第一篇：做酵母四個(gè)月的心得

還有個(gè)奇怪的現(xiàn)象，2天的時(shí)候克隆直徑不到2MM，還是乳白色的，長(zhǎng)到第3天后居然變成粉紅色的了，有的板紅色的程度更深一些

查資料，考慮有2個(gè)原因：1，長(zhǎng)的時(shí)間太長(zhǎng)，菌種老化了

2，培養(yǎng)板上的Ade含量不足，產(chǎn)生了代謝產(chǎn)物是粉紅色的(這一現(xiàn)象別人在實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)了)

3.也有人解釋說(shuō)是后期ade不足

般酵母雙雜交的bait序列不超過(guò)2000bp比較合適，這是因?yàn)?/p>

1、酵母的密碼子和人的密碼子有偏好性的差異，當(dāng)基因超過(guò)2000bp后，密碼子偏好性的累積效應(yīng)造成蛋白翻譯困難；

2、過(guò)大的bait蛋白的空間位阻效應(yīng)會(huì)影響Gal4的AD和BD的互做，就會(huì)造成即使bait和prey有互做時(shí)，Gal4的BD和AD沒(méi)有互做，從而不能激活報(bào)告基因表達(dá)。你的基因2346bp，對(duì)酵母來(lái)說(shuō)，翻譯比較困難，所以，酵母生長(zhǎng)緩慢，你可以考慮將你的基因分成兩段，分別用于篩庫(kù)。

第二篇：酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得

Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得

甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)有不少優(yōu)點(diǎn)，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)最為人熟知，并廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)。雖然說(shuō)酵母表達(dá)操作簡(jiǎn)單表達(dá)量高，但是在實(shí)際操作中，并不是每個(gè)外源基因都能順利得到高表達(dá)的。不少人在操作中會(huì)遇到這樣那樣的問(wèn)題，收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個(gè)被譽(yù)為最簡(jiǎn)單的畢赤酵母表達(dá)的經(jīng)典試劑盒過(guò)程中的心得體會(huì)。其中Xiang Yang是來(lái)自美國(guó)喬治城大學(xué)（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lombardi Cancer Center），部分用戶來(lái)自國(guó)內(nèi)。甲醇酵母部分優(yōu)點(diǎn)：

1.屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達(dá)； 2.AOX強(qiáng)效啟動(dòng)子，外源基因產(chǎn)物表達(dá)量高，表達(dá)產(chǎn)物可以達(dá)到每升數(shù)克的水平； 3.酵母培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，遠(yuǎn)較真核系 統(tǒng)簡(jiǎn)單，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；

4.可以誘導(dǎo)表達(dá)，也可以分泌表達(dá)，便于產(chǎn)物純化；

5.可以甲醇代替IPTG作為誘導(dǎo)物，部分甲醇酵母更可以用工業(yè)甲醇替代葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本低。

產(chǎn)品性能：優(yōu)點(diǎn)——使用簡(jiǎn)單，表達(dá)量高，His-tag便于純化；缺點(diǎn)——酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問(wèn)題。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達(dá)重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達(dá)出來(lái)的蛋白可以進(jìn)行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長(zhǎng)速度快，可以將表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。

畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ在多克隆位點(diǎn)（MCR）3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測(cè)和純化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表達(dá)，并且在表達(dá)后α-factor可以自動(dòng)被切除。在進(jìn)行克隆的時(shí)候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標(biāo)蛋白中增加兩個(gè)氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標(biāo)記，而誘導(dǎo)表達(dá)的載體需要甲醇——甲醇比一般用于大腸桿菌表達(dá)誘導(dǎo)使用的IPTG便宜。第一步——構(gòu)建載體

Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點(diǎn)可供選擇，同時(shí)也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。

