第一篇：食用菌育種技術(shù)的研究進(jìn)展

食用菌育種技術(shù)的研究進(jìn)展

作者：桂明英等來源：中國食用菌，2006（5）

隨著人們對食用菌營養(yǎng)價值和藥用價值認(rèn)識的提高以及食用菌生產(chǎn)所帶來的經(jīng)濟(jì)效益的增加。食用菌育種工作也成為食用菌科技工作者關(guān)注的熱點之一?，F(xiàn)對食用菌育種工作的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為食用菌的育種工作提供參考。

一、野生食用茵馴化育種

野生食用菌馴化栽培．是食用菌育種的重要內(nèi)容．栽培的食用菌品種絕大部分是由野生食用菌馴化而來的。例如：阿魏蘑的馴化工作．是中國科學(xué)院新疆生物土壤沙漠研究所于1983年開始的．當(dāng)時曹玉清、牟川靜、陳忠純等在研究馴化分布于新疆托里地區(qū)的野生阿魏側(cè)耳fP／eurotu~retainel時，對其形態(tài)特征、分類地位、氨基酸含量、生活條件(包括營養(yǎng)、pH值、溫度、濕度、光照和通風(fēng))、菌絲培養(yǎng)特征、馴化栽培等進(jìn)行了研究。觀察到分離的野生菌株K001、K002與K005在培養(yǎng)特征上的差異。1986年他們又在新疆木壘采集到Kill標(biāo)本．在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)．K005、Klll在子實體外部形態(tài)與菌絲培養(yǎng)特征上與阿魏側(cè)耳顯著不同。經(jīng)研究定名為阿魏側(cè)耳托里變種[Pieurotus ervngii(DC．ex． Fr)0ueI．var．tuoliensis Mou．n var]。他們1983年對 K001、K002、K005菌株馴化栽培中．發(fā)現(xiàn)在有無寄主植物阿魏根屑添加在培養(yǎng)基中的情況下．用棉籽殼、云杉木屑、麩皮等原料組成的培養(yǎng)基上都相繼長出了子實體．阿魏側(cè)耳及托里變種自此得到推廣．首先在新疆開始人工栽培。已成為近年來大面積進(jìn)行商業(yè)性栽培的一種食用菌新品種。其菇體肥大、顏色潔白、菌肉細(xì)膩、質(zhì)地脆嫩、久燉不綿、清爽滑潤、味美可口、營養(yǎng)豐富．投入市場后深受人們的青睞。目前我國引進(jìn)和馴化栽培成功的食用菌已達(dá)80多個種。

二、孢子分離育種

單孢分離就是將采集到的孢子群單個分開培養(yǎng)，讓其單獨萌發(fā)成菌絲而獲得純培養(yǎng)的方法。曹裕漢通過對草菇有性分離選育種研究．表明草菇孢子分離菌株在菌絲形態(tài)、生長速率、產(chǎn)厚垣孢子能力、出菇、產(chǎn)量等性狀上存在較大的差異?？梢栽诰z濃密、氣生菌絲多、能產(chǎn)生大量厚垣孢子的菌株中選擇到較高產(chǎn)量的菌株應(yīng)用于生產(chǎn)．解決草菇生產(chǎn)上出現(xiàn)的菌種老化、退化問題：潘保華采用稀釋鏡檢法對金針菇的6個品種．共計l 898個擔(dān)孢子分離培養(yǎng)．結(jié)果檢測出144個單孢結(jié)實菌株。這些菌株與其它非單孢結(jié)實菌株交配．篩選出6個強(qiáng)優(yōu)組合。這種通過組織分離．而后經(jīng)出菇或出耳試驗，從中篩選出產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)、遺傳性狀優(yōu)良的菌株再進(jìn)行擴(kuò)大繁殖的育種方法是目前采用最多的一種方法。

三、食用茵雜交育種

食用菌雜交育種的基本原理是通過單倍體交配實現(xiàn)基因重組。雜交育種通過選擇適當(dāng)?shù)挠H本進(jìn)行交配．從雜交后代中選育出具有雙親優(yōu)良性狀的菌株，具有一定的定向性．這種育種方法適用于異宗結(jié)合的食用菌。賀建超等以雙孢蘑菇176和2796為親本菌株。通過單孢子雜交育種，經(jīng)過初篩、復(fù)篩和生產(chǎn)性試驗．獲得一株新的穩(wěn)定的雙孢蘑菇雜交高產(chǎn)菌株。該雜交菌株具有發(fā)菌快、出菇早、產(chǎn)量高、顏色白、朵形較大、菌肉肥厚、抗逆性較強(qiáng)等優(yōu)點。許益財?shù)冗x擇生態(tài)、種性等差異較大的長白山野生香菇和栽培品種A3-3為親本．采用平板稀釋法進(jìn)行單孢分離．單孢萌發(fā)及單核菌絲鏡檢、配對。從中選擇優(yōu)良組合“撫香一號”。該菌株符合育種目標(biāo)，是一個產(chǎn)量高、菇形圓正、肉厚、內(nèi)實、抗逆性強(qiáng)、耐高溫、遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)良品種．可在北方作為更新?lián)Q代的優(yōu)良新品種：劉宇、陳文良等用杏鮑菇l號菌株和9號菌株通過單孢雜交育種方法選育出杏鮑菇13號雜交菌株．杏鮑菇13號雜交菌株的子實體產(chǎn)量最高．生物學(xué)效率達(dá)到109．20％。

四、食用茵誘變育種：

誘變育種是人為利用某些理化因子誘導(dǎo)食用菌遺傳因子發(fā)生突變．再從多種突變體中選出正突變菌株的方法。誘變育種是獲得優(yōu)良食用菌菌株的常用手段。目前來看對食用菌育種較為有效的理化因子包括60co、紫外線、離子束、激光、X射線、超聲波、快中子、亞硝酸、亞硝酸胍、氮芥、硫酸二乙酯等．研究人員根據(jù)各自的實驗條件及不同菌種的特點選擇不同的誘變方法．在食用菌新菌種的選育工作中已取得了不少成果。

4．1 60Co輻射誘變育種

60Co在生物技術(shù)上的應(yīng)用，是育種方法學(xué)的重要發(fā)展。夏志蘭、艾辛等采用60C0射線誘變杏鮑菇菌絲．在輻照劑量為1 000Gy．劑量率為67．8Gy／h的條件下．經(jīng)過拮抗試驗和酯酶同功酶電泳驗證．選育出一株杏鮑菇新菌株．誘變菌株與供試菌株比較．菌絲積累量差異均達(dá)到極顯著水平；張卉、佟俊生等采用60co-γ射線誘變菌絲，在輻照劑量為1 000Gv．劑量率為67．8Gy／h的條件下。經(jīng)過拮抗試驗和酯酶同功酶電泳驗證．選育出一株巴西蘑菇新菌株。經(jīng)液體培養(yǎng)其胞外多糖產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高12％。

