微生物利用甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的研究

輕工技術(shù)與工程

2111805077**

摘要：甘油可以參與氧化、酯化、硝化、醚化、胺化和鹵化等多種化學(xué)反應(yīng)，將廉價(jià)的甘油轉(zhuǎn)化為高附加值的化工產(chǎn)品。二羥基丙酮由于具有較高的附加值，有較大的市場需求，己成為甘油轉(zhuǎn)化研究的熱點(diǎn)。微生物利用生物柴油副產(chǎn)品甘油生產(chǎn)DHA是可行的，本文研究了包括生物柴油副產(chǎn)品甘油中離子對弗托氏葡糖桿菌CGMCC5397生產(chǎn)DHA的影響及甘油的預(yù)處理。最后對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行7L罐分批和補(bǔ)料發(fā)酵研究。

關(guān)鍵詞:甘油；1,3-二羥基丙酮；微生物法

前言

微生物能夠利用生物柴油副產(chǎn)品甘油生產(chǎn)甲醇、丙二醇等己被研究，同樣利用生物柴油副產(chǎn)品甘油生產(chǎn)DHA也是可行的，但生物柴油副產(chǎn)品甘油中含有金屬離子，毒性有機(jī)物等可阻礙或抑制甘油脫氫酶活性，從而導(dǎo)致微生物不能利用甘油生產(chǎn)DHA，為消除這些影響，必須對生物柴油副產(chǎn)品甘油中有害物質(zhì)進(jìn)行研究，并建立一套簡單處理方法除去生物柴油副產(chǎn)品甘油中毒性物質(zhì)，使微生物能有效利用其生產(chǎn)DHA。

二羥基丙酮概況

2.1

DHA的理化性質(zhì)

1,3-二羥基丙酮(1,3-dihydroxyacetone)或稱為羥基丙酮(dihydroxyacetone)，簡稱DHA,是自然界存在最簡單的三碳酮糖，它具有甜、涼的味道，外觀為白色或類似白色的粉末狀結(jié)晶，空氣中放置容易吸濕，吸濕后容易分解。1,3-二羥基丙酮是一種重要的化工制造原料，是合成醫(yī)藥、農(nóng)藥等方面的重要中間體和多功能食品添加劑，其用途很廣泛。

2.2

甘油及其應(yīng)用

甘油作為基本化工原料，廣泛應(yīng)用于多個(gè)行業(yè)近2000多個(gè)產(chǎn)品。各行業(yè)使用比例為醫(yī)藥6%，化妝品5%，煙草6%，涂料36%，牙膏35%，其他12%。甘油可以參與氧化、酯化、硝化、醚化、胺化和鹵化等多種化學(xué)反應(yīng)，將廉價(jià)的甘油轉(zhuǎn)化為高附加值的化工產(chǎn)品。在一定條件和催化劑作用下甘油經(jīng)選擇性氧化生成甘油酸和二羥基丙酮。經(jīng)脫水生成丙烯醛，經(jīng)發(fā)酵或氫解生成1，3-丙二醇、經(jīng)氫解生成1，2一丙二醇、經(jīng)重整生成合成氣以及碳酸甘油和縮水甘油等。其中二羥基丙酮由于具有較高的附加值，有較大的市場需求，己成為甘油氧化轉(zhuǎn)化研究的熱點(diǎn)。甘油有兩種不同的羥基結(jié)構(gòu)，而這種結(jié)構(gòu)使其易被氧化，然而不同的反應(yīng)條件或者催化劑對兩種羥基選擇性不同。將甘油作為原料進(jìn)行下游產(chǎn)品生產(chǎn)的主要過程如圖1所示。

2.3

DHA應(yīng)用

(1)二羥基丙酮分子中含有三個(gè)官能團(tuán)，化學(xué)性質(zhì)活潑，廣泛參與諸如聚合、縮合等各種化學(xué)反應(yīng)，是一種重要的化學(xué)合成的中間體，也是一個(gè)重要的多功能試劑，如能有效地參與從甲醛到羥醛、羥酮的縮合反應(yīng)。

