第一篇：狂犬病病毒培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

狂犬病病毒培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展

狂犬病作為一種幾乎100%致死的人獸共患傳染病，對人類的危害已經(jīng)存在了4000多年，至今仍無有效的治療藥物，可行的控制策略只有暴露前免疫和暴露后預(yù)防。其中暴露前免疫主要是針對動(dòng)物而言，因?yàn)槿说目袢碓从趧?dòng)物，只要?jiǎng)游锏目袢∶庖哳A(yù)防有效，可完全控制人狂犬病的發(fā)生；而暴露后預(yù)防主要用于人，因?yàn)槿艘坏┍粠Ф緞?dòng)物咬傷，必須及時(shí)進(jìn)行全程的暴露后預(yù)防才能防止感染狂犬病病毒。

不論是暴露前免疫，還是暴露后預(yù)防，都離不開安全、有效、廉價(jià)的疫苗。人和獸用狂犬病疫苗的發(fā)展，都依賴于病毒培養(yǎng)技術(shù)的不斷進(jìn)步，尤其是微載體、發(fā)酵技術(shù)和無血清培養(yǎng)基的廣泛應(yīng)用，把狂犬病病毒的增殖滴度提高到了一個(gè)新的水平，同時(shí)降低了生產(chǎn)成本，從而使高質(zhì)量的細(xì)胞純化疫苗逐漸占領(lǐng)市場。

無論是傳統(tǒng)的體內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)，還是現(xiàn)在的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以及新型的細(xì)胞發(fā)酵和生物反應(yīng)器，目前都廣泛應(yīng)用于狂犬病病毒的實(shí)驗(yàn)室研究或疫苗生產(chǎn)。本文主要就狂犬病病毒培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和新技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀綜述如下。體內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)

體內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)利用了狂犬病病毒的嗜神經(jīng)特性，具有敏感性好的優(yōu)點(diǎn)，可以提高病毒檢測的陽性率，而且易于操作，適用于不具備組織培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)室。其中，小鼠腦內(nèi)接種是實(shí)驗(yàn)室最常用的狂犬病診斷和病毒培養(yǎng)技術(shù)之一，其他動(dòng)物如大鼠、羊、兔等，過去主要用于狂犬病神經(jīng)組織疫苗的生產(chǎn)。

禽胚胎培養(yǎng)技術(shù)主要是利用鴨胚和雞胚進(jìn)行狂犬病病毒培養(yǎng)，如雞胚傳代致弱的Flury-HEP、Flury-LEP和Kelev毒株。

1.1 腦內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)

小鼠腦內(nèi)接種是最常用的狂犬病病毒腦內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)，最早用于狂犬病野毒株的分離培養(yǎng)是在1925年[5]。1955年，該技術(shù)開始用于疫苗生產(chǎn)，F(xiàn)uenjalida和Palacios用新生鼠腦制備出人用組織疫苗（SMBV），該疫苗曾在南美洲使用了40多年，最終因使用后會(huì)引起嚴(yán)重的神經(jīng)綜合癥而被迫停產(chǎn)[1]，但是小鼠腦內(nèi)接種技術(shù)卻一直延用至今。目前，該技術(shù)已成為病毒分離、毒力測定及中和試驗(yàn)等的常用方法，所用動(dòng)物一般為小鼠，乳鼠對狂犬病病毒腦內(nèi)接種的敏感性高于幼鼠和成年鼠[6]。小鼠中，以瑞士白化鼠（Swiss albino）為首先品種，該品種小鼠在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)容易，對狂犬病病毒高度敏感，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)任何對狂犬病病毒具有遺傳抗性的小鼠品系，因此也可使用其他品種的小鼠。實(shí)驗(yàn)室一般不采用野生灰鼠或家鼠，因?yàn)槠湟靶暂^大，人工飼養(yǎng)困難?？袢∧X內(nèi)接種試驗(yàn)周期長，通常需觀察21天，且成本較高，操作技術(shù)性強(qiáng)，鑒于此，有的實(shí)驗(yàn)室已改用細(xì)胞（如小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞和BHK細(xì)胞等）代替小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。

其他腦內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)（大鼠、羊、兔等動(dòng)物的腦內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)）在20世紀(jì)80年代以前曾廣泛應(yīng)用于人狂犬病腦組織滅活疫苗的生產(chǎn)，如Semple、Fermi和Hempt疫苗等。但是，隨著細(xì)胞疫苗的發(fā)展和神經(jīng)組織疫苗的使用安全問題，該技術(shù)已不再常用。

1.2 禽胚胎培養(yǎng)技術(shù)7－10

鴨胚培養(yǎng)技術(shù)過去主要用于人用狂犬病疫苗的生產(chǎn)，目前在實(shí)驗(yàn)室使用較少。1955年，Peck等開始研制狂犬病鴨胚疫苗，該疫苗于1957年在美國上市，到1973年已成為美國主要的狂犬病疫苗，但是進(jìn)入80年代后，在疫苗生產(chǎn)中人二倍體細(xì)胞（HDC）培養(yǎng)取代了鴨胚培養(yǎng)技術(shù)。

在狂犬病病毒適應(yīng)雞胚培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)傳40～50代時(shí)，獲得的低胚傳代株（Flury-LEP）對小鼠、大鼠和倉鼠進(jìn)行腦內(nèi)或肌肉接種時(shí)仍具有致病性，豚鼠腦內(nèi)接種也可感染，但肌肉接種時(shí)則無致病力；家兔腦內(nèi)和肌肉注射均不發(fā)病；犬肌肉接種也不發(fā)病。但是，病毒在傳代176至182代時(shí)（Flury-HEP）大部分毒力會(huì)喪失，此時(shí)將病毒腦內(nèi)接種成年鼠、兔、犬時(shí)，均無致病性。因此，一般高代次的Flury-HEP推薦在牛和貓中使用，F(xiàn)lury-LEP僅用于犬。Kelev株雞胚疫苗系經(jīng)雞胚傳代60～70次的病毒，該病毒對倉鼠、豚鼠和兔的腦內(nèi)和肌肉的接種均不產(chǎn)生感染癥狀；以高濃度的病毒對犬進(jìn)行肌肉接種，也不出現(xiàn)感染癥狀。Flury和Kelev株均適于在雞胚中生長，過去一直用于犬狂犬病疫苗的生產(chǎn)，其中Flury株在世界范圍內(nèi)廣泛使用。

鴨胚和雞胚的接種基本一致，選取培養(yǎng)7天的健康胚，將狂犬病病毒毒液接種到卵黃囊內(nèi)，鴨胚培養(yǎng)10～14d，雞胚培養(yǎng)9～10d。

2.體外培養(yǎng)技術(shù)

1913年，Noguchi和Levaditi首次將組織培養(yǎng)技術(shù)用于狂犬病病毒的研究。1930年，Stoel將狂犬病病毒在移植于兔血漿凝塊中的雞胚腦和心臟內(nèi)培養(yǎng)了5代，病毒感染力沒有喪失。Atanasieu等利用小鼠食管膜瘤細(xì)胞系（一種非神經(jīng)細(xì)胞）培養(yǎng)了狂犬病病毒街毒株和固定毒株，首次在細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中報(bào)道了類似于Negri小體的胞漿內(nèi)包涵體。

人用狂犬病細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗的研究始于1964年,該項(xiàng)研究表明，人二倍體細(xì)胞株WI-38株可以作為狂犬病固定毒PM株的適應(yīng)細(xì)胞，用于疫苗生產(chǎn)。1967年，Merieux研究所開始利用人二倍體體細(xì)胞進(jìn)行疫苗研發(fā)。1974年，人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗在法國批準(zhǔn)使用，1978年開始商業(yè)化生產(chǎn)。

2.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

前蘇聯(lián)以狂犬病病毒Vnukovo-32株感染原代地鼠腎細(xì)胞（PHKC），經(jīng)紫外滅活后制備狂犬病疫苗，我國則以原代地鼠腎細(xì)胞（PHKC）培養(yǎng)狂犬病固定毒北京株，經(jīng)甲醛滅活制備狂犬疫苗，主要用于暴露后治療，其年需求量也相當(dāng)大。

還有一些類似的疫苗是在原代胎牛腎細(xì)胞和犬腎細(xì)胞上培養(yǎng)并制備的。其中原代胎牛

腎細(xì)胞（FBKC）培養(yǎng)疫苗的適應(yīng)毒株是巴斯德固定株P(guān)V-31，于1984年在法國批準(zhǔn)用于暴露后治療，1987年以后不再生產(chǎn)。有報(bào)道顯示，F(xiàn)BKC疫苗有很好的耐受性和免疫原性，抗體反應(yīng)類似于HDC疫苗。原代犬腎細(xì)胞疫苗的適應(yīng)株是狂犬病固定毒PM株，PM株對人二倍體細(xì)胞也適應(yīng)。

不同動(dòng)物（小鼠、倉鼠、豬、犬和猴）源性的原代腎細(xì)胞培養(yǎng)物和禽類胚胎成纖維細(xì)胞對狂犬病病毒的易感性，證實(shí)了這些細(xì)胞具有用于狂犬病疫苗生產(chǎn)的潛力。如1960年Fennie報(bào)道了第一個(gè)用原代倉鼠腎細(xì)胞制備狂犬病疫苗，經(jīng)過修飾后，結(jié)合狂犬病病毒北京株，我國已經(jīng)將其用于人狂犬病疫苗的生產(chǎn)。Vnukovo-32株也是以類似的方式在前蘇聯(lián)用于狂犬病疫苗生產(chǎn)的。此外，人用疫苗也有以牛腎細(xì)胞、犬腎細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞生產(chǎn)的，后者采用的病毒株為Flury LEP C25。

人用狂犬病原代倉鼠腎細(xì)胞成品疫苗有凍干和液體2種劑形，由原代倉鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)的狂犬病病毒固定毒株經(jīng)甲醛滅活后制備，是我國此前主要的人用狂犬病疫苗品種?？袢」潭ǘ颈本┲暝谶m應(yīng)原代倉鼠腎細(xì)胞（PHKC）培養(yǎng)后，用于疫苗生產(chǎn)。該毒株是1931年從中國北京1條死于狂犬病的犬腦內(nèi)分離得到的。通過在兔腦內(nèi)連續(xù)傳代后得到固定毒株，到1980年為止主要用于Semple神經(jīng)組織疫苗的生產(chǎn)。

狂犬病病毒Vnukovo-32株是SAD株的衍生株，該毒株源于1935年從美國阿拉巴馬州的一條犬中分離出的野毒（SAD），經(jīng)鼠腦和PHKC交替?zhèn)鞔鷤鞔?5代，再在37℃下經(jīng)PHKC連續(xù)傳10代，達(dá)到第32代，完成該毒株在原代倉鼠腎細(xì)胞（PHKC）中的適應(yīng)，即稱為Vnukovo-32。適應(yīng)的毒株，在32℃，PHKC上培養(yǎng)，以第33代～178代毒建立基礎(chǔ)種子庫和工作種子庫，－60℃或凍干保存。

2.2 傳代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

人二倍體細(xì)胞（Human diploid cell, HDC）疫苗是最早商品化的細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，目前已在世界范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用，并成為其他狂犬病細(xì)胞培養(yǎng)疫苗的參照標(biāo)準(zhǔn)。法國Marcy l′Etoile的Merieux研究所和德國Marburg的 Behring研究所研制的人二倍體細(xì)胞疫苗均以人二倍體細(xì)胞MRC-5培養(yǎng)，經(jīng)β-丙內(nèi)酯（BPL）滅活后制得。兩者不同的是，Behring研究所生產(chǎn)的疫苗經(jīng)梯度超速離心進(jìn)行濃縮和純化，而Merieux研究所系通過超濾實(shí)現(xiàn)疫苗的濃縮。

