第一篇：課程大綱-微生物限度檢查

《微生物限度檢查》課程教學大綱

學分：8學分

學時：144學時

適用專業(yè)：應用生物技術(shù)、生物化工等

一、課程性質(zhì)和任務(wù)

1、課程性質(zhì)：本課程是應用生物技術(shù)專業(yè)的必修課程。

2、課程任務(wù)：通過本課程的學習，使學員具備藥品生物制品、食品和化妝品等相關(guān)企業(yè)產(chǎn)品日常衛(wèi)生微生物限度檢查的基本知識和技能，為產(chǎn)品常規(guī)衛(wèi)生微生物檢驗把好質(zhì)量關(guān)。

二、課程基本要求

1、了解生物制品、藥品、食品和化妝品等各種產(chǎn)品衛(wèi)生標準；

2、熟悉各種檢品微生物限度檢查項目；

3、能獨立完成各種檢品處理和梯度稀釋，并按標準規(guī)定項目進行常規(guī)微生物限度檢查；

4、能按菌數(shù)報告規(guī)則、控制菌形態(tài)特征等判定限度檢查結(jié)果，并及時正確填寫檢驗記錄和報告。

5、能以積極心態(tài)養(yǎng)成安全、文明、無菌潔凈操作習慣，樹立強烈的責任心和質(zhì)量無差錯意識,保證檢驗結(jié)果真實可信。

三、教學條件

1、師資：具有藥品、生物制品、食品和化妝品等衛(wèi)生微生物檢驗工作經(jīng)驗的教師2人；

2、場地：項目一體化教學所需基本的實訓室和設(shè)備如下：

六、教學說明

微生物限度檢查屬于微生物檢定工中級工段的課程，適用于相關(guān)專業(yè)全體制和培訓教學，教學采取一體化項目教學，教學過程學生2人一組互相配合；10個教學項目有三個層次，項目1-6注重不同的檢測內(nèi)容的能力培養(yǎng)，項目7-9注重產(chǎn)品衛(wèi)生微生物檢驗多種內(nèi)容的同步操作，項目10注重檢驗全過程系統(tǒng)化，同時將相關(guān)微生物的知識、不同檢品的取樣和樣品處理、常見設(shè)備的使用分解到各個項目之中，與項目有機結(jié)合，實現(xiàn)了知識目標和能力目標的系統(tǒng)化。

考核方式：職業(yè)素質(zhì)占20%，課程結(jié)束由學生、實訓室管理人員和教師分別評分匯總；專業(yè)能力和創(chuàng)新能力占80%，分項目考核，項目1-9主要由教師對過程、結(jié)果和記錄完成情況進行考核，前面注重過程，后邊注重結(jié)果；項目10小組自選，完成結(jié)果全班交流，學生現(xiàn)場互評和教師評分結(jié)合。

七、教材和參考書

自編講義《微生物限度檢查》

參考書：《中華人民共和國藥典》2010年版（現(xiàn)行版本）

《中國藥品檢驗標準規(guī)范》2010年版（現(xiàn)行版本）

第二篇：微生物限度檢查法標準操作規(guī)程

微生物限度檢查法標準操作規(guī)程

一、目的：建立微生物限度檢查的基本操作規(guī)程，為微生物檢查人員提供正確的操作規(guī)程。

二、適用范圍：適用于品管化驗室的微生物限度檢查。

三、職責：品管微生物檢驗員對本標準的實施負責。

四、正文： 定義：微生物限度檢查法：系指非規(guī)定滅菌制劑及其原輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。2 實驗用具：

電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水溫箱、試管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、試管架、注射器、針頭、注射器盒、研缽、75%酒精棉球、紫外燈（365nm 波長）。3 培養(yǎng)基：

3.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、乳糖膽鹽培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基。

3.2 培養(yǎng)基的管理、配制應符合檢定菌、培養(yǎng)基管理規(guī)程、培養(yǎng)基配制規(guī)程。試液：甲基紅試液、a-奈酚乙醇試液、40%氫氧化鉀溶液、靛基質(zhì)試液。稀釋劑：0.9%無菌氯化鈉溶液。供試品溶液的制備：取供試品（供試品如為固體，置研缽中研磨成細粉）放入試管中，加入適量的稀釋劑制成1：10 濃度的供試品溶液。對照用菌液：控制菌檢查均應作相應已知菌的對照試驗，對照菌株為大腸桿菌[CMCC（B）441022]。取相應菌株的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1 白金耳，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18-20 小時，稀釋至1：106，對照菌的加入量為50-100 個。8 檢查法：

