)師、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員以及患者的普遍問題。本文將從PCR技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展回顧、診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)化以及PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域的新契機(jī)等3個(gè)方面進(jìn)行闡述。PCR技術(shù)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展歷史回顧

1985年，美國MULLIS等[1]發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)，使人們夢寐以求的體外無限擴(kuò)增核酸片段的愿望成為現(xiàn)實(shí)，并依靠此項(xiàng)技術(shù)獲得1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1989年，Hoffmann—La Roche公司和Cetus公司開始將PCR技術(shù)應(yīng)用于臨床診斷領(lǐng)域。1996年，美國Applied Biosystems公司推出全球首款實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，并在歐美各國悄然興起，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染、自動化程度高等特點(diǎn)，因而在各級臨床實(shí)驗(yàn)室得以迅速推廣[3]。PCR技術(shù)于90年代中期在國內(nèi)全面展開臨床應(yīng)用工作，但是由于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)本身存在著許多局限性(如產(chǎn)物不能準(zhǔn)確定量、容易交叉污染、導(dǎo)致假陽性等)，在1998年遭到了衛(wèi)生部門的明令禁止。此后，由于熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)以及國內(nèi)外學(xué)者的不懈努力，政府相關(guān)部門于2002年頒布《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》和《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》等一系列準(zhǔn)入文件，從制度上規(guī)范了PCR實(shí)驗(yàn)室運(yùn)作，建立起有效的質(zhì)量保障體系[4]。目前，已有多家國內(nèi)外生產(chǎn)廠商涉足研發(fā)生產(chǎn)適用于臨床診斷的PCR檢測試劑盒，并在PCR產(chǎn)品市場中占得先機(jī)。經(jīng)過多年的發(fā)展和完善，熒光定量PCR技術(shù)在國內(nèi)科研、檢測和診斷領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，無論是產(chǎn)品種類、產(chǎn)品質(zhì)量、技術(shù)優(yōu)勢和市場規(guī)模均可與國外廠家相媲美，另外，由于試劑價(jià)格遠(yuǎn)低于進(jìn)口產(chǎn)品，國產(chǎn)PCR診斷試劑占領(lǐng)了絕大部分國內(nèi)市場份額。臨床PCR診斷試劑產(chǎn)品的弊端

臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化并非單一因素，它由諸多關(guān)鍵性環(huán)節(jié)組成，其中工作流程標(biāo)準(zhǔn)化、PCR儀器標(biāo)準(zhǔn)化和PCR試劑產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化是PCR臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化的核心內(nèi)容。目前國家頒布的《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》和《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》等一系列準(zhǔn)入文件從根本上規(guī)范了工作流程標(biāo)準(zhǔn)化問題；對PCR儀器標(biāo)準(zhǔn)化而言，一些進(jìn)口PCR儀器依靠高度的穩(wěn)定性、可重復(fù)性和高效的數(shù)據(jù)分析軟件，已實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；由于價(jià)格占優(yōu)，國產(chǎn)PCR診斷試劑占據(jù)了國內(nèi)的大部分市場，但是由于不同的廠家缺乏統(tǒng)一的檢查標(biāo)準(zhǔn)，往往使得同一實(shí)驗(yàn)室不同檢測批次間或不同實(shí)驗(yàn)室對同一標(biāo)本檢測間結(jié)果存在較大差異。這已經(jīng)成為困擾臨床醫(yī)生、患者以及實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員的普遍問題，這也是當(dāng)前不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果有條件互認(rèn)的一個(gè)巨大障礙。目前對于PCR診斷產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化主要存在以下4個(gè)問題：

2.1 定量的目的和意義不明 除少數(shù)種類試劑外，目前已上市的大部分試劑盒并不是報(bào)告原始樣本中病原體的濃度，而是核酸提取后產(chǎn)物的靶基因濃度，并不能真正反映原取材樣本的靶基因的真正含量。選擇合適的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本是減少實(shí)驗(yàn)誤差的第一個(gè)過程，然而不同實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)樣品并不具有通用性，很難確保實(shí)驗(yàn)樣品的均一性。在人體，血液樣本容易收集、相對恒定、能確保不同樣本間的比較，對血液中病原體進(jìn)行定量檢測更精確且有實(shí)際意義。然而對于如尿液、痰液、淋巴液、拭子、組織塊等樣本，由于采樣時(shí)患者的生理狀況和取樣部位等因素，雖然用物理、化學(xué)或酶的方法對標(biāo)本進(jìn)行了處理，但仍然無法做到均一性

和可比性，因此其所謂的定量僅僅是針對核酸提取物中靶基因定量。

2.2 定量的依據(jù)不妥據(jù)調(diào)查，目前市場上PCR定量試劑無一例外都采用質(zhì)粒做為試劑盒定量標(biāo)準(zhǔn)。由于質(zhì)粒是一種人為構(gòu)建的脫氧核糖核酸載體，環(huán)狀物理構(gòu)象存在特殊性，和線性的基因組DNA相比，PCR擴(kuò)增效率上具有差別。因此，先進(jìn)行質(zhì)粒拷貝數(shù)定值，再通過比較各個(gè)樣品擴(kuò)增曲線Ct值來獲得病原體基因組DNA的濃度，這樣的流程缺乏嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪壿嬕罁?jù)。有些廠家甚至用質(zhì)粒標(biāo)定RNA(有的病毒遺傳物質(zhì)為RNA)拷貝數(shù)，就更加無據(jù)可依。同時(shí)，采用與待檢樣本性質(zhì)差異很大的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品或質(zhì)控品，也無法回避檢測過程的基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 定量的準(zhǔn)確性不能保證核酸提?。号R床樣本的多樣性給核酸的提取和純化提出了新的問題，目前提取方法有手工提取、柱提取、磁珠提取等，不同的提取方法各有其的優(yōu)勢，因此很難建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的臨床標(biāo)本制作處理過程，這對于樣本的預(yù)處理、核酸的提取、提取的效率評估，也是核酸純化方法標(biāo)準(zhǔn)化的重要指標(biāo)。內(nèi)標(biāo)選擇：目前多數(shù)PCR試劑生產(chǎn)廠商并沒有引入質(zhì)量控制措施(如內(nèi)標(biāo))和校正品，這對于病原體數(shù)量準(zhǔn)確定量就無從談起。雖然醫(yī)院對于某一兩次檢測值的精確度要求不是太高，但對于那些引起重大疾病的病原體，如乙型肝炎病毒載量的長期監(jiān)控，準(zhǔn)確量化就成為臨床十分迫切的要求，這也是現(xiàn)階段體外診斷試劑生產(chǎn)廠家亟待突破的瓶頸。PCR實(shí)驗(yàn)過程：不同的PCR儀器、不同廠家的試劑、不同的操作者也是造成實(shí)驗(yàn)定量不準(zhǔn)確的重要指標(biāo)之一。

2.4 試劑缺乏穩(wěn)定性穩(wěn)定性是體外診斷試劑必須具有的基本屬性，是確保產(chǎn)品在使用過程中安全有效的重要指標(biāo)。通過對不同條件下產(chǎn)品的主要質(zhì)量指標(biāo)隨時(shí)間變化情況的檢測，可以為產(chǎn)品的保存條件和有效期的確定提供依據(jù)。而試劑方法的標(biāo)準(zhǔn)化以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用是保證實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的前提，在日常檢驗(yàn)工作中應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，將極大地改善不同實(shí)驗(yàn)室間檢驗(yàn)結(jié)果的可比性，從而逐步實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室間檢驗(yàn)結(jié)果有條件的互認(rèn)。PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域的新契機(jī)

分子生物學(xué)發(fā)展至今，人類基因組的草圖早已繪就[6]，許多信號傳導(dǎo)通道也已闡明[7]，PCR技術(shù)已經(jīng)成為分子生物學(xué)十分便利的工具。然而談到與臨床檢驗(yàn)相結(jié)合，仍有許多待改進(jìn)的地方，未來的PCR臨床發(fā)展之路，需要更加緊密地結(jié)合臨床、體外診斷(IVD)基本要求和新材料、自動化技術(shù)等研究領(lǐng)域的基礎(chǔ)理論，并在產(chǎn)品設(shè)計(jì)、制造工藝上取得新的突破，只有這樣方能有效彌補(bǔ)目前PCR技術(shù)存在的缺陷，進(jìn)一步拓寬這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用空間。

