第一篇：酵母轉(zhuǎn)化問(wèn)題參考

Ways to Destroy Your Yeast Transformation

by Emily Crow on 27th of July, 2011 in Cell / Tissue Culture

Transforming yeast with DNA is a very similar process to transforming E.coli, but with just enough differences to trip you up if you let your attention slip.Whether you’re doing a yeast two-hybrid screen, or using yeast as a model system, here are a some mistakes to to avoid…

1.Forgetting to add single stranded DNA

While E.coli readily takes up double-stranded DNA, yeast requires the addition of single-stranded “carrier DNA” to enhance uptake of your plasmid or fragment.If you only add your plasmid to the transformation mix, chances are you’ll be confronted with a pristinely sterile plate after three days of incubation.2.Using old PEG

PEG(polyethylene glycol)is a crucial ingredient in the yeast transformation buffer.Unfortunately, it’s annoying to make and goes bad quickly.The percentage of PEG will make or break the success of your transformation;an old PEG solution has had a chance to evaporate, so that the water to PEG ratio is off.If you can stand it, make new PEG for every transformation.Otherwise, make it in small batches, and seal tightly with parafilm between uses to minimize evaporation.3.Using cells in stationary phase

Cells in log phase, or exponential growth, take up DNA with much better efficiency.This is not to say that cells from a stationary culture can’t be transformed – only that your successful transformation rate will be much lower.Your best bet is to use cells that are growing rapidly at the time of transformation.4.Using the wrong selective marker

A stupid mistake, but one that I’ve made more times than I’d like to admit.Double check to save yourself some tears!

5.Cutting corners when heat-shocking

This is a major difference between E.coliand yeast transformations: while E.coli is relatively delicate, and requires a heat-shock of less than a minute to take up DNA, the cell wall makes yeast more hardy and resistant to shock.Thus, for efficient transformation, yeast are generally heat-shocked for up to 45 minutes.I’ve gotten away with as little as 15 minutes, but any shorter and the transformation efficiency is drastically reduced.If you’re not in a hurry, let it go the whole 45 minutes, or you’ll get to experience the joy of doing it all over again.

第二篇：關(guān)于酵母類(lèi)產(chǎn)品是否上稅問(wèn)題

根據(jù)相關(guān)法律來(lái)分析，酵母細(xì)胞壁多糖和酵母自溶物無(wú)論是以原料還是添加劑形式，都應(yīng)該要交稅，只有簡(jiǎn)單處理的飼用酵母可以享受稅收優(yōu)惠政策，稅率會(huì)低一些，稅率為13%，正常位17%。

（以下是各法律文件）

關(guān)于飼料產(chǎn)品免征增值稅問(wèn)題的通知

根據(jù)國(guó)務(wù)院關(guān)于部分飼料產(chǎn)品繼續(xù)免征增值稅的批示，現(xiàn)將免稅飼料產(chǎn)品范圍及國(guó)內(nèi)環(huán)節(jié)飼料免征增值稅的管理辦法明確如下：

一、免稅飼料產(chǎn)品范圍包括：

（一）單一大宗飼料。指以一種動(dòng)物、植物、微生物或礦物質(zhì)為來(lái)源的產(chǎn)品或其副產(chǎn)品。其范圍僅限于糠麩、酒糟、魚(yú)粉、草飼料、飼料級(jí)磷酸氫鈣及除豆粕以外的菜子粕、棉子粕、向日葵粕、花生粕等粕類(lèi)產(chǎn)品。

（二）混合飼料。指由兩種以上單一大宗飼料、糧食、糧食副產(chǎn)品及飼料添加劑按照一定比例配置，其中單一大宗飼料、糧食及糧食副產(chǎn)品的參兌比例不低于95%的飼料。

（三）配合飼料。指根據(jù)不同的飼養(yǎng)對(duì)象，飼養(yǎng)對(duì)象的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)需要，將多種飼料原料按飼料配方經(jīng)工業(yè)生產(chǎn)后，形成的能滿(mǎn)足飼養(yǎng)動(dòng)物全部營(yíng)養(yǎng)需要（除水分外）的飼料。

（四）復(fù)合預(yù)混料。指能夠按照國(guó)家有關(guān)飼料產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)要求量，全面提供動(dòng)物飼養(yǎng)相應(yīng)階段所需微量元素（4種或以上）、維生素（8種或以上），由微量元素、維生素、氨基酸和非營(yíng)養(yǎng)性添加劑中任何兩類(lèi)或兩類(lèi)以上的組分與載體或稀釋劑按一定比例配置的均勻混合物。