紅葉山莊：有關(guān)是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在原核表達(dá)，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點(diǎn)，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽(yáng)性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對(duì)于大小合適（30—50KD）的蛋白在產(chǎn)量上是pPIC9K無(wú)法比擬的。

leslie：要做畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)，首先當(dāng)然就要了解這個(gè)可愛(ài)的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛(ài)），她和大腸桿菌長(zhǎng)得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過(guò)程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測(cè)。大家做畢赤表達(dá)的時(shí)候應(yīng)該都遇過(guò)這種情況吧，表達(dá)過(guò)程中染菌（我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)污染過(guò)各種顏色形狀的細(xì)菌，那真是一段可怕的經(jīng)歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就是浪費(fèi)大把的

時(shí)間了。

基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長(zhǎng)的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長(zhǎng)的周期等等情況后，當(dāng)然更多的精力還是應(yīng)該花在表達(dá)的目的蛋白上，我的表達(dá)蛋白有些恐怖，有100KD，本來(lái)當(dāng)然應(yīng)該放在大腸桿菌中表達(dá)，但是為了分泌表達(dá)（其實(shí)后來(lái)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pET系列分泌表達(dá)系列也不錯(cuò)）和糖基化修飾（主要是這個(gè)方面，因?yàn)槲业牡鞍资侨嗽吹?，表達(dá)出來(lái)用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長(zhǎng)，所以在做克隆的時(shí)候也要非常小心，需要注意的是：

①酶切位點(diǎn)不能出現(xiàn)在目的DNA片段中——如果片段長(zhǎng)無(wú)法避免，可以采用平末端連接；

②雖然α-factor可以自動(dòng)切除，但是在設(shè)計(jì)表達(dá)的時(shí)候，如果在N端不能出現(xiàn)任何多余的aa（比如藥物蛋白表達(dá)），需要特別留意（說(shuō)明書上有詳細(xì)說(shuō)明：P13）；

③有三種不同的讀碼框（對(duì)于pPICZα系列來(lái)說(shuō)就是對(duì)上α-factor序列），在設(shè)計(jì)克隆的時(shí)候要反復(fù)確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問(wèn)題；

④無(wú)論pPICZ還是pPICZα都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒(méi)有ATG（起始密碼子），有人認(rèn)為酵母啟動(dòng)子與外源基因的ATG之間的距離越短對(duì)于表達(dá)的該基因越有利；

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；

⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關(guān)基因表達(dá)偏好密碼子的問(wèn)題有人認(rèn)為沒(méi)有必要更換，有人認(rèn)為一定要換，個(gè)人認(rèn)為以產(chǎn)量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過(guò)長(zhǎng)就比較麻煩，不過(guò)有許多真核保守蛋白其實(shí)是和酵母密碼子相似的；

⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因?yàn)榕掠绊懙娇股刈饔茫╖eocin平板要避光保存）；

⑧測(cè)序引物可以用α-factor信號(hào)引物，也可以用5'AOX1引物；

⑨如果需要高量表達(dá)，可以考慮做克隆的時(shí)候串聯(lián)基因片段進(jìn)行表達(dá)，另外也可以在轉(zhuǎn)化酵母的時(shí)候重復(fù)轉(zhuǎn)化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因?yàn)檫@個(gè)序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會(huì)影響表達(dá)，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因?yàn)檫@些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會(huì)由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄，也需要多加注意。

第二步就是將線性化的DNA轉(zhuǎn)化入Pichia酵母中：

Xiang Yang：EasySelect試劑盒準(zhǔn)備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因?yàn)檫@個(gè)菌株轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量相對(duì)而言較高，如果你有電轉(zhuǎn)儀（electroporator），可以嘗試一下。如果沒(méi)有的話，EasySelect也準(zhǔn)備了化學(xué)轉(zhuǎn)化試劑——EasyComp Transformation，但是由于轉(zhuǎn)化率的緣故，我建議使用電轉(zhuǎn)儀。

leslie：在得到了正確的序列之后就可以準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點(diǎn)有些不盡相同

（Manual上寫的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔(dān)心轉(zhuǎn)化率的話可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT＋表現(xiàn)型，也就是說(shuō)可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)，但是據(jù)說(shuō)會(huì)對(duì)外源基因表達(dá)有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護(hù)表達(dá)產(chǎn)物免受降解，促進(jìn)表達(dá)量的提高。

