第一篇：酵母表達系統(tǒng)使用心得

Pichia酵母表達系統(tǒng)使用心得

甲醇酵母表達系統(tǒng)有不少優(yōu)點，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達系統(tǒng)最為人熟知，并廣泛應用于外源蛋白的表達。雖然說酵母表達操作簡單表達量高，但是在實際操作中，并不是每個外源基因都能順利得到高表達的。不少人在操作中會遇到這樣那樣的問題，收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個被譽為最簡單的畢赤酵母表達的經(jīng)典試劑盒過程中的心得體會。其中Xiang Yang是來自美國喬治城大學（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lombardi Cancer Center），部分用戶來自國內(nèi)。甲醇酵母部分優(yōu)點：

1.屬于真核表達系統(tǒng)，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達； 2.AOX強效啟動子，外源基因產(chǎn)物表達量高，表達產(chǎn)物可以達到每升數(shù)克的水平； 3.酵母培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，遠較真核系 統(tǒng)簡單，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；

4.可以誘導表達，也可以分泌表達，便于產(chǎn)物純化；

5.可以甲醇代替IPTG作為誘導物，部分甲醇酵母更可以用工業(yè)甲醇替代葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本低。

產(chǎn)品性能：優(yōu)點——使用簡單，表達量高，His-tag便于純化；缺點——酵母表達蛋白有時會出現(xiàn)蛋白切割問題。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達出來的蛋白可以進行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。

畢赤酵母表達載體pPICZ在多克隆位點（MCR）3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測和純化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表達，并且在表達后α-factor可以自動被切除。在進行克隆的時候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標蛋白中增加兩個氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標記，而誘導表達的載體需要甲醇——甲醇比一般用于大腸桿菌表達誘導使用的IPTG便宜。第一步——構建載體

Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點可供選擇，同時也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。

紅葉山莊：有關是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在原核表達，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對于大小合適（30—50KD）的蛋白在產(chǎn)量上是pPIC9K無法比擬的。

leslie：要做畢赤酵母表達實驗，首先當然就要了解這個可愛的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛），她和大腸桿菌長得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測。大家做畢赤表達的時候應該都遇過這種情況吧，表達過程中染菌（我們實驗室曾經(jīng)污染過各種顏色形狀的細菌，那真是一段可怕的經(jīng)歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就是浪費大把的

時間了。

基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長的周期等等情況后，當然更多的精力還是應該花在表達的目的蛋白上，我的表達蛋白有些恐怖，有100KD，本來當然應該放在大腸桿菌中表達，但是為了分泌表達（其實后來發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pET系列分泌表達系列也不錯）和糖基化修飾（主要是這個方面，因為我的蛋白是人源的，表達出來用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長，所以在做克隆的時候也要非常小心，需要注意的是：

①酶切位點不能出現(xiàn)在目的DNA片段中——如果片段長無法避免，可以采用平末端連接；

②雖然α-factor可以自動切除，但是在設計表達的時候，如果在N端不能出現(xiàn)任何多余的aa（比如藥物蛋白表達），需要特別留意（說明書上有詳細說明：P13）；

③有三種不同的讀碼框（對于pPICZα系列來說就是對上α-factor序列），在設計克隆的時候要反復確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問題；

④無論pPICZ還是pPICZα都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒有ATG（起始密碼子），有人認為酵母啟動子與外源基因的ATG之間的距離越短對于表達的該基因越有利；

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；

⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關基因表達偏好密碼子的問題有人認為沒有必要更換，有人認為一定要換，個人認為以產(chǎn)量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過長就比較麻煩，不過有許多真核保守蛋白其實是和酵母密碼子相似的；

⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因為怕影響到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；

⑧測序引物可以用α-factor信號引物，也可以用5'AOX1引物；

⑨如果需要高量表達，可以考慮做克隆的時候串聯(lián)基因片段進行表達，另外也可以在轉(zhuǎn)化酵母的時候重復轉(zhuǎn)化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因為這個序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會影響表達，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因為這些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄，也需要多加注意。

第二步就是將線性化的DNA轉(zhuǎn)化入Pichia酵母中：

Xiang Yang：EasySelect試劑盒準備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因為這個菌株轉(zhuǎn)化率和表達量相對而言較高，如果你有電轉(zhuǎn)儀（electroporator），可以嘗試一下。如果沒有的話，EasySelect也準備了化學轉(zhuǎn)化試劑——EasyComp Transformation，但是由于轉(zhuǎn)化率的緣故，我建議使用電轉(zhuǎn)儀。

leslie：在得到了正確的序列之后就可以準備轉(zhuǎn)化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點有些不盡相同

（Manual上寫的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔心轉(zhuǎn)化率的話可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT＋表現(xiàn)型，也就是說可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長，但是據(jù)說會對外源基因表達有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護表達產(chǎn)物免受降解，促進表達量的提高。

一般來說，如果是胞內(nèi)表達，應盡量用Mut－細胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對較多(約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進行。而對于分泌蛋白的表達，無論是甲醇利用慢(Mut-)還是甲醇利用快(Mut+)的細胞都可應用，如在人血清白蛋白(HSA)(為分泌型蛋白)的表達中就看不出兩種類型的細胞之間有什么明顯差別。

所以一般手冊都會建議同時在這幾種菌株中進行轉(zhuǎn)化，這主要是因為不同的基因在不同的酵母菌中可能表達量截然不同，因此在最開始的時候建議多用幾種酵母菌實驗。

另外有個保存問題，原始酵母菌一定要保存好，因為酵母在傳代多次后會影響其轉(zhuǎn)化率和表達量，所以一方面分多管分裝保存于-80℃，另一方面如果出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化或者表達的問題，在其它方面都沒有出錯的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。

在準備酵母菌的同時也需要準備質(zhì)粒，由于酵母菌轉(zhuǎn)化對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的要求較高，量也較大（5-10ug），因此許多時候都會用PEG大提質(zhì)粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準備好足夠量的質(zhì)粒，并且不要忘記也要同時準備空載體以做對照。在轉(zhuǎn)化前質(zhì)粒需要進行線性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達量高的一個重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達）。線性化位點個人認為也會影響到表達量，對于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個線性化位點同時進行轉(zhuǎn)化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機會少，而且也有可能遇上沒有合適的線性化位點的情況，這個時候也不是說不能進行表達，但是準備的質(zhì)粒就要增加10倍，另外也可以進行部分酶切（即先進行預實驗，掐定時間和酶量保證被切開的質(zhì)粒有部分是在線性化位點切開而基因片段保存完好）。

在線性化之后的質(zhì)粒就可以酒精沉淀回收了——中間步驟需要使酶失活，說明書建議是熱失活或者EDTA，個人認為前者比較好，主要是擔心EDTA對于轉(zhuǎn)化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65℃/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風干，這一步需要多加注意保證風干完全，因為有實驗證明殘留的酒精對于轉(zhuǎn)化的影響頗大。