8.1 除另有規(guī)定外，細菌的培養(yǎng)溫度為30-35℃，霉菌的培養(yǎng)溫度為25-28℃，控制菌的培養(yǎng)溫度為35±1℃。8.2 細菌、霉菌計數(shù)：

8.2.1平皿菌落計數(shù)法取均勻供試液，進一步稀釋成1：102、1：103 等適宜的稀釋級。分別取連續(xù)三級10 倍稀釋的供試液各1ml，置直徑約90mm 的平皿中，再注入約45℃的培養(yǎng)基約15ml，混勻，等凝固后，倒置培養(yǎng)，每個稀釋級應作2~3 個平皿。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計數(shù)。8.2.2 菌數(shù)測定陰性對照試驗取供試驗用的稀釋劑各1ml，置4 個無菌平皿中，分別按細菌、霉菌計數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢查，不得長菌。

8.2.3 細菌培養(yǎng)時間為48 小時，分別在24 小時及48 小時點計菌落數(shù)，一般以48 小時菌落數(shù)為準，霉菌培養(yǎng)時間為72 小時，分別在48 小時及72 小時點計菌落數(shù)，一般以72 小時菌落數(shù)為準。菌落如蔓延生長成片，不宜計數(shù)。

8.2.4 點計后，計算各稀釋級的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。

8.2.5 菌數(shù)報告規(guī)則：細菌宜選取平均菌落數(shù)在30-300 之間的稀釋級，霉菌宜選取平均菌落數(shù)在30-100 之間的稀釋級，作為報告菌數(shù)計算的依據(jù)。如只有1 個稀釋級菌落數(shù)在30-300（30-100）

之間時，將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如同時有兩個稀釋級在30-300（30-100）之間時，按下式計算兩級比值。比值=低稀釋級平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)

高稀釋級平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)

.當比值≤2 時，以兩稀釋級的均值報告，當比值＞2 時以低稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如同時有3 個稀釋級的平均菌落數(shù)均在30-300（30-100）之間時，以后兩個稀釋級計算級間比值，如各稀釋級的平均菌落數(shù)均不在30-300（30-100）之間，以最接近30 或300 的稀釋級平均菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如各稀釋級平均菌落數(shù)均在300（100）以上，按最高稀釋級菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如各稀釋級平均菌落數(shù)均小于30 時，一般按最低稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告，如當1：10（1： 100）稀釋級平均菌落數(shù)等于或大于原液（或1：10）時，應以培養(yǎng)基稀釋法測定，按測定結(jié)果報告菌數(shù)。8.2.6 培養(yǎng)基稀釋法：取供試液（原液或1：10 供試液）3 份，每份各1ml，分別注入5 個平皿內(nèi)（每皿各0.2ml）每個平皿中傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后倒置培養(yǎng)，計數(shù)，每1ml 注入的5 個平板點計的菌落數(shù)之和即為每1ml 的菌落數(shù)，共得3 組數(shù)據(jù)，以3 份供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報告。

如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于1 時，則報告菌數(shù)為小于10 個。

8.3 控制菌檢查除另有規(guī)定外，取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、cm2），直接或處理后接種，經(jīng)增菌、分離培養(yǎng)后，進行革蘭氏染色、生化試驗等項檢查。8.3.1 大腸菌群：

8.3.1.1 檢樣稀釋及培養(yǎng)

① 以無菌操作，將檢樣25g（ml）放于含有225ml 滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠），經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10 的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好在均質(zhì)器中以8000—10000r/min 的速度處理1min，作成1：10 的均勻稀釋液。

② 用1ml 滅菌吸管吸取1：10 稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml 滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖不要接觸管內(nèi)稀釋液），混合均勻，做成1：100 的稀釋液。