人用純化雞胚細(xì)胞疫苗(PCEC)是以原代SPF雞胚細(xì)胞培養(yǎng)制備的，該疫苗為凍干品，其制備過程主要包括β-丙內(nèi)酯滅活后狂犬病病毒抗原的純化和濃縮等。

早期對組織培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雞胚細(xì)胞培養(yǎng)的低代狂犬病病毒Flury株(low egg passage Flury strain, Flury-LEP)更適于作為疫苗株使用。在此基礎(chǔ)上，1973年以Flury-LEP株研制出獸用滅活疫苗。以此系統(tǒng)進(jìn)行人用雞胚細(xì)胞疫苗的生產(chǎn)，首先須將收獲的狂犬病病毒經(jīng)蔗糖密度梯度離心，達(dá)到濃縮、純化的目的。改良后的抗體結(jié)合試驗(yàn)可以用于滅活后狂犬病病毒抗原成分的定量。20世紀(jì)80年代，建立了多種適用于純化雞胚細(xì)胞疫苗的實(shí)驗(yàn)室檢

測方法，并開始了在人的臨床試驗(yàn)。

恒河猴胎猴肺二倍體細(xì)胞（FRhMDC）疫苗是由美國的公共衛(wèi)生部的密歇根州生物制品研究所在20世紀(jì)70年代開發(fā)的。1979年開始在志愿者中進(jìn)行臨床試驗(yàn)，1988由美國食品與藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于暴露前后狂犬病防治。

人用狂犬病犬腎細(xì)胞疫苗是利用犬腎細(xì)胞在微載體上培養(yǎng)的。疫苗的凍干品包括經(jīng)?-丙內(nèi)酯滅活的狂犬病病毒固定毒株和用以吸附病毒的磷酸鋁佐劑。

建立了敏感的細(xì)胞系和細(xì)胞株以后，可以系統(tǒng)研究狂犬病病毒及病毒與宿主細(xì)胞的相互作用。迄今已有很多傳代細(xì)胞系用于動(dòng)物狂犬病疫苗的制備，如BHK-

21、倉鼠腎成纖維細(xì)胞（Nil-2）和雞胚相關(guān)細(xì)胞（CER）。但由于某些細(xì)胞系的異源特性和潛在致瘤性，目前只有猴腎細(xì)胞Vero用于人狂犬病疫苗的制備。

人二倍體細(xì)胞（WI-38）在1964年首次報(bào)道用于人狂犬病疫苗生產(chǎn)，此后，其他二倍體細(xì)胞如人胚肺細(xì)胞（HEL）、人肺細(xì)胞（MRC-5）和恒河猴二倍體細(xì)胞系也用于人狂犬病疫苗生產(chǎn)。

除了上面提到的細(xì)胞以外，狂犬病病毒還可在胚胎雞肌管、鼠的巨噬細(xì)胞、大鼠感覺神經(jīng)系統(tǒng)、大鼠垂體腫瘤細(xì)胞、黑山羊和豚鼠腎細(xì)胞、胎兒蝙蝠細(xì)胞、人滑液（McCoy）細(xì)胞、日本鵪鶉胚胎細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）中復(fù)制。病毒接種昆蟲細(xì)胞也能檢測到病毒特異性抗原，但其水平明顯低于其他細(xì)胞。

人和小鼠源的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞已廣泛用于狂犬病病毒研究，尤其是鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞（NA-C1300，為次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺陷細(xì)胞株），顯微鏡下觀察，該細(xì)胞與人的神經(jīng)元大致相同，細(xì)微結(jié)構(gòu)都有神經(jīng)元樣形態(tài)，在微管蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)合成酶和可興奮細(xì)胞膜上也有很多共同特征。

狂犬病病毒固定毒株HEP Flury和LEP Flury可以在原代雞胚細(xì)胞中培養(yǎng)，經(jīng)β-丙內(nèi)酯（BPL）滅活后制備疫苗。20世紀(jì)60年代，Kondo等研制出了純化的雞胚細(xì)胞培養(yǎng)疫苗（PCEC），1980年批準(zhǔn)使用。此后，很多國家引入了純化雞胚細(xì)胞培養(yǎng)疫苗用于暴露后治療，特別是一些東南亞國家。德國Behring研究所也研制了一種類似的疫苗。一項(xiàng)935名受試者接種4247劑純化雞胚細(xì)胞疫苗的臨床試驗(yàn)表明，與人二倍體細(xì)胞苗相比，純化雞胚細(xì)胞培養(yǎng)疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生更高的抗體滴度。在歐洲，印度次大陸以及東南亞地區(qū)（泰國）均有大量此種疫苗生產(chǎn)并應(yīng)用于暴露后治療。

接種病毒的組織培養(yǎng)細(xì)胞可用常規(guī)的單層或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)也已成功。培養(yǎng)液的最適pH為7.4～7.6，適宜溫度范圍為30～40℃，但低溫培養(yǎng)(32℃)尤為適宜。

3.細(xì)胞發(fā)酵和生物反應(yīng)器技術(shù)

前一節(jié)介紹了狂犬病人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)疫苗(HDC)的制備。盡管人用二倍體細(xì)胞疫苗安全性良好、免疫原性也高，但人二倍體細(xì)胞培養(yǎng)的病毒滴度相對較低，必有經(jīng)過濃縮才能獲

滿足質(zhì)量要求的疫苗，致使本疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)受到了限制。脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗是最早使用人二倍體細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗，因?yàn)楫a(chǎn)毒滴度不高，WHO生物標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會(huì)為此還對該疫苗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修正。

微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（由Van Wezel發(fā)明）的出現(xiàn)，使細(xì)胞得以大規(guī)模培養(yǎng)并應(yīng)用到人用疫苗的制備中。隨著脊髓灰質(zhì)炎病毒Vero細(xì)胞滅活疫苗的成功研制，人們開始轉(zhuǎn)向以Vero細(xì)胞培養(yǎng)狂犬病病毒并制備滅活疫苗。因?yàn)樵撘呙缫笥屑兓^程，以除去殘留的細(xì)胞DNA成分，因此該疫苗稱為狂犬病Vero細(xì)胞純化疫苗（purified Vero cell rabies vaccine, PVRV）。

考慮到HDC的生產(chǎn)成本，開發(fā)商們開始尋找適應(yīng)狂犬病病毒增殖的新的細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)體系、病毒株和相關(guān)的生產(chǎn)技術(shù)，希望能夠在保持疫苗高效力的同時(shí)，降低生產(chǎn)成本。最早用于狂犬病疫苗生產(chǎn)的傳代細(xì)胞系是用微載體系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，是來源于非洲綠猴的腎細(xì)胞系。

1984年11月，WHO和RF合作，采用微載體技術(shù)高密度灌流Vero細(xì)胞，工業(yè)化生產(chǎn)狂犬病疫苗，歷時(shí)15年，取得成功。目前，Vero細(xì)胞疫苗已經(jīng)在世界上許多國家取得了安全有效的使用經(jīng)驗(yàn)。

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[11]

第二篇：豬圓環(huán)病毒2型疫苗最新研究進(jìn)展

豬圓環(huán)病毒2型疫苗最新研究進(jìn)展

豬圓環(huán)病毒病是公認(rèn)的免疫抑制病之一，造成豬場損失慘重，疫苗免疫成了救命的稻草。從2011年豬圓環(huán)疫苗上市至今，已有17家圓環(huán)產(chǎn)品先后上市，目前，出現(xiàn)嚴(yán)重供大于求的現(xiàn)象，同時(shí)，養(yǎng)殖場也面臨著幸福的煩惱，大量產(chǎn)品的上市，產(chǎn)品價(jià)格可能下降，但是，面對玲瑯滿目的產(chǎn)品，如何選擇疫苗成了養(yǎng)殖場一個(gè)重要的課題，針對這些煩惱，本文希望能夠?yàn)轲B(yǎng)殖場選擇疫苗帶來幫助，避免走彎路，為養(yǎng)殖場服務(wù)。

1.PCV-2國內(nèi)外最新流行動(dòng)態(tài)

由PCV-2引發(fā)的疾病已成全球流行之勢，在加拿大首次報(bào)道該病原引起PMWS后[1]，學(xué)者通過調(diào)查本國包括SPF豬、部分散養(yǎng)豬以及育肥豬發(fā)現(xiàn)，豬群中PCV-2血清中抗體普遍存在，但目前該病在加拿大仍然只是散發(fā)。在英國和北愛爾蘭，豬群血清中PCV-2抗體陽性率分別為86％和92％。美國、法國、丹麥、意大利、西班牙、荷蘭、新西蘭、日本、韓國、墨西哥等國家也相繼報(bào)道豬群中存在PMWS。在我國豬群中PCV-2感染情況也不容樂觀。2000年郎洪武等[2]在北京、河北、山東、天津、江西、吉林、河南等7省(市)的22個(gè)豬群采集了559份血清，用ELISA方法檢測PCV-2抗體，其陽性率高達(dá)5l％，表明我國豬群中存在PCV-2的感染。王忠田等[3]用PCR方法對我國北京、山東、河北、深圳、山西、天津、廣東等省(市)的12個(gè)規(guī)?；i場發(fā)病豬群進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型感染的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明豬圓環(huán)病毒2型感染情況在我國豬群中相當(dāng)嚴(yán)重。李超等[4]在2010年對安徽省PCV-2流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果表明安徽省14個(gè)市(縣)的PCV-2抗體陽性率平均為74.36％，表明安徽省豬群中普遍存在著PCV-2的感染。從上述報(bào)道表明PCV-2在我國豬群中廣泛存在。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，雖然豬群中PCV-2抗體陽性率較高，但很大比例的抗體陽性豬群并不表現(xiàn)出臨床癥狀。PCV-2與其他多種病原混合感染較為嚴(yán)重，調(diào)查發(fā)現(xiàn)沙門氏菌、大腸桿菌等細(xì)菌性病原與PCV-2混合感染率達(dá)到了20％[5]。陜西省PCV-2與PRV混合感染率是21.7％[6]。2005年陳義祥等對廣西地區(qū)197份組織病料檢測發(fā)現(xiàn)，PCV-2與PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染占總病料數(shù)量的57.73％。2003年王文軍等[7]對黑龍江地區(qū)PCV-2陽性豬群的病料調(diào)查發(fā)現(xiàn)，藍(lán)耳病和豬瘟的陽性率也較高。

哈爾濱獸醫(yī)研究所劉長明[8]在2007年采用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞染色試驗(yàn)（IPMA）對來自與黑龍江、吉林、河北、上海、內(nèi)蒙古、云南、江西等地的健康豬群480份血清和發(fā)病豬群424份血清，抗體陽性率分別為79.2%和91.7%，表明PCV-2在豬群中感染率非常高。山東農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所吳家強(qiáng)博士檢測結(jié)果也證實(shí)PCV-2防控比較糟糕，PCV-2，2010年檢出率為34.66%（124/357），2011年檢出率為25.59%(174/588)；2012年檢出率為2

1.38%(147/683)，圓環(huán)病毒病依然嚴(yán)重，但有下降趨勢，這個(gè)和使用圓環(huán)疫苗免疫有關(guān)系。

第三篇：酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展

酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展

提 要 酵母雙雜交技術(shù)是一種有效的真核活細(xì)胞內(nèi)研究方法，在蛋白質(zhì)相互作用的研究方面得到了廣泛的應(yīng)用并取得了許多有價(jià)值的重要發(fā)現(xiàn)。作為一個(gè)完整的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，它自建立以來經(jīng)過了不斷的改進(jìn)與完善，不僅進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性與精確性，而且在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了反向雙雜交，三雜交及核外雙雜交等多項(xiàng)技術(shù)。這些都將對功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究起到促進(jìn)作用。