（五）濃縮飼料。指由蛋白質(zhì)、復(fù)合預(yù)混料及礦物質(zhì)等按一定比例配制的均勻混合物。

二、原有的飼料生產(chǎn)企業(yè)及新辦的飼料生產(chǎn)企業(yè)，應(yīng)憑省級(jí)稅務(wù)機(jī)關(guān)認(rèn)可的飼料質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)出具的飼料產(chǎn)品合格證明，向所在地主管稅務(wù)機(jī)關(guān)提出免稅申請(qǐng)，經(jīng)省級(jí)國(guó)家稅務(wù)局審核批準(zhǔn)后，由企業(yè)所在地主管稅務(wù)機(jī)關(guān)辦理免征增值稅手續(xù)。飼料生產(chǎn)企業(yè)飼料產(chǎn)品需檢測(cè)品種由省級(jí)稅務(wù)機(jī)關(guān)根據(jù)本地區(qū)的具體情況確定。

三、本通知自2001年8月1日起執(zhí)行。2001年8月1日前免稅飼料范圍及豆粕的征稅問(wèn)題，仍按照《國(guó)家稅務(wù)總局關(guān)于修訂“飼料”注釋及加強(qiáng)飼料征免增值稅管理問(wèn)題的通知》（國(guó)稅發(fā)[1999]39號(hào)）執(zhí)行

飼料類(lèi)初加工免征企業(yè)所得稅

中華人民共和國(guó)財(cái)政部、國(guó)家稅務(wù)總局聯(lián)合發(fā)布財(cái)稅〔2008〕149號(hào)文印發(fā)了《享受企業(yè)所得稅優(yōu)惠政策的農(nóng)產(chǎn)品初加工范圍（試行）》（2008年版）

（二）飼料類(lèi)初加工

1.植物類(lèi)飼料初加工。通過(guò)碾磨、破碎、壓榨、干燥、釀制、發(fā)酵等簡(jiǎn)單加工處理，制成的糠麩、餅粕、糟渣、樹(shù)葉粉。

2.動(dòng)物類(lèi)飼料初加工。通過(guò)破碎、烘干、制粉等簡(jiǎn)單加工處理，制成的魚(yú)粉、蝦粉、骨粉、肉粉、血粉、羽毛粉、乳清粉。

3.添加劑類(lèi)初加工。通過(guò)粉碎、發(fā)酵、干燥等簡(jiǎn)單加工處理，制成的礦石粉、飼用酵母。

（三）牧草類(lèi)初加工

通過(guò)對(duì)牧草、牧草種籽、農(nóng)作物秸稈等，進(jìn)行收割、打捆、粉碎、壓塊、成粒、分選、青貯、氨化、微化等簡(jiǎn)單加工處理，制成的干草、草捆、草粉、草塊或草餅、草顆粒、牧草種籽以及草皮、秸稈粉（塊、粒）。

根據(jù)國(guó)家稅務(wù)總局《關(guān)于修訂“飼料”注釋及加強(qiáng)飼料征免增值稅管理問(wèn)題的通知》（國(guó)稅發(fā)[1999]39號(hào)）的規(guī)定，用于動(dòng)物飼養(yǎng)的糧食、飼料添加劑不屬于免稅范圍。根據(jù)《財(cái)政部 國(guó)家稅務(wù)總局關(guān)于若干農(nóng)業(yè)生產(chǎn)飼料征免增值稅政策的通知》（財(cái)稅[2001]113號(hào)）的規(guī)定，生產(chǎn)銷(xiāo)售的除尿素以外的氮肥、除磷酸二銨以外的磷肥、鉀肥以及以免稅化肥為主要原料的復(fù)混費(fèi)免征增值稅。飼料添加劑不屬于免稅范圍，應(yīng)繳納增值稅，稅率為17%。

從飼料添加劑預(yù)混料生產(chǎn)和原料構(gòu)成看，它是由五種或六種添加劑加上一種或兩種載體混合而成，添加劑的價(jià)值占預(yù)混料的７０％以上。按照國(guó)家稅務(wù)總局１９９３年１２月２５日印發(fā)的《均值稅部分貨物征稅范圍注釋》（國(guó)稅發(fā)〔１９９３〕１５１號(hào)）中“飼料”的解釋范圍的規(guī)定，飼料添加劑預(yù)混料難以歸入上述“飼料”的解釋范圍，因此，不能享受規(guī)定的“飼料”免征增值稅的待遇。

第三篇：轉(zhuǎn)化方法和酵母質(zhì)粒抽提

酵母轉(zhuǎn)化（快速）

侯昕

1、挑單菌落于3ml 2XYPAD培養(yǎng)基中，30°C 200rpm培養(yǎng)至菌濃度為2X108 cell/ml。（約18h）。

2、用1.5ml離心管收集菌液兩次，每次1ml，13500rpm，常溫離心30秒。3、4、2mg/ml carrier DNA變性，100°C 5分鐘，置冰上備用。在菌中依次加入

50％PEG3350

240ul

1M LiAc

34ul 2mg/ml S.S.carrier DNA

50ul plasmid DNA(各1ug)