3.1 標(biāo)準(zhǔn)化首先，PCR技術(shù)面臨的歷史任務(wù)是解決標(biāo)準(zhǔn)化問題。應(yīng)該說，定量這一概念的提出為PCR標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程邁出了第一步，但這還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。標(biāo)準(zhǔn)化不僅意味著統(tǒng)一的量化形式，更重要的是建立固定、可重復(fù)的流程，嚴(yán)謹(jǐn)完備的質(zhì)量控制體系，一致且具可比性的評估方法。滿足這些條件，機(jī)器自動化無疑是最好的選擇。

3.2 自動化近2O年，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)以驚人的速度和規(guī)模獲得了巨大的發(fā)展，其中自動化的迅速發(fā)展尤為迅猛，它將傳統(tǒng)的人工檢測手段提高到自動化檢測的新水平，為精確、微量、快速和組合檢驗(yàn)提供了有力的保障，自動化已成為臨床檢驗(yàn)的趨勢。PCR擴(kuò)增的自動化早已實(shí)現(xiàn)，因而核酸提取純化的自動化就顯得更為重要。近年來各儀器廠商紛紛推出磁珠法提取儀器，如Roche MagNA Pure LC，利用電磁效應(yīng)以及納米級的磁性顆粒進(jìn)行核酸的分離純化，其提取效率相比之前的自動化系統(tǒng)有了明顯提高[8]。核酸提取純化與PCR擴(kuò)增聯(lián)為一體的自動化檢測系統(tǒng)則是臨床診斷的趨勢，如Handy-Lab公司的Jaguar全自動檢測系統(tǒng)。儀器的自動化是臨床PCR標(biāo)準(zhǔn)化的最佳選擇，自動化程度越高，標(biāo)準(zhǔn)化越容易實(shí)現(xiàn)。雖然目前這些儀器以及配套耗材的價(jià)格偏高，但并不影響各大醫(yī)院對這些新生技術(shù)平臺的接納。近年來，政府對重大傳染病(如乙肝、丙肝、結(jié)核等)項(xiàng)目予以資金上的支持，旨在加強(qiáng)這些重大傳染病的監(jiān)控與防治。目前這些儀器設(shè)備已進(jìn)入醫(yī)院和院方檢驗(yàn)的需求進(jìn)一步磨合，加上生產(chǎn)成本平攤之后，完全取代人工操作的情景必將成為現(xiàn)實(shí)。

3.3 高通量(1)絕對通量的提高。過去PCR 由于通量不高而一直受人詬病，不久前挪威公司DiaGenic聯(lián)合關(guān)國ABI公司開發(fā)出類似普通生物芯片的Taqman微量液體反應(yīng)板，讓人們看到了PCR微型化并實(shí)現(xiàn)高通量的希望[9-10]。該儀器含有384孔獨(dú)立反應(yīng)體系，具有良好的靈敏度、特異性和寬泛的動力學(xué)范圍。

在新的技術(shù)平臺下，精細(xì)繁瑣PCR加樣的工作將完全由儀器取代，精密度進(jìn)一步得到改善。另外，新的加樣方式進(jìn)一步微縮反應(yīng)體系，1塊普通的PCR反應(yīng)板便能同時(shí)進(jìn)行上萬個(gè)反應(yīng)，1次即能檢遍人體內(nèi)的多種基因的表達(dá)情況。Abgene公司推出的水浴熱循環(huán)儀PCR一次可完成24塊板(96孔、384孔、1 536孔)的PCR，最大通量1次測序反應(yīng)可達(dá)到24×1 536=36 864個(gè)樣本，真正實(shí)現(xiàn)了儀器的高通量。(2)相對通量的提高。相比于那些體積大的高通量儀器，臨床實(shí)驗(yàn)室更需要一些系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、體積小、容易實(shí)現(xiàn)自動化操作、分析通量高的儀器。如ABI公司推出的StepOnePlus采用了獨(dú)特的的VerriFlexTM 加熱模塊，它具有6個(gè)獨(dú)立控制的peltier加熱塊，相當(dāng)于6臺PCR，為具有優(yōu)化得到的有不同的退火溫度的引物和探針的用戶提供了操作的靈活性。

3.4 PCR技術(shù)的發(fā)展擴(kuò)大了臨床應(yīng)用(1)應(yīng)用種類和范圍擴(kuò)展。受益于生物信息學(xué)迅速發(fā)展，PCR檢測的種類和范圍也在日漸擴(kuò)大，從一開始純粹檢測人體中的感染源，到現(xiàn)在檢測各種基因的突變?nèi)笔?，判斷病原體的耐藥性或人體對于某些疾病的易感性，從而實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥和治療[11]。目前已在遺傳病的產(chǎn)前篩查、致病病原體的檢測、癌基因的檢測和診斷、DNA指紋、個(gè)體識別、親子關(guān)系鑒別及法醫(yī)物證、動植物檢疫等方面展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。(2)結(jié)合其他分子生物學(xué)技術(shù)擴(kuò)展。近十年來，PCR技術(shù)衍生出許多精細(xì)分支，它與免疫學(xué)方法、核酸雜交以及測序技術(shù)的結(jié)合大大豐富了分子生物學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域，目前眾多PCR衍生技術(shù)和相關(guān)技術(shù)已應(yīng)運(yùn)而生，并在臨床上得到廣泛的應(yīng)用，如TaqMan MGB探針技術(shù)使得單純使用PCR技術(shù)對單個(gè)堿基的突變進(jìn)行檢測成為可能，在臨床上可以對疾病相關(guān)位點(diǎn)(如耐藥位點(diǎn))進(jìn)行檢測；PCR結(jié)合測序技術(shù)，測序技術(shù)是在產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的基礎(chǔ)上，一次能獲得更多的序列信息，被視為核酸序列研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”，特別適用于多個(gè)疾病相關(guān)位點(diǎn)的檢測(如乙肝病毒P區(qū)耐藥位點(diǎn)檢測、EGFR、KRAS等靶向藥物耐藥突變檢測)；單堿基延伸技術(shù)(single base ex-tension，SBE)，該技術(shù)可對突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，這是很多高通量SNP分型技術(shù)的基礎(chǔ)。高通量的SNP分型在臨床上適用于大量標(biāo)本的快速檢測，如在人群中篩查攜帶某個(gè)疾病相關(guān)位點(diǎn)的個(gè)體。高分辨熔解曲線技術(shù)(HRM)是在PCR體系中加入飽和熒光染料，通過控制體系的溫度變化，繪制PCR產(chǎn)物的溫度熔解曲線圖。依據(jù)雜合異源雙鏈的原理，不同的DNA雙鏈由于長度、GC含量、錯(cuò)配性等存在差異而具有不同的溫度熔解曲線。該技術(shù)特別適用于那些無需確定突變位置和類型的快速篩查，如Kras基因12、13位密碼子的任一突變，若使用TaqMan，需要多個(gè)反應(yīng)檢測8種基因型，而HRM 只需要檢測野生型和非野生型。這些新技術(shù)的應(yīng)用極大地增強(qiáng)了PCR技術(shù)對于基因細(xì)小差別的分辨能力，將PCR技術(shù)精細(xì)化的應(yīng)用潛力提升到了一個(gè)新的層面。結(jié)語

盡管PCR技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域多年，但當(dāng)前仍被視為一種輔助的臨床診斷方法。不過隨著分子生物學(xué)理論的快速發(fā)展，PCR技術(shù)與新材料、自動化科學(xué)的結(jié)合日益緊密，并融合新的工藝設(shè)計(jì)，逐漸凸顯出以標(biāo)準(zhǔn)化、自動化、高通量以及精細(xì)化為代表的幾大發(fā)展趨勢。這些因素不僅為將來的PCR診斷試劑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展預(yù)留了廣闊空間，而且指明了方向，同時(shí)對現(xiàn)有的PCR產(chǎn)品和產(chǎn)業(yè)格局提出了挑戰(zhàn)和變革要求。綜上所述，PCR技術(shù)以及相關(guān)產(chǎn)業(yè)即將在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域迎來全新的發(fā)展契機(jī)。