一般來(lái)說(shuō)，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用Mut－細(xì)胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對(duì)較多(約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進(jìn)行。而對(duì)于分泌蛋白的表達(dá)，無(wú)論是甲醇利用慢(Mut-)還是甲醇利用快(Mut+)的細(xì)胞都可應(yīng)用，如在人血清白蛋白(HSA)(為分泌型蛋白)的表達(dá)中就看不出兩種類型的細(xì)胞之間有什么明顯差別。

所以一般手冊(cè)都會(huì)建議同時(shí)在這幾種菌株中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這主要是因?yàn)椴煌幕蛟诓煌慕湍妇锌赡鼙磉_(dá)量截然不同，因此在最開(kāi)始的時(shí)候建議多用幾種酵母菌實(shí)驗(yàn)。

另外有個(gè)保存問(wèn)題，原始酵母菌一定要保存好，因?yàn)榻湍冈趥鞔啻魏髸?huì)影響其轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量，所以一方面分多管分裝保存于-80℃，另一方面如果出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化或者表達(dá)的問(wèn)題，在其它方面都沒(méi)有出錯(cuò)的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。

在準(zhǔn)備酵母菌的同時(shí)也需要準(zhǔn)備質(zhì)粒，由于酵母菌轉(zhuǎn)化對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的要求較高，量也較大（5-10ug），因此許多時(shí)候都會(huì)用PEG大提質(zhì)粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準(zhǔn)備好足夠量的質(zhì)粒，并且不要忘記也要同時(shí)準(zhǔn)備空載體以做對(duì)照。在轉(zhuǎn)化前質(zhì)粒需要進(jìn)行線性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達(dá)量高的一個(gè)重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達(dá)）。線性化位點(diǎn)個(gè)人認(rèn)為也會(huì)影響到表達(dá)量，對(duì)于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個(gè)線性化位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機(jī)會(huì)少，而且也有可能遇上沒(méi)有合適的線性化位點(diǎn)的情況，這個(gè)時(shí)候也不是說(shuō)不能進(jìn)行表達(dá)，但是準(zhǔn)備的質(zhì)粒就要增加10倍，另外也可以進(jìn)行部分酶切（即先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，掐定時(shí)間和酶量保證被切開(kāi)的質(zhì)粒有部分是在線性化位點(diǎn)切開(kāi)而基因片段保存完好）。

在線性化之后的質(zhì)粒就可以酒精沉淀回收了——中間步驟需要使酶失活，說(shuō)明書建議是熱失活或者EDTA，個(gè)人認(rèn)為前者比較好，主要是擔(dān)心EDTA對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65℃/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風(fēng)干，這一步需要多加注意保證風(fēng)干完全，因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)證明殘留的酒精對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響頗大。

接下來(lái)就是酵母轉(zhuǎn)化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實(shí)驗(yàn)決定表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)化方法有不少，例如電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，其方法的難易程度和轉(zhuǎn)化率高低呈反向遞減的，也就是說(shuō)電轉(zhuǎn)最容易，轉(zhuǎn)化率較高（但要求有電轉(zhuǎn)儀），而原生質(zhì)體最麻煩，而且效果不好（比較傳統(tǒng)），因此不建議使用，EasySelect說(shuō)明書上這么建議，并且也詳細(xì)說(shuō)明了電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化（EasyComp和LiCl）方法的過(guò)程，可以按部就班。需要注意的是（電轉(zhuǎn)過(guò)程）：

①最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過(guò)的酵母放置時(shí)間不要超過(guò)一個(gè)星期；

②擴(kuò)大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，個(gè)人認(rèn)為不需要OD600達(dá)到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，這個(gè)時(shí)候的酵母比較新鮮，轉(zhuǎn)化率比較高； ③整個(gè)感受態(tài)制作過(guò)程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機(jī)，這是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵——為了進(jìn)一步保證這一點(diǎn)，無(wú)菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉(zhuǎn)杯都要預(yù)冷；