接下來就是酵母轉(zhuǎn)化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實驗決定表達的關鍵步驟。轉(zhuǎn)化方法有不少，例如電轉(zhuǎn)，化學轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，其方法的難易程度和轉(zhuǎn)化率高低呈反向遞減的，也就是說電轉(zhuǎn)最容易，轉(zhuǎn)化率較高（但要求有電轉(zhuǎn)儀），而原生質(zhì)體最麻煩，而且效果不好（比較傳統(tǒng)），因此不建議使用，EasySelect說明書上這么建議，并且也詳細說明了電轉(zhuǎn)，化學轉(zhuǎn)化（EasyComp和LiCl）方法的過程，可以按部就班。需要注意的是（電轉(zhuǎn)過程）：

①最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過的酵母放置時間不要超過一個星期；

②擴大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，個人認為不需要OD600達到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，這個時候的酵母比較新鮮，轉(zhuǎn)化率比較高； ③整個感受態(tài)制作過程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機，這是影響轉(zhuǎn)化的關鍵——為了進一步保證這一點，無菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉(zhuǎn)杯都要預冷；

④電轉(zhuǎn)儀需要預熱，所以準備感受態(tài)的時候就可以把電轉(zhuǎn)儀打開了，電轉(zhuǎn)后山梨醇的加入要快，曾有人做實驗證明晚一秒就會降低轉(zhuǎn)化的數(shù)量級，雖然不一定可信，但是我個人也認為這個過程要快，電轉(zhuǎn)后可以看看時間，如果時間過短（比如(4)就可能說明雜質(zhì)較多，會影響轉(zhuǎn)化率；

⑤轉(zhuǎn)化后溫育是個增加同源重組，增加存活率的過程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30℃搖一段時間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉(zhuǎn)化率。

(化學轉(zhuǎn)化)

如果沒有電轉(zhuǎn)儀，LiCl轉(zhuǎn)化是一種可供選擇的方法，轉(zhuǎn)化率是102到103cfu/ug。

主要過程為： 取過夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600達到0.8-1.0；4℃，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預冷的無菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL，4℃，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50μl冰預冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至80-90ml。

LiCl轉(zhuǎn)化 取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細胞12 000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入 50%PEG240ml 1mmol/L LiCl

ml 單鏈鮭精DNA

25ml 線性化質(zhì)粒DNA 10 ml(約10mg)用吸頭反復吹打，使細胞沉淀與加入的溶液混勻，30℃靜置溫育30min，42℃熱擊20-25min，4500rpm離心10min，吸棄轉(zhuǎn)化液，細胞沉淀加1ml YPD培養(yǎng)基于30℃ 200 rpm培養(yǎng)2-4hr，取轉(zhuǎn)化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培養(yǎng)2-3天。

第三步——挑克隆篩選

Xiang Yang：在protocol中用了許多篇幅來指導這一步，包括如何去通過平板篩選，觀測生長速率來確定Mut表現(xiàn)型等。這個過程需要3到5天，而我一般只用用了4個小時進行PCR（AOX引物）篩選。

leslie：完成轉(zhuǎn)化后就是克隆鑒定的過程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因為比較快），具體過程protocol上說的很清楚，其實也很簡單，就是凍融破菌進行菌落PCR，但是其中許多具體細節(jié)問題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問題，許多人用PCR方法進行鑒定都無法得到結(jié)果，甚至在表達出了以后還是無法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無法正常釋放酵母基因組，一般通過培養(yǎng)菌然后進行沸水和-20℃冷凍循環(huán)過程裂解細胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內(nèi)是可以得到好的結(jié)果的，但是有時候片段過長，模壁就會阻礙擴增，所以我們實驗室會用蝸牛酶（很便宜的酶來的）來幫助溶菌，我看許多實驗室也會這么做，不過加入的時間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。

第二就是是模板量，個人建議模板真的不要加太多了，按照說明書的上的5ul我覺得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來凍融的菌數(shù)量有關。其次是假陽性和假陰性結(jié)果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會出現(xiàn)3.6kb的片段，而Mut+則會出現(xiàn)AOX1基因原本長度的片段——大約長2.2kb，因此如果的基因片段長度相似，要注意區(qū)分。建議PCR過程中使用多對引物進行反應，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各種對照多了有利于比較——當然前提是你不能暈了頭。

掉了毛的鴕鳥：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動子的轉(zhuǎn)錄終止子(5’AOX1和3’AOX1),他們被多克隆位點分開,外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標記（HIS4區(qū)的整合方式為位點特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4）恢復野生型.HIS4區(qū)或AOX1區(qū)位點的整合都使轉(zhuǎn)化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS＋表型以篩選轉(zhuǎn)化子.）及3’AOX1區(qū),當整合型載體轉(zhuǎn)化受體菌感受態(tài)細胞時,他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,外源基因在5’AOX1啟動子的控制下表達.在載體中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關,通過篩選抗G418能力強的酵母即可獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.第四步——表達

Xiang Yang：將你的克隆在YPD培養(yǎng)基中培育到OD600值達到6.0，就可以離心收菌。用表達培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30oC培育過夜。

leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達，有許多人在酵母表達上花費了大量的時間——不同于大腸桿菌的兩天出結(jié)果，一次畢赤酵母的表達就需要起碼一周的時間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場空，我個人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉(zhuǎn)化的酵母菌，另外調(diào)整進行重新轉(zhuǎn)化。

另外剛開始的時候可以用小量表達，可以用5ml：生長慢型，生長快型，陰性對照（空質(zhì)粒），陽性對照（可以是曾經(jīng)表達成功的重組子）和沒有進行轉(zhuǎn)化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值2-6，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時間，一半為20-30分鐘，讓菌沉淀下來，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉(zhuǎn)入BMMY中誘導表達，這些步驟都需要在超凈工作臺里進行，如果要區(qū)分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表達，有可能會在沒有達到4天的時間培養(yǎng)基就干了，所以可以適當補充一些，以及在搖床里放置盛有無菌水的深口瓶，來保持搖床里濕度。

誘導物甲醇注意要在超凈臺中打開，可以分裝到滅過菌的瓶子中——當然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過甲醇瓶口的時候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。另外如果覺得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過紗布添加甲醇，這個方法可能會造成染菌，慎選。說到紗布就想到了通氣性問題，酵母在無氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對于這一基因的表達影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個搖床進行三十度酵母表達，這樣可以考慮將紗布減少到3—5層，同時需要注意的是搖瓶內(nèi)菌液體積不要超過10-30%。

每天取樣出來進行SDS-PAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過每天做膠跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時跑，不過樣品一定要煮過凍存，而且每次取樣不要反復凍融，最好分裝保存——因為蛋白經(jīng)煮沸變性會不穩(wěn)定，容易降解。另外為了防止蛋白在分泌出來的過程就降解了（特別是小分子蛋白），也可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說明書講解得詳細），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護物質(zhì)，競爭性抑制蛋白水解酶 的活性來防止表達產(chǎn)物降解。