36ul 每加入一種后，要吸打混勻。5、6、42°C水浴1－3小時(shí)。

13500rpm離心1分鐘，吸棄上清。沉淀中加500ul水，吸打均勻，100ul涂皿。

7、30°C培養(yǎng)兩天

此方法可用于已知蛋白互做檢測(cè)，將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化。

2×YPAD：Yeast Extract

16g

2mg/ml carrier DNA：

Peptone

32g

鮭魚(yú)精DNA（Sima D1626）

Glucose

32g

溶于水，低溫放置過(guò)夜，滅

Adenine hemisulfate

80mg

菌后－20°C保存。

d2 H2O

800ml 酵母轉(zhuǎn)化（高效）

侯昕

1、挑酵母單菌落于100ml SC液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖至菌濃度為2X107 cell/ml（稀釋20倍，OD545或OD600為0.1）。※或挑酵母單菌落于50ml 2XYPAD液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm搖至菌濃度為2X108cell/ml（稀釋200倍，OD545或OD600為0.1）。

2、用兩個(gè)50ml離心管分別收集40ml菌液，3000g，常溫離心5分鐘。

3、將菌分別轉(zhuǎn)入兩瓶150ml 2XYPAD培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)至菌濃度為2X107cell/ml。

4、用500ml離心管收集300ml菌液，3000g，5分鐘。用 200mlddH2O洗兩次，將菌轉(zhuǎn)入一個(gè)50ml離心管。

5、2mg/ml carrier DNA變性，100°C 5分鐘，置冰上備用。

6、配Mixture：

50％PEG3350

14.4Mml

1M LiAc

2.16ml 2mg/ml S.S.carrier DNA

3ml plasmid DNA＋ddH2O

2.04ml

7、把Mixture加入菌沉淀中，吸打均勻。

8、42°C水域熱激45分鐘；每5分鐘搖一下，使其受熱均勻。

9、3000g，離心5分鐘，棄上清，菌沉淀中加40ml水，吸打均勻，涂皿，100－200u/皿。

此方法可用于酵母雙雜交文庫(kù)篩選，建議分步轉(zhuǎn)化。

酵母質(zhì)粒抽提

侯昕

1、收集菌液，10000g，離心10秒。

2、菌沉淀中加200ul YLS，牙簽打散。

3、加200ul 苯酚氯仿異戊醇（25：24：1），搖5分鐘，13000rpm，離心5分鐘。

4、將上層轉(zhuǎn)入一新離心管中，重復(fù)3。

5、將上層轉(zhuǎn)入一新離心管中，加20ul 3M NaOAc（pH5.2）、500ul乙醇，搖勻，10000g，4°C離心10－30分鐘。

6、750ul 75％乙醇洗，10000g，離心5－10分鐘。

7、重復(fù)6。

8、吹干，加10－20ul 水或TE。

此方法得到的質(zhì)?？捎糜陔娹D(zhuǎn)大腸桿菌

Yeast lysis solution（YLS）：

2％（v/v）

Triton X－100

1％（w/v）

SDS 100mM

NaCl 1mM

EDTA

第四篇：實(shí)驗(yàn)總結(jié)的幾種高效釀酒酵母轉(zhuǎn)化方法

電轉(zhuǎn)法

設(shè)計(jì)方案一：

感受態(tài)制備：

1.挑一環(huán)酵母菌接種于5mL YEPD培養(yǎng)基中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)過(guò)夜； 2.取1mL一級(jí)種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養(yǎng)基中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)約16-18h(OD:1.3-1.5)；

3.于4℃離心收集菌體，用25mL冰無(wú)菌水洗滌一次后，細(xì)胞用10ml冰無(wú)菌水重懸，可換成較小的離心管； 4.加入1ml，pH7.5，10×TE緩沖液，搖晃均勻，再加入1ml 10×LiAc，旋轉(zhuǎn)搖勻，于30度輕輕搖動(dòng)45min；

5.再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同時(shí)旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，于30度輕輕搖動(dòng)15min； 6.于4℃離心，棄上清（用槍吸），再用25mL冰無(wú)菌水洗滌；

7.2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗滌，離心收集菌體，棄上清（用槍吸）； 8.每管用100ul山梨醇溶解，分裝于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。電轉(zhuǎn)化：

1．向感受態(tài)細(xì)胞中加入約5～10ug（體積小于10 ul）的DNA，用槍吹吸均勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，靜置5min；

2．擦干電轉(zhuǎn)杯，電擊，電擊參數(shù)：1.5KV，25uF，200歐姆；

3．立即加入1ml 預(yù)冷的山梨醇，轉(zhuǎn)移至EP管中，于30℃靜置1h； 4．離心，棄上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培養(yǎng)2h； 5．離心得菌體后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板進(jìn)行涂板。