0 引言

隨著分子生物學(xué)研究尤其是人類基因組計(jì)劃的迅速發(fā)展，大量關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的信息不斷涌現(xiàn)，對這些信息進(jìn)行系統(tǒng)研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。這不僅需要利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行生物信息學(xué)的分析和預(yù)測，而且必須結(jié)合生物學(xué)實(shí)驗(yàn)獲取證據(jù)。為適應(yīng)同時(shí)對多個(gè)基因或蛋白進(jìn)行研究的發(fā)展趨勢，已出現(xiàn)了很多新技術(shù)，如DNA微陣列技術(shù)（DNA micoarry）,基因表達(dá)的系列分析（SAGE）,肽質(zhì)譜分析法，蛋白雙向膠電泳技術(shù)及酵母雙雜交技術(shù)（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母雙雜交技術(shù)以其簡便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用等特點(diǎn)在基因功能的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。酵母雙雜交技術(shù)的基本原理

1989年，Song和Field建立了第一個(gè)基于酵母的細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白間相互作用的遺傳系統(tǒng)〔1〕。很多真核生物的位點(diǎn)特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可分割開的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異結(jié)合域（DNA-binding domain，BD）與轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptional activation domain，AD）。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,否則無法完成激活功能。不同來源激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則特異地激活被BD結(jié)合的基因表達(dá)?；谶@個(gè)原理，可將兩個(gè)待測蛋白分別與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白，并共表達(dá)于同一個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個(gè)待測蛋白間能發(fā)生相互作用，就會(huì)通過待測蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報(bào)告基因表達(dá)。通過對報(bào)告基因表型的測定可以很容易地知道待測蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。

酵母雙雜交系統(tǒng)由三個(gè)部分組成：(1)與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait)。(2)與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey)。(3)帶有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株。常用的報(bào)告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應(yīng)的缺陷型。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營養(yǎng)標(biāo)記基因。這些有利于實(shí)驗(yàn)后期雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。根據(jù)目前通用的系統(tǒng)中BD來源的不同主要分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng)。后者因其BD來源于原核生物，在真核生物內(nèi)缺少同源性，因此可以減少假陽性的出現(xiàn)。酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

酵母雙雜交技術(shù)產(chǎn)生以來，它主要應(yīng)用在以下幾方面：(1）檢驗(yàn)一對功能已知蛋白間的相

互作用。(2）研究一對蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域。通常需對待測蛋白做點(diǎn)突變或缺失突變的處理。其結(jié)果若與結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)合則可以極大地促進(jìn)后者的發(fā)展。(3)用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑。(4)分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫。然后根據(jù)釣到的已知基因的功能推測該新基因的功能。常見問題的解決與改進(jìn)

酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用中常遇到的問題一是假陽性較多，二是轉(zhuǎn)化效率偏低。所謂假陽性就是:在待研究的兩個(gè)蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下,報(bào)告基因被激活。主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨(dú)激活作用,或者這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合,則也可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。因此,為排除假陽性就需要作嚴(yán)格的對照試驗(yàn)。應(yīng)對誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。目前幾個(gè)公司推出的酵母雙雜系統(tǒng)都采用了多個(gè)報(bào)告基因,且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同,這可減少大量的假陽性。另外,報(bào)告基因通常整合到染色體上,可以使基因表達(dá)水平穩(wěn)定,消除了由于質(zhì)?？截悢?shù)變化引起基因表達(dá)水平波動(dòng)而造成的假陽性。即使根據(jù)嚴(yán)格的對照實(shí)驗(yàn)證明確實(shí)發(fā)生了蛋白間的相互作用，還應(yīng)對以下方面進(jìn)行分析：

(1)這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生,即這一對蛋白在細(xì)胞的正常生命活動(dòng)中是否會(huì)在同一時(shí)間表達(dá)且定位在同一區(qū)域。

（2)某些蛋白如是依賴于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員,它們具有普遍的蛋白間的相互作用的能力。

（3)一些實(shí)際上沒有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個(gè)親a-螺旋的蛋白質(zhì)間可以發(fā)生相互作用。十年來,酵母雙雜交技術(shù)一直在消除假陽性方面不斷改進(jìn),并且已取得較好的效果。

在酵母雙雜交的應(yīng)用中有時(shí)也會(huì)遇到假陰性現(xiàn)象。所謂假陰性，即兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用,但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測不出來。造成假陰性的原因主要有兩 方面：一是融合蛋白的表達(dá)對細(xì)胞有毒性。這時(shí)應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。二是蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現(xiàn)象雖不是實(shí)驗(yàn)中的主要問題,但也應(yīng)予以重視。

轉(zhuǎn)化效率是酵母雙雜交文庫篩選時(shí)成敗的關(guān)鍵之一，特別是對低豐度cDNA庫進(jìn)行篩選時(shí)，必須提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)可采用共轉(zhuǎn)化或依次轉(zhuǎn)化，相比之下共轉(zhuǎn)化省時(shí)省力。更重要的是如果單獨(dú)轉(zhuǎn)化會(huì)發(fā)生融合表達(dá)蛋白對酵母細(xì)胞的毒性時(shí),共轉(zhuǎn)化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型的單倍體酵母中,通過兩種接合型單倍體細(xì)胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個(gè)二倍體細(xì)胞。目前很多機(jī)構(gòu)建立了大量的cDNA文庫和基因組文庫，但這些文庫大多無法直接用于雙雜交系統(tǒng)的篩選。而文庫的質(zhì)量對于轉(zhuǎn)化和篩選又非常關(guān)鍵。因此，大量構(gòu)建適用于酵母雙雜交的文庫非常必要?，F(xiàn)已出現(xiàn)一種采用體內(nèi)重組技術(shù)來達(dá)到這個(gè)目的的方法。酵母雙雜交技術(shù)的新發(fā)展

酵母雙雜交技術(shù)在應(yīng)用中發(fā)揮了巨大的作用，但人們也注意到了它有一定的局限性。為此發(fā)展了多種適應(yīng)不同目的需要的改型的雙雜交技術(shù)。

反向雙雜交技術(shù) 在研究中檢測并鑒定出那些能阻斷兩個(gè)蛋白間相互作用的因素有重要意義。在研究那些能使相互作用被阻斷的因素(如尋找哪些結(jié)構(gòu)域上發(fā)生突變可使相互作用中

斷或那些分子可以阻斷相互作用)時(shí)，傳統(tǒng)的雙雜交技術(shù)有較大的局限性。因此，反向雙雜交系統(tǒng)(Reverse Two-Hybrid System)應(yīng)運(yùn)而生。這項(xiàng)技術(shù)的特點(diǎn)是采取了反選擇篩選策略。根據(jù)反選擇設(shè)計(jì)的不同，大致可以分為兩類。一類是用便于反選擇的URA3或CYH2基因作為報(bào)告基因。URA3基因編碼尿嘧啶合成途徑中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，使細(xì)胞無法生長。反之，在能生長的細(xì)胞中，外界因素已使蛋白間的相互作用不能發(fā)生，而我們想知道的正是這些因素。因此，只要對存活的克隆進(jìn)行檢測就可以得到結(jié)果。Vidal等人用這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)了影響轉(zhuǎn)錄因子E2F1中與DP1相互作用必需區(qū)內(nèi)的點(diǎn)突變。另一類是將常規(guī)報(bào)告基因(如HIS3)置于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn10編碼的tet-抑制因子(TetR)/操縱基因控制之下。待測蛋白之間發(fā)生相互作用后首先激活tet-R基因表達(dá)抑制因子TetR,TetR結(jié)合到tet操縱基因后就抑制了報(bào)告基因的表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)化子不能生長。只有當(dāng)待測蛋白之間的相互作用被某種因素所阻斷而無法激活tet-R基因時(shí)，報(bào)告基因才能擺脫tet操縱基因的控制而表達(dá)，使轉(zhuǎn)化子獲得在選擇培養(yǎng)基上生長的能力。Shih 等人利用這種方法鑒定出cAMP-應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位點(diǎn)的Ser133突變會(huì)阻斷其與輔助激活因子(CREB結(jié)合蛋白)的相互作用。

三雜交技術(shù) 在許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞過程中，兩個(gè)蛋白間的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究這些大分子對蛋白間相互作用的影響過程中發(fā)展了一種新的技術(shù)系統(tǒng)——三雜交系統(tǒng)(Three-Hybrid System)，其本質(zhì)與雙雜交是相同的，只是需通過第三個(gè)分子的介導(dǎo)把兩個(gè)雜交蛋白帶到一起。例如小配體三雜交系統(tǒng)(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以滲透的二聚體化學(xué)誘導(dǎo)物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作橋梁，將AD和BD融合蛋白連接到一起，激活報(bào)道基因的表達(dá)。研究較多的是免疫抑制劑FK506。Belshaw等將FK506與環(huán)孢菌素A(Cyclosporin

A)構(gòu)建成異源二聚體，它能把分別與FK506和環(huán)孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活報(bào)告基因。Licitra將FK506與地米塞松(dexamethasone)通過共價(jià)鍵連接成二聚體。通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了FK506與蛋白FKBP-12間的特異性相互作用，表明用這種方法鑒定蛋白與小分子間的相互作用是切實(shí)可行的。RNA與蛋白之間的相互作用是許多細(xì)胞生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，例如mRNA的翻譯，早期發(fā)育以及RNA病毒的感染等。然而可用于這方面研究的簡便方法卻很少。RNA三雜交系統(tǒng)(RNA Three-Hybrid System)的建立為分析RNA與蛋白之間的相互作用提供了有效的手段。這個(gè)系統(tǒng)主要是由一個(gè)RNA分子和兩個(gè)都能結(jié)合該RNA的蛋白質(zhì)組成。此RNA的一部分與一個(gè)已知蛋白結(jié)合后就可利用它的另一部分去篩選新的RNA結(jié)合蛋白。因此這種技術(shù)既可檢測由RNA介導(dǎo)的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可篩選鑒定新的蛋白結(jié)合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突變體RevM10與Gal4 DB域融合作為誘餌蛋白，利用該RevM10蛋白能識(shí)別并結(jié)合其靶RNA中Rev蛋白反應(yīng)元件(Rev responsive element,RRE)的作用去篩選同樣也能與此RNA結(jié)合并已與Gal4 AD域融合的未知蛋白。根據(jù)同樣的原理，如將一個(gè)已知RNA與RRE融合形成雜合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作為誘餌，便可用于篩選該RNA結(jié)合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌體衣殼蛋白能識(shí)別結(jié)合其基因組內(nèi)一種21核苷酸的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特性，將RNA噬菌體衣殼蛋白與Lex DB域融合，構(gòu)建成可用于尋找體內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白的酵母三雜交系統(tǒng)。

核外雙雜交技術(shù) 在傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)中，蛋白之間的相互作用是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的。因此,它不能檢測某些在核外蛋白之間的相互作用。為了克服這種局限性，近年來有人建立了核外雙雜交技術(shù)。其中SRS 和USPS就是這種技術(shù)的兩個(gè)代表。SRS也稱Sos蛋白召集系統(tǒng)(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分別將待測蛋白X與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的一種鳥苷交換因子(EGF)Sos蛋白融合；將Y蛋白與錨定在酵母細(xì)胞膜上的Src肉豆寇烯化信

