第一篇：微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂研究進(jìn)展

微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂研究進(jìn)展

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摘要: 微生物發(fā)酵產(chǎn)生油脂是開拓油脂新資源的一條好途徑。簡要地介紹了產(chǎn)生油脂微物生資源的探索, 微生物發(fā)酵產(chǎn)生油脂的優(yōu)點, 特種油脂的功能, 培養(yǎng)條件等因素對微生物產(chǎn)生油脂的影響及微生物產(chǎn)生油脂過程中的生化研究。

關(guān)鍵詞: 微生物；發(fā)酵；油脂

一 前言

目前，用于生產(chǎn)油脂的原料主要來源于石油和動植物等, 而石油儲藏量卻在逐年減少, 動植物的養(yǎng)殖業(yè)和種植業(yè)日益飽和, 因比多渠道開發(fā)其他油脂資源就成為必然。經(jīng)過幾十年來科技工作者的共同努力, 已探明微生物發(fā)酵產(chǎn)生油脂是開拓油脂新資源的一條好途徑。

二 產(chǎn)油脂微生物資源的探索

微生物產(chǎn)生油脂研究已有半個多世紀(jì)的歷史。第二次世界大戰(zhàn)期間,由于連年戰(zhàn)火，油脂奇缺，德國科學(xué)家們就開始了微生物生產(chǎn)油脂的研究工作，并發(fā)現(xiàn)了高產(chǎn)油脂的斯達(dá)油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)，粘紅酵母屬(Rhodotorulaglutinis)，曲霉屬(Aspergillus)以及毛霉屬(Mucor)等微生物。80年代初，日本成功地建立了發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)長鏈二元酸的新技術(shù)，結(jié)束了以蓖麻油裂解合成十三碳二元酸的歷史。1986年，日本和英國等國家率先推出含微生物γ-亞麻酸(GLA)油脂的保健食品、功能性飲料和高級化妝品等產(chǎn)品，微生物油脂實用化已邁出了第一步[1]。之后我國上海工業(yè)微生物研究所也利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)了GLA。

進(jìn)入90年代，特種油脂的發(fā)展越來越受人們的重視。羅玉萍等[2]分離到一株高產(chǎn)棕櫚油酸的酵母，總脂中棕櫚油酸含量高達(dá)50.14%。Matsunaga等篩選到兩株Cyanobacteria總脂中棕櫚油酸的含量分別達(dá)54.4%和54.5%。這些工作為利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)棕櫚油酸提供了廣闊的前景；Stewdansk和Radevan分別篩選到產(chǎn)生花生四烯酸(AA)的真菌,它們總脂中AA的含量達(dá)到42%～55%[3,4]；1996年Yazawa[5]從Pacificmarkarel的腸內(nèi)容物中分離到一株叫SCRC—2378的海生細(xì)菌，能產(chǎn)生一種多烯不飽和酸，即二十碳五烯酸(EPA)，其產(chǎn)量達(dá)24%～40%，被認(rèn)為是EPA 的一種新資源。1996年Nakahara等從海水中分離到一株Schizochytriumsp.SR21，其二十二碳六烯酸(DHA)產(chǎn)量達(dá)到每天2g/L。1996年Singh等在優(yōu)化培養(yǎng)基上對Thraustochytrium ATCC28210 進(jìn)行培養(yǎng)，5d后DHA產(chǎn)量達(dá)到1061mg/L。研究者還發(fā)現(xiàn)某些海藻和硅藻也能生產(chǎn)出較高產(chǎn)量的EPA 和DHA[6]。據(jù)文獻(xiàn)報道，產(chǎn)特種油脂的微生物主要有三類，即真菌、藻類和細(xì)菌等。

三 微生物發(fā)酵產(chǎn)生油脂的優(yōu)點及特種油脂的功能

微生物發(fā)酵產(chǎn)生油脂是一條開發(fā)新油源的好途徑。微生物適應(yīng)性強，生長繁殖迅速，生長周期短，代謝活力強，易于培養(yǎng)，生活所占空間小，不受原料和產(chǎn)地的限制等。另外，通過微生物發(fā)酵也能把一些農(nóng)副產(chǎn)品及其廢棄物等碳水化合物轉(zhuǎn)換為可利用的油脂，在環(huán)境衛(wèi)生方面具有現(xiàn)實的意義。

利用微生物發(fā)酵法可以得到各種類型的脂肪酸。有單烯不飽和酸，如棕櫚油酸等；多烯不飽和酸,如亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等；及羥基脂肪酸、支鏈脂肪酸等。這些脂肪酸的功能主要可歸納為以下幾個方面：抗炎癥作用[7]；抑制腫瘤細(xì)胞的形成、擴散和轉(zhuǎn)移[8]；預(yù)防和治療心血管疾病，尤其是糖尿病患者的心血管疾病[9]；降血脂、降血壓等功能[10]；多不飽和酸還能調(diào)節(jié)皮膚正常的生理功能, 具有護(hù)膚作用等。