參考文獻(xiàn)

[1] MULLIS K，F(xiàn)ALOONA F，SCHARF S，et a1．Specific enzymatic amplification of DNA in vitro:the polymerase chain reaction[J]．Cold Spring Harb Symp Quant Biol，1986，51 Pt 1：263—273．

[2] HOLLAND P M，ABRAMSON R D，WATSON R．et a1．Detec-tion of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5’-3’exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，1991，88(16)：7276-7280．

[3] KALININA O，LEBEDEVA I，BROWN J，et a1．Nanoliter scale PCR with TaqMan detection[J]．Nucleic Acids Res，1997，25(11200)：1999-2004．

[4] 李金明．臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化[J]．解放軍檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2002，1(2)：99-100．

[5] 程鋼，何蘊(yùn)韶，周新宇．熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測乙型肝炎病毒[J] 中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1999，22(3)：135-138．

[6] McPHERSON，J D，MARRA M，HILLIER L，et a1．A physical map of the human genome[J]．Nature，2001，409(6822)：934-941

[7] HIMPE E，KOOIJMAN R．Insulin-like growth factor-I receptor signal transduction and the Janus Kinase／Signal Transducer and Activator of Transcription(JAK-STAT)pathway[J]．Biofactors，2009，35(1)：76-81．

[8] LEE W C，LIEN K Y，LEE G B，et a1．An integrated microfluidic system using magnetic beads for virus detection[J]．Diagn Micro-biol Infect Dis,2008,60(1)：51-58．

[9] LANGMANN T，MAUERER R，SCHMITZ G．Human ATP-binding cassette transporter TaqMan low-density array：analysis of macrophage differentiation and foam cell formation[J]．Clin Chem，2006,52(2):310-313．

[10] GYORFFY B，SUROWIAK P，KIESSLICH O，et a1．Gene ex-pression profiling of 30 cancer cell lines predicts resistance towards 11 anticancer drugs at clinically achieved concentrations[J]．Int J Cancer,2006,118(7):1699一l712．

[11]BURCZYNSKI M E．Pharmacogenomic approaches in clinical

studies to identify biomarkers of safety and efficacy[J]．Toxicol Lett,2009,186(1):18-21．

[12]ST LOUIS M．PCR-ELISA for high—throughput blood group genotyping[J]．Methods Mol Biol,2009,496:3-13．

第二篇：PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

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醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會，具有極高的使用價(jià)值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

常見的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能。PCR法檢測乙肝的優(yōu)勢表現(xiàn)在：①早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。②對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過程中通過監(jiān)測血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性溫度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準(zhǔn)確性。國內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時(shí)，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國胃炎發(fā)病率之高估計(jì)比乙型肝炎更嚴(yán)重，對HP的檢測應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系統(tǒng)感染性疾病主要的有肺結(jié)核、非典型性肺炎等。結(jié)核桿菌感染曾給人類健康帶來很大威脅，一度是較嚴(yán)重的致死性疾病之一。解放以后由于對結(jié)核病的預(yù)防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現(xiàn)，使結(jié)核病流行基本被控制。近來結(jié)核病有抬頭的趨勢，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現(xiàn)，其二是對結(jié)核預(yù)防重視不足。結(jié)核菌痰涂片鏡檢陽性率太低，酶標(biāo)法又因抗原交叉反應(yīng)易出現(xiàn)假陽性，結(jié)核檢測的金標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)核菌培養(yǎng)法。但培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)昂貴并且受到用藥的影響，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。PCR在結(jié)核菌檢測方面有簡便、敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)。一般認(rèn)為樣本中內(nèi)要有100個(gè)左右的結(jié)核菌即可被檢出。目前用于結(jié)核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復(fù)插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質(zhì)粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復(fù)插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物為245BP，研究表明這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認(rèn)為這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測。結(jié)核菌痰標(biāo)本的PCR檢測應(yīng)注意以下幾種常見的問題。其一，多條帶。即擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產(chǎn)物帶，這與插入序列本身各片段長度有差異、結(jié)核菌在治療過程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關(guān)。這種擴(kuò)增結(jié)果的判斷應(yīng)特別注意，凡在陽性對照相應(yīng)位置有明顯條帶的判陽性，否則應(yīng)為陰性，或建議病人過一些時(shí)間后再復(fù)檢一次；其二，結(jié)核痰樣本PCR檢測時(shí)，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴(kuò)增效果，甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重非特異性擴(kuò)增，電泳結(jié)果呈霧狀；基三，結(jié)核痰樣本PCR檢測結(jié)果可能表現(xiàn)為陽性、陰性交替出現(xiàn)，這與結(jié)核病灶的不規(guī)律排菌有關(guān)。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進(jìn)入血液，最終可定位于心肌細(xì)胞中導(dǎo)致心肌炎。目前對這些病毒的血液樣本檢測往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測時(shí)因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測的血清常溫下不應(yīng)超過24小時(shí)，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR檢測在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。梅毒是由梅毒螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經(jīng)血行播散到全身，最嚴(yán)重的是波及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。感染早期，梅毒螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結(jié)痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測，其敏感性及特異性極高。二期梅毒皮疹中也存在梅毒螺體其取樣方法同埂下疳，三期梅毒皮疹中一般無螺旋體存在，因此III病人及部分無皮疹的I、II期梅毒病人可以取EDTA抗凝全血檢測。淋病是目前發(fā)病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內(nèi)寄生，常見的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對分泌物拭子進(jìn)行涂片鏡檢時(shí)，常導(dǎo)致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發(fā)病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養(yǎng)法準(zhǔn)確但費(fèi)時(shí)且費(fèi)用高，受用藥的影響。PCR法簡便、快捷、準(zhǔn)確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質(zhì)粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設(shè)計(jì)的引物特異性高但其敏感性低；隱性質(zhì)粒設(shè)計(jì)的引物敏感性高但偶爾出現(xiàn)多條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷結(jié)果時(shí)應(yīng)以陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)，凡在陽性對照相應(yīng)部位有明顯條帶的為陽性，其余均為陰性。以往對沙眼衣原體及解脲支原體的檢測主要靠培養(yǎng)法，費(fèi)時(shí)且昂貴，簡便快速的PCR檢測對其有極高的使用價(jià)值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴(kuò)增的抑制劑，因此每次采樣時(shí)盡量避免采集過多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉(zhuǎn)采集宮頸脫落細(xì)胞送檢，其準(zhǔn)確性更高。PCR也可以用檢測單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統(tǒng)感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結(jié)果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關(guān)系并不密切，經(jīng)常有交叉或多型民時(shí)感染。為簡化操作，對其基因?qū)Ρ确治鰧ふ夜餐蛄性O(shè)計(jì)的簡并引物可以同時(shí)檢出這幾種型別的病毒既簡化操作又減少費(fèi)用是一種極理想的方法。