號(hào)蛋白融合，并使它們共表達(dá)于一個(gè)cdc25-2基因溫度敏感型突變的酵母菌株內(nèi)。由于該菌株中cdc25-2基因編碼的EGF蛋白在36℃條件下不能激活細(xì)胞膜上的Ras蛋白，Ras途徑不通。所以細(xì)胞無法在36℃條件下生存。但如果待測蛋白X與Y之間發(fā)生相互作用就能把Sos蛋白帶到細(xì)胞膜上并激活附近的Ras蛋白，從而打通Ras途徑，使該菌株獲得在36℃條件下生存的能力。Aronheim等用此技術(shù)鑒別出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分離到了一個(gè)AP-1抑制因子JDP2。USPS也稱為基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的設(shè)計(jì)是根據(jù)這樣一個(gè)事實(shí)，即真核細(xì)胞中遍在蛋白與某一蛋白之間新生成的融合會(huì)被遍在蛋白特異的蛋白酶(UBPs)迅速切開，但這種切割只有當(dāng)遍在蛋白正確折疊時(shí)才會(huì)發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，遍在蛋白基因的N端和C端這兩部分即使分離，只要共表達(dá)與同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)，它們?nèi)阅苷_折疊。將待測蛋白X與帶有點(diǎn)突變的遍在蛋白N端片段融合，將待測蛋白Y與下游接有報(bào)告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它們共表達(dá)與同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)。因遍在蛋白N端片段內(nèi)含有點(diǎn)突變，它與C端片段之間不能自然形成正確的折疊。只有當(dāng)?shù)鞍譞和Y之間發(fā)生相互作用時(shí)才能克服點(diǎn)突變的影響，使遍在蛋白的兩端形成正確折疊，從而引來UBPs切除與C端片段連接的報(bào)告蛋白。此技術(shù)建立之初是通過Western blot檢測有無被切下的報(bào)告蛋白來判斷待測蛋白之間是否發(fā)生了相互作用的，所以操作比較繁瑣，不便于推廣。最近有人對它作了改進(jìn)，以一種融合的轉(zhuǎn)錄激活因子PLV作為報(bào)告蛋白。PLV一旦被從遍在蛋白C端片段上切下，它就會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活特定的報(bào)告基因，如：LacZ 和HIS3等。這樣就可以根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞是否生長及顯色來判斷待測蛋白之間有無相互作用。因此極大地簡化了操作步驟，提高了篩選效率。酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用的趨勢

在后基因組時(shí)代更具意義且更能發(fā)揮酵母雙雜交技術(shù)的領(lǐng)域是研究生命活動(dòng)中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。第一個(gè)具有開拓性的工作是Bartel利用酵母雙雜交技術(shù)建立了一個(gè)T7-噬菌體的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)圖(linkage-map)。Fromont-Racine等對篩選到的陽性克隆進(jìn)行鑒定測序，并將它們分為5類，然后對其中的四類(非編碼序列除外)通過15輪的篩選與分析，繪制出一張綜合了酵母蛋白相互作用的全局性信息圖。這是以往的實(shí)驗(yàn)所難以獲得的。

為適應(yīng)功能基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大學(xué)的EST項(xiàng)目研究成果基礎(chǔ)上，采用了與傳統(tǒng)建庫方式完全不同的細(xì)胞內(nèi)同源重組方法，以高通量規(guī)模構(gòu)建了一種陣列模式的酵母雙雜交cDNA文庫。它主要有以下特點(diǎn)：

(1)來源于多種組織器官和細(xì)胞系，因此含有幾乎所有基因的cDNA；

（2）所含各種cDNA的豐度趨于平衡；

（3)含有較長的插入序列，但不是全長cDNA序列。

這樣既避免了5’非編碼區(qū)可能存在的終止密碼阻礙融合蛋白的翻譯，又保證了表達(dá)出的蛋白構(gòu)象接近于天然。這種建庫方法不僅減少了工作量，而且在雙雜交中新發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白種類也明顯增多。

最后，有必要指出的是，酵母雙雜交技術(shù)必須與其它技術(shù)結(jié)合才能有利于對實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出更為完整和準(zhǔn)確的判斷。

胡文峰

2007040380106

第四篇：病毒分子生物學(xué)鑒定常用技術(shù)

實(shí)驗(yàn)二十三

病毒核酸檢測常用技術(shù)

（Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in

Common Use）

近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因檢測技術(shù)在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷中也取得了長足的進(jìn)展。由于部分病原微生物的基因組已成功地被克隆并進(jìn)行了核苷酸序列測定，因此根據(jù)病原微生物的基因特點(diǎn)，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測樣品中有無相應(yīng)病原微生物的核酸，從而可以特異、靈敏地判定標(biāo)本中是否含有相應(yīng)的病原微生物。在微生物學(xué)的研究及感染性疾病的診斷中，最常使用的微生物核酸檢測技術(shù)有PCR、RT-PCR、核酸雜交等技術(shù)，現(xiàn)對病毒核酸（DNA、RNA）的分離、PCR、RT-PCR、核酸雜交等技術(shù)的基本原理、操作方法、應(yīng)用及影響因素等進(jìn)行概述。

實(shí)驗(yàn) 1 PCR 檢測傳染性喉氣管炎病毒核酸

【目的要求】

通過本實(shí)驗(yàn)使學(xué)生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分離與PCR技術(shù)的基本原理、操作方法、影響因素和應(yīng)用。

【基本原理】

雞傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科的喉氣管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一種急性上呼吸道傳染病, 常表現(xiàn)呼吸困難、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降和死亡, 是危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的重要疫病之一。但在臨診上極易與其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎、支原體感染等。常規(guī)檢測IL TV 的方法有病原分離鑒定和血清學(xué)試驗(yàn), 這些方法雖經(jīng)典，但費(fèi)時(shí)且敏感性差, 不能檢測亞臨床感染, 而傳染性喉氣管炎潛伏感染是疾病的一種重要表現(xiàn)形式。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比較快速、敏感、特異的檢測手段，已被廣泛應(yīng)用在病毒核酸檢測方面。本實(shí)驗(yàn)以PCR方法檢測雞傳染性喉氣管炎病毒核酸為例，對PCR方法進(jìn)行介紹。

PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下（通常為93～94℃）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3’端開始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?’→3’方向延伸，合成DNA的新互補(bǔ)鏈。如此反復(fù)進(jìn)行，每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數(shù)擴(kuò)增一倍，PCR產(chǎn)物得以2n的批數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過25～30個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增109倍以上，實(shí)際上一般可達(dá)106～107倍（圖23-1）。

圖23-1 PCR基本原理示意圖

本實(shí)驗(yàn)是將被檢樣品中ILTV 顆粒經(jīng)裂解、變性后，分離ILTV—DNA。選擇雞傳染性喉氣管炎病毒的TK基因保守序列設(shè)計(jì)引物，由于引物與雞傳染性喉氣管炎病毒的TK基因存在著特異的互補(bǔ)性，當(dāng)加入DNA聚合酶后，就會(huì)在引物的引導(dǎo)下合成該段基因，該基因片段通過人工擴(kuò)增后，經(jīng)含溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下可顯示橙紅色I(xiàn)LTV—DNA條帶，根據(jù)片段大小來判定標(biāo)本中雞傳染性喉氣管炎病毒的存在。

【器材準(zhǔn)備】

1．病毒裂解液：醋酸鈉1.7g，EDTA鈉鹽4.65g，20mg/ml蛋白酶K 2.5ml，100g/L SDS 10ml，DEPC三重蒸餾水加至50ml。

2.3mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.2)，酚/氯仿/異戊醇混合液(25：24：1)，無水乙醇及70％乙醇。

3.2.5mmol dNTPs：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM。

4.10×PCR Buffer，Taq DNA聚合酶。

5.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

6.上樣緩沖液：2.5g/L溴酚藍(lán)、400g/L蔗糖水溶液。10mg/ml溴乙錠(EB)(具致癌性，操作時(shí)應(yīng)戴手套)，瓊脂糖。

7.50×TAE緩沖液：242g Tris，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。使用液為1×。

8.ILTV北京E2 株、ILTV-DNA可疑組織樣品、ILTV-DNA陰性組織樣品等。

9.引物序列: 參考已發(fā)表的ILTV的TK基因序列,設(shè)計(jì)并合成了一對引物,其序列如下：引物P1：5’-TTCGAGAACGATGACTCCG-3’；引物P2：5’-ATAGTCATCTGAACTTCCGC-3’。

10.儀器：臺(tái)式高速離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、水平式電泳槽、紫外透射反射分析儀、微量加樣器、Eppendorf 管與吸頭等。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1.病毒核酸的分離

（1）取ILTV-DNA可疑組織樣品上清液200μL、病毒裂解液20μL于Eppendorf管中，60℃水浴1h，同時(shí)設(shè)ILTV北京E2 株、ILTV-DNA陰性組織樣品對照。

（2）加酚/氯仿/異戊醇混合液200μL，上下顛倒混勻，14000rpm離心5min，吸上清液于另一新的Eppendorf管中。

（3）加1/10體積的3 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.2)及2倍體積的無水乙醇，-20℃過夜。14000rpm離心15min，棄上清液。

（4）加70％乙醇至Eppendorf管2/3處，混勻，洗滌沉淀。14000rpm離心15min，棄上清液，室溫中使乙醇揮發(fā)。

2.加樣及PCR擴(kuò)增

（1）按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤?.5ml 滅菌Eppendorf管中。

10×PCR buffer μl 2.5mM dNTPs

μl

引物P1（25pmol/μL）μl

引物P2（25pmol/μL）μl Taq DNA聚合酶（5U/μl）

0.5 μl 模板液（病毒核酸的分離液）μl 加ddH2O至

μl

（2）將上述混合液稍加離心，調(diào)整好反應(yīng)程序，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般在94℃預(yù)變性3min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：94℃ 60s→58℃ 30s→72℃ 60s，循環(huán)30-35次，最后在72℃保溫7min。

3.電泳檢測

（1）將倒膠槽兩端用透明膠帶封閉并放置在水平的臺(tái)面上，放好梳板，使梳板齒下沿距倒膠槽板1mm。

（2）配制合適濃度的瓊脂糖凝膠，如配制1.2％的凝膠，則稱取瓊脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE電泳緩沖液，置微波爐中加熱煮沸后以蒸餾水補(bǔ)足體積至100ml，迅速混勻，待冷至60℃左右時(shí)，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混勻。倒膠至倒膠槽內(nèi)，使厚度為3～5mm，排除氣泡后待膠完全凝固，撕去兩端膠帶。

（3）將倒膠槽置電泳槽中，加入1×TAE電泳緩沖液使其沒過膠面2～3mm，輕輕拔出梳板。

（4）加樣：取2μL上樣緩沖液于Parafilm膜上，加入PCR產(chǎn)物5μL，混勻后，加入點(diǎn)樣孔中，不要溢出孔外。同時(shí)設(shè)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

（5）電泳：樣品在負(fù)極端，接通電源，5V/cm恒壓電泳30～60min即可。

（6）檢測：電泳結(jié)束，關(guān)閉電泳儀電源，取出倒膠槽，將電泳完畢的瓊脂糖凝膠放在紫外燈300nm下觀察，可見桔紅色明亮帶，根據(jù)電泳條帶的位置判斷結(jié)果。

4.結(jié)果判定

在陽性對照孔出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶、陰性對照孔無此擴(kuò)增帶時(shí)判定結(jié)果。若樣品擴(kuò)增帶與陽性對照擴(kuò)增帶（約265bp）處于同一位置，則判定為ILTV-DNA陽性，否則判定為陰性。