如果使用的是分泌型培養(yǎng)基，按道理收集培養(yǎng)基上清就可以進行下一步分析了，但是由于培養(yǎng)基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測不出來的——除非你的表達蛋白量非常大。所以需要進行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當然最簡單的就是煮沸蒸發(fā)水分濃縮了。另外跑膠的時候同時對照酵母胞內(nèi)蛋白，以防沒有分泌出來。SDS-PAGE的配置參見分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對應性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過是個需要全盤重新準備的過程，要考慮清楚。如果選用的載體是帶有信號肽的，雖說是分泌表達好純化，但實際上畢赤酵母本身還是有本底表達的，而且有時候會造成假陽性，所以最后表達過程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細節(jié)可見Western Blotting前傳：想成為高手嗎？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒有合適抗體（如果是利用從大腸表達出來的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統(tǒng)表達出來的蛋白無法發(fā)生免疫作用），可以選用anti-myc或者anti-his的，前提當然是你的蛋白沒有提前終止。

其它在表達中可能出現(xiàn)的情況包括表達量低，沒有分泌表達（針對pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無法重復，表達出來的蛋白偏大等等，需要分各個方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號肽，但是就是無法分泌出來，這可能是蛋白結(jié)構在通過細胞膜的時候受到了阻礙，可能需要重新轉(zhuǎn)化，更換線性化位點或者更換菌株；如果蛋白表達第一天較高，但是之后越來越少，這很有可能是蛋白降解了或者產(chǎn)生了競爭表達；畢赤酵母無法重復的問題比較嚴重，許多情況下在第一次獲得了高量表達之后就再怎么也重復不了這個結(jié)果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達出來的蛋白分子量偏大則是個正?，F(xiàn)象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進行WB或進一步實驗驗證。

第五步——發(fā)酵和產(chǎn)物純化

Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE Healthcare），經(jīng)過簡單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一個大小為45kDa，可以通過二硫鍵形成反向平行二聚體(antiparallel homodimer)的糖蛋白，經(jīng)過純化，我通過一個細胞增殖實驗(cell proliferation assay)檢測了其活性，結(jié)果表明表達出來的蛋白在體外有完全的活性。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結(jié)合活性，與對照(通過大腸桿菌和Bacular細胞未帶tag的蛋白)相比，his-tag有一點副作用。

伊可麗：由于在搖瓶培養(yǎng)中巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的水平往往不能準確地反映罐發(fā)酵中的表達情況，使之成為令人頭痛的問題。主要原因是在搖瓶培養(yǎng)中，培養(yǎng)液的pH值無法控制，培養(yǎng)物通氣不充分及無法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對每一個表達菌株進行繁瑣的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的實驗，仍需摸索表達菌株的搖瓶培養(yǎng)條件，使其產(chǎn)物的表達量與預期的發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果相近。

總而言之，EasySelect系統(tǒng)是一個便于操作的酵母表達系統(tǒng)，我已經(jīng)使用這一系統(tǒng)表達過15個類似物了，每一個我都獲得了超過1mg/1升培養(yǎng)液的純化蛋白。

第二篇：畢赤酵母表達系統(tǒng)簡介

巴斯德畢赤酵母及啟動子

1.1 畢赤酵母表達系統(tǒng)簡介

隨著蛋白異源表達的飛速發(fā)展，越來越多的表達系統(tǒng)被建立并得到應用。酵母作為單細胞真核生物，因具有比較完備的基因表達調(diào)控機制和對表達產(chǎn)物的加工修飾能力，仍表現(xiàn)出不可比擬的優(yōu)勢。以甲醇營養(yǎng)型酵母（Methylotrophic yeast）-畢赤酵母為代表的第二代酵母表達系統(tǒng)，是近年來被公認的最有效的外源蛋白表達系統(tǒng)之一，已有多種外源蛋白在該宿主系統(tǒng)中獲得了成功表達[1]。作為生產(chǎn)外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各種不同功能的表達載體，已經(jīng)得到廣泛的應用。表達的蛋白質(zhì)包括酶、膜蛋白、抗原、抗體和調(diào)節(jié)蛋白等[2,3]。

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)是近年來發(fā)展迅速、應用廣泛的一種真表達系統(tǒng)。它是甲醇營養(yǎng)型酵母菌，有兩個乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）碼基因AOX1和AOX2，兩者序列相似，AOX1基因嚴格受甲醇誘導和調(diào)控。當甲醇為唯一碳源時，AOX1啟動子可被甲醇誘導，啟動乙醇氧化酶的表達，從而用甲醇進行代謝[4]。含AOX1啟動子的質(zhì)?？捎脕泶龠M編碼外源蛋白的目的因的表達。

隨著Invitrogen公司開發(fā)的一系列畢赤酵母表達試劑盒的應用，目前用該統(tǒng)已成功表達出了數(shù)以千計的來自細菌、真菌、原生動物、植物、無脊椎動物、包括人在內(nèi)的脊椎動物以及病毒等的具有生物學功能的外源蛋白或蛋白結(jié)構[5,6]。1.1.1 P.Pastoris表達載體及其元件

由于畢赤酵母沒有穩(wěn)定的附加質(zhì)粒，表達載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，外源基因表達框架整合于染色體中以實現(xiàn)外源基因的表達整合表達的優(yōu)點在于保持外源基因穩(wěn)定性并可產(chǎn)生多拷貝基因。典型的畢赤氏酵母表達載體含有醇氧化酶基因的調(diào)控序列，主要的結(jié)構包括：5′AOX1啟動子片段、多克隆位點(MCS)、轉(zhuǎn)錄終止和 polyA形成基因序列(TT)、篩選標記(His4或 Zeocin)、3′AOX1基因片段，作為一個能在大腸桿菌中繁殖擴增的穿梭質(zhì)粒，它還有部分pBR322質(zhì)?；駽OLE1序列。如果是分泌型表達載體，在多克隆位點的前面，外源基因的5′端和啟動子的3′端之間插人了分泌作用的信號肽序列。在這個分泌信號的引導下，外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中經(jīng)修飾和加工后能夠由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外，將成熟的蛋白質(zhì)分泌到細胞外。目前所采用的表達體均為穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌保存、復制、擴增，然后線性化后被導入宿主母細胞。

常用的表達載體包括胞內(nèi)表達載體及分泌表達載體如下表：

表1 常用表達載體及其選擇標記

表達方式 載體名稱 pPICZA,B,C

胞內(nèi)表達 pPIC6A,B,C PGAPZA,B,C

啟動子 AOX1 AOX1 GAP

選擇標記 Zeocin blasticidin Zeocin pPIC3.5K PAO815 PFLD pPICZαA,B,C pPIC6αA,B,C 分泌表達 PGAPZαA,B,C pPIC9k pFLDα

AOX1 AOX1 FLD AOX1 AOX1 GAP AOX1 FLD

His4 kanmycin ampicillin His4 ampicillin Zeocin ampicillin Zeocin blasticidin Zeocin