4．2紫外線輻射誘變育種

紫外線是一種非電離輻射誘變劑．是誘變產(chǎn)生突變的重要手段。張淵、王謙等研究了茶薪菇原生質(zhì)體的形成及影響因素．并進(jìn)行了以原生質(zhì)體為材料的誘變育種工作．實驗表明．培養(yǎng)5d的茶薪菇菌絲體酶解3h原生質(zhì)體數(shù)目達(dá)到最大．原生質(zhì)體經(jīng)紫外線照射20see．．致死率即達(dá)70％1~2上。再生菌株經(jīng)篩選后．原生質(zhì)體再生株C16和誘變株 C304產(chǎn)量較對照分別提高了42．7％和17．9％：李德舜、劉正學(xué)等通過對平菇“山大1號”原始菌株的擔(dān)孢子收集、UV誘變以及突變菌株的出菇性能、抗雜菌能力測試研究．從45個突變菌株中篩選出了2株很有潛力的菌株。6號菌株株形美觀，抗雜菌能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)潮快．生物學(xué)效率較原始菌株提高了約34．3％，達(dá)177．1％；3號菌株表現(xiàn)為無孢突變，為平菇新品種的研究開發(fā)提供了一個很好的出發(fā)菌株㈣。

4．3離子注入誘變育種

離子柬誘變育種與傳統(tǒng)的輻射法及化學(xué)誘變劑相比．具有損傷輕、突變率高、突變譜寬、遺傳穩(wěn)定、易于獲得理想菌株等特點。付永前、張軍等對阿魏菇的孢子采用不同的注入劑量進(jìn)行注入。以抽真空的樣品為對照，經(jīng)固體培養(yǎng)、液體發(fā)酵后，利用苯酚——濃硫酸法測其胞內(nèi)、胞外多糖含量。經(jīng)反復(fù)的注入和篩選后．獲得了最佳的注入劑量和阿魏多糖高產(chǎn)菌株2a-3．對此菌株和對照進(jìn)行液體發(fā)酵．在不同的發(fā)酵時間內(nèi)對其發(fā)酵物鮮重及胞內(nèi)、胞外多糖含量進(jìn)行測定．得到了最佳發(fā)酵周期為4d．其胞內(nèi)多糖和胞外多糖含量分別較對照菌株提高了20．33％和18．53％。

4．4激光誘變育種

激光對生物體作用的研究已有40多年的歷史．隨著研究水平的深入．目前認(rèn)為，激光對生物體的影響主要是由于其熱、壓力、光和電磁場等幾方面的效應(yīng)。其中，熱效應(yīng)引起酶失活、蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致生物的生理、遺傳變異；壓力效應(yīng)使組織變形、破裂，引起生理及遺傳變異；電磁場效應(yīng)是由產(chǎn)生的自由基導(dǎo)致DNA損傷。引起突變；而光效應(yīng)則是通過一定波長的光子被吸收、躍遷到一定的能級。引起生物分子變異。李耀維、張素梅等用 He-Ne激光輻照誘變金針菇(Flammulina Velu． tipes)的原生質(zhì)體、菌絲體片段，分生孢子懸液，并進(jìn)行初篩、復(fù)篩及突變株遺傳穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明：采用原生質(zhì)體進(jìn)行誘變．其正突變率、單株 SOD產(chǎn)量提高率、產(chǎn)SOD遺傳穩(wěn)定性均高于菌系體與分生孢子。激光誘變原生質(zhì)體是獲得金針菇 SOD高產(chǎn)株的有效途徑㈣；陳五嶺、姚勝利采用 He-Ne激光誘變選育的6株香菇．酯酶同工酶在親本相比。酶帶條紋數(shù)、遷移率等特征發(fā)生了明顯的改變．表明了在激光作用下。香菇菌絲體遺傳物質(zhì)發(fā)生了變異。所選育的香菇新菌種中試栽培結(jié)果表明：新菌種在相同生產(chǎn)條件下。生長周期平均縮短20d以上，香菇產(chǎn)量最低平均提高10％以上．最高可提高22．5％。

4．5空間誘變

空間誘變可以豐富食用菌的種質(zhì)資源．賈建航、邊銀丙將香菇、平菇、黑木耳、金針菇、靈芝等食用菌材料進(jìn)行了衛(wèi)星或高空氣球搭載．隨之進(jìn)行地面實驗。結(jié)果表明，搭載材料在拮抗反應(yīng)、菌絲生長速度、出菇形態(tài)等方面明顯變異。RAPD分析結(jié)果也證實一些搭載菌株在DNA水平上發(fā)生了變異。以上結(jié)果表明．空間誘變可能為食用菌的遺傳育種提供新途徑。

五、細(xì)胞融合技術(shù)

細(xì)胞融合技術(shù)是人們按照需要．使兩個不同遺傳特性的細(xì)胞。融合成一個新的雜種細(xì)胞．從而人工構(gòu)建新型細(xì)胞．這個細(xì)胞兼有兩個親代細(xì)胞的遺傳特性。

李省印、李孟樓等將16個平菇資源品種的菌絲體，在25℃、pH5．8-6．0環(huán)境下，分別用1．5％溶

菌酶加0．6mol／L KCI穩(wěn)滲劑溶解其細(xì)胞壁2h。將獲得的原生質(zhì)體兩兩配對成39個組合，在30℃、pH9、0．6 mol／L KCI穩(wěn)滲劑、不加融合促進(jìn)劑Ca-C12和PEG6000的融合條件下．得到種內(nèi)雜交融合子5株。其中4株融合子再生出菌絲體和子實體：同皿接種實驗顯示．新菌株與其雙親具明顯的拮抗線。經(jīng)栽培試驗與生產(chǎn)示范．新育的“優(yōu)生”1號品系表現(xiàn)適應(yīng)性強(qiáng)，優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、抗雜、耐熱。

平香1號是河北農(nóng)業(yè)大學(xué)利用細(xì)胞融合技術(shù)．培育的香菇(7402)與平菇(紫飽側(cè)耳)兩個屬間的遠(yuǎn)緣雜交新品系。平菇與香菇在生物學(xué)分類上分別屬于側(cè)耳屬和香菇屬。前者生長周期短、易栽培、產(chǎn)量高，但品質(zhì)較差；后者味道鮮美。平香一號細(xì)胞工程株子實體的氨基酸含量介于雙親之間．比平菇的氨基酸含量有所提高．比香菇的氨基酸含量有所下降。菌株在菌絲生長速度和產(chǎn)量(生物轉(zhuǎn)化率)方面都顯著超過雙親：金風(fēng)2—1是四川省農(nóng)科院土肥所微生物研究室利用獨創(chuàng)的細(xì)胞融合一融合核分裂技術(shù)，選育得到的金針菇、風(fēng)尾菇的科間雜交后代．它具備了親本金針菇叢生和朵數(shù)多的特點．又具備了風(fēng)尾菇朵大肉厚的特性．同時它突破了金針菇只能低溫出菇、風(fēng)尾菇只能在中溫條件下出菇的特性．是一個廣溫性菌株．從1990年開始已經(jīng)在全國19省市和省內(nèi)的60多個市地州縣大面積推廣應(yīng)用．據(jù)不完全統(tǒng)計．已經(jīng)創(chuàng)產(chǎn)值5億元以上。

六、轉(zhuǎn)基因育種

轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將人工分離和修飾過的基因?qū)氲侥康纳矬w的基因組中．從而達(dá)到改造生物的目的。張競、聶思惟等將MT基因用電擊法轉(zhuǎn)化平菇(Pjeurotu$ostreatusl。MT基因表達(dá)蛋白與金屬離子結(jié)合而形成絡(luò)合物．用Zn誘導(dǎo)．轉(zhuǎn)基因平菇能富集Zn．可對缺Zn的人群補(bǔ)充Zn．使平菇成為一種保健和治療的食品或蔬菜。出菇試驗結(jié)果表明．在米糠與鋸沫比為1：3的培養(yǎng)基上生長．在米糠與鋸沫比為1：4的培養(yǎng)基上不生長。24d菌絲可在廣口瓶中長滿，用于子實體培養(yǎng)。