我國惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60％以上。引起腫瘤的原因非常復(fù)雜包括外界環(huán)境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類即化學(xué)、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關(guān)的證據(jù)越來越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)控失調(diào)終形成腫瘤。癌基因是指在自然或?qū)嶒?yàn)條件下具有潛在誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，它們是在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據(jù)Rous(1911)的實(shí)驗(yàn)，在小雞肉瘤濾液中發(fā)現(xiàn)一種能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來又在其它哺乳動物基因中發(fā)現(xiàn)與病毒癌基因同源序列，這種正常的細(xì)胞基因表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞生長、增殖、分化有關(guān)。但若被某種因素激活就會轉(zhuǎn)化為有活力的癌基因，通常稱之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區(qū)分，分別用V-Onc及C-Onc基因來代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細(xì)胞中，并表達(dá)生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能的原癌基因活化機(jī)理有：①點(diǎn)突變，受到射線、化學(xué)因素、生物因素的誘導(dǎo)，這樣微小的變化，就會活化癌基因，活化的基因產(chǎn)物僅有極微的結(jié)構(gòu)差異，但在功能在卻有很大的區(qū)別。②獲得啟動子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動子而活化。③基因易位，內(nèi)外界因素能導(dǎo)致染色體的某些基因易位、重排使原來無活性的原癌基因移至某些強(qiáng)的啟動因子或增強(qiáng)子附近而被活化。④原癌基因的過量擴(kuò)增，原癌基因產(chǎn)物一般與生長因子、生長因子受體、跨膜信息蛋白有關(guān)或功能相近，過度表達(dá)時(shí)，會因調(diào)控失常而引起細(xì)胞癌變。另一類與腫瘤相關(guān)的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因較復(fù)雜，作用機(jī)理不太清楚。癌基因檢測中常用的分子生物學(xué)技術(shù)有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴(kuò)增及序列分析。PCR擴(kuò)增簡便、快捷有較強(qiáng)的實(shí)用性，甚至可從病人體液樣本中檢測活化的癌基因而不需取活組織，對癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首命名。1982年首次在人膀胱細(xì)胞細(xì)胞癌中檢出有轉(zhuǎn)化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱C-H-ras基因，后從肺細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經(jīng)母細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)了N-ras基因。Ras基因激活的最常見方式是點(diǎn)突變。人類原發(fā)腫瘤時(shí)點(diǎn)突變主要發(fā)生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據(jù)其點(diǎn)突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴(kuò)增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性內(nèi)切酶消化或產(chǎn)物測序法檢測基因的突變情況即可用診斷。P53是抑制癌基因的代表，位于17號染色體短臂上，其產(chǎn)物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。1979年Cane發(fā)現(xiàn)了P53蛋白Eliyahu發(fā)現(xiàn)了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產(chǎn)物突變蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期較野生型基因產(chǎn)物長，在細(xì)胞內(nèi)堆積，可以用免疫組化法測出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡單、快速、特異性高，更具有實(shí)用價(jià)值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導(dǎo)致構(gòu)型改變，在進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，其泳動速率發(fā)生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區(qū)分開，統(tǒng)計(jì)表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達(dá)97％，300-450bp標(biāo)出率可達(dá)69％，因此大于400bp的片段多態(tài)性應(yīng)采用其它方法檢測。

遺傳病是由于遺傳基礎(chǔ)異常而引起的疾病，人類遺傳病約有3000多種，患者占總?cè)丝跀?shù)的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學(xué)發(fā)展，基因診斷愈來愈表現(xiàn)出其優(yōu)越性，PCR技術(shù)是基因診斷的主要技術(shù)之一，為快速、準(zhǔn)確地檢測人類遺傳病開辟了一個(gè)新的途徑，預(yù)計(jì)與遺傳相關(guān)的疾病的檢測有80％將在3-5年內(nèi)被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應(yīng)用中，可以利用引物直接擴(kuò)增變化的基因產(chǎn)物，也可以結(jié)合應(yīng)用限制內(nèi)切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進(jìn)行診斷。應(yīng)用較為廣泛的有PCR法檢測中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見的單基因遺傳病，不有同類型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見。a珠蛋白基因位于11號染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現(xiàn)溶血性貧血，肝脾腫大，在我國發(fā)病率為0.66％，貴州、四川等地高發(fā)可達(dá)2.2％。應(yīng)用PCR技術(shù)可以直接檢測突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria,PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴(yán)重缺乏使苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酷氨酸血癥，出現(xiàn)腦組織損傷，智力障礙。此病患者出生時(shí)正常，出生后一經(jīng)確診立即停止母乳喂養(yǎng)，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價(jià)之昂貴是一般家庭所不能承受的，關(guān)鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結(jié)合斑點(diǎn)雜交能有效診斷PKU。遺傳性疾病的基因變化很復(fù)雜，單基因固定位點(diǎn)變異布致病的情況很少，因此基因診斷過程中往往需要PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶、斑點(diǎn)雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析結(jié)合，作綜合判斷。

優(yōu)生學(xué)包括基礎(chǔ)優(yōu)生學(xué)、社會優(yōu)生學(xué)、臨床優(yōu)生學(xué)及環(huán)境優(yōu)生學(xué)。孕期檢查及產(chǎn)前診斷是臨床優(yōu)生學(xué)的最重要內(nèi)容之一。孕期檢查除一般項(xiàng)目外還能及時(shí)了解孕婦是患有某些對胎兒發(fā)育有嚴(yán)重影響的疾病如風(fēng)疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、弓體感染等，及時(shí)發(fā)現(xiàn)及時(shí)治療并采取有效措施預(yù)防發(fā)展成為宮內(nèi)感染。PCR技術(shù)對這些病原體的檢測簡便而確實(shí)，另外利用PCR技術(shù)可以對地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進(jìn)行宮內(nèi)診斷。可見PCR在優(yōu)生優(yōu)育方面有很高的應(yīng)用價(jià)值。

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個(gè)內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時(shí)或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。由于VNTR在等位基因中的多態(tài)性便構(gòu)成了遺傳標(biāo)記。使用PCR技術(shù)對其進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)合對擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜分析即可進(jìn)行個(gè)人識別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復(fù)串聯(lián)序列稱為微衛(wèi)星。在人類基因組中，微衛(wèi)星更加豐富。微衛(wèi)星的重復(fù)序列比VNTR短，擴(kuò)增分型簡便，易于自動化，在VNTR或微衛(wèi)星不僅重復(fù)片段的數(shù)量不同而且重復(fù)片段的核苷酸也具有多態(tài)性。在VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性分析時(shí)，如再結(jié)合堿基配對分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標(biāo)志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術(shù)可以完成替代早期的Southern印跡法進(jìn)行多態(tài)性分析而且操作簡便，敏感性及準(zhǔn)確性都有大幅度的提高。當(dāng)然PCR技術(shù)在法醫(yī)中的應(yīng)用仍在起步階段有許多技術(shù)問題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報(bào)告?zhèn)?、PCR擴(kuò)增污染等。想念隨著PCR技術(shù)的不斷完善它將在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有更加廣泛的應(yīng)用。

第三篇：臨床檢驗(yàn)中PCR技術(shù)的應(yīng)用

臨床檢驗(yàn)中PCR技術(shù)的應(yīng)用

青海紅十字醫(yī)院檢驗(yàn)科 楊軍 檢驗(yàn)士 關(guān)鍵詞：pcr ：pcr的應(yīng)用

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會，具有極高的使用價(jià)值。

PCR檢測的臨床應(yīng)用范圍：用于疾病的早期診斷，疾病的鑒別診斷，疾病的病因確定，藥物療效的評價(jià)，治療效果的評價(jià)，治愈標(biāo)準(zhǔn)的確定

通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。PCR法檢測乙肝的優(yōu)勢表現(xiàn)在：

① 早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。

② 對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③ 療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過程中通過監(jiān)測血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT-PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(RT)后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)。

PCR檢測在性傳播性疾病(STD)的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有梅毒、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎(NGU)可能更具有代表性意義。檢測標(biāo)本無特殊限制：

痰、尿、腹水、胸水、關(guān)節(jié)液、血、肺泡灌洗液、腦脊液、分泌物等均可送檢PCR檢測淋球菌。淋病的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，其確診主要是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查。傳統(tǒng)的方法有涂片染色法，分離培養(yǎng)法和用來檢測淋球菌抗原的EIA-Gonozyme系統(tǒng)法。近年來，熒光定量PCR診斷技術(shù)的應(yīng)用，使淋病的快速診斷有重大突破。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進(jìn)入血液，最終可定位于心肌細(xì)胞中導(dǎo)致心肌炎。目前對這些病毒的血液樣本檢測往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測時(shí)因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測的血清常溫下不應(yīng)超過24小時(shí)，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下

PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動態(tài)狀況

（1）參考文獻(xiàn)：《中國醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志》2001.11:13-14

(2)