(2)二羥基丙酮廣泛應(yīng)用于化妝品中，二羥基丙酮能阻止皮膚水分的過度蒸發(fā)，對皮膚起到保濕和防曬作用。二羥基丙酮又是一種良好的著色劑，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含有二羥基丙酮的乳液涂抹在皮膚上可與皮膚表面的氨基酸反應(yīng)，不需曬太陽就可以產(chǎn)生古銅色的皮膚。二羥基丙酮還可以作為良好的白癱風(fēng)遮蓋劑。在制革工業(yè)中，二羥基丙酮也可作為皮革制品的保護(hù)劑。

（3)二羥基丙酮是一種重要的醫(yī)藥中間體和藥物，現(xiàn)已應(yīng)用于低血糖和糖尿病及某些皮膚病的治療。此外，以1,3一二羥基丙酮衍生物為中間體合成的一些化合物表現(xiàn)出一定的抗病毒活性，如抗艾滋病病毒等。

（4）應(yīng)用于食品行業(yè)。被嘗試作為保健和功能性食品添加劑,并且DHA具有特殊甜味，有人用其作為一些食品的風(fēng)味添加劑和食品果蔬的。具有抗肥胖作用，補(bǔ)充DHA能夠有效地促進(jìn)人體脂肪的分解并抑制脂肪合成。

實(shí)驗(yàn)材料與方法

3.1實(shí)驗(yàn)材料

3.1.1

實(shí)驗(yàn)菌種

供試菌種:由本實(shí)驗(yàn)室篩選出菌種:弗托氏葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter

frateurii)HD924，中國微生物菌種保藏中心保藏號:CGMCC

5397

3.1.2

培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):甘油50，酵母粉15,KH2P043，瓊脂20,pH

6.0

一級種子培養(yǎng)基(g/L):甘油50，酵母粉15,KH2P043,pH

6.0

二級種子培養(yǎng)基(g/L):甘油30，酵母粉10,KH2P043,pH

6.0

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油100，酵母粉10,KH2P043,pH

6.0

發(fā)酵罐補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L）:甘油20，玉米漿15,KH2P043,pH

6.0

以上培養(yǎng)基均121℃,20

min高壓蒸汽滅菌。

3.1.3

其他材料

（1）生物柴油副產(chǎn)品甘油來源及性質(zhì)

生物柴油副產(chǎn)品甘油，以地溝油為原料油通過酯交換工藝制成長鏈脂肪酸和甘油，甘油含量為53%，各種離子含量分別為SO42-4.39%、Mg2+53

ppm、Zn2+1848

mg/L、Ca2+

2800

ppm、K+

315

ppm、Fe2+1730

ppm、Fe3+1800

ppm、Cl-4800

ppm、pH

1.1。

（2）生物柴油副產(chǎn)品甘油預(yù)處理

mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.9，沉淀8

h，抽濾，濾液分別過732陽離子交換樹脂，D315陰離子交換樹脂，流速為2

mL/min，稀釋為10%甘油含量溶液待用。

（3）搖瓶發(fā)酵

取冷凍管保藏菌株接于裝液量為30

mL一級種子培養(yǎng)基的250

mL錐形瓶，30℃,220

rpm搖床培養(yǎng)24

h,5%接種量接二級種子，同上條件培養(yǎng)9h，接裝液量為30

mL發(fā)酵培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)48

h，測DHA含量。

3.2

分析檢測方法

①DHA檢測方法:本文選取分光光度法和液相兩種方法測定發(fā)酵液中DHA含量。

②甘油檢測方法:采用HPLC法測定甘油含量。測定條件同DHA，檢測器為RI檢測器。

③菌體量測定方法:采用比濁法，菌液用2%稀鹽酸稀釋10倍后在560

nm處測定吸光值。

結(jié)果與討論

4.1

不同離子對弗托氏葡糖桿菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA的影響

以純甘油為碳源，按照搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成份配制培養(yǎng)基，另外配制培養(yǎng)基時(shí)以生物柴油副產(chǎn)品甘油中各種離子含量比例分別加入相應(yīng)的無機(jī)鹽配制成含有不同離子的發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)條件培養(yǎng)48