回顧食用菌育種方法的歷史．可發(fā)現(xiàn)育種的手段和技術(shù)在不斷發(fā)展和完善。最初人們認(rèn)為食用菌可以馴化。出現(xiàn)了野生食用菌馴化技術(shù)。后來隨著對遺傳變異現(xiàn)象的認(rèn)識．出現(xiàn)了誘變育種技術(shù)．提高了微生物自發(fā)突變率，這就為選育高產(chǎn)、耐高溫、多糖含量高的優(yōu)質(zhì)食用菌開辟了新的途徑。幾乎與誘變育種在同一時期．在對微生物有性生殖、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)合等研究的基礎(chǔ)上．出現(xiàn)了雜交育種技術(shù)．該技術(shù)是在已知的不同性狀的親本間雜交．故比誘變育種的方向性和自覺性要好．這就為食用菌的定向育種提供了保證。20世紀(jì)60年代出現(xiàn)了細(xì)胞融合技術(shù)．隨著細(xì)胞融合技術(shù)在食用菌育種上的應(yīng)用．使得食用菌育種技術(shù)得到空前的進(jìn)步。20世紀(jì)70年代出現(xiàn)的基因工程技術(shù)給微生物育種帶來了新的革命．它所創(chuàng)造的新物種是自然演化中不可能出現(xiàn)的．作為一種可控的育種手段．必將在食用菌定向育種中發(fā)揮重要作用。中國食用菌，2006（5）

桂明英1,2，王剛3，郭永紅2，劉蓓2，馬紹賓1(1．云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明650091；2．昆明食用菌研究所云南昆明650223；3．云南農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館咨詢部云南昆明650201)

第二篇：蔬菜育種技術(shù)

蔬菜育種技術(shù)

課程名稱：適用專業(yè)：適用年級：學(xué)年學(xué)期：任課教師：編寫時間： 教案

園藝植物育種技術(shù)各論 園藝專業(yè)等 三年級

2010-2011學(xué)年第二學(xué)期 劉志勇 2011年3月

第一章 緒論

上課班級：08級園藝專業(yè) 日 期：2011年4月17日 學(xué) 時 數(shù)：2學(xué)時

本章教學(xué)目標(biāo)：

通過本章學(xué)習(xí)，了解蔬菜育種的定義及重要性，了解蔬菜育種技術(shù)課程的內(nèi)容和任務(wù)，了解蔬菜育種技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢。

本章基本要求：

通過概念的闡述，是學(xué)生明白蔬菜育種是做什么的，為什么要開展育種技術(shù)研究，讓學(xué)生掌握蔬菜育種的任務(wù)及基本流程。通過課程學(xué)習(xí)，學(xué)生能夠表述清楚蔬菜育種技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢。

本節(jié)的教學(xué)內(nèi)容: 第一部分：蔬菜育種的概念和任務(wù) 第二部分：蔬菜育種的基本途徑 第三部分：蔬菜育種技術(shù)體系 第四部分：蔬菜育種工作的發(fā)展趨勢

本章教學(xué)重點：

① 使學(xué)生了解、熟悉蔬菜作物主要的育種途徑。② 使學(xué)生掌握蔬菜作物育種技術(shù)的發(fā)展方向和重點。

本章教學(xué)內(nèi)容的深化和拓寬：使學(xué)生了解國內(nèi)外種子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀與趨勢。本章教學(xué)方式：板書

本章教學(xué)過程中應(yīng)注意的問題： 通過舉例說明，加深學(xué)生對關(guān)鍵問題的理解，聯(lián)系生產(chǎn)實際，啟發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

本章主要參考書目：

①西南大學(xué)主編，《蔬菜育種學(xué)各論》，中國農(nóng)業(yè)出版社，2000年。②沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)主編，《蔬菜育種學(xué)》，中國農(nóng)業(yè)出版社，1992年。

③山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，《園藝植物育種學(xué)總論》，中國農(nóng)業(yè)出版社，2000年。

本章思考題：

①蔬菜育種的基本途徑有哪些？ ②蔬菜育種的趨勢有哪些？

第二章 大白菜育種技術(shù)

上課班級：08級園藝專業(yè) 學(xué) 時 數(shù)：8學(xué)時

本章教學(xué)目標(biāo)：

①了解大白菜的基本生物學(xué)特點 ②掌握大白菜的分類及其特點

③掌握大白菜主要農(nóng)藝性狀的遺傳特點，尤其是雜交制種相關(guān)的性狀 ④掌握大白菜雜交制種的基本流程

本章基本要求：

①使學(xué)生了解大白菜的基本種性特點，進(jìn)而了解開展雜交制種技研究的必要性 ②使學(xué)生了解現(xiàn)階段大白菜雜交制種技術(shù)研究現(xiàn)狀，進(jìn)而理解雄性不育在大白菜雜交種生產(chǎn)中的重要性。

③掌握大白菜100%核基因雄性不育系定向轉(zhuǎn)育模式的實質(zhì)

本節(jié)的教學(xué)內(nèi)容: 第一部分 起源與種質(zhì)資源 重點講譚其猛和李家文兩位學(xué)者的起源學(xué)說。第二部分：開花授粉與性狀遺傳 為后期雄性不育系的利用奠定基礎(chǔ)。第三部分：我國大白菜育種研究現(xiàn)狀及展望 重點講已有成就及存在不足 第四部分：現(xiàn)代育種的主要目標(biāo) 產(chǎn)量已經(jīng)滿足，應(yīng)將優(yōu)質(zhì)放在第一位，舉例黃心、桔紅心、紫色大白菜等。

第五部分：主要育種途徑與選擇技術(shù) 可以拿其中的一個生態(tài)型進(jìn)行舉例說明。第六部分：良種繁育 主要講一下雄性不育系和自交不親和系，重點講制種的原則。

本章教學(xué)重點：

① 使學(xué)生了解、熟悉目前大白菜各種雜交制種方法優(yōu)劣。② 使學(xué)生掌握大白菜的最根本的生物學(xué)特性。

本章教學(xué)內(nèi)容的深化和拓寬：使學(xué)生了解國內(nèi)和國外白菜類蔬菜雜交種生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢

本章教學(xué)方式：板書

本章教學(xué)過程中應(yīng)注意的問題：培養(yǎng)學(xué)生用發(fā)展變化的觀點看待問題，通過舉例說明，加深學(xué)生對關(guān)鍵問題的理解，聯(lián)系生產(chǎn)實際，啟發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。

本章主要參考書目：

①西南大學(xué)主編，《蔬菜育種學(xué)各論》，中國農(nóng)業(yè)出版社，2000年。②沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)主編，《蔬菜育種學(xué)》，中國農(nóng)業(yè)出版社，1992年。③山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，《園藝植物育種學(xué)總論》，中國農(nóng)業(yè)出版社，2000年。