姜懷春pcr技術(shù)研究新進(jìn)展。重慶工商大學(xué)報(bào)，2005.22（4）：232-235

第四篇：PCR在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

PCR在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)大致可分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、血清免疫學(xué)和分子生物學(xué)幾大類，其分別代表幾代實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)。60年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)及半保留復(fù)制模式的出現(xiàn)，70年代基因重組及體外基因克隆技術(shù)、分子雜交技術(shù)的應(yīng)用使分子生物學(xué)在疾病診斷中得到了長足的發(fā)展。特別是1985年Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，使醫(yī)學(xué)界真正興起了基因診斷技術(shù)熱，成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。用于臨床檢驗(yàn)的PCR技術(shù)與經(jīng)典的PCR反應(yīng)在操作上稍有區(qū)別，有其自己的特色。一般在樣品處理上，多采用非離子去污劑一次加熱處理，這種方法對DNA純化有限，但適應(yīng)臨床微量、快速的特點(diǎn)。另外PCR反應(yīng)體系中各組成成份往往都預(yù)分裝到反應(yīng)管中，既減少操作者的工作強(qiáng)度而且也減少了污染的機(jī)會，具有極高的使用價(jià)值。本公司率先研制并推出單管單人份的PCR診斷試劑，具有開創(chuàng)性意義。這些改進(jìn)都不影響PCR效果，同樣表現(xiàn)出高特異性、高敏感性、簡便快捷等PCR最優(yōu)秀的特征，在常見傳染病、性病、腫瘤、遺傳病、寄生蟲病、優(yōu)生優(yōu)育、法醫(yī)學(xué)等廣泛領(lǐng)域中有相當(dāng)高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

常見的傳染性疾病有細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等，可引起消化、呼吸、循環(huán)、泌尿生殖等不同系統(tǒng)相應(yīng)的病變。消化系統(tǒng)感染性疾病在我國具有代表性意義的有肝炎、胃炎及腸道感染性疾病。引起肝炎的病原體主要包括乙型肝炎病毒（乙肝）、丙型肝炎病毒（丙肝），其它還有甲型肝炎病毒（甲肝）、丁型肝炎病毒（丁肝）、戊型肝炎病毒（戊肝）、庚型肝炎病毒（庚肝）等。這幾種肝炎病毒中只有乙型肝炎病毒是DNA病毒，其余均為RNA病毒。我國是乙肝高發(fā)區(qū)，乙肝病人為世界乙肝病人總數(shù)的50％。乙肝病毒經(jīng)血液傳播，病毒主要在肝細(xì)胞中增殖，也可以長期存留在骨髓細(xì)胞或外周血白細(xì)胞中。通常用PCR法檢測血清中的乙肝病毒。有報(bào)道用PCR法可以在淚液、乳汁、精液及血白細(xì)胞中檢出乙肝病毒，這些發(fā)現(xiàn)提示其它傳染途經(jīng)存在的可能。PCR法檢測乙肝的優(yōu)勢表現(xiàn)在： ① 早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，理論上可檢出100CID/ml乙肝病毒的患者血清，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。② 對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③ 療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過程中通過監(jiān)測血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。丙型肝炎病毒在血清中的濃度很低，丙肝病毒的分離尚未成功。目前用于丙肝病毒檢驗(yàn)的方法主要是ELISA法測定血清中的HCV抗體。由于HCV尚無法分離純化，所以用于包被的抗原是人工合成肽或基因工程蛋白，這些人工抗原與天然病毒抗原有一定的區(qū)別，理論上是存在假陽性或假陰性。同時(shí)血清中抗體的出現(xiàn)及動態(tài)變化與病人病情無線性相關(guān)關(guān)系。RT－PCR技術(shù)使這些困難得到解決。HCV是RNA病毒，需先將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（RT）后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這種技術(shù)稱之為逆轉(zhuǎn)錄－PCR（RT－PCR）。PCR敏感性高可以檢測出血清中低濃度的病毒，了解病毒在體內(nèi)復(fù)制的動態(tài)狀況。RNA純化要求嚴(yán)格，是RT－PCR的技術(shù)關(guān)鍵，本公司目前使用的高效基因釋放劑，聯(lián)合特異性固相基因吸附乳膠顆粒，對樣本中的RNA進(jìn)行分離純化，使這一問題得到解決。通常用于RNA→cDNA逆轉(zhuǎn)錄的酶大致可以分為二大類，即低逆轉(zhuǎn)錄酶，如AMV/MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，高逆轉(zhuǎn)錄酶，如Tth酶。Tth酶在錳離子作用下，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，Tth酶活性度高，可以使核酸充分線性化，提高逆轉(zhuǎn)錄效率及特異性。Tth酶在鎂離子的作用下，又具有DNA聚合酶活性，從而真正實(shí)現(xiàn)單管單酶單人份的擴(kuò)增要求，這樣就在不降低擴(kuò)增敏感性的條件下，一步完成擴(kuò)增，不僅簡化操作，而且又減少污染，提高檢測的準(zhǔn)確性。國內(nèi)本公司已采用這種技術(shù)推出單管單酶單人份的RT－PCR診斷試劑。丁型肝炎病毒是缺陷病毒，與乙型肝炎病毒協(xié)同感染。甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒主要存在于急性病人糞便樣本中，戊型肝炎病毒也長期存在于血清中。在PCR檢測時(shí)，需注意取材的合理性。在消化道傳染性疾病中，另一類最重要的感染性疾病是幽門螺旋桿菌（HP）所引起的胃炎、胃潰瘍等。HP可以經(jīng)口－口途經(jīng)傳播并定位于胃粘膜上皮細(xì)胞，早期表現(xiàn)為淺表性胃炎，可發(fā)展成為胃潰瘍。我國胃炎發(fā)病率之高估計(jì)比乙型肝炎更嚴(yán)重，對HP的檢測應(yīng)受到廣大醫(yī)務(wù)工作者的重視。對HP的檢測可以用生化法測試尿素酶或用免疫法測試血清中對HP特異性抗體，也可對胃液、胃粘膜樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及菌種鑒定。PCR法檢測HP非常敏感且特異性高，有研究發(fā)現(xiàn)可以從病人的唾液或口腔含漱液中檢出HP。PCR法避免了取胃液及胃粘膜，減少病人痛苦，是目前最理想的方法。

呼吸系統(tǒng)感染性疾病主要的有肺結(jié)核、非典型性肺炎等。結(jié)核桿菌感染曾給人類健康帶來很大威脅，一度是較嚴(yán)重的致死性疾病之一。解放以后由于對結(jié)核病的預(yù)防的重視，特別是特效抗癆藥物的出現(xiàn)，使結(jié)核病流行基本被控制。近來結(jié)核病有抬頭的趨勢，基原因可能有兩方面，其一是耐藥株的不斷出現(xiàn)，其二是對結(jié)核預(yù)防重視不足。結(jié)核菌痰涂片鏡檢陽性率太低，酶標(biāo)法又因抗原交叉反應(yīng)易出現(xiàn)假陽性，結(jié)核檢測的金標(biāo)準(zhǔn)是結(jié)核菌培養(yǎng)法。但培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)昂貴并且受到用藥的影響，在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。PCR在結(jié)核菌檢測方面有簡便、敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)。一般認(rèn)為樣本中內(nèi)要有100個(gè)左右的結(jié)核菌即可被檢出。目前用于結(jié)核菌PCR診斷的試劑，其引物主要來源于以下基因片段36KD/65KD抗原蛋白基因；染色體重復(fù)插入序列IS986、IS960、IS6110、染色體質(zhì)粒DNA PH7311、PMTB4、P36基因等。其中最常用的是染色體重復(fù)插入序列IS986或IS6110，1990年Hermans首先介紹并使用了IS986基因設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物為245BP，研究表明這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌有特異性。而后Thierry又介紹了插入序列IS6110基因，并認(rèn)為這一基因?qū)θ诵徒Y(jié)核菌具有比IS986更高的特異性及敏感性，最適合M.TB的檢測。結(jié)核菌痰標(biāo)本的PCR檢測應(yīng)注意以下幾種常見的問題。其一，多條帶。即擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后有三條或三條以上的螢光除最前面的引物以外有兩條產(chǎn)物帶，這與插入序列本身各片段長度有差異、結(jié)核菌在治療過程中染色體畸變、斷裂、缺欠及不等位交換有關(guān)。這種擴(kuò)增結(jié)果的判斷應(yīng)特別注意，凡在陽性對照相應(yīng)位置有明顯條帶的判陽性，否則應(yīng)為陰性，或建議病人過一些時(shí)間后再復(fù)檢一次；其二，結(jié)核痰樣本PCR檢測時(shí)，要使樣本充分液化，否則痰液中的粘液成份將影響擴(kuò)增效果，甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重非特異性擴(kuò)增，電泳結(jié)果呈霧狀；基三，結(jié)核痰樣本PCR檢測結(jié)果可能表現(xiàn)為陽性、陰性交替出現(xiàn)，這與結(jié)核病灶的不規(guī)律排菌有關(guān)。