說(shuō)明：該方法可直接采用50或100mL體系的一步法，即直接挑單菌落于YEPD中培養(yǎng)至預(yù)定菌濃，也可采用試管搖菌收集菌體制備感受態(tài)。

設(shè)計(jì)方案二：

感受態(tài)制備：

1.挑一環(huán)酵母菌接種于5mL YEPD培養(yǎng)基中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)過(guò)夜； 2.取1mL一級(jí)種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養(yǎng)基中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)約16-18h(OD:1.3-1.5)；

3.于4℃，5000rpm，5min離心收集菌體，用25mL冰無(wú)菌水洗滌后，細(xì)胞重懸于8ml處理液中（處理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室溫靜置30min；

4.4℃，5000rpm，5min離心收集菌體，用1.5mL 1mol/L預(yù)冷的山梨醇洗滌三次，離心條件一樣；

5.每管用100ul山梨醇溶解（以黃槍頭能吸取為宜，菌濃低時(shí)可適量少加入山梨醇），最后以80 ul的終體積轉(zhuǎn)移至EP管中（菌體太多可適當(dāng)放棄部分），置于-70℃冰箱保存。電轉(zhuǎn)化：

1.向感受態(tài)細(xì)胞中加入約3ug（體積小于10ul）的DNA，用槍吹吸均勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，靜置5min；

2.擦干電轉(zhuǎn)杯，電擊，電擊參數(shù)：2.0KV，25uF，200歐姆；

3.立即加入1ml 預(yù)冷的山梨醇，轉(zhuǎn)移至EP管中，于30℃靜置1h；

4.離心，棄上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培養(yǎng)2h； 5.離心得菌體后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板進(jìn)行涂板。

說(shuō)明：處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨(dú)于-20度保存，可配成100倍的貯備液。制備體系可按比例放大。

設(shè)計(jì)方案二特別適合于采用一步法制備感受態(tài)細(xì)胞 具體如下：

1.挑一環(huán)酵母菌接種于5mL YEPD培養(yǎng)基中或轉(zhuǎn)接于50mL YEPD中，在30℃、250-300rpm 條件下培養(yǎng)至OD=6-10（為防止菌體老化，可將50mL培養(yǎng)體系提早收獲細(xì)胞，取菌體時(shí)，以1mL/次，取菌兩次或三次不等，使用菌濃達(dá)到預(yù)定的OD:6-10）；

2.取1mL菌液分裝于EP管中，于4℃，12000rpm離心30s，棄上清； 3.收集菌體，用預(yù)冰的無(wú)菌水洗滌兩次，離心條件一樣；

4.所得菌體用1mL處理液（配方同上）于室溫下處理30min；

5.離心，棄上清，加入1ml 1M 預(yù)冷山梨醇，離心，棄上清，重復(fù)兩次； 6.最終用1M 預(yù)冷山梨醇溶解菌體至終體積為80 ul，于-70℃冰箱保存； 7.電轉(zhuǎn)方法同上。

8.每一步的離心均30s即可，在較短的時(shí)間內(nèi)制備出的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率特別高。

備注：OD檢測(cè)均為600nm，空白參比為：YEPD，高濃測(cè)定時(shí)應(yīng)稀釋測(cè)定。所有無(wú)菌水與山梨醇均在冰上預(yù)冷處理；在制備感受態(tài)階段，所有離心均在4℃條件下。

醋酸鋰轉(zhuǎn)化法

方案一：

1.挑一環(huán)酵母菌接種于5mL YEPD培養(yǎng)基中，30℃、200rpm培養(yǎng)過(guò)夜；

2.取1mL一級(jí)種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養(yǎng)基中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)約5h(OD:0.5-0.8)；

3.于4℃，5000rpm，5min離心收集菌體； 4.25mL冰無(wú)菌水洗滌兩次，離心條件一樣； 5.用1mL 0.1M LiAc懸浮，離心收集菌體；

6.再用0.5mL 0.1M LiAc懸浮，以50 ul/管分裝于EP管中，置于冰上備用； 7.依次向上述50 ul感受態(tài)細(xì)胞中加入50% PEG3350 ：240ul、1M LiCl：36ul、2mg/ml 單鏈DNA：50ul、轉(zhuǎn)化DNA（5-10ug）：50ul； 8.劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻（約1min）； 9.30℃水浴孵育30min；

10.42℃水浴熱休克20～25min；

11.13000rpm離心30s收集酵母菌體，重懸酵母于1ml YEPD培養(yǎng)基，30℃搖床

孵育4h；

12.離心收集沉淀菌體，取除約800 ul上清液，然后按每100 ul/板進(jìn)行漲涂板。

方案二：

1、接種液體YEPD培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)至1-2×107cells/ml；