本章思考題：

①為什么說雄性不育是大白菜雜交種生產(chǎn)的理想途徑？ ②大白菜核基因雄性不育系創(chuàng)制方案及其理論基礎(chǔ)？

第三章 番茄育種技術(shù)

上課班級：08級園藝專業(yè) 學(xué) 時 數(shù)：5學(xué)時

本章教學(xué)目標(biāo)：

通過本章學(xué)習(xí)，了解番茄育種主要研究進(jìn)展和掌握番茄品種選育方法。

本章基本要求：

通過本章學(xué)習(xí)，了解番茄育種主要研究進(jìn)展和掌握番茄品種選育方法。

本節(jié)的教學(xué)內(nèi)容: 第一部分：起源與種質(zhì)資源 第二部分：開花授粉與性狀遺傳 第三部分：主要育種成就與研究進(jìn)展 第四部分：現(xiàn)代育種的主要目標(biāo) 第五部分：主要育種途徑與選擇技術(shù) 第六部分：種子生產(chǎn)

本章教學(xué)重點：

① 使學(xué)生了解、熟悉番茄主要的育種途徑。② 使學(xué)生掌握了解番茄雜交種的制種方式。

本章教學(xué)內(nèi)容的深化和拓寬：使學(xué)生了解國內(nèi)外番茄種子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀與趨勢，同時可以講到不同地區(qū)的番茄種植特點。

本章教學(xué)方式：板書

本章教學(xué)過程中應(yīng)注意的問題： 通過舉例說明，加深學(xué)生對關(guān)鍵問題的理解，聯(lián)系生產(chǎn)實際，啟發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。尤其是應(yīng)該講到我國番茄育種所面臨的嚴(yán)重形勢。

本章主要參考書目：

①西南大學(xué)主編，《蔬菜育種學(xué)各論》，中國農(nóng)業(yè)出版社，2000年。②沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)主編，《蔬菜育種學(xué)》，中國農(nóng)業(yè)出版社，1992年。③山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，《園藝植物育種學(xué)總論》，中國農(nóng)業(yè)出版社，2000年。

本章思考題：

①番茄育種的基本途徑有哪些？ ②番茄育種的趨勢有哪些？

第四章 黃瓜育種技術(shù)

上課班級：09級園藝專業(yè) 學(xué) 時 數(shù)：5學(xué)時

本章教學(xué)目標(biāo)：

通過本章學(xué)習(xí)，了解黃瓜育種主要研究進(jìn)展和掌握黃瓜新品種選育方法。

本章基本要求：

通過本章學(xué)習(xí)，了解黃瓜育種主要研究進(jìn)展和掌握番茄品種選育方法。

本節(jié)的教學(xué)內(nèi)容: 第一部分：起源與種質(zhì)資源 第二部分：開花授粉與性狀遺傳 第三部分：主要育種成就與研究進(jìn)展 第四部分：現(xiàn)代育種的主要目標(biāo) 第五部分：主要育種途徑與選擇技術(shù) 第六部分：種子生產(chǎn)

本章教學(xué)重點：

① 使學(xué)生了解、熟悉黃瓜主要的育種途徑。② 使學(xué)生掌握了解黃瓜雜交種的制種方式。

本章教學(xué)內(nèi)容的深化和拓寬：使學(xué)生了解國內(nèi)外黃瓜種子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀與趨勢，同時可以講到不同地區(qū)的黃瓜種植特點。同時，重點介紹歐美國家同我國黃瓜育種方向的差別，以及國外種子企業(yè)在中國的研發(fā)情況。

本章教學(xué)方式： 板書

本章教學(xué)過程中應(yīng)注意的問題： 通過舉例說明，加深學(xué)生對關(guān)鍵問題的理解，聯(lián)系生產(chǎn)實際，啟發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。尤其是應(yīng)該講到我國黃瓜育種所面臨的嚴(yán)重形勢，例如國外種子企業(yè)加大了華北型黃瓜的研發(fā)力度，并且已經(jīng)有了部分新品種推向了市場。

本章主要參考書目：

①西南大學(xué)主編，《蔬菜育種學(xué)各論》，中國農(nóng)業(yè)出版社，2000年。

②沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)主編，《蔬菜育種學(xué)》，中國農(nóng)業(yè)出版社，1992年。③山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，《園藝植物育種學(xué)總論》，中國農(nóng)業(yè)出版社，2000年。

本章思考題：

①黃瓜育種的基本途徑有哪些？ ②黃瓜育種的趨勢有哪些？

第三篇：食用菌技術(shù)[最終版]

農(nóng)村實用技術(shù)培訓(xùn)教案

培訓(xùn)內(nèi)容：食用菌技術(shù) 主講人：

食用菌技術(shù)

雙孢菇具有品質(zhì)優(yōu)良，口感好，投資少，效益高的特點，有廣闊的市場前景，每667平方米經(jīng)濟(jì)效益達(dá)1.2萬元，其栽培技術(shù)：

一、準(zhǔn)備培養(yǎng)料及配方，以栽培100m2計算，需備優(yōu)質(zhì)干麥秸1500kg，干牛馬糞600kg，磷肥50kg，尿素15kg，石膏粉25kg，碳酸鈣12.5kg。

二、培養(yǎng)料的堆制與翻堆

（一）堆制培養(yǎng)料的全過程需要25天左右，建堆時間在播種前期5天進(jìn)行。

（二）堆制與翻堆。培養(yǎng)成料堆制選在地平、不存水、無污染、有水源的地方；建堆前2－3天，將麥秸浸水后撈出，逐層均勻撒入1.5石灰粉，再將麥秸堆成長方形大堆，逐層踏實，同時將馬糞土預(yù)濕；建堆時先在堆料場上鋪一層濕好的麥秸，厚薄15－20cm，然后再在麥秸上撒一層糞，共計10－12層，從第二層開始適量加水，分四次進(jìn)行翻堆，第一次在建堆后的第七天進(jìn)行，以后每次間隔5-6天，每次翻堆嚴(yán)格按技術(shù)要求進(jìn)行。

三、播種

（一）播種時間：外界溫度在25℃左右，料溫在28℃以下適合播種，根據(jù)我市氣溫狀況9月5目前為宜。

（二）播種量：每 m2接種500g/瓶。

四、播種后覆土前的管理

（一）播種后，相對濕度保持在80％左右，如料溫超過28℃，棚內(nèi)溫度超過30℃，適當(dāng)通風(fēng)降溫。

（二）播種后4－10天內(nèi)，要及時微量通風(fēng)，如濕度在70%左右，屬于偏低，可用紙蓋在料面上，再用1%的石灰水噴在紙上，至紙濕而不積水為止。

（三）播種10日后及時把紙拿掉，15-20天后菌絲基本長滿料層時即可覆土。

五、覆土及覆土后的管理

（一）覆土：按100m2計算需2.5m3土，在土中拌入50kg磷肥，1-2石灰粉，用水滲透，抓起成團(tuán)，撒下散開為宜，把土均勻地鋪在料面上，厚度在2－2.5cm為宜。