循環(huán)系統(tǒng)以腸道小RNA病毒感染最具代表意義，如柯薩奇病毒等。這些病毒經(jīng)腸道粘膜、淋巴結(jié)進(jìn)入血液，最終可定位于心肌細(xì)胞中導(dǎo)致心肌炎。目前對這些病毒的血液樣本檢測往往比較困難。PCR用于柯薩奇病毒檢測時(shí)因其是RNA病毒所以應(yīng)注意樣本的保存。外在環(huán)境中存在大量RNA酶，病毒脫殼后RNA將被迅速降解。一般用于RNA檢測的血清常下不應(yīng)超過24小時(shí)，4℃下可保存2天，-20℃下可以保存2月以下。

PCR檢測在性傳播性疾病（STD）的診斷中有較廣泛的應(yīng)用。經(jīng)典的性傳播疾病有、淋病、腹股溝淋巴肉芽腫、軟銳濕癘、硬下疳等。而在現(xiàn)代STD中、解尿支原體及沙眼衣原體引起的非淋菌性尿道炎（NGU）可能更具有代表性意義。是由螺旋體感染布致，首先在局部形成硬軟下疳，布后經(jīng)血行播散到全身，最嚴(yán)重的是波及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。感染早期，螺旋體大量存在于硬下疳中，可以用生理鹽水濕棉簽擦去皮疹表面污物再用鈍刀片輕輕刮去上皮及結(jié)痂，用潔凈棉簽取滲出液樣本作PCR檢測，其敏感性及特異性極高。二期皮疹中也存在螺體其取樣方法同埂下疳，三期皮疹中一般無螺旋體存在，因此III病人及部分無皮疹的I、II期病人可以取EDTA抗凝全血檢測。淋病是目前發(fā)病率最高的性傳播性疾病之一，由淋病雙球菌引起。淋病雙球菌一般為胞內(nèi)寄生，常見的感染部位為外生殖器、尿道粘膜最常見。在尿道及外生殖器分泌物中有許多非致病的雙菌存在，對分泌物拭子進(jìn)行涂片鏡檢時(shí)，常導(dǎo)致誤診。另外目前非淋球菌性尿道炎的發(fā)病率不斷增加，鑒別診斷特要，培養(yǎng)法準(zhǔn)確但費(fèi)時(shí)且費(fèi)用高，受用藥的影響。PCR法簡便、快捷、準(zhǔn)確非常理想。常用的引物多采用外膜蛋白抗原基因、隱性質(zhì)粒DNA或16s RNA基因。16s RNA基因設(shè)計(jì)的引物特異性高但其敏感性低；隱性質(zhì)粒設(shè)計(jì)的引物敏感性高但偶爾出現(xiàn)多條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷結(jié)果時(shí)應(yīng)以陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)，凡在陽性對照相應(yīng)部位有明顯條帶的為陽性，其余均為陰性。以往對沙眼衣原體及解脲支原體的檢測主要靠培養(yǎng)法，費(fèi)時(shí)且昂貴，簡便快速的PCR檢測對其有極高的使用價(jià)值。沙眼衣原體、解脲支原體樣本來源主要是尿道及宮頸分泌物拭子，由于分泌物中有許多污物含有PCR擴(kuò)增的抑制劑，因此每次采樣時(shí)盡量避免采集過多膿性分泌物，如果宮頸分泌物太多可以先用濕棉簽將表面的分泌物擦去，再用潔凈的濕棉簽輕壓旋轉(zhuǎn)采集宮頸脫落細(xì)胞送檢，其準(zhǔn)確性更高。PCR也可以用檢測單純皰疹病毒、EB病毒、乳頭瘤病毒等。引物尖銳濕疣的病毒是人類乳頭瘤（HPV）,可致生殖系統(tǒng)感染的乳頭瘤病毒主要是6、11、16、18、33型。新近研究結(jié)果表明，在乳頭瘤病毒引起的良、惡性生殖器病變中，與血清型的關(guān)系并不密切，經(jīng)常有交叉或多型時(shí)感染。為簡化操作，對其基因?qū)Ρ确治鰧ふ彝蛄性O(shè)計(jì)的簡并引物可以同時(shí)檢出這幾種型別的病毒既簡化操作又減少費(fèi)用是一種極理想的方法。

我國惡性腫瘤為人口死亡的第一位原因，其中以肺癌、胃癌及食管癌的發(fā)病率最高，占惡性腫瘤死亡總數(shù)的60％以上。引起腫瘤的原因非常復(fù)雜包括外界環(huán)境因素及遺傳背景。外界因此可分為三大類即化學(xué)、物理及生物因素。腫瘤與遺傳有關(guān)的證據(jù)越來越多，除已知的單基因遺傳腫瘤如視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤等以外，還在幾乎所有的腫瘤細(xì)胞中觀察到原癌基因的重排，這些基因的變化常導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)控失調(diào)終形成腫瘤。癌基因是指在自然或?qū)嶒?yàn)條件下具有潛在誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的基因，它們是在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)的。目前已知的腫瘤基因有60多種，1969年Hubner根據(jù)Rous（1911）的實(shí)驗(yàn)，在小雞肉瘤濾液中發(fā)現(xiàn)一種能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的RNA病毒性癌基因（Viral Oncogene）。后來又在其它哺乳動物基因中發(fā)現(xiàn)與病毒癌基因同源序列，這種正常的細(xì)胞基因表達(dá)產(chǎn)物與細(xì)胞生長、增殖、分化有關(guān)。但若被某種因素激活就會轉(zhuǎn)化為有活力的癌基因，通常稱之為原癌基因（Proto Oncogene）。為了與病毒癌基因區(qū)分，分別用V-Onc及C-Onc基因來代表。目前了解較多的癌基因（C-one）有scr基因族、ras基因族、mgc及myb基因族。原癌基因存在于正常細(xì)胞中，并表達(dá)生物功能，只有在原癌基因被激活后才能誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可能的原癌基因活化機(jī)理有：①點(diǎn)突變，受到射線、化學(xué)因素、生物因素的誘導(dǎo)，這樣微小的變化，就會活化癌基因，活化的基因產(chǎn)物僅有極微的結(jié)構(gòu)差異，但在功能在卻有很大的區(qū)別。②獲得啟動子，原癌基因從病毒基因中獲得啟動子而活化。③基因易位，內(nèi)外界因素能導(dǎo)致染色體的某些基因易位、重排使原來無活性的原癌基因移至某些強(qiáng)的啟動因子或增強(qiáng)子附近而被活化。④原癌基因的過量擴(kuò)增，原癌基因產(chǎn)物一般與生長因子、生長因子受體、跨膜信息蛋白有關(guān)或功能相近，過度表達(dá)時(shí)，會因調(diào)控失常而引起細(xì)胞癌變。另一類與腫瘤相關(guān)的基因是抑癌基因如P53。抑癌基因較復(fù)雜，作用機(jī)理不太清楚。癌基因檢測中常用的分子生物學(xué)技術(shù)有：雜交、DNA分子克隆、PCR擴(kuò)增及序列分析。PCR擴(kuò)增簡便、快捷有較強(qiáng)的實(shí)用性，甚至可從病人體液樣本中檢測活化的癌基因而不需取活組織，對癌癥的早期診斷有極重要的意義。Ras基因是1964年首次從大鼠肉瘤的急性逆轉(zhuǎn)錄病毒（Harver Murine Sarcoma and Kister Murine Sarcoma Virus）中分離出來取大鼠肉瘤（Rat Sarcoma）的字首名。1982年首次在人膀胱細(xì)胞細(xì)胞癌中檢出有轉(zhuǎn)化能力的ras基因與Harver大鼠肉瘤病毒癌基因有同源性稱C-H-ras基因，后從肺細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了與Kister大鼠肉瘤癌基因同源的C-K-ras基因，從神經(jīng)母細(xì)胞中又發(fā)現(xiàn)了N-ras基因。Ras基因激活的最常見方式是點(diǎn)突變。人類原發(fā)腫瘤時(shí)點(diǎn)突變主要發(fā)生在密碼子12、13、59、61位。激活后的ras基因不牟自行滅活，根據(jù)其點(diǎn)突變的情況可以基因診斷、療效觀察。用PCR擴(kuò)增樣本ras原癌基因，再使用雜交法、限制性內(nèi)切酶消化或產(chǎn)物測序法檢測基因的突變情況即可用診斷。P53是抑制癌基因的代表，位于17號染色體短臂上，其產(chǎn)物為53KD分子量的蛋白從此而得名，可分為突變型和野生型，前者為癌基因，后者為抗癌基因。1979年Cane發(fā)現(xiàn)了P53蛋白Eliyahu發(fā)現(xiàn)了p53基因有抑癌作用。P53突變后其產(chǎn)物突變蛋白穩(wěn)定性增加，半衰期較野生型基因產(chǎn)物長，在細(xì)胞內(nèi)堆積，可以用免疫組化法測出。PCR-RELP、PCR-SSCP則因方法簡單、快速、特異性高，更具有實(shí)用價(jià)值。在SSCP分析中，單鏈DNA因堿基序列的變異，導(dǎo)致構(gòu)型改變，在進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，其泳動速率發(fā)生改變，從布將變異的DNA與正常DNA區(qū)分開，統(tǒng)計(jì)表明100-300bp分子大小的ssDNA突變檢出率可達(dá)97％，300-450bp標(biāo)出率可達(dá)69％，因此大于400bp的片段多態(tài)性應(yīng)采用其它方法檢測。