③ 另取1ml 滅菌吸管，按上述操作順序，做10 倍遞增稀釋液。如此每次遞增稀釋一次，即換用一支1ml 滅菌吸管。

④ 根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或標本污染情況的估計，選擇3 個合適的稀釋度，每個稀釋度接種三管。8.3.1.2 乳糖發(fā)酵試驗

將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml 以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1ml 及1ml 以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種三管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。8.3.1.3 分離培養(yǎng)

將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18~24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實試驗。

8.3.1.4 證實試驗

在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1~2 個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±1℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。

8.3.1.5 報告：根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN 檢索表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN 值。9 結(jié)果判斷：

9.1 細菌菌落數(shù)、霉菌菌落數(shù)、控制菌三項均符合該品種微生物限度項下的規(guī)定，應判為供試品符合規(guī)定；其中任何一項不符合該品種項下規(guī)定，應判供試品不符合規(guī)定。

9.2 細菌菌落數(shù)、霉菌菌落數(shù)第一次測定超過該品種項下微生物限度規(guī)定時，應從同一批號樣品中隨機抽樣，復試兩次，以三次結(jié)果平均值報告。

9.3 如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上生長霉菌菌落數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上生長細菌菌落數(shù)超過該品種項下微生物限度規(guī)定時，經(jīng)復試2 次，如3 次結(jié)果平均值仍超過規(guī)定，應判為供試品不符合規(guī)定。9.4 各類制劑檢出控制菌或其他致病菌時，按第一次檢出結(jié)果為準，不再抽樣復試，即應判該供試品不符合規(guī)定。

第三篇：上海師范大學環(huán)境微生物課程大綱（模版）

※≈70-75% ※+*≈90%

環(huán)境微生物學教學大綱（應化專業(yè)）

緒論

*微生物的概念

※微生物的分類(簡單劃分、三域系統(tǒng)、六界系統(tǒng))細菌、古菌和真核生物的系統(tǒng)發(fā)育圖 ※微生物的分類單位 *微生物的命名(雙名法)※原核微生物和真核微生物各自的含義、區(qū)別 *微生物的特點

第一章

非細胞結(jié)構(gòu)的超微生物——病毒 ※病毒的一般特征 *病毒的分類 病毒的構(gòu)型

噬菌體、煙草花葉病毒、SARS的構(gòu)型 *病毒的一般大小

最大病毒和最小病毒舉例 ※病毒的化學組成

※病毒的結(jié)構(gòu)及相關(guān)表述

*大腸桿菌T系噬菌體的繁殖過程

細菌/病毒的溶原性、溶原性細菌的特征 病毒的培養(yǎng)特征、病毒的培養(yǎng)基 病毒的培養(yǎng)（如何分離培養(yǎng)噬菌體）

第二章原核微生物

※本章提到的各種代表微生物（課件中提到的微生物）※古菌(Archaea)的一般特點

※古菌、細菌在六界和三域系統(tǒng)內(nèi)所在的地位 細菌的形態(tài) 細菌的大小

※細菌的一般結(jié)構(gòu)和特殊結(jié)構(gòu) ※細菌細胞壁結(jié)構(gòu)（G+、G-）、組成與功能 *革蘭氏染色法 *細胞膜的結(jié)構(gòu) 細胞膜的功能 ※核糖體的作用

其他細胞質(zhì)中的內(nèi)含物 *擬核的概念及特點 芽孢的概念與作用

細菌的培養(yǎng)特征（如何通過培養(yǎng)判斷細胞的運動性*）※細菌的電荷和等電點、革蘭氏染色機理

*藍細菌的主要特點藍細菌的代謝（光合作用）藍細菌的二綱及代表種屬 藍細菌與人類及環(huán)境的關(guān)系 *放線菌的定義、放線菌菌絲的形態(tài)、功能

*放線菌的繁殖方式、鏈霉菌的生活史 放線菌的菌落特征

*藍細菌、放線菌、螺旋體、立克次體、支原體、衣原體的分類歸屬 ※名詞術(shù)語：莢膜、菌膠團、菌落、菌苔

第三章真核微生物

※原生動物的一般特征、分類歸屬

一、原生動物的一般特征

（一）原生動物的概念、細胞結(jié)構(gòu)和功能

原生動物是動物中最原始、最低等、結(jié)構(gòu)最簡單的單細胞動物；在活性污泥法廢水處理中原生動物以吞食細菌為生，對凈化污水起到一定作用, , 在污水處理中起指示作用；