【注意事項(xiàng)】

1.所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有成功或失敗，實(shí)驗(yàn)的失敗可能是應(yīng)該出結(jié)果而沒有出，我們把它稱作假陰性，不該出結(jié)果而出了結(jié)果我們把它稱為假陽性。PCR實(shí)驗(yàn)中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題。

（1）假陰性：出現(xiàn)假陰性結(jié)果最常見的原因有Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時(shí)，要注意用活力高、質(zhì)量好的酶。同時(shí)在提取PCR模板時(shí)，應(yīng)特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿）的存在。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機(jī)試劑的污染。保證引物的3’端與靶基因的互補(bǔ)。PCR反應(yīng)的各溫度點(diǎn)的設(shè)置要合理。

（2）假陽性：PCR反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生，所以污染是PCR假陽性的主要根源。污染的原因可能有：

① 樣品間交叉污染。樣品污染主要有收集樣品的容器被污染，或樣品放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有樣品而造成相互間交叉污染；樣品核酸模板在提取過程中，由于移液器污染導(dǎo)致樣品間污染；有些微生物樣品尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

② PCR試劑的污染。主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于移液器、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

③ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染。這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽性。還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染移液器的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。

④ 實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見，因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大。

為了避免因污染而造成的假陽性，PCR操作時(shí)采取如下措施：

① 合理分隔實(shí)驗(yàn)室。將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開，最好能劃分①標(biāo)本處理區(qū)；②PCR反應(yīng)液制備區(qū)；③PCR循環(huán)擴(kuò)增區(qū)；④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。

② 移液器：移液器污染是一個(gè)值得注意的問題，由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入移液器內(nèi)或粘上槍頭是一個(gè)嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。

③ 預(yù)混和分裝PCR試劑：所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存，以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機(jī)會(huì)。另外，PCR試劑與反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。

④ 防止操作人員污染，手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。

⑤ 設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的最低量的標(biāo)準(zhǔn)核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照。

⑥ 減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止。

⑦ 選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部，開管動(dòng)作要輕，以防管內(nèi)液體濺出。

2.注意個(gè)人防護(hù)和環(huán)境保護(hù)，電泳中用到的EB（Times New Roman體）可誘發(fā)基因突變，試驗(yàn)中被EB污染的物品要有專用收集處，并通過焚燒作無害化處理。

3.實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)專用，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)將實(shí)驗(yàn)室用紫外線照射以破壞殘留的DNA或RNA。總而言之，PCR的條件是隨系統(tǒng)而異的，并無統(tǒng)一的最佳條件，先選用通用的條件擴(kuò)增，然后可以通過稍稍改變各參數(shù)，使反應(yīng)條件得到優(yōu)化，以取得優(yōu)良的特異性和產(chǎn)率。

【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】

1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）你所做的PCR實(shí)驗(yàn)陽性對照是否出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶? 如果有擴(kuò)增帶，請對你的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行描述。如果失敗，請分析其原因。

2.思考題

（1）PCR技術(shù)的基本原理？

（2）影響PCR實(shí)驗(yàn)成功的因素有哪些？

（3）PCR檢測中出現(xiàn)假陽性，可能導(dǎo)致的因素有哪些？

（4）根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程中的體會(huì)，總結(jié)如何做好PCR實(shí)驗(yàn)？關(guān)鍵因素有哪些？

實(shí)驗(yàn)2 RT-PCR檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸

【目的要求】

通過本實(shí)驗(yàn)使學(xué)生初步了解和熟悉病毒核酸（RNA）的分離與RT-PCR技術(shù)的基本原理、操作方法、影響因素和應(yīng)用。

【基本原理】

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的一種傳染病,其臨診特征為各種年齡的豬均可感染,病豬厭食、嗜睡、體溫升高,妊娠母豬發(fā)生早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、弱胎和木乃伊胎,種公豬性功能下降,仔豬和育肥豬呼吸障礙。1987年該病首次報(bào)道于美國,隨后迅速蔓延北美、歐洲及亞洲各國,目前已成為一種地方性流行病。1996年初,我國也報(bào)道了本病的發(fā)生。由于PRRS與其它引起豬繁殖障礙的疾病存在著非常類似的臨診癥狀,根據(jù)現(xiàn)場診斷很難做出準(zhǔn)確鑒別。實(shí)驗(yàn)室診斷方面,如病毒的分離與鑒定,抗原及抗體的檢測等方法或特異性、敏感性差,或操作技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn),不能滿足臨床需要。PRRSV屬動(dòng)脈炎病毒科成員，有囊膜，基因組為單股正鏈RNA，大小約15kb。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法具有特異、敏感、快速診斷等優(yōu)點(diǎn)，因此PRRSV適用RT-PCR方法進(jìn)行檢測。

RT-PCR是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，它是以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA。這一過程與一般遺傳信息流轉(zhuǎn)錄的方向相反，故稱為反轉(zhuǎn)錄，催化此過程的DNA聚合酶叫做反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)。基本過程是以dNTP為底物，以RNA為模板，按5’→3’方向，合成一條與RNA模板互補(bǔ)的DNA單鏈，這條DNA單鏈叫做互補(bǔ)DNA(complementary DNA, cDNA)，它與RNA模板形成RNA-DNA雜交體。隨后又在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，水解掉RNA鏈，再以cDNA為模板合成第二條DNA鏈。至此，完成由RNA指導(dǎo)的DNA合成(圖23-2)，然后將DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的基本原理見實(shí)驗(yàn)1部分。

圖23-2 RT-PCR基本原理示意圖

【器材準(zhǔn)備】

1.TRIzol LS Reagent RNA提取試劑。2.氯仿、異丙醇、70%乙醇。

3.DEPC處理水：按1∶1000的比例將DEPC加入三蒸水，室溫放置12h以上。4.5×反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液。

5.SuperScriptTMⅡ反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）。6.RNA酶抑制劑(40U/μL)。

7.2.5 mM dNTPs：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mM。

8.10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶。9.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

10.上樣緩沖液：2.5g/L溴酚藍(lán)、400g/L蔗糖水溶液。10mg/ml溴乙錠(EB)(具致癌性，操作時(shí)應(yīng)戴手套)，瓊脂糖。

11.50×TAE：242g Tris，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。使用液為1×。

12.PRRSV標(biāo)準(zhǔn)毒株、PRRSV-RNA可疑組織樣品、PRRSV-RNA陰性組織樣品等。13.引物：

（1）反轉(zhuǎn)錄引物：可用隨機(jī)引物（Random Primers）（市售）、Oligo（dT）12-18（市售）或Random Primers與Oligo（dT）按3：1混合而成的引物Oligo（dT）/Random primer，或用相對PRRSV RNA來說的PCR下游單側(cè)特異性引物。

（2）PCR引物序列：以高度保守的ORF7作為擴(kuò)增靶區(qū)設(shè)計(jì)并合成一對引物，序列如下：引物F：5-ATGCCAAATAACAACGGCAAGC；引物R：5-TTAATTTGCACCCTGACTG-3。

14.儀器：臺(tái)式高速離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、水平式電泳槽、紫外透射反射分析儀、微量加樣器、Eppendorf 管、吸頭與水浴箱等。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1.病毒核酸（RNA）的分離：病毒核酸（RNA）分離方法很多，實(shí)際應(yīng)用時(shí)可靈活考慮。本實(shí)驗(yàn)選擇市售商品化TRIzol LS Reagent RNA提取試劑完成豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(PRRSV)基因組RNA的分離。操作按TRIzol LS Reagent RNA提取試劑使用說明書進(jìn)行，步驟如下：

（1）在1.5mL離心管中加入250μL的PRRSV細(xì)胞培養(yǎng)物和750μL TRIzol LS，蓋上管蓋，倒置混勻，室溫放置10min。

（2）加入200μL氯仿，將勻漿劇烈振蕩15sec，室溫靜置5min使核蛋白質(zhì)復(fù)合體徹底裂解。

（3）4℃ 12 000 rpm離心15min，將上層含RNA的水相移入一新管中。為了降低被處于水相和有機(jī)相分界處的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下層。（4）加入等體積的異丙醇，充分混勻液體，室溫放置10min。

（5）4℃ 12 000 rpm離心15min，棄上清，再用70%的乙醇洗滌沉淀，然后離心，再用吸頭徹底吸棄上清，在自然條件下干燥沉淀，溶于適量DEPC處理的水中。直接用于RT-PCR或-80℃貯存，備用。

（6）另外，也可選擇異硫氰酸胍法完成PRRSV RNA的提取。2.病毒cDNA第一鏈的合成（反轉(zhuǎn)錄，RT）

病毒cDNA第一鏈的合成參照Invitrogen公司的SuperScriptTMⅡ反轉(zhuǎn)錄酶使用說明進(jìn)行，步驟如下：

（1）于微量離心管中加入6μL RNA、2μL反轉(zhuǎn)錄引物：Oligo（dT）/Random primer混合物，混勻，65℃ 5min。（2）冰浴2min，離心。（3）繼續(xù)加入以下組分：

5×反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液 4μL 0.1 m M DTT 2μL 2.5mmol dNTPs 2μL SuperScriptTMⅡ反轉(zhuǎn)錄酶 1μL（200U/μL）RNA酶抑制劑 0.5μL（40U/μL）DEPC水 2.5μL（4）混勻，42℃水浴50min，最后70℃水浴15min，完成cDNA鏈合成。取出后可以直接進(jìn)行PCR，或者放于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ囼?yàn)中同時(shí)設(shè)立陽性和陰性對照。

3.PCR擴(kuò)增

根據(jù)擴(kuò)增目的選擇引物F與引物R，按TaKaRa公司Ex-Taq DNA 聚合酶使用說明進(jìn)行，步驟如下：

按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤?.5ml 滅菌Eppendoff管中。

雙蒸滅菌水 37.5μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 4μL 引物F（25pmol/μL）0.5μL 引物R（25pmol/μL）0.5μL 10×PCR Buffer 5μL 2.5mmol dNTPs 2μL Taq酶 0.5μL（5U/μL）

注意首先加入雙蒸滅菌水，然后再按照順序逐一加入上述成分，每一次要加入到液面下。

（4）全部加完后，混懸，瞬時(shí)離心，使液體都沉降到Eppendorf管底。（5）在PCR擴(kuò)增儀上執(zhí)行如下反應(yīng)程序：94℃ 3min；94℃ 30 sec，50℃ 45 sec，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min結(jié)束。可根據(jù)擴(kuò)增目的基因的不同，選擇不同的循環(huán)參數(shù)。

4.電泳檢測

（1）將倒膠槽兩端用透明膠帶封閉并放置在水平的臺(tái)面上，放好梳板，使梳板齒下沿距倒膠槽板1mm。

（2）配制合適濃度的瓊脂糖凝膠，如配制1.2％的凝膠，則稱取瓊脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE電泳緩沖液，置微波爐中加熱煮沸后以蒸餾水補(bǔ)足體積至100ml，迅速混勻，待冷至60℃左右時(shí)，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混勻。倒膠至倒膠槽內(nèi)，使厚度為3～5mm，排除氣泡后待膠完全凝固，撕去兩端膠帶。

（3）將倒膠槽置電泳槽中，加入1×TAE電泳緩沖液使沒過膠面2～3mm，輕輕拔出梳板。

（4）加樣：取2μL上樣緩沖液于Parafilm膜上，加入PCR產(chǎn)物5μL，混勻后，加入點(diǎn)樣孔中，不要溢出孔外。同時(shí)設(shè)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