2、取1mL一級(jí)種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養(yǎng)基中，30℃、250-300rpm培養(yǎng)約5h(OD:0.5-0.8)；

3、收集細(xì)胞，并用無(wú)菌水清洗，之后用1ml無(wú)菌水重懸，并轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管； 4、1ml TE/LiAC（10×TE[0.1 M Tris-HCI,0.01 M EDTA,pH 7.5]；lO×LiAc[1 M LiAc pH 7.5）清洗細(xì)胞，然后用1×TE/LiAC重懸至2×109 cells/ml； 5、1.5ml離心管中取50u懸浮液，用1ug轉(zhuǎn)化片段和50ug單鏈鮭魚(yú)精DNA混合；

6、加入300ul滅菌的40%PEG溶液，劇烈混勻； 7、30度振蕩培養(yǎng)30min； 8、42度水浴熱擊15min；

9、離心5s，用1ml 1×TE重懸，適當(dāng)稀釋后涂布于選擇培養(yǎng)基。

附：

電轉(zhuǎn)法方案二中的處量液配制方法：

1.A液成份：100 mM LiAc，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5；配制量：500mL。

1.1 稱(chēng)取54.654g山梨醇，用適量dd無(wú)菌水溶解于500 mL容量瓶中； 1.2 事先配制1 M LiAc母液，再?gòu)腖iAc母液中取50mL至1.1所述容量瓶中； 1.3 事先配好1M Tris-HCl（pH 7.5），再取5mL至1.1所述容量瓶中； 1.4 用dd無(wú)菌水定量至500mL，轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，于4℃保存。2.B液成份（母液）：1 M DTT

配制量：20mL。2.1 稱(chēng)取3.09g DTT，加入到50mL小燒杯內(nèi)； 2.2 加入20 mL的0.01M NaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22um濾器過(guò)濾除菌； 2.3 適量分成小份后，-20℃保存。

3.在使用時(shí)按每50mL菌體量用8mL處理液（A+B）。以50mL菌體為例：取A 液8mL，再取80ul 1 M DTT 于小三角瓶中混勻，備用。

第五篇：酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展

酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展

提 要 酵母雙雜交技術(shù)是一種有效的真核活細(xì)胞內(nèi)研究方法，在蛋白質(zhì)相互作用的研究方面得到了廣泛的應(yīng)用并取得了許多有價(jià)值的重要發(fā)現(xiàn)。作為一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，它自建立以來(lái)經(jīng)過(guò)了不斷的改進(jìn)與完善，不僅進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與精確性，而且在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了反向雙雜交，三雜交及核外雙雜交等多項(xiàng)技術(shù)。這些都將對(duì)功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究起到促進(jìn)作用。

0 引言

隨著分子生物學(xué)研究尤其是人類(lèi)基因組計(jì)劃的迅速發(fā)展，大量關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的信息不斷涌現(xiàn)，對(duì)這些信息進(jìn)行系統(tǒng)研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。這不僅需要利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行生物信息學(xué)的分析和預(yù)測(cè)，而且必須結(jié)合生物學(xué)實(shí)驗(yàn)獲取證據(jù)。為適應(yīng)同時(shí)對(duì)多個(gè)基因或蛋白進(jìn)行研究的發(fā)展趨勢(shì)，已出現(xiàn)了很多新技術(shù)，如DNA微陣列技術(shù)（DNA micoarry）,基因表達(dá)的系列分析（SAGE）,肽質(zhì)譜分析法，蛋白雙向膠電泳技術(shù)及酵母雙雜交技術(shù)（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母雙雜交技術(shù)以其簡(jiǎn)便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用等特點(diǎn)在基因功能的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。酵母雙雜交技術(shù)的基本原理

1989年，Song和Field建立了第一個(gè)基于酵母的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白間相互作用的遺傳系統(tǒng)〔1〕。很多真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分割開(kāi)的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異結(jié)合域（DNA-binding domain，BD）與轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptional activation domain，AD）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,否則無(wú)法完成激活功能。不同來(lái)源激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則特異地激活被BD結(jié)合的基因表達(dá)。基于這個(gè)原理，可將兩個(gè)待測(cè)蛋白分別與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白，并共表達(dá)于同一個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個(gè)待測(cè)蛋白間能發(fā)生相互作用，就會(huì)通過(guò)待測(cè)蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報(bào)告基因表達(dá)。通過(guò)對(duì)報(bào)告基因表型的測(cè)定可以很容易地知道待測(cè)蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。

酵母雙雜交系統(tǒng)由三個(gè)部分組成：(1)與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱(chēng)誘餌蛋白(bait)。(2)與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱(chēng)靶蛋白(prey)。(3)帶有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株。常用的報(bào)告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應(yīng)的缺陷型。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因。這些有利于實(shí)驗(yàn)后期雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。根據(jù)目前通用的系統(tǒng)中BD來(lái)源的不同主要分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng)。后者因其BD來(lái)源于原核生物，在真核生物內(nèi)缺少同源性，因此可以減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)。酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