*三類原生動物（肉足綱、鞭毛綱、纖毛綱）的代表種屬 不同種類原生動物的主要習性及意義 原生動物的胞囊及意義

原生動物在廢水凈化中的作用

*微型后生動物的分類歸屬、代表種屬 不同種類后生動物的主要習性及意義

※藻類的分類歸屬、營養(yǎng)類型

藻類的代表種屬及環(huán)境意義（水體富營養(yǎng)化）

※真菌的分類歸屬、代表種屬 ※酵母菌的概念

酵母菌特征、不同類型的細胞結(jié)構(gòu) *酵母菌的芽殖

*霉菌菌絲體結(jié)構(gòu)、菌落特征 霉菌的類型

第四章微生物的生理

生物酶的概念、分類、作用 *NADH的功能

※酶蛋白的本質(zhì)、酶的活性中心 酶的系統(tǒng)分類法、系統(tǒng)命名及編號

*酶催化特性、誘導契合假說、作用機理 *碳源的概念、作用 ※微生物的營養(yǎng)類型 *氮源的概念、作用 固氮微生物的概念 幾種主要的無機鹽所含元素的功能 *生長因子的概念

活性污泥所需的碳氮磷比 ※培養(yǎng)基的概念、種類

※營養(yǎng)物質(zhì)進入微生物細胞的方式、各自的特征、異同

＋＋初級主動運輸、次級主動運輸及鈉鉀泵（Na-K－ATP酶）主動運輸?shù)倪\行機制 供氫體、受氫體概念

※ATP的概念及3種生成方式

*產(chǎn)能代謝的類型（3種）及其定義、比較 *發(fā)酵、好氧呼吸步驟

※EMP途經(jīng)、三羧酸循環(huán)概念

發(fā)酵、好氧呼吸產(chǎn)能量、能量利用率 ※三大有機物有氧呼吸代謝途徑

※電子傳遞體系概念、功能、細胞定位 電子傳遞體的組成第五章微生物的生長繁殖與生存因子

*世代時間、世代數(shù)的概念及計算

※生長曲線及各個時期特征

*間歇培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)的概念

※常規(guī)活性污泥法采用哪個生長時期的微生物? 測定微生物總數(shù)的方法有哪些？ *什么是CFU計數(shù)法? 廢水處理中影響pH的因素

*根據(jù)微生物與氧的關(guān)系對微生物進行分類 *巴斯德效應

紫外線殺菌的原理 *消毒、滅菌的概念 重金屬的殺菌機制

※微生物之間的關(guān)系及典型舉例。

第六章遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)

證明遺傳物質(zhì)是核酸的三個經(jīng)典實驗。核酸的組成 ※基因的定義

基因按功能分類(3種)※乳糖操縱子的功能 *中心法則的內(nèi)容

*DNA的復制方式（半保留復制）原核生物和真核生物DNA復制的特點

*RNA的種類和功能（rRNA、mRNA、tRNA）*DNA的變性和復性 *遺傳密碼的涵義、數(shù)量，有意義密碼子、無意義密碼子的涵義 ※DNA如何指導蛋白質(zhì)合成 ※馴化

*雜交、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導的機制和過程 基因工程的定義 什么是超級細菌？

*什么是PCR技術(shù)？操作步驟?

第七章微生物的生態(tài) *生態(tài)系統(tǒng)的功能； 種群、群落的概念 土壤微生物的特點 *土壤自凈

空氣微生物特點

空氣微生物的測定：平皿落菌法； 貧營養(yǎng)湖、富營養(yǎng)湖概念

※水體自凈及過程

*氧垂曲線

排污點下游污化帶特征 *細菌菌落總數(shù)

*大腸菌群被選作致病菌指示菌的原因 ※水體富營養(yǎng)化

第八章微生物在環(huán)境物質(zhì)循環(huán)中的作用 碳循環(huán)中心 植物殘體成分

※纖維素的構(gòu)成及轉(zhuǎn)化 半纖維素的構(gòu)成 木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)