His4 kanmycin ampicillin Zeocin ampicillin

1.1.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)勢

自從1987年Cregg等首次用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為宿主表達外源蛋白以來,作為一種新的高效的表達系統(tǒng)，畢赤酵母越來越引起人們的重視，到1995年，已有四十多種外源蛋白在該宿主菌中獲得表達。而最近幾年每年報道的在畢赤酵母中表達的外源基因就有幾十種，且一年比一年多，它除了具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性之外，同釀酒酵母等傳統(tǒng)真核表達系統(tǒng)相比，它還具有以下的優(yōu)勢:（1）含有特有的強有力的AOX（醇氧化酶基因）啟動子，用甲醇可嚴格地調(diào)控外源基因的表達；

（2）培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離。畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化；而釀酒酵母所用誘導物一般為價格較高的半乳糖；

（3）外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定。外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能夠到高表達菌株；

（4）作為真核表達系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結(jié)構，具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。

1.2

AOX啟動子序列分析現(xiàn)狀

啟動子是基因表達調(diào)控的順式元件，也是基因工程表達載體的一個重要元件。啟動子在轉(zhuǎn)錄水平上的重要作用，不僅決定了基因的表達水平，也決定了基因表達的時空順序[7,8]，可以說啟動子活性的高低在很大程度上影響著基因表達最終產(chǎn)物的表達水平。所以找到一個轉(zhuǎn)錄啟動功能較好的啟動子，對于外源蛋白高效表達的研究具有重要的意義。目前，已有不少的啟動子被克隆和功能鑒定[9]。

新型疫苗主要包括亞單位疫苗、基因缺失疫苗、核算疫苗、重組活載體疫苗等，盡管大多數(shù)被認為較為安全，但往往都需要免疫刺激性強的佐劑來提高免疫效果。菌蛻疫苗可通過發(fā)酵大量生產(chǎn)且無需加入佐劑即可獲得堅強的免疫效果。

目前，畢赤酵母表達系統(tǒng)中較常用的表達載體有兩類[10]：種是分泌型表達載體(如pPIC9K)，另一種是組成型表達載體(如pGAPZB)。前者(以pPIC9K為例)含有的醇氧化酶啟動子pAOX1，可以在甲醇的誘導下高效表達。該載體自身攜帶有α 分泌信號肽，可以將外源蛋白直接分泌到胞外。后者(以pGAPZB 為例)含有三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子pGAP，可以在多種碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸條件下表達外源蛋白，且不需添加誘導物[11]。

在啟動子功能的研究中，多數(shù)是利用報告基因的表達量來達到功能研究的目的，常用的報告基因有綠色熒光蛋白GFP(green fluorescent protein)、紅色熒光蛋白RFP(red fluorescent protein)β-葡糖醛酸糖苷酶GUS(β-glucuronidase)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT(chloramphenicolacetyltransferase)等[12,13]。在前期的工作中，克隆了啟動子pScgpd，并在巴斯德畢赤酵母中研究了AOX1 啟動子的功能[14]。實驗以人血清白蛋白(HSA）作為報告基因，在Pichia pastoris GS115中表達。

到目前為止，利用AOX啟動子表達的蛋白有很多，例如：在AOX1(醇氧化酶)啟動子調(diào)控下，類似天然抗菌肽大小的magainin 及cecA-mil 蛋白獲得分泌表達[15]；人前列腺特異性抗原的表達[16]；重組木糖異構酶的分泌和表達[17]；人骨唾液酸蛋白的表達等[18]。

第三篇：酵母表達系統(tǒng)概述及相關研究進展

酵母表達系統(tǒng)的研究進展和前景

(XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX學院)

摘要：酵母表達系統(tǒng)在表達真核生物蛋白方面已經(jīng)得到廣泛而成功的應用，表達出的重組蛋白表現(xiàn)出較高甚至比原物種體內(nèi)的蛋白質(zhì)更高的生物活性。近年來，利用釀酒酵母和畢赤巴斯德氏酵母表達人源蛋白或肽類活性物以及其它中間體取得了新的進展。本文主要從上游設計，重組表達，分離純化和活性驗證等方面進行了總結(jié)，并且對未來更好的利用酵母生產(chǎn)藥物等活性物質(zhì)作出展望。

關鍵詞：酵母表達系統(tǒng)；蛋白分泌：異源基因；糖基化修飾；人源活性藥物

引言

酵母作為一種表達外源基因的宿主菌, 既具有操作簡單, 生長快等特點, 又具有真核細胞的翻譯后修飾加工系統(tǒng)。在表達某些基因工程產(chǎn)品時, 可以大規(guī)模生產(chǎn), 從而有效地降低成本。常用的酵母表達系統(tǒng)有釀酒酵母表達系統(tǒng), 甲基營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)和裂殖酵母表達系統(tǒng)。釀酒酵母（Saccharomyces.cerevisiae）在分子遺傳學方面被人們的認識最早，也是最先作為外源基因表達的酵母宿主。但由于釀酒酵母的局限，1983 年美國Wegner 等人最先發(fā)展了以甲基營養(yǎng)型酵母（methylotrophic yeast）為代表的第二代酵母表達系統(tǒng)。其中畢赤酵母（P.pastoris）是繼S.cerevisiae 之后被迅速推廣的一種外源基因表達的宿主菌。

釀酒酵母難于高密度培養(yǎng)，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白質(zhì)，也不能使所表達的外源蛋白質(zhì)正確糖基化，而且表達蛋白質(zhì)的C端往往被截短。因此，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質(zhì)表達的宿主菌。但是，可以通過基因敲除或改造用釀酒酵母表達亞單位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物質(zhì)及其中間體（如青蒿素，色素）。與原核和其它真核表達系統(tǒng)相比，巴斯德畢赤酵母作為重組蛋白表達系統(tǒng)有以下優(yōu)點

[1]：（1）生長速率快，易于高密度培養(yǎng)（2）在幾乎不含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中具有高水平產(chǎn)率

（3）消除了內(nèi)源毒性和噬菌體感染（4）易于對具有明確特征的酵母表達載體進行操作（5）對畢赤酵母的噬菌體對人沒有病原性（6）具有多種翻譯后修飾包括多肽折疊，糖基化，乙?；谆?，蛋白質(zhì)降解調(diào)控以及定位至亞細胞結(jié)構（7）能夠構建分泌的蛋白，這樣只需從生長培養(yǎng)基中提純而不必收集酵母本身細胞。

基因工程與酵母表達系統(tǒng)

即使酵母表達系統(tǒng)具有一些優(yōu)勢，但在用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)等藥物時，還需要選擇合適的載體并對宿主菌的某些代謝途徑進行改造，使之利于目標產(chǎn)物的表達，要用于工業(yè)生產(chǎn)，還需根據(jù)實際情況優(yōu)化培養(yǎng)條件，比如pH，溫度，溶氧量，培養(yǎng)基營養(yǎng)，特殊添加劑等。