④電轉(zhuǎn)儀需要預(yù)熱，所以準(zhǔn)備感受態(tài)的時(shí)候就可以把電轉(zhuǎn)儀打開(kāi)了，電轉(zhuǎn)后山梨醇的加入要快，曾有人做實(shí)驗(yàn)證明晚一秒就會(huì)降低轉(zhuǎn)化的數(shù)量級(jí)，雖然不一定可信，但是我個(gè)人也認(rèn)為這個(gè)過(guò)程要快，電轉(zhuǎn)后可以看看時(shí)間，如果時(shí)間過(guò)短（比如(4)就可能說(shuō)明雜質(zhì)較多，會(huì)影響轉(zhuǎn)化率；

⑤轉(zhuǎn)化后溫育是個(gè)增加同源重組，增加存活率的過(guò)程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30℃搖一段時(shí)間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉(zhuǎn)化率。

(化學(xué)轉(zhuǎn)化)

如果沒(méi)有電轉(zhuǎn)儀，LiCl轉(zhuǎn)化是一種可供選擇的方法，轉(zhuǎn)化率是102到103cfu/ug。

主要過(guò)程為： 取過(guò)夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8-1.0；4℃，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL，4℃，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50μl冰預(yù)冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至80-90ml。

LiCl轉(zhuǎn)化 取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞12 000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入 50%PEG240ml 1mmol/L LiCl

ml 單鏈鮭精DNA

25ml 線性化質(zhì)粒DNA 10 ml(約10mg)用吸頭反復(fù)吹打，使細(xì)胞沉淀與加入的溶液混勻，30℃靜置溫育30min，42℃熱擊20-25min，4500rpm離心10min，吸棄轉(zhuǎn)化液，細(xì)胞沉淀加1ml YPD培養(yǎng)基于30℃ 200 rpm培養(yǎng)2-4hr，取轉(zhuǎn)化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培養(yǎng)2-3天。

第三步——挑克隆篩選

Xiang Yang：在protocol中用了許多篇幅來(lái)指導(dǎo)這一步，包括如何去通過(guò)平板篩選，觀測(cè)生長(zhǎng)速率來(lái)確定Mut表現(xiàn)型等。這個(gè)過(guò)程需要3到5天，而我一般只用用了4個(gè)小時(shí)進(jìn)行PCR（AOX引物）篩選。

leslie：完成轉(zhuǎn)化后就是克隆鑒定的過(guò)程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過(guò)程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因?yàn)楸容^快），具體過(guò)程protocol上說(shuō)的很清楚，其實(shí)也很簡(jiǎn)單，就是凍融破菌進(jìn)行菌落PCR，但是其中許多具體細(xì)節(jié)問(wèn)題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問(wèn)題，許多人用PCR方法進(jìn)行鑒定都無(wú)法得到結(jié)果，甚至在表達(dá)出了以后還是無(wú)法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無(wú)法正常釋放酵母基因組，一般通過(guò)培養(yǎng)菌然后進(jìn)行沸水和-20℃冷凍循環(huán)過(guò)程裂解細(xì)胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內(nèi)是可以得到好的結(jié)果的，但是有時(shí)候片段過(guò)長(zhǎng)，模壁就會(huì)阻礙擴(kuò)增，所以我們實(shí)驗(yàn)室會(huì)用蝸牛酶（很便宜的酶來(lái)的）來(lái)幫助溶菌，我看許多實(shí)驗(yàn)室也會(huì)這么做，不過(guò)加入的時(shí)間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。

第二就是是模板量，個(gè)人建議模板真的不要加太多了，按照說(shuō)明書的上的5ul我覺(jué)得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當(dāng)然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來(lái)凍融的菌數(shù)量有關(guān)。其次是假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會(huì)出現(xiàn)3.6kb的片段，而Mut+則會(huì)出現(xiàn)AOX1基因原本長(zhǎng)度的片段——大約長(zhǎng)2.2kb，因此如果的基因片段長(zhǎng)度相似，要注意區(qū)分。建議PCR過(guò)程中使用多對(duì)引物進(jìn)行反應(yīng)，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各種對(duì)照多了有利于比較——當(dāng)然前提是你不能暈了頭。