遺傳病是由于遺傳基礎(chǔ)異常而引起的疾病，人類遺傳病約有3000多種，患者占總?cè)丝跀?shù)的10％。遺傳病大概可分為單基因、多基因及染色體遺傳病。常用診斷方法有家系譜分析、染色體檢查（特別是顯帶法）、生物化分析等。隨分子生物學(xué)發(fā)展，基因診斷愈來愈表現(xiàn)出其優(yōu)越性，PCR技術(shù)是基因診斷的主要技術(shù)之一，為快速、準(zhǔn)確地檢測人類遺傳病開辟了一個(gè)新的途徑，預(yù)計(jì)與遺傳相關(guān)的疾病的檢測有80％將在3-5年內(nèi)被PCR法所取代。PCR在遺傳病診斷應(yīng)用中，可以利用引物直接擴(kuò)增變化的基因產(chǎn)物，也可以結(jié)合應(yīng)用限制內(nèi)切酶，分子雜交及電泳圖譜分析進(jìn)行診斷。應(yīng)用較為廣泛的有PCR法檢測中海貧血、苯丙酮尿癥、血友病、脆性X綜合癥及性別鑒定等。地中海貧血（Thalassmia）是世界上最常見的單基因遺傳病，不有同類型，以a地中海貧血及在中海貧血最常見。a珠蛋白基因位于11號染色體短臂上，a珠蛋白基因突變致血紅蛋白的全成減少或缺失，表現(xiàn)溶血性貧血，肝脾腫大，在我國發(fā)病率為0.66％，貴州、四川等地高發(fā)可達(dá)2.2％。應(yīng)用PCR技術(shù)可以直接檢測突變的基因診斷此病。苯丙酮尿癥（Phenylketouria,PKU）是一種常染色體隱性遺傳病。病人肝臟苯丙氨酸羥化酶嚴(yán)重缺乏使苯丙氨酸不能轉(zhuǎn)化為酷氨酸血癥，出現(xiàn)腦組織損傷，智力障礙。此病患者出生時(shí)正常，出生后一經(jīng)確診立即停止母乳喂養(yǎng)，采用低苯丙氨酸飲食治療8-10年不致影響患者智力，但低苯丙氨酸飲食代價(jià)之昂貴是一般家庭所不能承受的，關(guān)鍵在于避免患兒出生。因此本病的早期診斷有極其重要的意義。PCR結(jié)合斑點(diǎn)雜交能有效診斷PKU。遺傳性疾病的基因變化很復(fù)雜，單基因固定位點(diǎn)變異布致病的情況很少，因此基因診斷過程中往往需要PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶、斑點(diǎn)雜交、聚丙烯酰胺膠電泳圖譜分析及擴(kuò)增產(chǎn)物序列分析結(jié)合，作綜合判斷。

優(yōu)生學(xué)包括基礎(chǔ)優(yōu)生學(xué)、會優(yōu)生學(xué)、臨床優(yōu)生學(xué)及環(huán)境優(yōu)生學(xué)。孕期檢查及產(chǎn)前診斷是臨床優(yōu)生學(xué)的最重要內(nèi)容之一。孕期檢查除一般項(xiàng)目外還能及時(shí)了解孕婦是患有某些對胎兒發(fā)育有嚴(yán)重影響的疾病如風(fēng)疹病毒感染、沙眼衣原體、解脲支原體、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、弓體感染等，及時(shí)發(fā)現(xiàn)及時(shí)治療并采取有效措施預(yù)防發(fā)展成為宮內(nèi)感染。PCR技術(shù)對這些病原體的檢測簡便而確實(shí)，另外利用PCR技術(shù)可以對地中海貧血、血友病、苯丙酮尿癥、脆性X綜合癥等遺傳性疾病進(jìn)行宮內(nèi)診斷?？梢奝CR在優(yōu)生優(yōu)育方面有很高的應(yīng)用價(jià)值。

PCR技術(shù)的出現(xiàn)對法醫(yī)學(xué)的發(fā)展也有不可低估的作用。在法醫(yī)物證如血斑、毛發(fā)、組織碎片等的確證，DAN多態(tài)性分析遠(yuǎn)比血清學(xué)或等方法確實(shí)可靠。早期DNA多態(tài)性分析主要使用Southern印跡雜交的方法。1985年Jeffreys首先采用肌紅基因第一個(gè)內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作探針，從人的基因庫中篩選出小衛(wèi)量DNA，使用阿交法產(chǎn)生雜交圖譜即DNA指紋。這一技術(shù)成功地應(yīng)用于個(gè)人識別及親子鑒定。這種方法仍受到樣本量的限制，當(dāng)樣本DNA數(shù)量不足時(shí)或DAN嚴(yán)重降解則不能正常檢出。且雜交技術(shù)常使用同位素杯記探針要求較鎬的防護(hù)措施。PCR技術(shù)的出現(xiàn)，可以對極少量物證如一根毛發(fā)、一滴血液、極小精斑都可以進(jìn)行分析。在人類基因組中有許多由10-15bp核心順序構(gòu)成的串聯(lián)重復(fù)DNA序列，具有單位點(diǎn)特征的稱為VNTR結(jié)構(gòu)，多位點(diǎn)串聯(lián)成為衛(wèi)星DNA。由于VNTR在等位基因中的多態(tài)性便構(gòu)成了遺傳標(biāo)記。使用PCR技術(shù)對其進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)合對擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜分析即可進(jìn)行個(gè)人識別及親子鑒定。由2-6核苷組成的重復(fù)串聯(lián)序列稱為微衛(wèi)星。在人類基因組中，微衛(wèi)星更加豐富。微衛(wèi)星的重復(fù)序列比VNTR短，擴(kuò)增分型簡便，易于自動化，在VNTR或微衛(wèi)星不僅重復(fù)片段的數(shù)量不同而且重復(fù)片段的核苷酸也具有多態(tài)性。在VNTR或微衛(wèi)星多態(tài)性分析時(shí)，如再結(jié)合堿基配對分析可以藜得更大量的信息，這一種更有希望的標(biāo)志即MVR（Microsatllite Variant Repeats）。理論上其對嫌疑人的排除率為99.999％。PCR技術(shù)可以完成替代早期的Southern印跡法進(jìn)行多態(tài)性分析而且操作簡便，敏感性及準(zhǔn)確性都有大幅度的提高。當(dāng)然PCR技術(shù)在法醫(yī)中的應(yīng)用仍在起步階段有許多技術(shù)問題等待解決，如樣本中的抑制劑、檢村中DNA的損報(bào)告?zhèn)?、PCR擴(kuò)增污染等。想念隨著PCR技術(shù)的不斷完善它將在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有更加廣泛的應(yīng)用。