釀酒酵母的表達載體有自主復制型和整合型，自主復制型質(zhì)粒通常有30個或更多的拷貝，含有自動復制序列(automaticreplicating sequence，ARS)，能夠獨立于酵母染色體外進行復制，如果沒有選擇壓力，這些質(zhì)粒往往不穩(wěn)定。整合型質(zhì)粒不含ARS，必需整合到染色體上，隨染色體復制而復制。整合過程是高特異性的，但是拷貝數(shù)很低。為此，人們設計了pMIRY2(for multiple integration into ribosomal DNin yeast)質(zhì)粒，旨在將目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇為酵母基因組中串聯(lián)存在的150個重復序列)，因此利用pMIRY2質(zhì)?？梢缘玫?00個以上的拷貝。值得注意的是，釀酒酵母表達的外源蛋白質(zhì)往往被高度糖基化，糖鏈上可以帶有40個以上的甘露糖殘基，糖蛋白的核心寡聚糖鏈含有末端僅1,3甘露糖，致使產(chǎn)物的抗原性明顯增強。

畢赤酵母的表達載體多采用整合型載體，即將異源基因通過載體整合進酵母基因組中，這是由于沒有適合畢赤酵母的游離型表達載體。所有巴斯德氏畢赤酵母的表達載體都是一個表達組件，它由一個啟動子序列（大多是AOX1啟動子），一個來自AOX1的轉(zhuǎn)錄終止序列用以指導3’終止過程和mRNA的多聚腺苷酸化，在它們之間有一個或多個克隆位點用以插入外源基因。這樣的設計保證了產(chǎn)物(cap-AOX1 5′UTR-ORF-3′UTR-polyA)是一個成熟的mRNA以適應畢赤酵母的細胞體系，確保了信息的穩(wěn)定性和有效性。檢測表達所用的標記基因一般是HIS4（組氨醇脫氫酶基因），有時也用kan（卡那霉素抗性基因）或Sh ble.此外，有時為了防止酵母自身蛋白酶對所要表達的異源蛋白的降解，會使用蛋白酶缺陷突變型或降低發(fā)酵溫度，保證目的蛋白的產(chǎn)量和得率。發(fā)酵過程一般分兩個階段，第一階段是細胞以甘油為碳源生長，甘油耗盡后進入第二階段，加入甲醇誘導AOX1啟動子的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而使異源基因表達，生產(chǎn)目標蛋白。

酵母表達系統(tǒng)研究進展

1． 利用釀酒酵母生產(chǎn)青蒿素前體——青蒿酸

青蒿素（Artemisinin）是目前治療瘧疾的高效藥物，這主要是由于瘧原蟲（Plasmodium falciparum）逐漸對其它藥物產(chǎn)生了抗藥性?，F(xiàn)在青蒿素的產(chǎn)量遠達不到需求量，所以Jay D.Keasling 等人通過釀酒酵母生產(chǎn)它的前體——artemisinic acid，成本低，環(huán)保，可作為高質(zhì)[2]R

量和可靠的青蒿素來源。這個實驗通過改造甲羥戊酸途徑，引入兩個來自青蒿（Artemisia annua）的外源酶amorphadiene synthase(ADS)和cytochrome P450 monooxygenase(CYP71AV1)使釀酒酵母獲得將amorpha-4,11-diene氧化為artemisinic acid的三步途徑。同時，還導入了CYP71AV1的天然氧化還原配體CPR(cytochrome P450 oxidoreductase)，在這之前，還需將法尼基焦磷酸即FPP（farnesyl pyrophosphate）的合成途徑修飾，減少它用于固醇的合成，使之更多的用于合成amorphadiene。然后，利用改造的釀酒酵母EPY224生產(chǎn)artemisinic acid，不僅純度較高，易于提取分離，而且不受氣候影響。

2．利用畢赤巴斯德氏酵母生產(chǎn)人源抗菌肽——LL-37

抗菌肽是生物體抵御外源性病原體的防御反應中所產(chǎn)生的一類小分子多肽。許多傳統(tǒng)的抗生素具有毒副作用且能夠誘導耐藥菌株的產(chǎn)生，發(fā)展克服耐藥性問題的新型抗生素顯得越來越重要。抗菌肽具有分子質(zhì)量小、水溶性好、耐熱性強、無免疫原性、抗菌譜廣和作用機制獨特等特點，還有研究表明，hCAP（Human cathelicidin antimicrobial peptide）是人皮膚在受傷或炎癥刺激下，嗜堿性粒細胞分泌的一種防御或抗微生物的肽，在人類中只有LL-37一種。固相化學合成技術可以生產(chǎn)像肽這樣較短的氨基酸序列，不過成本太高。Yong-Seok Kim等人[3]利用pGAPZ-E（pGAPZB載體的游離形式）將編碼成熟LL-37的111bp的基因片段采用電穿孔方法轉(zhuǎn)化到P.pastoris X-33中，進行細胞內(nèi)表達，表達的重組LL-37通過LC-ESI-MS/MS檢測確定，發(fā)現(xiàn)有5kDa的LL-37條帶。酵母的表達出來的LL-37的粗提取物對Micrococcus luteus具有抑制活性。表達載體采用GAP強啟動子，另外還進行了有a-MF外分泌信號的載體pGAPZaA，結(jié)果采用這個載體的X-33培養(yǎng)物中沒有發(fā)現(xiàn)胞外分泌的LL-37.另外還利用蛋白酶缺陷型菌株SMD1168H進行了轉(zhuǎn)化，LL-37在其中的表達水平與在X-33中的沒有顯著差異。這個實驗說明了利用游離型表達載體在P.pastoris X-33中可以成功表達LL-37，并且具有生物活性，可以用于生產(chǎn)這類抗菌肽藥物。

3．人源化的畢赤酵母生產(chǎn)糖蛋白類藥物

人體內(nèi)，除了抗體外的大多數(shù)糖蛋白的半衰期和治療潛力依賴于末端的唾液酸化，這是由于一個糖蛋白的其它末端糖比如甘露糖，N-乙酰葡糖胺和半乳糖等會被體內(nèi)的糖特異性受體或凝集素識別并被清除，也就失去療效了。酵母和絲狀真菌在表達這類糖蛋白方面具有一定前景。用酵母表達在人體內(nèi)具有活性的糖蛋白需要進行很多基因刪除或修飾，Tillman U.Gerngross等人[4]利用畢赤酵母構建出能表達重組紅細胞生成素（EPO）的菌株P.pastoris YSH597。這個菌株是在以前的菌株RDP762基礎上利用pSH926載體引入了5個新的外源基因構建成的，為的是使這個酵母能完成人源的末端唾液酸化。對天然酵母的改造設計到四個酵