（二）覆土后的管理

1、水分：覆土層的含水量一般在20%最佳，在菇蕾長成米粒大時，噴一次出落水。

2、濕度：覆土后要求空間濕度在80-90%之間。

3、溫度：菌絲體生長適溫13-18℃，實體生長適溫13-18℃。

4、適時采收：采收直徑2－4cm。專

家預(yù)計，今年我省食用菌價格會繼續(xù)上漲，但平菇會逐漸被姬菇、秀珍菇、白靈菇取代，這主要是因為平菇的品質(zhì) 在下降，價格可能略有下降。而一些口感好、營養(yǎng)價值高的食用菌如杏鮑菇、姬菇、秀珍菇、白靈菇、茶樹菇則會大受消費者歡迎，比2010年的銷量肯定會翻一番，尤其是雙孢菇的市場占有量會大幅度增加，種植珍稀食用菌定會有一個好收成。目前雙孢菇批發(fā)價在2.7-3.5元/斤之間。

第四篇：食用菌技術(shù) PK 企業(yè)管理

“如一”易菇論劍第二期：食用菌技術(shù) PK 企業(yè)管理

提要：由易菇網(wǎng)主辦，易菇論壇承辦的易菇論劍第二期食用菌技術(shù) PK 企業(yè)管理，在辯論期間，大家對食用菌領(lǐng)域食用菌技術(shù)和企業(yè)管理的重要性做了深入的探討，在技術(shù)和管理有很多獨特的見解，論辯觀點明確、條理清楚，現(xiàn)摘錄其中精彩部分與廣大讀者分享。

辯論時間：2010年5月6日起——2010年5月31日

主題：食用菌技術(shù) PK 企業(yè)管理

正方：食用菌技術(shù)比企業(yè)管理重要

反方： 企業(yè)管理比食用菌技術(shù)重要

（以上辯論設(shè)定范圍是食用菌領(lǐng)域，食用菌技術(shù)指食用菌的科研、生產(chǎn)和栽培技術(shù)等；企業(yè)管理是指食用菌企業(yè)的管理）

主辦：易菇網(wǎng)

承辦：易菇論壇

冠名：廣西南寧元本生物科技有限公司

正文：

網(wǎng)友lsy6560483，反方：企業(yè)管理包括管理技術(shù)，企業(yè)管理開始就將技術(shù)放在了企業(yè)管理之下，如果技術(shù)不行應(yīng)該通過企業(yè)管理去引進(jìn)技術(shù)、引進(jìn)人才或者去研發(fā)技術(shù)，所以技術(shù)肯定是在企業(yè)管理的范疇之內(nèi)的工作。技術(shù)比管理重要的觀點怎么能讓人認(rèn)同？企業(yè)管理不到位，企業(yè)肯定要一塌糊涂。但是缺少技術(shù)，技術(shù)落后，可以通過高薪聘請技術(shù)人才，花錢買技術(shù)的企業(yè)管理手段去解決，所以我認(rèn)為企業(yè)管理就是比技術(shù)重要。

網(wǎng)友cuijinjunh，正方：食用菌技術(shù)比管理重要!

食用菌算是高風(fēng)險行業(yè)。食用菌行業(yè)的出路就是技術(shù)代替管理。這里我說的技術(shù)包括很多，滅菌，接種，溫濕光風(fēng)的控制，這些都是可以用科學(xué)技術(shù)來一一實現(xiàn)自動化的。我贊同正方是因為科學(xué)技術(shù)可以代替日常的管理。管理不是靠感覺，而是需要更科學(xué)的技術(shù)。

網(wǎng)友lianwen，反方：不管在什么時候，食用菌生產(chǎn)在技術(shù)缺乏的情況下都不可能順利生產(chǎn)的。現(xiàn)在明確了，食用菌技術(shù)與企業(yè)管理，在食用菌大規(guī)模經(jīng)營時，企業(yè)管理的重要性確實在生產(chǎn)技術(shù)之上。

網(wǎng)友ff_lxj，正方：就食用菌領(lǐng)域而言，目前99%生產(chǎn)者還是普通的菇農(nóng)或者小規(guī)模企業(yè)，技術(shù)無疑占主導(dǎo)地位，管理相對而言不是很重要。隨著時間的發(fā)展，規(guī)模企業(yè)最終會占主導(dǎo)地位，那時肯定管理要占主導(dǎo)地位的。所以就目前而言，技術(shù)無疑是主要的。

網(wǎng)友lsy6560483，反方：頂尖的技術(shù)被發(fā)明者發(fā)明之后，可能會帶來一場技術(shù)革命，但它一旦進(jìn)入生產(chǎn)階段，它就無法離開管理手段去進(jìn)行生產(chǎn)。

網(wǎng)友yxianbo，正方：先有技術(shù)然后才談得上管理，不管是小作坊還是大公司。實際上來說對于食用菌管理也一多半隨技術(shù)范疇--所以技術(shù)重要

網(wǎng)友jph6060，反方:食用菌有技術(shù)密集型、勞動密集型、資金密集型的特點。在小規(guī)模栽培時認(rèn)為技術(shù)很重要,在中規(guī)模栽培時認(rèn)為技術(shù)和管理同等重要,在大規(guī)模栽培時認(rèn)為管理比技術(shù)更重要。管理的重要性在栽培規(guī)模的不斷擴(kuò)大中越來越被突現(xiàn)出來。

網(wǎng)友菌海一葉，正方：食用菌技術(shù)比管理重要

首先，應(yīng)明確什么是技術(shù)和管理。技術(shù)即在生產(chǎn)的全部過程（即從產(chǎn)品的到產(chǎn)品的銷售）中所應(yīng)用的系統(tǒng)知識，包括制造產(chǎn)品、實施工藝流程、提供服務(wù)等系統(tǒng)知識。管理古文的解釋是“主其事曰管，治其事曰理”，現(xiàn)代管理學(xué)的定義是：在一定的環(huán)境中，運(yùn)用計劃、決策、組織、控制等職能，采取一定的管理方法和手段，調(diào)動各種資源來有效地達(dá)到組織目標(biāo)的實踐活動，管理的作用是放大所管理系統(tǒng)的效能和產(chǎn)生新的效能。從技術(shù)和管理概念的內(nèi)涵和外延看技術(shù)是基礎(chǔ)、是資源，管理是方法、是手段。巧婦難為無米之炊，空中又怎能建樓閣？另外現(xiàn)代管理學(xué)就是建立在泰羅的科學(xué)管理基礎(chǔ)之上的，泰羅的科學(xué)管理實質(zhì)就是針對技術(shù)的管理。

其次，食用菌的特點：勞動密集，機(jī)械化程度低，但勞動強(qiáng)度相對傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)??；不但技術(shù)密集，而且技術(shù)環(huán)節(jié)多，技術(shù)鏈條長；實踐性較強(qiáng)，經(jīng)驗管理主導(dǎo)，規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化管理難度大；食用菌是高風(fēng)險行業(yè)，風(fēng)險就高在滅菌、感染控制、病害防治、環(huán)境調(diào)控等技術(shù)方面。這些特點決定了食用菌技術(shù)較管理更為重要。

其三，產(chǎn)業(yè)企業(yè)不同于服務(wù)型企業(yè)，不但有管理競爭，而且有技術(shù)競爭，食用菌企業(yè)作為產(chǎn)業(yè)企業(yè)技術(shù)競爭凸顯重要。食用菌基于傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)又不同于傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)，生物化工等高新技術(shù)的應(yīng)用是其與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)最大的區(qū)別，這就要求在技術(shù)方面有所創(chuàng)新、有所突破，提高技術(shù)競爭