*淀粉的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)化 ※脂肪的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)化 ※氮的形態(tài)及氮循環(huán)

※氨化作用、硝化作用、反硝化作用 *固氮作用 硫的形態(tài)

*硫循環(huán)、硫化作用、反硫化作用

第九章水環(huán)境污染控制與治理的生態(tài)工程及微生物學原理 好氧活性污泥組成

*兩種基本的反應器形式及特點（推流/全混）、※好氧活性污泥性質(zhì)、功能中心、主體細菌、凈化機理； 菌膠團（概念）及其作用 *氧化塘概念、生態(tài)特點； 原生動物、后生動物的作用； ※生物膜法（概念）； 生物膜結(jié)構(gòu) *生物膜法特點 厭氧消化概念

※厭氧發(fā)酵四個階段；

第十章污、廢水深度處理和微污染源水預處理的微生物學原理 *生物脫氮原理、脫氮微生物 ※脫氮工藝(傳統(tǒng)A/O法)*硝化段、反硝化段運行操作關(guān)鍵點 水消毒的方法 ※氯的殺菌機制 *出廠水加氯的原則 不同形態(tài)氯消毒的特點

考試: 填空40分,專業(yè)名詞解釋(5個), 15分,問答45分

第四篇：微生物限度檢驗人員考試試題

2012年微生物限度檢查基礎(chǔ)知識考試試題 姓名： 分數(shù)：

一、填空題（1×35=35分）

1．微生物限度檢查和無菌檢查應在環(huán)境潔凈度 級的局部潔凈度 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。

2.除另有規(guī)定外，微生物限度檢查法中，細菌培養(yǎng)溫度為，培養(yǎng)時間為 ；霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為，培養(yǎng)時間為 ；控制菌培養(yǎng)溫度為，培養(yǎng)時間為。

3.除另有規(guī)定外，一般供試品檢驗量為 或 ；膜劑為 ；、的檢驗量可以酌減。其中沙門菌的檢驗量為 或。

4.檢驗時應從 個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑不得少于 片；一般應 抽取不少于檢驗用量 倍量的供試品。

5.試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過 代。從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為 代。菌液制備后若在室溫下放置，應在 小時內(nèi)使用，若保存在，可在24小時內(nèi)使用。

6.消除供試品抑菌活性的方法有、、、。

7.薄膜過濾法所用濾膜孔徑應不大于 um，直徑一般為50mm。若需要沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為。總沖洗量不得超過。8.培養(yǎng)基配制的分裝量不得超過容器的，以免滅菌時溢出；配制后應在 內(nèi)滅菌，避免細菌繁殖。

9.供試液制備若需水浴加溫時，溫度不應超過 ℃，供試液自制備至加入培養(yǎng)基不得超過 小時。

10.潔凈區(qū)測定沉降菌時，注入培養(yǎng)基的平皿應放置 分鐘。

二、單項選擇題（2×10=20分）

1.熱力滅菌法分干熱和濕熱滅菌兩類，并在同一溫度下濕熱滅菌效力較干熱滅菌效力要強這是因為（）

A、可迅速提高溫度 B、濕熱有一定潛熱、穿透力大，促進菌體蛋白凝固

C、迅速破壞細菌的酶系統(tǒng) D、使細菌迅速失活 2.生物安全柜主要原理（）

A、干燥 B、空氣經(jīng)濾膜除菌后定向流動 C、空氣定向流動 D、通風

3.培養(yǎng)基加入有供試品的平皿時的溫度不宜超過（）A、45℃ B、50℃ C、48℃ D、60℃

4.藥品微生物實驗室所檢測微生物的生物危害等級大部分為生物安全（）A、一級 B、二級 C、三級 D、四級

5.潔凈實驗室內(nèi)的溫度應控制在（），相對濕度最好控制在（）A、20～25℃，40～60% B、10～30℃，50～70% C、15～25℃，50～70% D、18～26℃，40～60% 6.操作間或凈化工作臺的潔凈空氣對環(huán)境的相對正壓為（），操作間與緩沖間的相對正壓為（）