母特異性糖?；虻那贸?4個異源基因的導入。利用SDS-PAGE和HPLC提純分離的重組EPO具有與劑量相關的生物學活性。EPO是一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，利用酵母表達需要在N-乙酰葡糖胺或甘露糖等修飾后再加上人源的唾液酸化過程，才能產(chǎn)生有活性的EPO（已經(jīng)進行動物試驗）。這項研究表明利用酵母生產(chǎn)EPO等同類糖蛋白具有可行性，不僅能節(jié)省時間，而且節(jié)約成本，大量生產(chǎn)以緩解對這類醫(yī)療藥物的需求。

酵母表達的糖蛋白不同于哺乳動物表達的雜合型或復雜型糖蛋白，而是高甘露糖型或過度甘露糖化糖蛋白。楊曉鵬等人[5]在前期成功敲除畢赤酵母α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(Och1p)基因、阻斷畢赤酵母過度糖基化，獲得畢赤酵母過度糖基化缺陷菌株GJK01(ura3、och1)的基礎上，構建了PGE-URA3-PNOI-GAP-signal-MDSI載體，通過表達不同物種來源的α-1,2-甘露糖苷酶I(MDSI)的活性區(qū)與酵母自身定位信號的融合蛋白，并通過DSA-FACE(基于DNA 測序儀的熒光輔助糖電泳)分析篩選報告蛋白HSA/GM-CSF(人血清白蛋白與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子融合蛋白)的糖基結(jié)構，發(fā)現(xiàn)當編碼釀酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)基因的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號與帶有完整C-端催化區(qū)的擬南芥MDSI基因融合表達時，畢赤酵母工程菌株能夠合成Man5GlcNAc2 哺乳動物甘露糖型糖蛋白。這為在酵母體內(nèi)合成類似于哺乳動物雜合型或復雜型糖基化修飾的糖蛋白奠定了基礎。

4．在巴斯德氏畢赤酵母中高水平表達一種合成酶——植酸酶

植酸（Phytate）,即肌醇六磷酸（IP6），是植物種子中磷元素的主要儲存形式, 普遍存在于植物性食品和飼料。人和單胃動物畜禽和魚類等缺乏內(nèi)源性植酸酶不能利用有機植酸磷。飼料中常添加無機磷酸鹽以滿足單胃動物的磷營養(yǎng)需求，隨之產(chǎn)生了諸多問題，最主要的是植酸作為一種抗營養(yǎng)因子，在體內(nèi)絡合多種礦質(zhì)元素和蛋白質(zhì)等，常引起人和單胃動物各種營養(yǎng)不良癥，而且未被利用的植酸磷被微生物降解釋放無機磷易引發(fā)水體磷污染。植酸酶（Phytase）是一類特殊的正磷酸單酯磷酸水解酶，催化植酸水解生成低級肌醇磷酸衍生物和無機磷酸，在動物營養(yǎng)、資源環(huán)境保護和人類健康等領域愈來愈顯示出巨大的應用潛力和研究價值。植酸酶普遍存在于植物、真菌、酵母和細菌，其中微生物植酸酶因活性高、生產(chǎn)比較容易等諸多優(yōu)點，對其研究和開發(fā)最為廣泛和深入。Ai-Sheng Xiong等人利用一種擔子菌隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的植酸酶[6]（一種6’-植酸酶）基因，優(yōu)化出適合P.pastoris的密碼子的基因序列——phy-pl-sh，連接上信號肽MF4I的基因，采用含有AOX1啟動子的pPIC9K載體，轉(zhuǎn)化并使畢赤酵母GS115合成并分泌了植酸酶，產(chǎn)量為12.2g/L.控制的培養(yǎng)條件是：30°C，pH5.5，溶氧量30%，高密度培養(yǎng)。酶蛋白檢測和酶活測試發(fā)現(xiàn)，酶的糖基化較嚴重，用水解酶Endo Hf在37°C下處理提純的酶蛋白4h，得到的片段較均一，且在pH4.5下具有最大

酶活力。對基因穩(wěn)定性和酶的熱穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)效果良好，此外他們還利用DNA Shuffling獲得了幾種熱穩(wěn)定的酶的候選基因，這項研究表明利用畢赤巴斯德氏酵母生產(chǎn)6’-植酸酶具有很大潛力，可以用于工業(yè)生產(chǎn)。

5．畢赤酵母表達大分子類藥物

在畢赤酵母表達系統(tǒng)表達具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，顯著地提高了SOD 保護HeLa 細胞免受氧化損傷的能力。細胞質(zhì)轉(zhuǎn)導肽(CTP，一種能夠攜帶外源大分子穿過細胞膜，定位于細胞質(zhì)的短肽)運輸人銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)跨過細胞膜進入細胞質(zhì)，可以提高其生物利用度。李沛志等[7]利用P.pastoris GS115(his4-)及其整合型分泌表達質(zhì)粒pPIC9K轉(zhuǎn)化表達了融合蛋白CTD-SOD。首先，設計含有CTD轉(zhuǎn)導肽基因序列的融合基因，連接至pPIC9K 質(zhì)粒并用它轉(zhuǎn)化E.coli Top10并進行菌落PCR篩選，抽提出重組質(zhì)粒并電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，將轉(zhuǎn)化成功的酵母接種到Y(jié)PD 培養(yǎng)基中，通過加入甲醇至終濃度0.5％誘導表達。培養(yǎng)結(jié)束后分析發(fā)酵液中誘導蛋白的表達量，純化后并進行對細胞的保護作用測試。本研究成功地在畢赤酵母表達系統(tǒng)中高效表達了具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，發(fā)酵上清中重組蛋白的含量為156.5 mg/L。純化得到的CTP-SOD 分子量約為22.5 kDa。CTP-SOD 預處理Hela 細胞可顯著地提高了鄰苯三酚(Progallol)誘導氧化脅迫下HeLa 細胞的存活率，較野生型SOD 相比具有較強的保護作用。但是，CTP 和其他種類的PTD（蛋白轉(zhuǎn)導域，Protein transduction domain）相比是否更有利于SOD或其他在細胞質(zhì)中起作用的藥物發(fā)揮功能都有待進一步深入的研究來證明，具有跨膜轉(zhuǎn)導能力的新一代藥物運輸載體PTD 將會促進多肽、核酸等大分子藥物的快速發(fā)展，為生物大分子藥物的應用帶來更廣闊的前景。

在哺乳動物中, 三葉型家族(trefoil factorfamily, TFFs)蛋白通過增強細胞遷移，促進細胞增殖，對抗細胞凋亡等過程參與黏膜的修復并維持其完整性。Bm-TFF2, 一種從大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的兩棲類三葉因子, 具有比人三葉因子更強的生物學活性。余果宇等人