能力。技術(shù)創(chuàng)新和核心技術(shù)才是企業(yè)的核心競爭力，才是高端企業(yè)處于壟斷地位的實質(zhì)。

其四，技術(shù)和管理是相輔相成的，在不同的環(huán)境和條件下發(fā)揮的作用是不同的。在起步階段和小規(guī)模栽培時技術(shù)尤為重要,要完成起步和原始積累。在壯大階段和規(guī)模栽培時管理的重要性提高,否則就會是曇花一現(xiàn)。企業(yè)成型后技術(shù)創(chuàng)新和改進(jìn)是維持企業(yè)不敗和發(fā)展的必然要求?，F(xiàn)代工廠化規(guī)模生產(chǎn)基本上都是大企業(yè)、成功企業(yè)投資，他們都有先進(jìn)的、成熟的管理經(jīng)驗，但在食用菌上很多都栽了跟頭或建樹不大，他們都輸在了技術(shù)上或針對技術(shù)的管理上。

網(wǎng)友gongxiang，反方： 管理比技術(shù)重要這個問題非常簡單，也無可爭議之處，做為一名企業(yè)管理人員，我說說個人看法：原因很簡單，所有的項目都需要技術(shù)人員去做，但更重要的是所有的項目都需要人管理。一個很簡單的例子：一個企業(yè)里，老總不一定什么技術(shù)都會，但是管理到位就可以做大做強(qiáng)，而一個技術(shù)員，技術(shù)再強(qiáng)不懂管理，也只能自己跟自己玩，為別人效力而已，試問世界五百強(qiáng)的老總們，哪一位是技術(shù)最高的？

網(wǎng)友lsy6560483，反方：管理是多方面的。要想讓技術(shù)優(yōu)勢發(fā)揮出來，管理層的管理必須到位是毫無疑問的事實，在沒有技術(shù)的前提下管理，那個企業(yè)的生產(chǎn)豈不是成了盲人瞎馬？任何企業(yè)都不應(yīng)該在毫無技術(shù)的前提下進(jìn)行生產(chǎn)的。

網(wǎng)友玉皇菇，反方：核心技術(shù)很少，一般技術(shù)就可以應(yīng)付一般規(guī)模企業(yè)的需求，但一個企業(yè)的生存。發(fā)展沒有好的合理的管理制度那是不會發(fā)展也許就是曇花一現(xiàn)。只有合理嚴(yán)格的管理制度才能降低成本，提高產(chǎn)量。質(zhì)量等才會有好的效益。

網(wǎng)友平菇葉，正方：生產(chǎn)社會化程度越高，勞動分工和協(xié)作越細(xì)，就越要有嚴(yán)密的科學(xué)的管理來保證技術(shù)的實施，和技術(shù)相比管理有上層建筑的味道。另一方面生產(chǎn)企業(yè)不論大小，最終要拿質(zhì)量和產(chǎn)量說話，高科技企業(yè)和生物企業(yè)有其本身的特點，能在強(qiáng)手如林的同行中最后勝出一定是技術(shù)領(lǐng)先，這叫核心。即使是信賴槍桿子里面出政權(quán)，指揮槍的先生們也是以軍事首長指揮為主。

網(wǎng)友環(huán)游世界，反方：管理創(chuàng)新比較重要。技術(shù)可以買，但是管理制度則是很難用錢就買到的，畢竟管理是一種企業(yè)文化的傳承。管理的繼承與創(chuàng)新是每一個領(lǐng)導(dǎo)層相傳的，要想有創(chuàng)新比較困難，就如我國的一些企業(yè)，管理基本上是學(xué)習(xí)外國，然后是慢慢形成自己的管理體

制，或者家族形式、或者理事董事形式。說到底，管理就是一種制度問題，是企業(yè)的根本，是上層建筑。有好的創(chuàng)新管理，利于企業(yè)的其他方面的發(fā)展，例如技術(shù)創(chuàng)新、人事管理等方面。

網(wǎng)友蘑菇工程，反方：管理的作用對企業(yè)的發(fā)展是至關(guān)重要的食用菌的栽培，正在從農(nóng)耕向工業(yè)化方向發(fā)展，工業(yè)化的特征就是用先進(jìn)的技術(shù)和機(jī)器設(shè)備替代傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式、生產(chǎn)工具，來有序高效的開展生產(chǎn)活動。從這一連串的詞匯中我們不難看出：要做到是誰用什么方法（技術(shù)）實現(xiàn)什么目標(biāo)，其間沒有計劃、決策、組織、控制行嗎？不行 這就是管理的作用。

結(jié)果公布：

由易菇網(wǎng)主辦，易菇論壇承辦的“如一”易菇論劍第二期：食用菌技術(shù) PK 企業(yè)管理自2010年5月6日起開始在論壇討論以來，截至2010年5月31日，多名網(wǎng)友參與討論，總計發(fā)帖60余條，帖子點擊1500多次。大家就食用菌技術(shù)和企業(yè)管理誰更重要，進(jìn)行了深入、多方面的討論，拓寬了從業(yè)者的視野，加深了大家對食用菌的科研、生產(chǎn)和栽培技術(shù)的了解，同時對食用菌企業(yè)的管理范疇和概念也進(jìn)行了討論，受到行業(yè)人士廣泛關(guān)注和好評。

本期辯論已經(jīng)結(jié)束，但是食用菌技術(shù)和企業(yè)管理的現(xiàn)實命題依舊存在，期待更多精彩的觀點在論壇里繼續(xù)綻放光彩。

此次辯論經(jīng)過易菇論壇顧問團(tuán)評審商議，最終產(chǎn)生： 正方冠軍：菌海一葉反方冠軍：lsy6560483，冠軍將獲得易菇網(wǎng)贈送的禮品一份，易菇網(wǎng)感謝各位網(wǎng)友的參與，希望大家關(guān)注更多的辯論，提出更好的創(chuàng)意，為食用菌行業(yè)的發(fā)展壯大獻(xiàn)計獻(xiàn)策。

第五篇：酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展

酵母雙雜交技術(shù)研究進(jìn)展

提 要 酵母雙雜交技術(shù)是一種有效的真核活細(xì)胞內(nèi)研究方法，在蛋白質(zhì)相互作用的研究方面得到了廣泛的應(yīng)用并取得了許多有價值的重要發(fā)現(xiàn)。作為一個完整的實驗系統(tǒng)，它自建立以來經(jīng)過了不斷的改進(jìn)與完善，不僅進(jìn)一步提高了實驗結(jié)果的可靠性與精確性，而且在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了反向雙雜交，三雜交及核外雙雜交等多項技術(shù)。這些都將對功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究起到促進(jìn)作用。

0 引言

隨著分子生物學(xué)研究尤其是人類基因組計劃的迅速發(fā)展，大量關(guān)于基因結(jié)構(gòu)的信息不斷涌現(xiàn)，對這些信息進(jìn)行系統(tǒng)研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。這不僅需要利用計算機(jī)進(jìn)行生物信息學(xué)的分析和預(yù)測，而且必須結(jié)合生物學(xué)實驗獲取證據(jù)。為適應(yīng)同時對多個基因或蛋白進(jìn)行研究的發(fā)展趨勢，已出現(xiàn)了很多新技術(shù)，如DNA微陣列技術(shù)（DNA micoarry）,基因表達(dá)的系列分析（SAGE）,肽質(zhì)譜分析法，蛋白雙向膠電泳技術(shù)及酵母雙雜交技術(shù)（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母雙雜交技術(shù)以其簡便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用等特點在基因功能的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。酵母雙雜交技術(shù)的基本原理