第五篇：常規(guī)臨床檢驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)知識

常規(guī)臨床檢驗(yàn)技術(shù)基礎(chǔ)知識

分析：分：使整體事物變成幾部分或使聯(lián)在一起的事物離開；析：分開，散開，挑出。

血液分析的目的就是將不同成分分開。

血液是人體的重要組成部分，它維持著人體各部分的生理功能。是維持生命的基本成分之一，沒有了血液，人的生命就不會存在。

血液的組成：

血液是由血漿和血細(xì)胞（就是所說的血球）兩大部分組成的流體組織，在心血管系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)流動。（將血液用抗凝劑抗凝處理后，放在離心機(jī)內(nèi)離心或靜置一段時(shí)間后，血漿和血細(xì)胞就明顯分出）。血細(xì)胞沉淀在底部，懸浮在紅色血細(xì)胞上面的黃色液體為血漿。

全血、血漿、血清的區(qū)別：

◇全血：血液經(jīng)抗凝處理后的全部血液為全血。

◇血漿：離心除去血細(xì)胞后所得到的淡黃色液體為血漿。

◇血清：血液不經(jīng)抗凝處理，讓它自行凝固，則在抽血后的一段時(shí)間內(nèi)，血液會自動在一系列凝血因子的作用下發(fā)生凝集，血液首先凝固成一個(gè)整體，再經(jīng)過一段時(shí)間或用離心機(jī)離心，血液中凝固的部分會與一些清澈淡黃色的液體分離開，這些液體稱為血清。

血清與血漿從表面上看似乎沒有什么不同，但其內(nèi)在的主要區(qū)別是血清中不含纖維蛋白原，是未經(jīng)抗凝處理過的血液凝固后得到的。

血液標(biāo)本的三種主要處理方式：

① 血清測定：主要用于血液生化、免疫等方面的測定。

② 全血測定：多用于在血細(xì)胞、血常規(guī)、血沉等方面的測定。③ 血漿測定：多用于凝血等方面的測定。

血漿的主要成分是水、低分子物質(zhì)（電解質(zhì)、小分子有機(jī)化合物、營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、激素等）、蛋白質(zhì)、和O2、CO2等。

血細(xì)胞包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板三部分。

化學(xué)成分的測量技術(shù)：電解質(zhì)的測量由ISE電解質(zhì)分析儀完成。其余的微量元素由微量元素分析儀測量。

其余的低分子物質(zhì)包括部分蛋白質(zhì)由生化分析儀測量（生化分析儀通過濁度測量也可以測定電解質(zhì)、部分蛋白質(zhì)，但這些方法已被淘汰或正在被淘汰）。蛋白質(zhì)測量有多種技術(shù)完成：電泳、酶免疫測量技術(shù)等。

PO2（氧分壓）及PCO2（二氧化碳分壓）等由血?dú)鉁y量儀測量。

血?dú)夥治鰞x是測定患者血液中氧的分壓、二氧化碳分壓、血液酸堿度及其 1

相關(guān)的一系列指標(biāo)，用于評價(jià)患者肺泡的通氣和換氣功能。（主要用于呼吸功能和酸堿平衡的診斷及調(diào)整藥物治療）。

凝血因子測量由血凝儀進(jìn)行。

止血與凝血的檢查項(xiàng)目很多，用于所有手術(shù)前檢查、檢測抗凝及溶栓治療、預(yù)測血栓形成和血管內(nèi)凝血、先天及后天凝血因子缺乏、纖維蛋白原及凝血酶原缺乏的診斷等。

血液的理化指標(biāo)： 血液的比重，黏度、滲透壓，PH等。PH值由血?dú)鉁y量 儀測量。比重、黏度由血流變測量儀測量。滲透壓由滲透計(jì)測量。

血細(xì)胞計(jì)數(shù)：測量血液中血細(xì)胞的數(shù)量及分類由血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行。

尿液是血液通過腎小球?yàn)V過、腎小管和集合管重吸收及排泄代謝的產(chǎn)物。其組成為水、電解質(zhì)、有機(jī)物、有形成分。

分析技術(shù)：尿液分析儀，分析化學(xué)成分。尿沉渣分析儀分析其中的有形成分。

尿化學(xué)分析儀，干式尿化學(xué)分析儀。

試劑帶/試紙條，在長條型的塑料片上固定一系列的試劑塊，一次可以完成多個(gè)項(xiàng)目的測量。多層結(jié)構(gòu)，第一層為尼龍膜，防止大分子物質(zhì)干擾，第二層抗維生素層，消除尿液中維生素C的干擾。第三層為試劑層，其中的試劑與尿液中的特定成分反應(yīng)，發(fā)生顏色變化。第四層為吸水層。第五層為塑料片。

8項(xiàng)/10項(xiàng)/11項(xiàng)尿試紙條，PH、尿蛋白、尿糖、尿酮體、尿隱血/紅細(xì)胞、膽紅素、尿膽原、亞硝酸鹽、白細(xì)胞、尿比重、VC。白色的參考塊用來補(bǔ)償光強(qiáng)、尿液本底顏色對測試的影響。

不同廠家的儀器不同，試紙條也不同，試紙條的尺寸、排列不同，因此一般試紙條不能通用。

試紙條浸入尿液中，尿液中的特定成分與不同的試劑塊中的試劑反應(yīng)，產(chǎn)生顏色的變化，顏色的深淺與尿液中某特定成分的含量有關(guān)，測量顏色的變化即可計(jì)算出濃度/數(shù)值。

光源：鹵素?zé)艋蛞唤M發(fā)光二極管，發(fā)出的光照射在試紙條上，用傳感器（積分球，CCD）/接收反射回來的光，轉(zhuǎn)換為電信號進(jìn)行測量。

傳感器：積分球/CCD。分色原理，白光積分球系統(tǒng)需要濾光片。用發(fā)光二極管做光源時(shí)，二極管發(fā)出的光本身就是單色光，不需要分光。CCD陣列，攝像頭，內(nèi)部將白光分為三原色（紅綠藍(lán)），得到圖象。轉(zhuǎn)換效率高，通過軟件處理，可以自動校正試劑塊的不同排列，有希望做到試劑條通用。

機(jī)械系統(tǒng)：載紙臺及運(yùn)動控制部件。將試紙條送入測量位置，測量完成后排送到廢物盒。

指標(biāo)：測試速度，一般為30-60秒一個(gè)測試，快速的儀器可以做到500/小時(shí)。測試項(xiàng)目：與試紙條結(jié)合，8/10/11。也有自動識別測試項(xiàng)目的儀器。（有的儀

器可同時(shí)兼容8/10/11項(xiàng)）。

尿沉渣（Urinary sediment）分析儀：

尿沉渣分析儀主要是采用相差顯微鏡來觀察尿中各種細(xì)胞和管型，并根據(jù)它們的數(shù)量和形態(tài)來檢查和分析腎實(shí)質(zhì)性疾病，為疾病的活動性和嚴(yán)重性提供線索。

分析尿液的沉渣中的細(xì)胞、管型、結(jié)晶、細(xì)菌、寄生蟲等。離心后，得到離心管底部的沉渣，傳統(tǒng)的方法是用顯微鏡人工檢測。最近發(fā)展了自動檢測技術(shù)。

尿沉渣分析儀：圖象法，得到顯微鏡下尿沉渣的圖象，通過軟件對圖象進(jìn)行處理，自動或手工分析其中的有形成分。此類儀器的自動化程度低，技術(shù)差別很大，部分儀器僅僅解決肉眼的視覺疲勞、及手工記錄工作?；贑OULTER原理的分析方法，與血液分析相同?；瘜W(xué)染色法。