（5）電泳：樣品在負(fù)極端，接通電源，5V/cm恒壓電泳30～60min即可。

（6）檢測：電泳結(jié)束，關(guān)閉電泳儀電源，取出倒膠槽，將電泳完畢的瓊脂糖凝膠放在紫外燈300nm下觀察，可見桔紅色明亮帶，根據(jù)電泳條帶的位置判斷結(jié)果。

5.結(jié)果判定

在陽性對照孔出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶、陰性對照孔無此擴(kuò)增帶時(shí)判定結(jié)果。

若樣品擴(kuò)增帶與陽性對照擴(kuò)增帶處于同一位置，則判定為PRRSV-RNA陽性，否則判定為陰性。

【注意事項(xiàng)】

1.分離高質(zhì)量的病毒RNA是RT-PCR成敗的關(guān)鍵。由于RNA酶無處不在，且可耐受多種處理（例如煮沸）而不失活，因此RNA在分離過程中極易受其污染而降解。為了獲取完整的RNA，應(yīng)創(chuàng)造一個(gè)無RNA酶的環(huán)境。整個(gè)操作過程應(yīng)戴一次性手套并勤換。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫（240℃）烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的。注意采用滅菌的一次性塑料制品，且不得重復(fù)使用；非一次性的玻璃和塑料用品須在使用前應(yīng)用0.05%焦碳酸二乙酯（DEPC）室溫處理過夜，然后高壓滅菌去除DEPC，以確保無RNA酶；所有溶液（Tris除外）均須加入0.05% DEPC浸泡過夜后高壓滅菌。

2.病毒cDNA第一鏈的合成（反轉(zhuǎn)錄）步驟（1）、（2）中，將RNA溶液置65℃中溫育，然后冷卻再加樣目的是破壞RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率，此步驟不能省略。

3.RT-PCR過程中的PCR步驟中最常見的問題參見實(shí)驗(yàn)1注意事項(xiàng)內(nèi)容。

【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】

1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）你所做的RT-PCR實(shí)驗(yàn)陽性對照是否出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶? 如果有擴(kuò)增帶，請對你的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行描述。如果失敗，請分析其原因。

2.思考題

（1）RT-PCR技術(shù)的基本原理？

（2）影響RT-PCR實(shí)驗(yàn)成功的因素有哪些？

（3）RT-PCR檢測中出現(xiàn)假陽性，可能導(dǎo)致的因素有哪些？

（4）根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程的體會(huì)，總結(jié)如何做好RT-PCR實(shí)驗(yàn)？關(guān)鍵因素有哪些？

實(shí)驗(yàn)3 核酸雜交技術(shù)檢測病毒核酸

【目的要求】

通過本實(shí)驗(yàn)使學(xué)生初步了解和熟悉病毒核酸雜交技術(shù)的基本原理、操作方法、影響因素和應(yīng)用。

【基本原理】

雞馬立克氏病(Marek’s Disease，MD)是由馬立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus，MDV)引起的雞的一種傳染性腫瘤病,它同時(shí)還能引起感染雞的免疫抑制,從而導(dǎo)致對多種疫苗免疫效應(yīng)降低。應(yīng)用特異、敏感的方法對該病作出早期診斷是控制其流行的一項(xiàng)重要措施。實(shí)驗(yàn)室診斷MD的方法很多,到目前為止有瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫熒光抗體試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等,但這些方法存在敏感性低及易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)等缺點(diǎn)。近年來業(yè)已建立的一些分子生物學(xué)方法,如核酸探針技術(shù)，以其特異、快速、敏感，適合檢測和早期診斷等特點(diǎn),已在MDV檢測及MD的診斷上得到應(yīng)用。

核酸雜交技術(shù)是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的方法。其原理主要是利用四種脫氧核苷酸中堿基配對原則(G=C、A=T)，核酸變性和復(fù)性理論（圖23-3）。

圖23-3核酸分子雜交原理示意圖

病毒核酸雜交基本原理是將和已知病毒核酸特定區(qū)域堿基互補(bǔ)的DNA或RNA克隆片

32段，用非放射性物質(zhì)(如生物素、地高辛)或放射性物質(zhì)(如P)標(biāo)記，制備成核酸分子探針。在適當(dāng)條件下，核酸探針與臨床樣品中的病毒核酸形成雙鏈結(jié)構(gòu)而被保留，然后通過放射自顯影或免疫技術(shù)檢測標(biāo)記的核酸片段。若被檢樣品與探針形成雜交雙鏈，則顯示陽性結(jié)果。如樣品中無與探針互補(bǔ)的序列，則不發(fā)生分子雜交，結(jié)果為陰性。常用的雜交方法有DNA斑點(diǎn)雜交、原位雜交、Southern雜交和Northern雜交。

下面以地高辛(Dig)標(biāo)記的單鏈DNA探針試劑盒檢測MDV核酸為例，對常用的DNA斑點(diǎn)雜交法進(jìn)行介紹。將MDV-DNA樣品滴于硝酸纖維素膜上，MDV-DNA經(jīng)處理變性，雙螺旋DNA變?yōu)閱捂淒NA吸附在固相濾膜上，再加分子質(zhì)量較小的地高辛標(biāo)記的單鏈DNA（即核酸探針），在一定條件下按互補(bǔ)堿基順序配對的特點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，形成DNA—DNA的雙鏈雜交分子。然后用偶聯(lián)有酶的抗地高辛抗體結(jié)合物作為酶標(biāo)記，再分別用顯色底物使雜交部位顯色以達(dá)到檢測目的，其反應(yīng)過程見圖23-4。

圖23-4 地高辛標(biāo)記的探針檢測酶聯(lián)免疫反應(yīng)

【器材準(zhǔn)備】

1.Dig-MDV-DNA探針：參照Dig-DNA探針標(biāo)記試劑盒說明進(jìn)行制備。2.預(yù)雜交液（pH7.0-8.6）：Ficoll 0.8ml，2.0g/L BSA 0.8ml，20g/L PVP 0.8ml，20×SSC 2ml，1 mg/m1小牛胸腺DNA 0.4ml, 雙蒸水2.8ml,0.5mol/L HCl 0.4ml。

3.漂洗液（1）20×SSC：NaCl 175.32g，枸櫞酸鈉(2H2O)88.2g，加雙蒸水至1000ml。（2）4×SSC-1.0g/L SDS：20×SSC 100ml，100.0g/L SDS 5ml，雙蒸水395ml。（3）參照（2）法配制4×SSC-5.0g/L SDS、0.1×SSC-1.0g/L SDS。

（4）3mol/L NaCl-0.5mol/L Tris：NaCl 175.32g，Tris 60.5g，雙蒸水395ml。

4.MDV 中國疫苗株814 株或中國標(biāo)準(zhǔn)株Jing-1 株、MDV-DNA可疑組織樣品與MDV-DNA陰性組織樣品等。

5.器材：負(fù)壓抽濾點(diǎn)樣器、硝酸纖維素膜、塑料袋、烤箱、水浴箱、冰箱、塑料封接機(jī)。

【實(shí)驗(yàn)步驟】

1.病毒DNA 分離：MDV核酸分離方法參照實(shí)驗(yàn)1 PCR 檢測傳染性喉氣管炎病毒核酸部分（1.病毒核酸的分離）進(jìn)行。

2.探針標(biāo)記：MDV pp38基因片段DNA 特異寡核苷酸探針標(biāo)記，參照Dig-DNA探針試劑盒說明書進(jìn)行。

3.點(diǎn)樣：將上述適度稀釋的病毒核酸（DNA）80μl、陽性對照80μl、陰性對照80μl點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜(NC膜)或尼龍膜上，負(fù)壓抽濾。

4.變性：用0.5 mol/L NaOH變性點(diǎn)樣膜10min，再抽干水分按下述順序洗膜。（1）0.5 mol/L HCl漂洗1次，每次10min。

（2）3 mol/L NaCl-0.5 mol/L Tris(pH7.5)漂洗1次，每次15min。（3）1 mol/L Tris-0.5 mol/L NaCl(pH7.5)漂洗1次，每次20min。（4）0.5 mol/L Tris-0.5 mol/L NaCl(pH7.5)漂洗1次，每次20min。（5）0.2mol/L Tris-EDTA(0.002mol/L)(pH7.5)漂洗1次，每次5min。

（6）2×SSC漂洗1次，每次5min。

（7）80℃ 5min，氯仿浸泡5min，再80℃烘干2h。

5.預(yù)雜交：將濾膜和預(yù)雜交液—起放塑料袋內(nèi)密封65℃水浴5h。

6.雜交：

（1）將地高辛標(biāo)記的MDV pp38基因探針放沸水中煮沸10 min ,再置冰中速冷變性。（2）在塑料袋內(nèi)留有適量預(yù)雜交液，加入變性的Dig-ILTV DNA，除去氣泡，充分混勻，密封，68℃搖動(dòng)，雜交過夜或6 h 以上。

7.洗膜：按下列順序充分洗去未雜交的標(biāo)記物。

（1）4×SSC 1.0g/L SDS漂洗1次，每次10～30min。（2）4×SSC 5.0g/L SDS 65℃漂洗1次，每次4h。（3）0.1×SSC 1.0g/L SDS 45℃漂洗1次，每次2h。

8.顯色：將雜交膜置80℃烘干30min，再裝入塑料袋內(nèi)，加堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，室溫顯色3～4h；雙蒸水洗滌，終止反應(yīng)，以BCIP和NBT為底物進(jìn)行顯色。

9.結(jié)果判定

在陰陽對照正常的情況下，陽性標(biāo)本硝酸纖維素膜點(diǎn)樣處呈紫色?？膳c同時(shí)雜交的已知的MDV DNA樣品顯色強(qiáng)度相比較，進(jìn)行樣品中MDV DNA的定量檢測。陽性與陰性結(jié)果如圖23-5。

圖23-5 DNA斑點(diǎn)雜交檢測結(jié)果

【注意事項(xiàng)】

1.實(shí)驗(yàn)要設(shè)立各種對照（陽性對照、陰性對照與空白對照）。

2.非特異顯色的排除。非特異顯色是固相膜雜交方法常遇到的問題，指標(biāo)記DNA非特異結(jié)合到空白膜上而顯色，即本底。這個(gè)問題的克服一是使用高純度的核酸制品和充分嚴(yán)格的雜交條件，二是選擇合格的雜交反應(yīng)液充分封閉膜上的非特異結(jié)合位點(diǎn)和對膜進(jìn)行處理。

3.使用的抗體進(jìn)行梯度測試，找出最佳的使用濃度。抗體的有效期和保存條件要經(jīng)常檢查，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融，試劑保存時(shí)一定要避免與揮發(fā)性有機(jī)溶劑同放一室，以免降低抗體的效價(jià)。底物顯色液最好新鮮配制，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。

4.顯色過程最好實(shí)時(shí)監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。

5.結(jié)果判定時(shí)，應(yīng)與陽性、陰性對照進(jìn)行比較，克服肉眼觀察所造成的誤差。

6.在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格注意控制污染，所用器皿需高溫消毒，實(shí)驗(yàn)者需戴手套。另外，在處理點(diǎn)樣硝酸纖維素膜(NC膜)或尼龍膜時(shí)，自始至終應(yīng)保持濕潤，勿令其干燥。

【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】

1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

DNA斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)設(shè)立的各種對照顯色是否正常? 并對你的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行描述。如果失敗，請分析其原因。

2.思考題

（1）核酸雜交技術(shù)的基本原理？請闡述斑點(diǎn)雜交法主要步驟。

（2）在斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)中引起非特異性染色的主要因素有哪些？應(yīng)如何排除？

(陳金頂)

參考文獻(xiàn)

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第五篇：偽狂犬病防制技術(shù)規(guī)