酵母雙雜交技術(shù)產(chǎn)生以來(lái)，它主要應(yīng)用在以下幾方面：(1）檢驗(yàn)一對(duì)功能已知蛋白間的相

互作用。(2）研究一對(duì)蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域。通常需對(duì)待測(cè)蛋白做點(diǎn)突變或缺失突變的處理。其結(jié)果若與結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)合則可以極大地促進(jìn)后者的發(fā)展。(3)用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫(kù)，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑。(4)分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫(kù)。然后根據(jù)釣到的已知基因的功能推測(cè)該新基因的功能。常見(jiàn)問(wèn)題的解決與改進(jìn)

酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用中常遇到的問(wèn)題一是假陽(yáng)性較多，二是轉(zhuǎn)化效率偏低。所謂假陽(yáng)性就是:在待研究的兩個(gè)蛋白間沒(méi)有發(fā)生相互作用的情況下,報(bào)告基因被激活。主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨(dú)激活作用,或者這種融合蛋白的激活作用被外來(lái)蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合,則也可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。因此,為排除假陽(yáng)性就需要作嚴(yán)格的對(duì)照試驗(yàn)。應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。目前幾個(gè)公司推出的酵母雙雜系統(tǒng)都采用了多個(gè)報(bào)告基因,且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同,這可減少大量的假陽(yáng)性。另外,報(bào)告基因通常整合到染色體上,可以使基因表達(dá)水平穩(wěn)定,消除了由于質(zhì)?？截悢?shù)變化引起基因表達(dá)水平波動(dòng)而造成的假陽(yáng)性。即使根據(jù)嚴(yán)格的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明確實(shí)發(fā)生了蛋白間的相互作用，還應(yīng)對(duì)以下方面進(jìn)行分析：

(1)這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生,即這一對(duì)蛋白在細(xì)胞的正常生命活動(dòng)中是否會(huì)在同一時(shí)間表達(dá)且定位在同一區(qū)域。

（2)某些蛋白如是依賴(lài)于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員,它們具有普遍的蛋白間的相互作用的能力。

（3)一些實(shí)際上沒(méi)有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個(gè)親a-螺旋的蛋白質(zhì)間可以發(fā)生相互作用。十年來(lái),酵母雙雜交技術(shù)一直在消除假陽(yáng)性方面不斷改進(jìn),并且已取得較好的效果。

在酵母雙雜交的應(yīng)用中有時(shí)也會(huì)遇到假陰性現(xiàn)象。所謂假陰性，即兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用,但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來(lái)。造成假陰性的原因主要有兩 方面：一是融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性。這時(shí)應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。二是蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現(xiàn)象雖不是實(shí)驗(yàn)中的主要問(wèn)題,但也應(yīng)予以重視。

轉(zhuǎn)化效率是酵母雙雜交文庫(kù)篩選時(shí)成敗的關(guān)鍵之一，特別是對(duì)低豐度cDNA庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí)，必須提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)可采用共轉(zhuǎn)化或依次轉(zhuǎn)化，相比之下共轉(zhuǎn)化省時(shí)省力。更重要的是如果單獨(dú)轉(zhuǎn)化會(huì)發(fā)生融合表達(dá)蛋白對(duì)酵母細(xì)胞的毒性時(shí),共轉(zhuǎn)化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型的單倍體酵母中,通過(guò)兩種接合型單倍體細(xì)胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個(gè)二倍體細(xì)胞。目前很多機(jī)構(gòu)建立了大量的cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)，但這些文庫(kù)大多無(wú)法直接用于雙雜交系統(tǒng)的篩選。而文庫(kù)的質(zhì)量對(duì)于轉(zhuǎn)化和篩選又非常關(guān)鍵。因此，大量構(gòu)建適用于酵母雙雜交的文庫(kù)非常必要?，F(xiàn)已出現(xiàn)一種采用體內(nèi)重組技術(shù)來(lái)達(dá)到這個(gè)目的的方法。酵母雙雜交技術(shù)的新發(fā)展

酵母雙雜交技術(shù)在應(yīng)用中發(fā)揮了巨大的作用，但人們也注意到了它有一定的局限性。為此發(fā)展了多種適應(yīng)不同目的需要的改型的雙雜交技術(shù)。

反向雙雜交技術(shù) 在研究中檢測(cè)并鑒定出那些能阻斷兩個(gè)蛋白間相互作用的因素有重要意義。在研究那些能使相互作用被阻斷的因素(如尋找哪些結(jié)構(gòu)域上發(fā)生突變可使相互作用中