h，測各物質(zhì)含量。

表1

不同離子對發(fā)酵生產(chǎn)DHA影響

Fe3+、Fe2+、SO42-、Ca2+、Zn2+對菌體生長均有抑制作用，特別是Zn2+幾乎完全抑制菌體生長及轉(zhuǎn)化甘油。由此見，要使弗托氏葡糖桿菌利用甘油生產(chǎn)DHA，必須對甘油進(jìn)行預(yù)處理，除去其中的金屬離子和毒性有機(jī)物質(zhì)。

圖2

Zn2+、SO42-不同濃度對發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響

圖3

Fe3+、Fe2+不同濃度對發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響

Zn2+含量升高，菌體量和DHA濃度呈現(xiàn)先緩慢升高，當(dāng)濃度大于100

mg/L時(shí)DHA生成量迅速降低，F(xiàn)e3+、Fe2+、SO42-隨著發(fā)酵液離子濃度的升高，DHA濃度逐漸降低。

4.2

生物柴油副產(chǎn)品甘油預(yù)處理對生產(chǎn)DHA的影響

調(diào)節(jié)pH7.9使Fe2+

Fe3+及一些酸性蛋白、雜質(zhì)充分沉淀，抽濾除去沉淀物，通過離子交換樹脂除去其他一些離子及可溶性蛋白。每步處理后，取此步處理后甘油配制發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵后測DHA。

表2

不同處理對DHA生產(chǎn)影響

甘油中離子強(qiáng)度逐漸降低，經(jīng)732陽離子交換樹脂處理后離子強(qiáng)度為3278

us/cm，降低了97%，處理后甘油按發(fā)酵培養(yǎng)基組分配制，搖瓶發(fā)酵后，DHA含量由未處理時(shí)的不產(chǎn)DHA提高到72

g/L。

4.3

不同氮源對發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響

圖4

不同氮源對發(fā)酵生產(chǎn)DHA的影響

該菌對硫酸按，硫酸鉀，尿素等無機(jī)氮源的同化能力較差，該菌對牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿等同化能力較好，以此作氮源能有效促進(jìn)菌體生長和DHA合成。以玉米漿為氮源的DHA產(chǎn)量最高達(dá)75.63

g/L，酵母膏和牛肉膏次之，分別為69.4

g/L和61.6

g/L。

4.4

初始甘油濃度的影響

圖5

不同甘油濃度對發(fā)酵DHA的影響

當(dāng)甘油濃度為20

g/L時(shí)，生物量最大為9.23，由于甘油濃度過低，轉(zhuǎn)化生成DHA濃度很低，隨著甘油濃度不斷增加，DHA產(chǎn)量不斷變大，而菌體量趨于平衡，當(dāng)甘油濃度為100

g/L時(shí)DHA達(dá)到最大70.87

g/L。隨著甘油濃度不斷增加，高濃度底物甘油及有毒金屬離子濃度增大，菌體生長受到抑制，菌體量不斷降低，DHA產(chǎn)量也不斷降低。

4.5

處理后生物柴油副產(chǎn)品甘油與純甘油發(fā)酵罐分批發(fā)酵比較

在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，純甘油和處理后生物柴油副產(chǎn)品甘油在7L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。初始甘油濃度為100

g/L,30℃下，通氣量為2vvm，發(fā)酵48h。

圖6

生物柴油甘油和純甘油7L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn)DHA

菌體在32

h時(shí)生長達(dá)最大，發(fā)酵結(jié)束時(shí)DHA濃度為77.2

g/L。純甘油發(fā)酵時(shí)，菌體增長與生物柴油副產(chǎn)品甘油相似，最大菌體量略高，發(fā)酵結(jié)束后DHA濃度為88.9

g/L。甘油剩余量只有5.9

g/L。表明生物柴油副產(chǎn)品甘油中可能仍含有一些有毒物質(zhì)，抑制DHA合成。為降低抑制作用可進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵。