掉了毛的鴕鳥(niǎo)：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄終止子(5’AOX1和3’AOX1),他們被多克隆位點(diǎn)分開(kāi),外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標(biāo)記（HIS4區(qū)的整合方式為位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4）恢復(fù)野生型.HIS4區(qū)或AOX1區(qū)位點(diǎn)的整合都使轉(zhuǎn)化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進(jìn)行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS＋表型以篩選轉(zhuǎn)化子.）及3’AOX1區(qū),當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí),他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個(gè)載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,外源基因在5’AOX1啟動(dòng)子的控制下表達(dá).在載體中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關(guān),通過(guò)篩選抗G418能力強(qiáng)的酵母即可獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.第四步——表達(dá)

Xiang Yang：將你的克隆在YPD培養(yǎng)基中培育到OD600值達(dá)到6.0，就可以離心收菌。用表達(dá)培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30oC培育過(guò)夜。

leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說(shuō)什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達(dá)，有許多人在酵母表達(dá)上花費(fèi)了大量的時(shí)間——不同于大腸桿菌的兩天出結(jié)果，一次畢赤酵母的表達(dá)就需要起碼一周的時(shí)間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場(chǎng)空，我個(gè)人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉(zhuǎn)化的酵母菌，另外調(diào)整進(jìn)行重新轉(zhuǎn)化。

另外剛開(kāi)始的時(shí)候可以用小量表達(dá)，可以用5ml：生長(zhǎng)慢型，生長(zhǎng)快型，陰性對(duì)照（空質(zhì)粒），陽(yáng)性對(duì)照（可以是曾經(jīng)表達(dá)成功的重組子）和沒(méi)有進(jìn)行轉(zhuǎn)化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值2-6，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時(shí)間，一半為20-30分鐘，讓菌沉淀下來(lái)，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉(zhuǎn)入BMMY中誘導(dǎo)表達(dá)，這些步驟都需要在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行，如果要區(qū)分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表達(dá)，有可能會(huì)在沒(méi)有達(dá)到4天的時(shí)間培養(yǎng)基就干了，所以可以適當(dāng)補(bǔ)充一些，以及在搖床里放置盛有無(wú)菌水的深口瓶，來(lái)保持搖床里濕度。

誘導(dǎo)物甲醇注意要在超凈臺(tái)中打開(kāi)，可以分裝到滅過(guò)菌的瓶子中——當(dāng)然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過(guò)甲醇瓶口的時(shí)候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。另外如果覺(jué)得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過(guò)紗布添加甲醇，這個(gè)方法可能會(huì)造成染菌，慎選。說(shuō)到紗布就想到了通氣性問(wèn)題，酵母在無(wú)氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導(dǎo)的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對(duì)于這一基因的表達(dá)影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個(gè)搖床進(jìn)行三十度酵母表達(dá)，這樣可以考慮將紗布減少到3—5層，同時(shí)需要注意的是搖瓶?jī)?nèi)菌液體積不要超過(guò)10-30%。

每天取樣出來(lái)進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過(guò)每天做膠跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時(shí)跑，不過(guò)樣品一定要煮過(guò)凍存，而且每次取樣不要反復(fù)凍融，最好分裝保存——因?yàn)榈鞍捉?jīng)煮沸變性會(huì)不穩(wěn)定，容易降解。另外為了防止蛋白在分泌出來(lái)的過(guò)程就降解了（特別是小分子蛋白），也可以通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說(shuō)明書講解得詳細(xì)），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護(hù)物質(zhì)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白水解酶 的活性來(lái)防止表達(dá)產(chǎn)物降解。