偽狂犬病防制技術(shù)規(guī)范

偽狂犬?。≒seudorabies,Pr 又名Aujeszky’s disease,AD）。是由皰疹病毒科豬皰疹病毒I型（偽狂犬病毒PrV）引起的各種家畜和野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為特征的急性傳染病。除豬以外的其它動(dòng)物發(fā)病均以死亡而告終，但呈散發(fā)形式或地方疫源性疾病。該病對養(yǎng)豬業(yè)的危害最大，在豬呈爆發(fā)流行，常引起妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、新生仔豬大量死亡，育肥豬發(fā)生嚴(yán)重的呼吸道癥狀和增重滯緩、種豬不育，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Wold Organisation for Animal Health，簡稱OIE）將其列為B類動(dòng)物疫病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。

為了預(yù)防、控制和消滅偽狂犬病，依據(jù)（中華人民共和國動(dòng)物防疫法）和共他相關(guān)法律法規(guī)，特制定本技術(shù)規(guī)范。

1．適用范圍

本規(guī)范適用于中華人民共和國境內(nèi)一切從事哺乳動(dòng)物飼養(yǎng)、經(jīng)營、使用、屠宰、加工、運(yùn)輸?shù)认嚓P(guān)活動(dòng)中的動(dòng)物疫病防治工作。

2．診斷

根據(jù)流行特點(diǎn)，臨床特征和病理變化，結(jié)合乳膠凝集試驗(yàn)（LAT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）作出初步診斷。確認(rèn)需進(jìn)一步做病毒中和試驗(yàn)（NT）或病毒分離鑒定或動(dòng)物接種試驗(yàn)或聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。

2．1 流行特點(diǎn)

本病與其他皰疹病毒病不同，宿主范圍廣，豬、牛、羊、犬、貓最易感，寒冷季節(jié)多發(fā)，本病在豬呈爆發(fā)流行，豬是偽狂犬病毒儲(chǔ)存者和傳染源，病豬、隱性感染豬和康復(fù)豬可以長期帶毒。病毒在豬群中主要通過空氣傳播，通過呼吸道和消化道感染，也可通過胎盤感染胎兒，除豬以外的其它動(dòng)物感染偽狂犬病毒后，發(fā)病均以死亡告終，但呈散發(fā)形式或地方疫源性疾病。

2．2 臨床表現(xiàn)：

2．2．1 潛伏期一般為3-6天

2．2．2 牛、羊、犬、貓、兔等動(dòng)物感染本病后以發(fā)熱、興奮、奇癢、腦脊髓炎癥狀，結(jié)果均以死亡轉(zhuǎn)歸。

2．2．3 母豬感染偽狂犬病毒后常發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔、木乃伊胎。青年母豬和空懷母豬常出現(xiàn)返情、屢配不孕或不發(fā)情；公豬常出現(xiàn)睪丸腫脹、萎縮、性能下降、失去種用能力；新生仔豬大量死亡，15日齡內(nèi)死亡率為100%；斷奶仔豬發(fā)病20-30%，死亡率為10-20%；仔豬癥狀病初高燒、腹瀉、嘔吐、精神不振，隨后出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈、震顫、鳴叫、昏睡等神經(jīng)癥狀；育肥豬出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸道癥狀，生長滯緩，飼料報(bào)酬降低。2．3 病理變化：

病理組織學(xué)呈現(xiàn)非化膿性腦炎變化，剖檢腦膜瘀血、出血，腎臟布滿針尖樣出血點(diǎn)，其它大體剖檢特征不明顯。

2．4 實(shí)驗(yàn)室診斷：

2．4．1 病原學(xué)診斷：

2．4．1．1 動(dòng)物接種：

采取病豬扁桃體，嗅球、腦和肺，用生理鹽水或PBS（磷酸鹽緩沖液）制成10%懸液，反復(fù)凍融三次后離心取上清液接種于家兔皮下或者小鼠腦內(nèi)，（用于接種的家兔和小白鼠必須事先用乳膠凝集試驗(yàn)或ELISA檢測偽狂犬病毒抗體陰性者才能用），家兔經(jīng)2-5天或者小鼠2-10天發(fā)病死亡。家兔發(fā)病時(shí)先用舌舔接種部位，以后用力撕咬接種部位，使接種部位被撕咬傷、鮮紅、出血，持續(xù)4-6小時(shí)，病兔衰竭，倒臥于一側(cè)，痙攣，呼吸困難而死亡。小鼠不如家兔敏感，但明顯表現(xiàn)興奮不安，神經(jīng)癥狀，奇癢和四肢麻痹而死亡。

2．4．1．2 雞胚接種：

取上述上清液接種9-10日齡雞胚絨毛尿囊腔，經(jīng)3-4天后形成特征性痘皰樣白斑，死亡的雞胚神經(jīng)系統(tǒng)出血導(dǎo)致胚胎顱腔突出，取尿囊液做病毒中和試驗(yàn)，進(jìn)行病毒鑒定。

2．4．1．3 用細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒，見附件一。

2．4．1．4 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）診斷，見附件二。

2．4．1．5熒光抗體試驗(yàn)（見附件三）

2．4．2 血清學(xué)診斷（抗體檢測）

2．4．2．1 微量中和試驗(yàn)（固定病毒、稀釋血清）見附件四

2．4．2．2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（見附件五）

2．4．2．3 乳膠凝集試驗(yàn)（見附件六）

2．4．2．4 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（見附件七）

2．4．2．5 區(qū)分強(qiáng)弱毒感染鑒別乳膠凝集試驗(yàn)（見附件八）

2．4．2．6 區(qū)分強(qiáng)弱毒感染鑒別ELISA（見附件九）

3．疫情報(bào)告

凡發(fā)現(xiàn)疑似疫情的單位和個(gè)人，均應(yīng)及時(shí)報(bào)告所在地基層動(dòng)物防疫組織或動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)。

接到報(bào)告后的基層防疫組織和動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)，按《動(dòng)物疫情報(bào)告管理辦法》的規(guī)定上報(bào)。

4．疫情處理

4．1 緊急免疫接種：對發(fā)病種母豬、種公豬，用gG單基因缺失滅活疫苗作緊急免疫接種注射，第一次注射后間隔4-6周后再加強(qiáng)免疫一次，以后按種豬免疫程序進(jìn)行，對正在發(fā)病的豬場，仔豬采用TK-/gG-雙基因缺失弱毒疫苗作超前

--免疫，即滴鼻或注射一頭份劑量。對正在發(fā)病的仔豬用TK/gG雙基因缺失弱毒

疫苗滴鼻或肌肉注射作緊急預(yù)防接種可收到很好的效果。同時(shí)對所有的其它種豬用gG單基因缺失滅活疫苗注射，仔豬和肥豬用TK-/gG-雙基因缺失弱毒疫苗注射。

4．2 消毒：對欄舍、場地、道路等用2%的氫氧化鈉溶液1-3%的漂白粉液。1:300的消毒靈或1:300的復(fù)合酚溶液噴灑；對金屬器具用0.5%的次氯酸鈉薰蒸消毒；工作人員服裝、鞋帽等用消毒液浸泡、高壓滅菌法消毒。

4．3 嚴(yán)格禁止狗、貓、雞、鳥類等動(dòng)物進(jìn)入豬場，加強(qiáng)滅鼠。

4．4 嚴(yán)格限制和減少豬場外來人員和外來車輛進(jìn)入場內(nèi)，同時(shí)要限制場內(nèi)飼養(yǎng)員和工作人員在各豬舍互相來往和串門，以免人為擴(kuò)散原病。

4．5 對病死動(dòng)物尸體、剖檢動(dòng)物、死胎、流產(chǎn)物及其它污染物和排泄物作銷毀無害化處理或者按《病死動(dòng)物及產(chǎn)品深埋處理技術(shù)規(guī)范》深埋處理。

4．6 進(jìn)行緊急免疫注射見效果后，以后按偽狂犬病根除計(jì)劃方案中偽狂犬

病陽性場根除方案進(jìn)行偽狂犬病的根除計(jì)劃（見5、6偽狂犬病根除計(jì)劃方案），直到最終消滅此病。

5．預(yù)防與控制：

5．1養(yǎng)畜場（含種畜場）的選址和布局要符合《動(dòng)物防疫法》和國家畜牧獸醫(yī)主管部門規(guī)定的防疫條件，并取得動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)頒發(fā)的《動(dòng)物防疫合格證》。

5．2 經(jīng)常保持場（戶、舍）的清潔衛(wèi)生、嚴(yán)格滅鼠，嚴(yán)禁其它動(dòng)物和鳥類進(jìn)入場內(nèi)，避免因動(dòng)物帶毒傳播。

5．3 新進(jìn)動(dòng)物必須來源于非疫區(qū)（非疫場），并進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，偽狂犬抗體陰性或強(qiáng)毒感染陰性的豬才能引進(jìn)。對出場、廠（戶）種畜由動(dòng)物防疫監(jiān)督人員進(jìn)行檢疫、監(jiān)測陰性的方出具檢疫合格證明，準(zhǔn)予出場、廠（戶）；或經(jīng)動(dòng)物防疫監(jiān)督機(jī)構(gòu)檢疫，并持有檢疫合格證明。

5．4 免疫預(yù)防：對飼養(yǎng)動(dòng)物（特別是豬）進(jìn)行定期免疫。免疫用疫苗首選基因缺失苗，種豬選用gG-或gE-單基因缺失標(biāo)志滅活疫苗、仔豬和育肥豬選用----TK/gG或TK/gE雙基因缺失弱毒疫苗，注射劑量、部位和方法及疫苗保存、運(yùn)輸方法等按生產(chǎn)廠的說明書要求進(jìn)行。

免疫程序：種豬第一次免疫后，間隔4-6周后加強(qiáng)免疫一次，以后每6個(gè)月免疫一次，產(chǎn)仔前一個(gè)月加強(qiáng)免疫一次，經(jīng)過前面規(guī)則免疫后的種豬所產(chǎn)仔豬，其母源抗體可以維持到60日齡左右，因此后備種豬可在60-70日齡首免。間隔4-6周后加強(qiáng)免疫一次作為基礎(chǔ)免疫，以后按種豬的免疫程序進(jìn)行免疫，育肥豬是經(jīng)過前述規(guī)則免疫后所產(chǎn)的仔豬，應(yīng)在60-70日齡用基因缺失弱毒疫苗免疫一次，間隔4-6周后加強(qiáng)免疫一次，直到出欄。如果是沒有規(guī)則免疫母豬所產(chǎn)的仔豬，可提前到斷奶時(shí)注射一次，間隔4-6周后加強(qiáng)免疫一次，直到出欄。

5．5 監(jiān)測：對種豬場、育肥豬場要定期進(jìn)行該病的監(jiān)測。監(jiān)測方法采用乳膠凝集試驗(yàn)或ELISA方法，種畜場每年監(jiān)測2次，商品場每年監(jiān)測一次，監(jiān)測時(shí)種公豬（含后備種公豬）應(yīng)100%，種母豬（含后備種母豬）按20%的比例抽檢，商品豬按5%的比例不定期進(jìn)行抽檢；對有流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)木乃伊胎等癥狀的種母豬100%進(jìn)行檢測。