A、不低于10帕，不高于5帕 B、不高于10帕，不低于5帕 C、不低于10帕，不低于5帕 D、不低于5帕，不低于10帕

7．檢查結(jié)果如各稀釋級的平板均無菌落生長或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，應報告（）A、0個 B、＜1 cfu C、0cfu D、＜1乘以最低稀釋倍數(shù)的值

8.微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法，檢查項目包括（）檢查

A、細菌數(shù)和霉菌數(shù) B、細菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù) C、細菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌 D、細菌數(shù)、霉菌數(shù)、控制菌數(shù) 9.微生物限度檢查驗證試驗至少應進行（）次獨立的平行試驗，各試驗菌每次試驗的回收率應不低于（）

A、3，70% B、2，80% C、3，80% D、2，70% 10.細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證時試驗菌加入量規(guī)定為（）cfu，控制

菌計數(shù)方法驗證時試驗菌加入量規(guī)定為（）cfu。A、50～100,50～100 B、10～100,10～100 C、10～100,50～100 D、50～100,10～100

三、多項選擇題（3×5=15分）

1.常用的清毒劑的種類有：（）A.75%乙醇 B.甲醛 C.碘酊 D.0.1%新潔爾滅 E.乳酸

2.下列（）不是無菌操作法的特點

A.無菌操作法是一個殺菌的過程 B無菌操作法是一個抑菌的過程 C.無菌操作法是一個消毒的過程 D.無菌操作法只能保持原有的無菌度 E.無菌操作的目的僅是為了防止待檢品被環(huán)境中的微生物污染

3.2010版藥典附錄微生物限度檢查法中，可選用的稀釋液有（）A.pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液 B.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液 C.pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液 D.0.9%無菌氯化鈉溶液 E.pH7.0無菌磷酸鹽緩沖液 4.供試液的制備方法有（）A、勻漿法 B、研缽法 C、保溫振搖法 D、振搖法

5.以下哪些是影響集菌培養(yǎng)效果的因素（）

A.溫度和培養(yǎng)基 B.氧氣和光 C.抗生素 D.滲透壓 E、PH值和氧化還原電位

二、判斷題（2×10=20分）

1．融化培養(yǎng)基可以選擇用水浴或電爐直接加熱，一次未用完的封存好可以再次使用。（）

2．培養(yǎng)時每垛最多堆放6個平板，以保證各個平板的受熱均勻。（）3.配制培養(yǎng)基時若出現(xiàn)沉淀屬正?，F(xiàn)象，無需過濾，可以直接使用。（）

4.濕熱滅菌條件就是指121℃15分鐘。（）

5.從事藥品微生物試驗工作的人員只要具備微生物學或相近專業(yè)知識的教育背景就可以直接上崗。（）

6.若同一稀釋級的兩個平板的菌落數(shù)小于15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。（）

7.若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌、酵母菌，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細菌，則應分別點計菌落數(shù)，合并計算后報告菌數(shù)。（）

8.對供試品進行微生物限度檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物生長的存活無影響。（）9.平皿法操作時應先注入培養(yǎng)基，再加入1ml供試液。（）10.MUG陽性，靛基質(zhì)陰性，判斷未檢出大腸埃希菌。（）

三、簡答題（2×5=10分）

1.簡述藥品染菌的可能原因。

2.列舉不少于五種的滅菌消毒方式。

一

1.1000、100

2.30～35℃，3天∕72h；23～28℃，5天∕120h；30～35℃，2天∕48h 3．10g，10ml，100cm；貴重藥品、微量包裝藥品；20g、20ml 4.2，4；隨機，3 5.5；0；2；2～8℃

6.培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法 7.0.45；100ml；1000ml 8.2／3，2h 9.45℃；1 10．30min

2二

BBABD

CDCAD 三

3.ABCDE;2.ABCE;3.ABCD;4.ABCD;5.ABCDE 四

×√×××

××√×× 五

1.一、二、三、四、2.水系統(tǒng)的內(nèi)外部污染；

無菌室密封性差；環(huán)境衛(wèi)生、個人衛(wèi)生達不到要求； 設(shè)備和配件消毒不符合要求、物料物品消毒不徹底 生產(chǎn)中操作不當