如果使用的是分泌型培養(yǎng)基，按道理收集培養(yǎng)基上清就可以進(jìn)行下一步分析了，但是由于培養(yǎng)基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測(cè)不出來(lái)的——除非你的表達(dá)蛋白量非常大。所以需要進(jìn)行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當(dāng)然最簡(jiǎn)單的就是煮沸蒸發(fā)水分濃縮了。另外跑膠的時(shí)候同時(shí)對(duì)照酵母胞內(nèi)蛋白，以防沒(méi)有分泌出來(lái)。SDS-PAGE的配置參見(jiàn)分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對(duì)應(yīng)性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過(guò)是個(gè)需要全盤重新準(zhǔn)備的過(guò)程，要考慮清楚。如果選用的載體是帶有信號(hào)肽的，雖說(shuō)是分泌表達(dá)好純化，但實(shí)際上畢赤酵母本身還是有本底表達(dá)的，而且有時(shí)候會(huì)造成假陽(yáng)性，所以最后表達(dá)過(guò)程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細(xì)節(jié)可見(jiàn)Western Blotting前傳：想成為高手嗎？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒(méi)有合適抗體（如果是利用從大腸表達(dá)出來(lái)的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統(tǒng)表達(dá)出來(lái)的蛋白無(wú)法發(fā)生免疫作用），可以選用anti-myc或者anti-his的，前提當(dāng)然是你的蛋白沒(méi)有提前終止。

其它在表達(dá)中可能出現(xiàn)的情況包括表達(dá)量低，沒(méi)有分泌表達(dá)（針對(duì)pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無(wú)法重復(fù)，表達(dá)出來(lái)的蛋白偏大等等，需要分各個(gè)方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號(hào)肽，但是就是無(wú)法分泌出來(lái)，這可能是蛋白結(jié)構(gòu)在通過(guò)細(xì)胞膜的時(shí)候受到了阻礙，可能需要重新轉(zhuǎn)化，更換線性化位點(diǎn)或者更換菌株；如果蛋白表達(dá)第一天較高，但是之后越來(lái)越少，這很有可能是蛋白降解了或者產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)；畢赤酵母無(wú)法重復(fù)的問(wèn)題比較嚴(yán)重，許多情況下在第一次獲得了高量表達(dá)之后就再怎么也重復(fù)不了這個(gè)結(jié)果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達(dá)出來(lái)的蛋白分子量偏大則是個(gè)正常現(xiàn)象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進(jìn)行WB或進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

第五步——發(fā)酵和產(chǎn)物純化

Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE Healthcare），經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一個(gè)大小為45kDa，可以通過(guò)二硫鍵形成反向平行二聚體(antiparallel homodimer)的糖蛋白，經(jīng)過(guò)純化，我通過(guò)一個(gè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(cell proliferation assay)檢測(cè)了其活性，結(jié)果表明表達(dá)出來(lái)的蛋白在體外有完全的活性。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結(jié)合活性，與對(duì)照(通過(guò)大腸桿菌和Bacular細(xì)胞未帶tag的蛋白)相比，his-tag有一點(diǎn)副作用。

伊可麗：由于在搖瓶培養(yǎng)中巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的水平往往不能準(zhǔn)確地反映罐發(fā)酵中的表達(dá)情況，使之成為令人頭痛的問(wèn)題。主要原因是在搖瓶培養(yǎng)中，培養(yǎng)液的pH值無(wú)法控制，培養(yǎng)物通氣不充分及無(wú)法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對(duì)每一個(gè)表達(dá)菌株進(jìn)行繁瑣的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)，仍需摸索表達(dá)菌株的搖瓶培養(yǎng)條件，使其產(chǎn)物的表達(dá)量與預(yù)期的發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果相近。

總而言之，EasySelect系統(tǒng)是一個(gè)便于操作的酵母表達(dá)系統(tǒng)，我已經(jīng)使用這一系統(tǒng)表達(dá)過(guò)15個(gè)類似物了，每一個(gè)我都獲得了超過(guò)1mg/1升培養(yǎng)液的純化蛋白。