斷或那些分子可以阻斷相互作用)時(shí)，傳統(tǒng)的雙雜交技術(shù)有較大的局限性。因此，反向雙雜交系統(tǒng)(Reverse Two-Hybrid System)應(yīng)運(yùn)而生。這項(xiàng)技術(shù)的特點(diǎn)是采取了反選擇篩選策略。根據(jù)反選擇設(shè)計(jì)的不同，大致可以分為兩類(lèi)。一類(lèi)是用便于反選擇的URA3或CYH2基因作為報(bào)告基因。URA3基因編碼尿嘧啶合成途徑中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，使細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)。反之，在能生長(zhǎng)的細(xì)胞中，外界因素已使蛋白間的相互作用不能發(fā)生，而我們想知道的正是這些因素。因此，只要對(duì)存活的克隆進(jìn)行檢測(cè)就可以得到結(jié)果。Vidal等人用這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)了影響轉(zhuǎn)錄因子E2F1中與DP1相互作用必需區(qū)內(nèi)的點(diǎn)突變。另一類(lèi)是將常規(guī)報(bào)告基因(如HIS3)置于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn10編碼的tet-抑制因子(TetR)/操縱基因控制之下。待測(cè)蛋白之間發(fā)生相互作用后首先激活tet-R基因表達(dá)抑制因子TetR,TetR結(jié)合到tet操縱基因后就抑制了報(bào)告基因的表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)化子不能生長(zhǎng)。只有當(dāng)待測(cè)蛋白之間的相互作用被某種因素所阻斷而無(wú)法激活tet-R基因時(shí)，報(bào)告基因才能擺脫tet操縱基因的控制而表達(dá)，使轉(zhuǎn)化子獲得在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力。Shih 等人利用這種方法鑒定出cAMP-應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位點(diǎn)的Ser133突變會(huì)阻斷其與輔助激活因子(CREB結(jié)合蛋白)的相互作用。

三雜交技術(shù) 在許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞過(guò)程中，兩個(gè)蛋白間的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究這些大分子對(duì)蛋白間相互作用的影響過(guò)程中發(fā)展了一種新的技術(shù)系統(tǒng)——三雜交系統(tǒng)(Three-Hybrid System)，其本質(zhì)與雙雜交是相同的，只是需通過(guò)第三個(gè)分子的介導(dǎo)把兩個(gè)雜交蛋白帶到一起。例如小配體三雜交系統(tǒng)(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以滲透的二聚體化學(xué)誘導(dǎo)物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作橋梁，將AD和BD融合蛋白連接到一起，激活報(bào)道基因的表達(dá)。研究較多的是免疫抑制劑FK506。Belshaw等將FK506與環(huán)孢菌素A(Cyclosporin

A)構(gòu)建成異源二聚體，它能把分別與FK506和環(huán)孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活報(bào)告基因。Licitra將FK506與地米塞松(dexamethasone)通過(guò)共價(jià)鍵連接成二聚體。通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了FK506與蛋白FKBP-12間的特異性相互作用，表明用這種方法鑒定蛋白與小分子間的相互作用是切實(shí)可行的。RNA與蛋白之間的相互作用是許多細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，例如mRNA的翻譯，早期發(fā)育以及RNA病毒的感染等。然而可用于這方面研究的簡(jiǎn)便方法卻很少。RNA三雜交系統(tǒng)(RNA Three-Hybrid System)的建立為分析RNA與蛋白之間的相互作用提供了有效的手段。這個(gè)系統(tǒng)主要是由一個(gè)RNA分子和兩個(gè)都能結(jié)合該RNA的蛋白質(zhì)組成。此RNA的一部分與一個(gè)已知蛋白結(jié)合后就可利用它的另一部分去篩選新的RNA結(jié)合蛋白。因此這種技術(shù)既可檢測(cè)由RNA介導(dǎo)的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可篩選鑒定新的蛋白結(jié)合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突變體RevM10與Gal4 DB域融合作為誘餌蛋白，利用該RevM10蛋白能識(shí)別并結(jié)合其靶RNA中Rev蛋白反應(yīng)元件(Rev responsive element,RRE)的作用去篩選同樣也能與此RNA結(jié)合并已與Gal4 AD域融合的未知蛋白。根據(jù)同樣的原理，如將一個(gè)已知RNA與RRE融合形成雜合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作為誘餌，便可用于篩選該RNA結(jié)合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌體衣殼蛋白能識(shí)別結(jié)合其基因組內(nèi)一種21核苷酸的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特性，將RNA噬菌體衣殼蛋白與Lex DB域融合，構(gòu)建成可用于尋找體內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白的酵母三雜交系統(tǒng)。