[8]以Bm-TFF2 的cDNA 為模板, 利用PCR 方法擴增Bm-TFF2 基因, 然后插到含有AOX1 啟動子和α-因子信號肽序列的表達載體pPIC9K 中, 采用畢赤酵母表達系統(tǒng)進行分泌表達, 并用G418 篩選高拷貝整合轉(zhuǎn)化子。SDS-PAGE 和Western blotting 都檢測到Bm-TFF2 被分泌性表達于酵母上清。在1%的甲醇誘導表達不同時間后, 重組蛋白在72 h 的表達量最大, 可達50 mg/ L;而不同濃度的飽和硫酸銨沉淀菌液上清時, 80%的飽和硫酸銨沉淀量最大。這些結(jié)果表明, 重組質(zhì)粒Bm-TFF2-pPIC9K 成功構建并在真核細胞中高效表達, 這為進一步研究Bm-TFF2 的生物學活性及其結(jié)構與功能關系奠定了基礎。

6．畢赤酵母在表達病毒蛋白用于疫苗和診斷方面的應用

人輪狀病毒的VP7 基因目前已有用大腸埃希氏菌、乳酸桿菌，植物和哺乳動物細胞等表達系統(tǒng)的報道，而酵母表達尚未見報道。利用巴斯德畢赤酵母表達輪狀病毒的保護性抗原VP7，以制備輪狀病毒基因工程疫苗，可為預防輪狀病毒感染提供一條有效途徑。盧穎等人

[9]將已構建的重組質(zhì)粒VP7-pPICZαA 經(jīng)SacⅠ線性化后，通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，然后Zeocin平板篩選并進行PCR鑒定及Mut 表型篩選，成功構建VP7 基因的重組酵母表達系統(tǒng)，為進一步表達VP7 基因提供理論依據(jù)和實驗基礎。

為了分析真核體系中表達的乙型腦炎病毒E蛋白的生物學特性，張健等人[10]以乙腦病毒SA-14 株為代表，構建了E 蛋白基因的畢赤酵母表達系統(tǒng)。首先，應用RT-PCR 法擴增乙型腦炎病毒E蛋白表達基因，定向克隆入載體pPICZαA，然后將重組質(zhì)粒以PmeⅠ線性化并電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115 感受態(tài)細胞，最后用Zeocin篩選轉(zhuǎn)化子進行鑒定。PCR 擴增產(chǎn)物約為1 350 bp，定向克隆獲得pPICZαA-E 表達載體，經(jīng)測序結(jié)果與Genbank 相應序列比較，核苷酸序列同源性為100%，電轉(zhuǎn)化得到巴氏畢赤酵母重組菌株GS115-E，提取其基因組DNA 經(jīng)PCR鑒定與預期相符。本研究構建的乙型腦炎病毒E 基因畢赤酵母表達系統(tǒng)為進一步進行E蛋白真核表達研究奠定了基礎。

酵母表達系統(tǒng)表達病毒蛋白抗原還在血清學診斷方面有所進展。于天飛等人[11]在多酵母表達系統(tǒng)（GS115/pPIC9-TY，GS115/pPIC9K-ts（Mut+），KM71/pPIC9-ts）中表達了含有豬傳染性胃腸炎病毒S 基因B 和C 抗原位點片段。經(jīng)檢測表明，不同類型酵母表達系統(tǒng)蛋白表達量和抗原性差異不大，研究中獲得的重組蛋白為建立TGE血清學檢測方法提供了必要的物質(zhì)基礎．本試驗所獲得蛋白為PRCV S蛋白缺失部分，以此重組蛋白作為診斷抗原建立的血清學診斷方法可望避免潛在的PRCV感染對檢測TGE的干擾，得出篩選生長速度較快的GS115/pPIC9-TY適合作為今后進一步應用的候選重組菌．

總結(jié)

由于酵母表達外源蛋白，特別是藥用蛋白質(zhì)的種種優(yōu)勢，促使研究人員不斷改進酵母的遺傳特性和生理特性。這些突破更加提高了酵母在生產(chǎn)藥用蛋白中的應用。在工作中對不同來源、不同作用特點外源蛋白的研究和開發(fā)應用，畢赤酵母表達體系是一個很好的選擇，我們需要綜合考慮這一表達體系的上述特點，對目的外源蛋白基因進行相應的改造，設計合理的構建策略，使重組外源蛋白按我們的要求進行表達，有助于獲得大量有活性的表達產(chǎn)物。相信這一表達體系的采用和不斷深入研究勢必為基因工程藥物的發(fā)展提供加速度。

參考文獻

1．V.Renugopalakrishnan, et al.Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris.Appl

Biochem Biotechnol 2007;142:105-124.2．Dae-Kyun Ro, et al.Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast.Nature 2006;440:940-943.3．In Pyo Hong, Sung Jae Lee, Yong Seok Kim, Shin Geon Choi.Recombinant expression of human cathelicidin(h CAP18/LL-37)in Pichia pastoris.Biotechnol Lett 2007;29:73-78.4．Tillman U.Gerngross, et al.Humanization of yeast to produce complex terminally sialylated glycoproteins.Science 2006;313:1441-1443.5．Xiaopeng Yang, et al.Construction of yeast Pichia pastoris to produce Man5GlcNAc2 mammalian mannose-type glycoprotein.Chin J Biotech 2011;27:108-117.6．Aisheng Xiong, Quanhong Yao, et al.High level expression of a synthetic gene encoding Peniophora lycii phytase in methylotrophic yeast Pichia pastoris.Appl Microbiol Biotechnol 2006;72:1039-1047.7．李沛志，任軍樂，安婷，劉堰.融合蛋白CTP-SOD 在畢赤酵母中的表達、純化及抗氧 化能力.生物工程學報 2010;26:324-329.8．余果宇，張紅蕓，張勇，江萍，李文輝，張云.Bm-TFF2 在畢赤酵母中的表達及鑒定.動物學研究 2010;31:565-569.9．盧穎，佟偉，單穎，張軼博，吳囡，董穎，李華，吳學敏.人輪狀病毒外衣殼糖蛋白VP7 基因畢赤酵母重組表達系統(tǒng)的構建.現(xiàn)代預防醫(yī)學 2010;37:3523-3528.10．張健，李一卿.乙型腦炎病毒E 蛋白畢赤酵母表達系統(tǒng)的構建.天津醫(yī)科大學學報 2009;15:40-43.11．于天飛，黎明，呂建偉等人.TGEV 截短S 基因片段在多酵母表達系統(tǒng)中的表達.高師理科學刊 2011;31:73-75.