4.6處理后生物柴油副產(chǎn)品甘油補(bǔ)料分批發(fā)酵

在分批發(fā)酵的過程中，底物的抑制作用是影響弗托氏葡糖桿菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA的主要因素，因此在發(fā)酵過程采取補(bǔ)料分批發(fā)酵，即初始底物濃度較低，一段時(shí)間后加入一定量底物，使底物一直保持在一個(gè)相對較低的濃度，這樣菌體就能快速生長，并且穩(wěn)定期得到延長，底物抑制作用降低，轉(zhuǎn)化效率提高。

圖7

生物柴油副產(chǎn)品甘油補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)DHA

經(jīng)過48

h，生物量達(dá)到最大8.37，發(fā)酵結(jié)束后DHA產(chǎn)量為87.1

g/L,，比分批發(fā)酵提高22.9%。

4.7棕櫚油生物柴油副產(chǎn)物甘油來源分批及補(bǔ)料分批發(fā)酵

棕櫚油生產(chǎn)生物柴油副產(chǎn)品甘油進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵且金屬離子和雜質(zhì)較少。

圖8

棕櫚油生物柴油副產(chǎn)品甘油補(bǔ)料分批發(fā)酵

發(fā)酵前8h，菌體量迅速增加，并于8h達(dá)到最大，發(fā)酵48h后，DHA產(chǎn)量達(dá)到125.8

g/L。由此可知，棕櫚油生物柴油副產(chǎn)品甘油進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)DHA時(shí)，雜質(zhì)對菌體生長抑制較弱，DHA能得到高效生產(chǎn)。

討論與展望

（1）

本文對生物柴油副產(chǎn)品甘油用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA的可行性的研究，通過對甘油性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，其本身pH過低，離子強(qiáng)度過大，尤其是Zn2+對菌體的生長及轉(zhuǎn)化的抑制非常明顯，不適合進(jìn)行生產(chǎn)DHA。

（2）通過一定方法預(yù)處理后，生物柴油副產(chǎn)品甘油可以進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)DHA。通過對不同氮源，及初始甘油濃度的研究可知最適氮源為玉米漿，最佳初始甘油濃度為100

g/L。

（3）選取棕櫚油生物柴油副產(chǎn)品甘油分批補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)，甘油雜質(zhì)較少，轉(zhuǎn)化高效，最終DHA產(chǎn)量能達(dá)到125.8

g/L。

參考文獻(xiàn)

[1]Liu

Yu-Peng,Sun

Yang,Tan

Cong,Li

Hua,Zheng

Xiao-Juan,Jin

Kui-Qi,Wang

Gang.Efficient

production

of

dihydroxyacetone

from

biodiesel-derived

crude

glycerol

by

newly

isolated

Gluconobacter

frateurii.[J].Bioresource

technology,2013,142.[2]馬駿.微生物法生產(chǎn)二羥基丙酮[D].浙江工業(yè)大學(xué),2009.[3]許曉菁,陳詢,晉明芬,武曉煒,王祥河.微生物法生產(chǎn)二羥基丙酮的研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào),2009,25(06):903-908.[4]李堯.微生物發(fā)酵生產(chǎn)二羥基丙酮的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].四川食品與發(fā)酵,2007(05):20-23.[5]林曦,陳建華.1,3二羥基丙酮微生物法生產(chǎn)研究進(jìn)展[J].輕工科技,2016,32(07):10-11+30.[6]鄭小娟.弗托氏葡萄糖酸桿菌轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮的條件優(yōu)化[D].河南大學(xué),2015.附英文文獻(xiàn)：

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