核外雙雜交技術(shù) 在傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)中，蛋白之間的相互作用是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的。因此,它不能檢測(cè)某些在核外蛋白之間的相互作用。為了克服這種局限性，近年來(lái)有人建立了核外雙雜交技術(shù)。其中SRS 和USPS就是這種技術(shù)的兩個(gè)代表。SRS也稱(chēng)Sos蛋白召集系統(tǒng)(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分別將待測(cè)蛋白X與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一種鳥(niǎo)苷交換因子(EGF)Sos蛋白融合；將Y蛋白與錨定在酵母細(xì)胞膜上的Src肉豆寇烯化信

號(hào)蛋白融合，并使它們共表達(dá)于一個(gè)cdc25-2基因溫度敏感型突變的酵母菌株內(nèi)。由于該菌株中cdc25-2基因編碼的EGF蛋白在36℃條件下不能激活細(xì)胞膜上的Ras蛋白，Ras途徑不通。所以細(xì)胞無(wú)法在36℃條件下生存。但如果待測(cè)蛋白X與Y之間發(fā)生相互作用就能把Sos蛋白帶到細(xì)胞膜上并激活附近的Ras蛋白，從而打通Ras途徑，使該菌株獲得在36℃條件下生存的能力。Aronheim等用此技術(shù)鑒別出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分離到了一個(gè)AP-1抑制因子JDP2。USPS也稱(chēng)為基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的設(shè)計(jì)是根據(jù)這樣一個(gè)事實(shí)，即真核細(xì)胞中遍在蛋白與某一蛋白之間新生成的融合會(huì)被遍在蛋白特異的蛋白酶(UBPs)迅速切開(kāi)，但這種切割只有當(dāng)遍在蛋白正確折疊時(shí)才會(huì)發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，遍在蛋白基因的N端和C端這兩部分即使分離，只要共表達(dá)與同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，它們?nèi)阅苷_折疊。將待測(cè)蛋白X與帶有點(diǎn)突變的遍在蛋白N端片段融合，將待測(cè)蛋白Y與下游接有報(bào)告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它們共表達(dá)與同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)。因遍在蛋白N端片段內(nèi)含有點(diǎn)突變，它與C端片段之間不能自然形成正確的折疊。只有當(dāng)?shù)鞍譞和Y之間發(fā)生相互作用時(shí)才能克服點(diǎn)突變的影響，使遍在蛋白的兩端形成正確折疊，從而引來(lái)UBPs切除與C端片段連接的報(bào)告蛋白。此技術(shù)建立之初是通過(guò)Western blot檢測(cè)有無(wú)被切下的報(bào)告蛋白來(lái)判斷待測(cè)蛋白之間是否發(fā)生了相互作用的，所以操作比較繁瑣，不便于推廣。最近有人對(duì)它作了改進(jìn)，以一種融合的轉(zhuǎn)錄激活因子PLV作為報(bào)告蛋白。PLV一旦被從遍在蛋白C端片段上切下，它就會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活特定的報(bào)告基因，如：LacZ 和HIS3等。這樣就可以根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞是否生長(zhǎng)及顯色來(lái)判斷待測(cè)蛋白之間有無(wú)相互作用。因此極大地簡(jiǎn)化了操作步驟，提高了篩選效率。酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用的趨勢(shì)

在后基因組時(shí)代更具意義且更能發(fā)揮酵母雙雜交技術(shù)的領(lǐng)域是研究生命活動(dòng)中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。第一個(gè)具有開(kāi)拓性的工作是Bartel利用酵母雙雜交技術(shù)建立了一個(gè)T7-噬菌體的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)圖(linkage-map)。Fromont-Racine等對(duì)篩選到的陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定測(cè)序，并將它們分為5類(lèi)，然后對(duì)其中的四類(lèi)(非編碼序列除外)通過(guò)15輪的篩選與分析，繪制出一張綜合了酵母蛋白相互作用的全局性信息圖。這是以往的實(shí)驗(yàn)所難以獲得的。

為適應(yīng)功能基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大學(xué)的EST項(xiàng)目研究成果基礎(chǔ)上，采用了與傳統(tǒng)建庫(kù)方式完全不同的細(xì)胞內(nèi)同源重組方法，以高通量規(guī)模構(gòu)建了一種陣列模式的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。它主要有以下特點(diǎn)：

(1)來(lái)源于多種組織器官和細(xì)胞系，因此含有幾乎所有基因的cDNA；

（2）所含各種cDNA的豐度趨于平衡；

（3)含有較長(zhǎng)的插入序列，但不是全長(zhǎng)cDNA序列。

這樣既避免了5’非編碼區(qū)可能存在的終止密碼阻礙融合蛋白的翻譯，又保證了表達(dá)出的蛋白構(gòu)象接近于天然。這種建庫(kù)方法不僅減少了工作量，而且在雙雜交中新發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白種類(lèi)也明顯增多。

最后，有必要指出的是，酵母雙雜交技術(shù)必須與其它技術(shù)結(jié)合才能有利于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出更為完整和準(zhǔn)確的判斷。

胡文峰

2007040380106