第三篇：安琪酵母--班組長(zhǎng)學(xué)習(xí)培訓(xùn)心得

記得在《沒(méi)有任何借口》中有這樣一段話：“每個(gè)人所作的工作，都是由一件一件的小事構(gòu)成的所有的成功者，他們與我們都做著同樣簡(jiǎn)單的小事，唯一的區(qū)別就是，他們從不認(rèn)為他們所做的事是簡(jiǎn)單的事”，聽(tīng)起來(lái)平實(shí)無(wú)華的一句話，細(xì)細(xì)品來(lái)卻意味深長(zhǎng)。

通過(guò)這幾個(gè)課程的學(xué)習(xí)，讓我從新了解和明白做為一個(gè)管理人員,在現(xiàn)場(chǎng)管理中需要管的是什么。通過(guò)培訓(xùn)能明確自己的工作職責(zé),不單只是把工作做好,還要正確的為自己擬定目標(biāo),并將目標(biāo)作為執(zhí)行工作的依據(jù),合理的安排工作。

在沒(méi)有培訓(xùn)前我對(duì)目視管理并不是很了解,通過(guò)培訓(xùn)后,讓我對(duì)目視管理有了更深的了解,并希望在日后的工作中能很好的運(yùn)用,有工作中能明確時(shí)間,嚴(yán)守時(shí)間,實(shí)時(shí)對(duì)應(yīng),預(yù)見(jiàn)性的去工作,要做到老師說(shuō)的:前無(wú)古人,后無(wú)來(lái)者。

在培訓(xùn)過(guò)程中讓我明白5S不單只是要做好(整理、整頓、清掃、清潔、素養(yǎng))最重要的是制造一個(gè)和-諧的工作環(huán)境,讓員工在和-諧的氛圍環(huán)境下工作,這樣才能做出好的品質(zhì),提高我們的業(yè)績(jī)和作業(yè)水平。

通過(guò)培訓(xùn)讓我明白做為一個(gè)管理人員,不單只是把工作做好,還要不斷的關(guān)心員工,了解員工的需求,盡量滿足他們的需求,制造一個(gè)團(tuán)結(jié)友善的工作氛圍,推動(dòng)員工要以積極上進(jìn)的心態(tài)工作,對(duì)員工的崗位進(jìn)行輪換,讓他們有機(jī)會(huì)接觸和掌握各崗位的操作技能,使員工綜合素質(zhì)得到進(jìn)一步提高,且對(duì)他們進(jìn)行職業(yè)道德教育,讓他們認(rèn)識(shí)到工作的重要性和必要性,且不斷的要求自己有效的運(yùn)用人力資源,合理的安排工作,不能對(duì)做錯(cuò)的員工嚴(yán)厲的處罰,對(duì)做好的員工只獎(jiǎng)不罰,做為管理人員,要獎(jiǎng)罰分明,要站在員工的角度想問(wèn)題。

通過(guò)這次培訓(xùn)希望自己能在日后的工作中能做到老師所說(shuō)的要想成為優(yōu)秀的現(xiàn)場(chǎng)管理者，要達(dá)到以下的幾個(gè)目標(biāo)，并朝著以下目標(biāo)要求自己。

四班

何留仙

2016年12月12日

第四篇：酵母轉(zhuǎn)化問(wèn)題參考

Ways to Destroy Your Yeast Transformation

by Emily Crow on 27th of July, 2011 in Cell / Tissue Culture

Transforming yeast with DNA is a very similar process to transforming E.coli, but with just enough differences to trip you up if you let your attention slip.Whether you’re doing a yeast two-hybrid screen, or using yeast as a model system, here are a some mistakes to to avoid…

1.Forgetting to add single stranded DNA

While E.coli readily takes up double-stranded DNA, yeast requires the addition of single-stranded “carrier DNA” to enhance uptake of your plasmid or fragment.If you only add your plasmid to the transformation mix, chances are you’ll be confronted with a pristinely sterile plate after three days of incubation.2.Using old PEG

PEG(polyethylene glycol)is a crucial ingredient in the yeast transformation buffer.Unfortunately, it’s annoying to make and goes bad quickly.The percentage of PEG will make or break the success of your transformation;an old PEG solution has had a chance to evaporate, so that the water to PEG ratio is off.If you can stand it, make new PEG for every transformation.Otherwise, make it in small batches, and seal tightly with parafilm between uses to minimize evaporation.3.Using cells in stationary phase

Cells in log phase, or exponential growth, take up DNA with much better efficiency.This is not to say that cells from a stationary culture can’t be transformed – only that your successful transformation rate will be much lower.Your best bet is to use cells that are growing rapidly at the time of transformation.4.Using the wrong selective marker

A stupid mistake, but one that I’ve made more times than I’d like to admit.Double check to save yourself some tears!