1989年，Song和Field建立了第一個基于酵母的細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白間相互作用的遺傳系統(tǒng)〔1〕。很多真核生物的位點特異轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個可分割開的結(jié)構(gòu)域，即DNA特異結(jié)合域（DNA-binding domain，BD）與轉(zhuǎn)錄激活域（Transcriptional activation domain，AD）。這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時含有這兩個結(jié)構(gòu)域,否則無法完成激活功能。不同來源激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則特異地激活被BD結(jié)合的基因表達(dá)。基于這個原理，可將兩個待測蛋白分別與這兩個結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白，并共表達(dá)于同一個酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個待測蛋白間能發(fā)生相互作用，就會通過待測蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報告基因表達(dá)。通過對報告基因表型的測定可以很容易地知道待測蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。

酵母雙雜交系統(tǒng)由三個部分組成：(1)與BD融合的蛋白表達(dá)載體，被表達(dá)的蛋白稱誘餌蛋白(bait)。(2)與AD融合的蛋白表達(dá)載體，被其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey)。(3)帶有一個或多個報告基因的宿主菌株。常用的報告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應(yīng)的缺陷型。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營養(yǎng)標(biāo)記基因。這些有利于實驗后期雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。根據(jù)目前通用的系統(tǒng)中BD來源的不同主要分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng)。后者因其BD來源于原核生物，在真核生物內(nèi)缺少同源性，因此可以減少假陽性的出現(xiàn)。酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

酵母雙雜交技術(shù)產(chǎn)生以來，它主要應(yīng)用在以下幾方面：(1）檢驗一對功能已知蛋白間的相

互作用。(2）研究一對蛋白間發(fā)生相互作用所必需的結(jié)構(gòu)域。通常需對待測蛋白做點突變或缺失突變的處理。其結(jié)果若與結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究結(jié)合則可以極大地促進(jìn)后者的發(fā)展。(3)用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫，以研究蛋白質(zhì)之間相互作用的傳遞途徑。(4)分析新基因的生物學(xué)功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫。然后根據(jù)釣到的已知基因的功能推測該新基因的功能。常見問題的解決與改進(jìn)

酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用中常遇到的問題一是假陽性較多，二是轉(zhuǎn)化效率偏低。所謂假陽性就是:在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下,報告基因被激活。主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用,或者這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合,則也可單獨激活報告基因的表達(dá)。因此,為排除假陽性就需要作嚴(yán)格的對照試驗。應(yīng)對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。目前幾個公司推出的酵母雙雜系統(tǒng)都采用了多個報告基因,且每個報告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同,這可減少大量的假陽性。另外,報告基因通常整合到染色體上,可以使基因表達(dá)水平穩(wěn)定,消除了由于質(zhì)?？截悢?shù)變化引起基因表達(dá)水平波動而造成的假陽性。即使根據(jù)嚴(yán)格的對照實驗證明確實發(fā)生了蛋白間的相互作用，還應(yīng)對以下方面進(jìn)行分析：

(1)這種相互作用是否會在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生,即這一對蛋白在細(xì)胞的正常生命活動中是否會在同一時間表達(dá)且定位在同一區(qū)域。

（2)某些蛋白如是依賴于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員,它們具有普遍的蛋白間的相互作用的能力。

（3)一些實際上沒有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個親a-螺旋的蛋白質(zhì)間可以發(fā)生相互作用。十年來,酵母雙雜交技術(shù)一直在消除假陽性方面不斷改進(jìn),并且已取得較好的效果。

在酵母雙雜交的應(yīng)用中有時也會遇到假陰性現(xiàn)象。所謂假陰性，即兩個蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用,但報告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測不出來。造成假陰性的原因主要有兩 方面：一是融合蛋白的表達(dá)對細(xì)胞有毒性。這時應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。二是蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現(xiàn)象雖不是實驗中的主要問題,但也應(yīng)予以重視。

轉(zhuǎn)化效率是酵母雙雜交文庫篩選時成敗的關(guān)鍵之一，特別是對低豐度cDNA庫進(jìn)行篩選時，必須提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時可采用共轉(zhuǎn)化或依次轉(zhuǎn)化，相比之下共轉(zhuǎn)化省時省力。更重要的是如果單獨轉(zhuǎn)化會發(fā)生融合表達(dá)蛋白對酵母細(xì)胞的毒性時,共轉(zhuǎn)化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型的單倍體酵母中,通過兩種接合型單倍體細(xì)胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個二倍體細(xì)胞。目前很多機(jī)構(gòu)建立了大量的cDNA文庫和基因組文庫，但這些文庫大多無法直接用于雙雜交系統(tǒng)的篩選。而文庫的質(zhì)量對于轉(zhuǎn)化和篩選又非常關(guān)鍵。因此，大量構(gòu)建適用于酵母雙雜交的文庫非常必要。現(xiàn)已出現(xiàn)一種采用體內(nèi)重組技術(shù)來達(dá)到這個目的的方法。酵母雙雜交技術(shù)的新發(fā)展

酵母雙雜交技術(shù)在應(yīng)用中發(fā)揮了巨大的作用，但人們也注意到了它有一定的局限性。為此發(fā)展了多種適應(yīng)不同目的需要的改型的雙雜交技術(shù)。

反向雙雜交技術(shù) 在研究中檢測并鑒定出那些能阻斷兩個蛋白間相互作用的因素有重要意義。在研究那些能使相互作用被阻斷的因素(如尋找哪些結(jié)構(gòu)域上發(fā)生突變可使相互作用中

斷或那些分子可以阻斷相互作用)時，傳統(tǒng)的雙雜交技術(shù)有較大的局限性。因此，反向雙雜交系統(tǒng)(Reverse Two-Hybrid System)應(yīng)運(yùn)而生。這項技術(shù)的特點是采取了反選擇篩選策略。根據(jù)反選擇設(shè)計的不同，大致可以分為兩類。一類是用便于反選擇的URA3或CYH2基因作為報告基因。URA3基因編碼尿嘧啶合成途徑中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)，使細(xì)胞無法生長。反之，在能生長的細(xì)胞中，外界因素已使蛋白間的相互作用不能發(fā)生，而我們想知道的正是這些因素。因此，只要對存活的克隆進(jìn)行檢測就可以得到結(jié)果。Vidal等人用這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)了影響轉(zhuǎn)錄因子E2F1中與DP1相互作用必需區(qū)內(nèi)的點突變。另一類是將常規(guī)報告基因(如HIS3)置于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn10編碼的tet-抑制因子(TetR)/操縱基因控制之下。待測蛋白之間發(fā)生相互作用后首先激活tet-R基因表達(dá)抑制因子TetR,TetR結(jié)合到tet操縱基因后就抑制了報告基因的表達(dá)，結(jié)果轉(zhuǎn)化子不能生長。只有當(dāng)待測蛋白之間的相互作用被某種因素所阻斷而無法激活tet-R基因時，報告基因才能擺脫tet操縱基因的控制而表達(dá)，使轉(zhuǎn)化子獲得在選擇培養(yǎng)基上生長的能力。Shih 等人利用這種方法鑒定出cAMP-應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位點的Ser133突變會阻斷其與輔助激活因子(CREB結(jié)合蛋白)的相互作用。