1.濕熱滅菌 2.干熱滅菌 3.輻射滅菌 4.氣體滅菌 5.消毒劑滅菌 6.紫外照射滅菌

7.過濾滅菌

第五篇：復方甲苯咪唑乳膏微生物限度檢查方法的研究

復方甲苯咪唑乳膏微生物限度檢查方法的研究

【摘 要】 目的：建立復方甲苯咪唑乳膏的微生物限度檢查方法。方法：按《中國藥典》2015年版第三部通則非無菌微生物限度檢查法規(guī)定的常規(guī)法進行驗證。結(jié)果：銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌以常規(guī)法驗證回收率均大于70%，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌菌液對照組和試驗組生長良好。結(jié)論：需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)采用常規(guī)的平皿傾注法，控制菌的檢查采用常規(guī)法。

【關(guān)鍵詞】 復方甲苯咪唑乳膏；微生物限度檢驗法；藥品檢驗

【中圖分類號】R286.0 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）11-0012-02

復方甲苯咪唑乳膏用于驅(qū)除蛔蟲、蟯蟲，其主要成分為鹽酸左旋咪唑和甲苯咪唑。為了保證所采用的檢驗方法適合于該藥品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)以及控制菌的檢查，確認供試液制備、測定方法及檢測系統(tǒng)適用于該藥品的檢驗。研究參照《中國藥典》[1]2015年版第三部通則“1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法”以及“1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法”、《中國藥品檢驗標準操作規(guī)范》[2]，建立復方甲苯咪唑乳膏微生物限度檢驗方法，并進行方法適用性試驗，現(xiàn)報道如下。儀器與材料

1.1 試驗環(huán)境 根據(jù)2015年版《中國藥典》第三部“9203藥品微生物質(zhì)量管理原則”[3]規(guī)定，試驗在環(huán)境潔凈度B級、局部潔凈度A級的單向流空氣的無菌室進行，陽性菌操作在符合國家Ⅱ級生物安全標準的生物安全柜內(nèi)進行。

1.2 儀器 BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）；GHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海金慧科電子有限公司）；MJX-160B-Z型微電腦霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海市博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；TZQ-Ⅱ型勻質(zhì)器型號（天津市津德實驗儀器技術(shù)開發(fā)中心）。

1.3 材料 復方甲苯咪唑乳膏（批號：160101、160102、160103，宿州億帆藥業(yè)有限公司），0.1%無菌吐溫溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（自配），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB，批號：20151210-00）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號：20160111-00）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號：20151110-00）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：20150716-00）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號：20151026-00）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，批號：20151112-00）等均由杭州微生物試劑有限公司提供。

1.4 試驗菌種 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10 104]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]等由中國醫(yī)學菌種保藏中心和中國藥品生物制品檢定所提供，試驗用菌株的傳代次數(shù)為3代。方法與結(jié)果

2.1 菌懸液的制備及菌懸液菌落數(shù)的檢查

2.1.1 菌懸液的制備 取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h的銅綠假單胞菌的TSB培養(yǎng)物1ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋至10-6備用，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌用同樣方法分別稀釋至10-5和10-8備用，取經(jīng)25℃培養(yǎng)2～3天的白色念珠菌的SDB培養(yǎng)物1ml，用上述方法稀釋至10-5，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加4mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋至10-6，備用。

2.1.2 菌懸液中菌落數(shù)的檢查 取“2.1.1”銅綠假單胞菌10-6級菌懸液、枯草芽孢桿菌10-5級菌懸液、金黃色葡萄球菌10-8級菌懸液各0.1ml，分別用已滅菌的45℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測定兩皿；取2.1.3白色念珠菌10-5級菌懸液、黑曲霉10-6孢子菌懸液各0.1ml，分別用已滅菌的45℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和已滅菌的45℃沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測定兩皿，按《中國藥典》2015年版規(guī)定溫度培養(yǎng)一定時間，計數(shù)，均應不大于100cfu/ml；實測結(jié)果見表1，符合要求。

2.2 供試液制備 取本品最小包裝兩支（10g/支），按微生物限度檢查法規(guī)定稱取10g，加40℃無菌0.1%吐溫溶液至100ml，勻漿儀2000轉(zhuǎn)/min，3min混勻，即為1∶[KG-*2]10的供試品溶液。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的適用性試驗