5.Cutting corners when heat-shocking

This is a major difference between E.coliand yeast transformations: while E.coli is relatively delicate, and requires a heat-shock of less than a minute to take up DNA, the cell wall makes yeast more hardy and resistant to shock.Thus, for efficient transformation, yeast are generally heat-shocked for up to 45 minutes.I’ve gotten away with as little as 15 minutes, but any shorter and the transformation efficiency is drastically reduced.If you’re not in a hurry, let it go the whole 45 minutes, or you’ll get to experience the joy of doing it all over again.

第五篇：減重心得：四個(gè)月狂瘦22公斤

減重心得：四個(gè)月狂瘦22公斤

王女士，29歲/158CM。以下為王女士口述：

我是兩個(gè)娃娃的媽媽了，因?yàn)閭€(gè)性比較好，朋友找我聚餐我都是來(lái)者不拒，讓我的體重從生了小孩后再也沒(méi)有下來(lái)過(guò)，而且還有繼續(xù)增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，最尷尬的是坐輕軌還有人給我讓座，鄰居還問(wèn)我：“是不是要生第三個(gè)了？”

拜托，我可是很有羞恥心的呢！

心里正在想著減肥時(shí)，剛好我好朋友三姐最近體積明顯縮小。哇塞，這是老天在暗示我嗎？

于是抱著必定成功的決心，到博粹堂找傳說(shuō)中的周醫(yī)生。

周醫(yī)生快救救我這不堪的體型吧！

坐在治療室，聽(tīng)到好幾位胖友在討論自己的戰(zhàn)績(jī)，讓我越聽(tīng)越有信心了！治療結(jié)束后，醫(yī)生教我注意事項(xiàng)，很是簡(jiǎn)單嘛，重點(diǎn)就是晚餐不要太晚，不碰淀粉類、還有甜的飲料！這有難度嗎？哈哈哈。

療程期間，感覺(jué)胃口好像減小了，吃飯飽得挺快！

王女士的減重戰(zhàn)績(jī)報(bào)告

第一次到診所體重83.7/體脂47.3；第二次81.5/46.2；第三次79.9/47.4；第四次78.9/45；第五次78.4/44.4；第六次76.8/44.5；第七次75.2/43.9；第八次73.8/42.7。我的第一個(gè)十公斤??！

第九次72.9/41.3；第十次71.6/40.4；第11次73/40.5；第12次69.6/39.2；第13次69.3/37.6；第14次68.2/41.4；第15次66/37.6；第16次66.1/39.2；第17次64.1/35.7；第18次63.4/35.6。感謝周醫(yī)生，感謝自己！我的第一個(gè)二十公斤??！

經(jīng)過(guò)了三個(gè)多月的堅(jiān)持，我發(fā)揮了驚人的耐力，得到了美麗的果實(shí)好開(kāi)心喲！還不夠，還不夠！想告訴大家支持以恒的你也可以做到哦！

分享給大家我的經(jīng)驗(yàn)，是想告訴大家，你們也行的！

有周醫(yī)生的幫助，大家要有耐心，要加油哦！

還有一個(gè)重要的就是任何身體狀況一定要跟醫(yī)生充分溝通喲！因?yàn)槲矣袝r(shí)會(huì)順便請(qǐng)周醫(yī)生調(diào)理下身體。

回想第一次來(lái)時(shí)是2013年5月7日~2013年9月24，4個(gè)多月，我瘦了22.8公斤。五字頭體重，我來(lái)啰！繼續(xù)加油！