三雜交技術(shù) 在許多細(xì)胞內(nèi)信號傳遞過程中，兩個蛋白間的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究這些大分子對蛋白間相互作用的影響過程中發(fā)展了一種新的技術(shù)系統(tǒng)——三雜交系統(tǒng)(Three-Hybrid System)，其本質(zhì)與雙雜交是相同的，只是需通過第三個分子的介導(dǎo)把兩個雜交蛋白帶到一起。例如小配體三雜交系統(tǒng)(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以滲透的二聚體化學(xué)誘導(dǎo)物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作橋梁，將AD和BD融合蛋白連接到一起，激活報道基因的表達(dá)。研究較多的是免疫抑制劑FK506。Belshaw等將FK506與環(huán)孢菌素A(Cyclosporin

A)構(gòu)建成異源二聚體，它能把分別與FK506和環(huán)孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活報告基因。Licitra將FK506與地米塞松(dexamethasone)通過共價鍵連接成二聚體。通過實驗進(jìn)一步證實了FK506與蛋白FKBP-12間的特異性相互作用，表明用這種方法鑒定蛋白與小分子間的相互作用是切實可行的。RNA與蛋白之間的相互作用是許多細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ)，例如mRNA的翻譯，早期發(fā)育以及RNA病毒的感染等。然而可用于這方面研究的簡便方法卻很少。RNA三雜交系統(tǒng)(RNA Three-Hybrid System)的建立為分析RNA與蛋白之間的相互作用提供了有效的手段。這個系統(tǒng)主要是由一個RNA分子和兩個都能結(jié)合該RNA的蛋白質(zhì)組成。此RNA的一部分與一個已知蛋白結(jié)合后就可利用它的另一部分去篩選新的RNA結(jié)合蛋白。因此這種技術(shù)既可檢測由RNA介導(dǎo)的兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可篩選鑒定新的蛋白結(jié)合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突變體RevM10與Gal4 DB域融合作為誘餌蛋白，利用該RevM10蛋白能識別并結(jié)合其靶RNA中Rev蛋白反應(yīng)元件(Rev responsive element,RRE)的作用去篩選同樣也能與此RNA結(jié)合并已與Gal4 AD域融合的未知蛋白。根據(jù)同樣的原理，如將一個已知RNA與RRE融合形成雜合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作為誘餌，便可用于篩選該RNA結(jié)合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌體衣殼蛋白能識別結(jié)合其基因組內(nèi)一種21核苷酸的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特性，將RNA噬菌體衣殼蛋白與Lex DB域融合，構(gòu)建成可用于尋找體內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白的酵母三雜交系統(tǒng)。

核外雙雜交技術(shù) 在傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)中，蛋白之間的相互作用是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的。因此,它不能檢測某些在核外蛋白之間的相互作用。為了克服這種局限性，近年來有人建立了核外雙雜交技術(shù)。其中SRS 和USPS就是這種技術(shù)的兩個代表。SRS也稱Sos蛋白召集系統(tǒng)(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分別將待測蛋白X與哺乳動物細(xì)胞的一種鳥苷交換因子(EGF)Sos蛋白融合；將Y蛋白與錨定在酵母細(xì)胞膜上的Src肉豆寇烯化信

號蛋白融合，并使它們共表達(dá)于一個cdc25-2基因溫度敏感型突變的酵母菌株內(nèi)。由于該菌株中cdc25-2基因編碼的EGF蛋白在36℃條件下不能激活細(xì)胞膜上的Ras蛋白，Ras途徑不通。所以細(xì)胞無法在36℃條件下生存。但如果待測蛋白X與Y之間發(fā)生相互作用就能把Sos蛋白帶到細(xì)胞膜上并激活附近的Ras蛋白，從而打通Ras途徑，使該菌株獲得在36℃條件下生存的能力。Aronheim等用此技術(shù)鑒別出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分離到了一個AP-1抑制因子JDP2。USPS也稱為基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的設(shè)計是根據(jù)這樣一個事實，即真核細(xì)胞中遍在蛋白與某一蛋白之間新生成的融合會被遍在蛋白特異的蛋白酶(UBPs)迅速切開，但這種切割只有當(dāng)遍在蛋白正確折疊時才會發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，遍在蛋白基因的N端和C端這兩部分即使分離，只要共表達(dá)與同一個細(xì)胞內(nèi)，它們?nèi)阅苷_折疊。將待測蛋白X與帶有點突變的遍在蛋白N端片段融合，將待測蛋白Y與下游接有報告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它們共表達(dá)與同一個細(xì)胞內(nèi)。因遍在蛋白N端片段內(nèi)含有點突變，它與C端片段之間不能自然形成正確的折疊。只有當(dāng)?shù)鞍譞和Y之間發(fā)生相互作用時才能克服點突變的影響，使遍在蛋白的兩端形成正確折疊，從而引來UBPs切除與C端片段連接的報告蛋白。此技術(shù)建立之初是通過Western blot檢測有無被切下的報告蛋白來判斷待測蛋白之間是否發(fā)生了相互作用的，所以操作比較繁瑣，不便于推廣。最近有人對它作了改進(jìn)，以一種融合的轉(zhuǎn)錄激活因子PLV作為報告蛋白。PLV一旦被從遍在蛋白C端片段上切下，它就會進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活特定的報告基因，如：LacZ 和HIS3等。這樣就可以根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞是否生長及顯色來判斷待測蛋白之間有無相互作用。因此極大地簡化了操作步驟，提高了篩選效率。酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展與應(yīng)用的趨勢

在后基因組時代更具意義且更能發(fā)揮酵母雙雜交技術(shù)的領(lǐng)域是研究生命活動中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。第一個具有開拓性的工作是Bartel利用酵母雙雜交技術(shù)建立了一個T7-噬菌體的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)圖(linkage-map)。Fromont-Racine等對篩選到的陽性克隆進(jìn)行鑒定測序，并將它們分為5類，然后對其中的四類(非編碼序列除外)通過15輪的篩選與分析，繪制出一張綜合了酵母蛋白相互作用的全局性信息圖。這是以往的實驗所難以獲得的。

為適應(yīng)功能基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大學(xué)的EST項目研究成果基礎(chǔ)上，采用了與傳統(tǒng)建庫方式完全不同的細(xì)胞內(nèi)同源重組方法，以高通量規(guī)模構(gòu)建了一種陣列模式的酵母雙雜交cDNA文庫。它主要有以下特點：

(1)來源于多種組織器官和細(xì)胞系，因此含有幾乎所有基因的cDNA；

（2）所含各種cDNA的豐度趨于平衡；

（3)含有較長的插入序列，但不是全長cDNA序列。

這樣既避免了5’非編碼區(qū)可能存在的終止密碼阻礙融合蛋白的翻譯，又保證了表達(dá)出的蛋白構(gòu)象接近于天然。這種建庫方法不僅減少了工作量，而且在雙雜交中新發(fā)現(xiàn)的相互作用蛋白種類也明顯增多。

最后，有必要指出的是，酵母雙雜交技術(shù)必須與其它技術(shù)結(jié)合才能有利于對實驗結(jié)果作出更為完整和準(zhǔn)確的判斷。

胡文峰

2007040380106