第四篇：做酵母四個月的心得

還有個奇怪的現(xiàn)象，2天的時候克隆直徑不到2MM，還是乳白色的，長到第3天后居然變成粉紅色的了，有的板紅色的程度更深一些

查資料，考慮有2個原因：1，長的時間太長，菌種老化了

2，培養(yǎng)板上的Ade含量不足，產(chǎn)生了代謝產(chǎn)物是粉紅色的(這一現(xiàn)象別人在實驗中也出現(xiàn)了)

3.也有人解釋說是后期ade不足

般酵母雙雜交的bait序列不超過2000bp比較合適，這是因為

1、酵母的密碼子和人的密碼子有偏好性的差異，當基因超過2000bp后，密碼子偏好性的累積效應造成蛋白翻譯困難；

2、過大的bait蛋白的空間位阻效應會影響Gal4的AD和BD的互做，就會造成即使bait和prey有互做時，Gal4的BD和AD沒有互做，從而不能激活報告基因表達。你的基因2346bp，對酵母來說，翻譯比較困難，所以，酵母生長緩慢，你可以考慮將你的基因分成兩段，分別用于篩庫。

第五篇：暢言語音教具系統(tǒng)使用心得

暢言語音教具系統(tǒng)使用心得

作為一名農(nóng)村小學的英語教師，我一直都有一個愿望：讓學生在每節(jié)課的課堂上都能聽到地地道道的英語口語，師生暢言語音在課堂上用英語暢所欲言。但是由于多方原因，要達到這種境界似乎很難。

最近“暢言智能語音教具系統(tǒng)”的到來，讓我的教學工作有了新的起色。一開始看到暢言智能教具，并沒有在意。后來在慢慢的摸索，逐步使用的過程中，我終于體驗到了它強大而奇妙的功能。現(xiàn)在，我在教學中已越來越離不開它了。我認為這套教具對于英語教師自身素質(zhì)、英語課堂教學效果和學生的綜合能力等各方面的提高有著重大作用。

下面就簡單談談使用暢言語音教具的體會：

一、簡單方便易操作，提高教學效率。

首先，暢言智能語音教具系統(tǒng)用法非常簡單，教師只需用識別筆點擊課本上的內(nèi)容，主機就朗讀相應的英文單詞、句子，唱歌曲歌謠等等，不但節(jié)省了錄音機倒帶的時間，而且解放了教師。這樣一來教師可以巡視、關注每一個學生的情況，了解學生學習效果，適時指導，增大了課堂容量。

其次，識別筆可以一筆多用，除了點擊要播放的內(nèi)容以外，識別筆的激光燈可以當作教鞭使用，引導學生觀看要學習的目標；識別筆上的任意功能鍵還可以幫助維護課堂秩序，提醒學生們集中注

意力；另外在課堂上需要結(jié)束學生熱烈討論的時候，用此鍵可以起“喚醒”和“終止”的作用，提高了各個教學環(huán)節(jié)的學習效果。

二、優(yōu)化英語課堂，調(diào)動學生學習英語的積極性。

傳統(tǒng)的英語課堂教學，組織形式單一。只有老師的講解、提問、學生的回答、跟錄音機反復讀，很難吸引學生的注意力，智能語音教具系統(tǒng)給這樣的課堂注入了新的活力。

暢言智能語音教具中語音合成，自制教具的功能，可以把任意實物，圖片，卡片等制成生動有趣的有聲教具，讓他們自己開口說英語，還可以利用人與主機對話交流，使英語課堂變得更加直觀、形象、真實、從而課堂變得生動活潑有趣。例如，在講動物單詞的時候，我自己錄制了貓和狗的叫聲，來引入單詞教學；講蔬菜水果單詞時，我將相應單詞讀音輸入識別碼中，然后貼到相應圖片上，用筆一點就能說話，這樣一來，學生覺得很奇妙，自然興趣就提高了。還可以利用合成聲音，選擇女聲或男聲朗讀，使學生在純正的語言中感知英語。并通過有聲實物，標準聲音，有聲圖片等把枯燥的單詞，抽象的敘述以生動活潑的形象顯現(xiàn)出來，使學生的大腦變得異常興奮，注意力非常集中，學習的積極性隨之調(diào)動起來。

三、提高教師自身素質(zhì)，促進學生的發(fā)展。

暢言智能語音教具系統(tǒng)提供的“發(fā)音評測”、“中英文朗讀”功能為我們教師自身發(fā)展提供了很好的學習工具，在一定程度上也促進了學生的發(fā)展。

“發(fā)音評測”相當于隨時隨地的口語校正“老師”，利用它可以對教師自己的發(fā)音進行測試，比較差異，提高發(fā)音的標準度。也可以對學生單詞、句子和篇章的發(fā)音準確性進行評測，系統(tǒng)立即打分，得出錯對辨率，我們可以對照標準，改正錯誤的發(fā)音。

“中英文朗讀”功能中的“每日推薦”板塊提供了大量的英文閱讀材料，是老師提升英語閱讀及聽力能力的絕妙的好機會，每日內(nèi)容不同，涉及面廣，我們不需要花大量的時間和精力去尋找或購買英語報刊等，很輕松地就能增加我們的課外知識，提高我們的語言綜合運用能力。

除此之外，暢言智能語音教具系統(tǒng)還有許多重要的功能：

第一，暢言智能語音教具系統(tǒng)實現(xiàn)了中英文對照朗讀功能，這 是區(qū)別于其他英語語音教具的一大亮點。

一般的語音教具僅能播放英語課文的朗讀，很難實現(xiàn)英漢同步播放。為了能更好的利用暢言智能語音教具軟件系統(tǒng)解決此類矛盾，服務于現(xiàn)代英語教學，我的想法是：在語音合成過程中同時輸入英文和中文，對發(fā)音人進行配合選擇，這樣便可以聽取中英文對照的朗讀，解決了部分學生的聽力理解較差的難題。具體的做法是將手頭的中英文對照文本，或者是一段中文一段英文的文本上傳至暢言智能語音教具軟件，在軟件的“高級朗讀模式”中，可以用中文發(fā)音人（“中文男聲”或者“中文女聲”）來朗讀中文，用英文發(fā)音人（“英文男聲”或者“英文女聲”）來朗讀英文，這樣，就可以聽到中英文對照朗讀了。若有的中英文對

照文本，英文較簡單只需要朗讀英文部分，而中文部分不需要朗讀，那么可以這樣設置：選擇英文部分，選擇英文男聲或女聲發(fā)音人；選擇中文部分，選擇“不朗讀”即可。

第二，借助暢言智能語音教具中英文“高級朗讀模式”你還可以根據(jù)課文的難易，學生的反應適當調(diào)節(jié)朗讀的速度，獲取最佳的聽覺效果。

第三，系統(tǒng)軟件上附帶的“生詞表”可以說是一本“活字典”，不僅可以幫助教師和學生查找任何一個生疏的單詞，還可以點讀、跟讀、模仿，一定程度上降低了學生出現(xiàn)啞巴英語的可能性。從“生詞表”中，可以看到生詞以字母順序進行排列，當鼠標指向某個詞語或短語時，會給出詞語相應的解釋，使用者可以點擊“試聽”來聽取標準的讀音。最為便捷的是，用戶還可以任意搜索需要的詞語或者選擇是否需要顯示詞語的解釋，這樣為使用者提供了很大的方便。

總之，智能語音教具的到來，對我們廣大英語教師來講真是增添了一個好幫手，它給我們帶來了很大的的方便，豐富了教學手段，使課堂生動起來，給學生帶來了學習英語的好環(huán)境，大大調(diào)動了學生學習英語的積極性，增強了學習興趣。相信，在我和它以后相處的日子里，我會進一步加深對它的認識，更好的將它應用于現(xiàn)代英語教學中。