5．6 偽狂犬病根除計(jì)劃方案：

根據(jù)不同的豬場、不同情況和實(shí)驗(yàn)室檢測情況，選擇不同的方案與措施。

種豬與種豬場

偽狂犬病毒是屬于高度潛伏感染的病毒，而且這種潛伏感染隨時(shí)都有可能被體內(nèi)外和環(huán)境變化的應(yīng)激因素刺激而引起疾病爆發(fā)，同時(shí)基因缺失弱毒疫苗注射帶有野毒潛伏感染的動(dòng)物時(shí)，由于活病毒之間發(fā)生基因交換和重組的可能性，加上種豬飼養(yǎng)的時(shí)間長（3-4年），因此這種可能性和機(jī)率就會(huì)增大，而且國內(nèi)外都有因注射弱毒疫苗而引起偽狂犬病爆發(fā)的例子。因此在西方發(fā)達(dá)國家如德國嚴(yán)格規(guī)定種豬只允許使用滅活疫苗。美國在其偽狂犬病的根除計(jì)劃中，也規(guī)定種豬只允許使用滅活疫苗。根據(jù)以上這些特點(diǎn)，因此建議在我國種豬也只能使用基因缺失滅活疫苗。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)專門研制了針對種豬用的單基因缺失濃縮滅活疫苗。尤其是gG單基因缺失滅活疫苗對病毒的免疫原性幾乎完全沒有什么影響。因?yàn)間G是病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因，gG蛋白是病毒繁殖時(shí)分泌到細(xì)胞培養(yǎng)的上清

中與病毒免疫原性無關(guān)；該基因缺失后，對病毒的免疫原性沒有什么影響，但又可以作為鑒別診斷。鑒于國內(nèi)外已大量使用gE缺失疫苗，為了與國際接軌，我們也研制了gE單基因缺失滅活濃縮疫苗。

育肥用的仔豬和架子豬可以使用雙基因缺失的弱毒疫苗。華中農(nóng)大研制的TK-/gG-和TK-/gE-雙基因缺失弱毒疫苗都是缺失了偽狂犬病毒的主要毒力基因TK，該基因缺失疫苗可用作于新生仔豬（未吃初乳）的超前免疫，尤其是TK-/gG-缺失疫苗可用于發(fā)病仔豬的緊急預(yù)防接種，具有明顯的急救和預(yù)防效果。也可用于斷奶仔豬和生長育肥豬的免疫，可預(yù)防各種年齡豬的偽狂犬病，具有明顯的促生長作用。由于育肥豬的生長周期短（6個(gè)月左右），因此不存在病毒重組變異和返強(qiáng)的危險(xiǎn)。

5．6．1 種豬及種豬場的根除計(jì)劃

5．6．1．1 在沒有使用過疫苗的豬場，先作普遍血清學(xué)檢查，如果發(fā)現(xiàn)血清學(xué)陽性豬，最好是能將血清學(xué)陽性豬與血清學(xué)陰性豬分群飼養(yǎng)。然后將血清學(xué)陽性豬和血清學(xué)陰性都用基因缺失滅活濃縮疫苗注射，所有豬普遍注射一次疫苗后，間隔4-6周再加強(qiáng)免疫一次。以后血清學(xué)陰性豬群按每半年注射一次，血清學(xué)陽性豬群每4個(gè)月注射一次，然后每半年進(jìn)行一次血清學(xué)鑒別檢查，凡是注射疫苗血清學(xué)陽性的豬歸為健康群，凡是野毒感染血清學(xué)陽性豬歸為另一群，逐步縮小和有計(jì)劃的淘汰野毒感染豬群，逐步達(dá)到完全健康無野毒感染的豬群。直到最后根除消滅偽狂犬病。

5．6．1．2 對已經(jīng)注射過疫苗的豬場，首先將疫苗完全換成濃縮單基因缺失滅活疫苗。免疫程序按每4個(gè)月注射一次。每半年進(jìn)行一次血清學(xué)鑒別檢查，逐步開始分群將基因缺失疫苗免疫血清學(xué)陽性豬視為健康群分開飼養(yǎng)，將野毒感染血清學(xué)陽性豬分為另一群分開飼養(yǎng)，逐步淘汰和縮小野毒感染豬群，最后建立完全健康無野毒感染的豬群。

5．6．1．3 以上述經(jīng)過規(guī)則免疫后的種豬所生仔豬留作種用的仔豬在100日齡時(shí)作一次偽狂犬病普通血清學(xué)檢查，凡是抗體陰性者留作種用。對檢出的抗體陽性者作進(jìn)一步的鑒別血清學(xué)檢查，對野毒感染陰性者同樣可用作種用，對強(qiáng)毒感染陽性者淘汰作為肥豬用，不能作為種豬用。對偽狂犬病抗體檢測陰性豬和野毒感染陰性豬等留作種用的仔豬用偽狂犬病濃縮單基因缺失滅活疫苗在100-110日齡接種一次，再到130-140日齡時(shí)加強(qiáng)免疫一次，以后按種豬的免疫程序每半年注射一次濃縮基因缺失滅活疫苗。同時(shí)每半年抽血樣進(jìn)行一次鑒別血清學(xué)檢查，如發(fā)現(xiàn)野毒感染血清學(xué)陽性豬應(yīng)及時(shí)隔離淘汰處理，以保持豬群無野毒感染，安全健康。

5．6．1．4 對種用仔豬經(jīng)上述檢測，發(fā)現(xiàn)和分群隔離的野毒感染血清學(xué)陽性豬，立即注射滅活疫苗或基因缺失疫苗，最好是間隔4-6周注射2次，作為育肥豬飼養(yǎng)出欄。

5．6．1．5 以上是在種豬群和種豬場進(jìn)行偽狂犬病根除計(jì)劃的最佳方案。但考慮到我國養(yǎng)豬業(yè)的實(shí)際情況，一般豬場的養(yǎng)豬數(shù)量都已達(dá)到滿負(fù)荷的程度，豬舍和欄圈都比較緊張，對采取隔離分群有困難時(shí)，此種情況在沒有注射過疫苗的場先進(jìn)行抗體檢測，確定有無感染存在，或是已經(jīng)注苗的場先將疫苗更換為濃縮單基因缺失滅活疫苗，再按前述的種豬及種豬場的免疫程序進(jìn)行免疫。即抗體

陰性豬首先作兩次基礎(chǔ)免疫，其間隔4-6周。然后每半年注射一次。如是野毒感染陽性豬群先作兩次基礎(chǔ)免疫后，再每4個(gè)月免疫一次，直至野毒感染抗體消失后，改為每半年一次。對已經(jīng)免疫過的豬群，則將疫苗更換成濃縮單基因缺失疫苗就行。然后按每半年抽血檢查一次。逐步縮小野毒感染的豬。這就是要比前述的采取分群隔離的措施達(dá)到凈化根除的目的要慢一些。

5.6．1．6 對正在爆發(fā)偽狂犬病的豬場，種豬除進(jìn)行兩次間隔4-6周基礎(chǔ)免疫外：種豬應(yīng)在配種前注射一次，產(chǎn)前一個(gè)月加強(qiáng)免疫一次，均使用濃縮的單基因缺失的滅活疫苗。育肥豬用基因缺失弱毒疫苗進(jìn)行兩次免疫。如仔豬發(fā)病用基因缺失疫苗緊急預(yù)防接種效果顯著。

5．6．1.7 對新引進(jìn)的種豬，要進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫，最好是要引進(jìn)偽狂犬病抗體陰性豬或野毒感染抗體陰性豬，引到本場后，隔離飼養(yǎng)2個(gè)月，抽血樣檢查，抗體或野毒感染抗體為陰性者再與本場其它豬混群飼養(yǎng)。與其它豬群一樣，每半年作一次檢查。對于檢測出的野毒感染陽性豬要嚴(yán)格隔離，注射疫苗后，看情況能否作為種用，最好是將其淘汰不作種豬用。

5.6．1．8 豬場要進(jìn)行定期嚴(yán)格的消毒管理措施，最好是使用2%的氫氧化鈉（燒鹼）溶液或酚類消毒劑。豬舍、欄圈的清洗消毒，最要選擇氣候干燥和具有陽光照射下進(jìn)行效果最佳。

5.6．1．9豬場嚴(yán)格禁止養(yǎng)狗、養(yǎng)貓、養(yǎng)雞，嚴(yán)格禁止狗、貓、雞和其它鳥類及動(dòng)物進(jìn)入豬舍。在豬場內(nèi)要進(jìn)行嚴(yán)格的滅鼠措施。消滅鼠類帶毒傳播疾病的危險(xiǎn)。

5.6．1．10 要嚴(yán)格禁止人員和車輛等進(jìn)入豬場，避免因人員和機(jī)械帶毒傳播疾病。

5．6．1．11在5公里方圓范圍內(nèi)的相關(guān)豬場都必須統(tǒng)一采取同樣措施，因?yàn)閭慰袢】稍诜綀A5公里范圍內(nèi)通過空氣傳播。

5．6．2育肥豬場偽狂犬病的根除計(jì)劃

上述種豬及種豬場的根除計(jì)劃措施完全適用于育肥豬場。育肥豬場種豬的偽狂犬病根除計(jì)劃措施與上述的種豬的根除計(jì)劃措施是完全一樣的。不同的只是在育肥豬方面，首先應(yīng)對育肥豬群在70-100日齡的豬進(jìn)行偽狂犬病血清學(xué)檢測，如發(fā)現(xiàn)有抗體陽性或野毒抗體陽性豬，所有的豬只都應(yīng)注射疫苗。經(jīng)過規(guī)則免疫的種豬所生的仔豬，一般在60-70日齡注射一次基因缺失弱毒疫苗，間隔4-6周后再加強(qiáng)免疫一次。一般情況下在育肥豬場種豬育肥豬都應(yīng)進(jìn)行免疫。如只免疫種豬，大量的育肥感染病毒，在那里大量增殖病毒并向豬舍內(nèi)排毒，直接威脅著種豬，因而種豬的免疫效果受到影響。此外育肥豬感染偽狂犬病毒后，雖不表現(xiàn)出典型的臨床癥狀和發(fā)生死亡，但可明顯的引起呼吸道癥狀，增重遲緩，飼料報(bào)酬降低，推遲出欄，其間接經(jīng)濟(jì)損失也是巨大的。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床上的觀察證實(shí)，感染了偽狂犬病毒的育肥豬群，注射疫苗與不注苗其增重相差約1/3。即注射疫苗豬比未注射疫苗豬在同等飼養(yǎng)條件下多增1/3，可見育肥豬應(yīng)該進(jìn)行偽狂犬病免疫的重要性。

6．無病標(biāo)準(zhǔn)：

首先要配合我國無特定病原區(qū)的建設(shè)的工作計(jì)劃，劃定一定的區(qū)域，對區(qū)域內(nèi)的豬場進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，了解和掌握偽狂犬病豬場和豬群陽性感染率的情況，制定偽狂犬病的免疫預(yù)防計(jì)劃與措施。按照前述偽狂犬病的根除計(jì)劃方案，實(shí)施強(qiáng)制性免疫計(jì)劃，配合強(qiáng)有力和有效的區(qū)分強(qiáng)弱毒感染的監(jiān)測，建立健康群，通過有計(jì)劃的免疫，使豬群偽狂犬病強(qiáng)毒感染率降到10%左右時(shí)，就可以采取捕殺或淘汰野毒血清學(xué)陽性豬，建立健康豬群。最后要在一定的區(qū)域范圍內(nèi)或甚至是全國范圍內(nèi)，經(jīng)過較長時(shí)間的監(jiān)測沒有再發(fā)現(xiàn)野毒感染豬。在穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，停止注苗后，連續(xù)3年無臨床病例出現(xiàn)，由國家指定的專門實(shí)驗(yàn)室到該區(qū)域內(nèi)的豬場隨機(jī)抽血樣檢測偽狂犬病毒抗體為陰性，沒有陽性豬出現(xiàn)，才算消滅或根除了偽狂犬病。