2.3.1 采用常規(guī)法（即平皿傾注法）進行3次獨立的平行試驗。

2.3.1.1 試驗組 取5支裝有1∶[KG-*2]10供試液的試管，分別加“2.1.1”試驗菌液0.1ml，使每1ml供試液中含菌量不大于100cfu，分別取上述試驗液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，立即注入20ml溫度不超過45℃熔化的無菌胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或無菌沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。

2.3.1.2 菌液對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，按試驗組操作。

2.3.1.3 供試品對照組 取“2.2”制備好的供試液，以無菌0.1%吐溫溶液代替菌液同試驗組操作。

2.3.1.4 陰性對照 取無菌0.1%吐溫溶液1ml置90mm的無菌平皿中，立即注入20ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5d，逐日觀察結(jié)果并記錄。

從表

2、表3可知，3次平行試驗，試驗組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值與菌液對照組平均菌落數(shù)的比值均在0.5～2范圍內(nèi)。

2.4 控制菌檢查方法的適用性試驗 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查方法的適用性試驗：按常規(guī)法進行三次平行試驗。

2.4.1 試驗組 分別取“2.2”中1∶[KG-*2]10供試液10ml及上述不大于100cfu/ml的銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌1ml，分別接種置90ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置35℃培養(yǎng)18～24h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

2.4.2 菌液對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，同試驗組操作。

2.4.3 供試品對照組 取1∶[KG-*2]10供試液10ml，以0.1%無菌吐溫溶液代替菌液同試驗組操作。

2.4.4 陰性對照組 取無菌0.1%吐溫溶液11ml，接種置90ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置35℃培養(yǎng)18～24h，按相應的控制菌的檢查法檢查。

由表4方法驗證結(jié)果可以看出銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌菌液對照組、試驗組生長良好，說明復方甲苯咪唑乳膏對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌無抑菌作用或抑菌作用較弱。討論

3.1 由上述驗證結(jié)果可知，三批復方甲苯咪唑乳膏在需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查的方法適用性試驗中，平皿法對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌的回收試驗均符合要求；從表4可知，控制菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查可采用常規(guī)法檢查。

3.2 培養(yǎng)基影響 本次驗證所用培養(yǎng)基均由杭州微生物試劑有限公司提供，在驗證前每批培養(yǎng)基均應進行無菌及性能檢查，符合2015版《中國藥典》要求方可用于微生物方法驗證。

3.3 菌種及菌液影響因素 《中國藥典》2015年版要求選用標準菌株，實驗所用黑曲霉菌株由中國藥品生物制品檢定所提供，其他菌株由中國醫(yī)學菌種保藏中心提供，均選用第3代為試驗菌，符合《中國藥典》2015版實驗菌株不得超過5代的標準。菌懸液制備完成后立即使用，未超過《中國藥典》2015年版規(guī)定的“菌液制備后室溫下放置，應在2h內(nèi)使用”的要求。

3.4 培養(yǎng)條件影響因素 《中國藥典》2015年版規(guī)定需氧菌用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30℃～35℃，培養(yǎng)時間不得超過3d，實驗取33℃，培養(yǎng)3d，符合要求。霉菌和酵母菌采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20℃～25℃培養(yǎng)時間不超過5d，本實驗采用25℃培養(yǎng)5d，符合要求。

3.5 稀釋劑的影響 因乳膏供試品不易混和均勻，故實驗過程中采用0.1%無菌吐溫溶液溶解供試品，再用勻漿儀進行攪拌混合。然后用pH7.0無菌氯化鈉未檢出蛋白胨緩沖液（自配）稀釋到合適稀釋級，符合《中國藥典》2015年版油脂類供試品處理要求。

3.6 菌落計數(shù)是方法驗證實驗過程中極為重要的一步，實驗采用含菌量不大于100cfu/ml菌懸液，計數(shù)時應仔觀察，必要時可借助放大鏡、兩人復核等方法，減少操作誤差。

參考文獻

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（三部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：80-90.[2]中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗總所.中國藥品檢驗標準操作規(guī)范[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：351-369.[3]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（三部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：220-221.（收稿日期：2016.04.11）