四 培養(yǎng)條件等因素對微生物產(chǎn)生油脂的影響

實驗證明, 不同種屬的微生物其產(chǎn)油脂量、油脂成分及含量各不相同。而就同一種微生物菌株，在不同培養(yǎng)條件下,其產(chǎn)油脂量、油脂成分及含量也不盡相同。與此相關(guān)的培養(yǎng)條件主要有碳源、氮源、溫度等，其中以碳源的影響為最大。

4.1 碳源對產(chǎn)生油脂的影響

微生物高產(chǎn)油脂的一個關(guān)鍵因素，就是培養(yǎng)基中碳源充足而其他營養(yǎng)成分缺乏，在這種狀況下, 微生物菌株主要將過量的碳水化合物轉(zhuǎn)化為脂類。目前發(fā)酵生產(chǎn)食用級脂類的碳源主要有葡萄糖、淀粉、糖蜜和乙醇等。但通常采用的碳源是葡萄糖, 因為葡萄糖作為碳源所生產(chǎn)的菌體生物量高，且產(chǎn)脂量也高。

4.2 氮源及碳氮比對產(chǎn)生油脂的影響

氮源的作用是促進(jìn)細(xì)胞的生長, 在嚴(yán)重缺氮的條件下，可觀察到細(xì)胞內(nèi)脂類的積累。趙人俊等[11]在研究被孢霉M14菌株產(chǎn)脂條件時，認(rèn)為無機氮有利于不飽和脂肪酸產(chǎn)生，有機氮有利于細(xì)胞增殖，低C/N比有利于菌絲體產(chǎn)量的提高，高C/N比則促進(jìn)菌體細(xì)胞內(nèi)的油脂合成。

4.3 溫度對產(chǎn)生油脂的影響

溫度調(diào)節(jié)脂肪酸成分，是由于細(xì)胞對外界溫度變化的一種適應(yīng)性反應(yīng)。通常情況下不飽和脂肪酸的熔點比飽和脂肪酸低, 短鏈脂肪酸比長鏈脂肪酸低。因此當(dāng)菌株從高溫轉(zhuǎn)移到低溫生長時，細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸及短鏈脂肪酸含量增加，主要是棕櫚油酸或油酸等含量的增加；而當(dāng)溫度升高時，平均鏈長就增長。這些變化都是為了保證細(xì)胞膜的正常流動性和通透性[12]。

4.4 其他因素對產(chǎn)生油脂的影響

Cohen等發(fā)現(xiàn)有幾種吡定族的除草劑能抑制脂肪酸去飽和，SAN9785是ω3脫飽和的最有效抑制劑。1996年Khozin等研究表明，除草劑SAN9785能降低Red alga 和Porphyridiumcruentum的EPA產(chǎn)量, 卻同時又能將Eustigmatohyte和Monodussubterraneus的EPA產(chǎn)量從54%增到81%。pH 值的變化對微生物產(chǎn)生油脂的影響也較大，一般最適產(chǎn)生油脂的pH值與其最適生長pH值相一致。不同的干燥方式也能影響脂肪酸成分的變化[13]。實驗還證明，NaCl濃度、菌體稀釋率、苯酚濃度、日照等對一些菌株產(chǎn)生油脂也有影響[6,12,14]。

微生物產(chǎn)生油脂過程的生化研究微生物產(chǎn)生油脂過程與動植物產(chǎn)生油脂過程相似，都是從乙酰CoA羧化酶催化羧化的反應(yīng)開始，然后經(jīng)過多次鏈延長，或再經(jīng)過去飽和作用等完成了整個生化過程。在此過程中, 有兩個主要的催化酶，即乙酰CoA 羧化酶和去飽和酶。乙酶CoA 羧化酶催化脂肪酸合成的第一步，是第一個限速酶。此酶是由多個亞基組成的復(fù)合酶，以生物素作為輔基。乙酰CoA 羧化酶結(jié)構(gòu)中有多個活性位點，如乙酰CoA 結(jié)合位點，ATP 結(jié)合位點，生物素結(jié)合位點等等。因此該酶能為乙酰CoA、ATP和生物素所激活。ADP 是該酶AT P 的競爭性抑制劑，抗生物素蛋白作用于生物素而抑制了該酶的活性，丙二酸單酰CoA 起反饋抑制作用。另外，丙酮酸鹽對該酶有輕微的激活作用，磷酸鹽對該酸的活性有較低程度的抑制。去飽和酶是微生物通過氧化去飽和途徑生成不飽和酸的關(guān)鍵酶。去飽和作用是由一個復(fù)雜的去飽和酶系來完成的。70年代中期，科研人員就發(fā)現(xiàn)酵母微粒體中的去飽和酶系主要由三個酶組成，即NADH—Cytb5還原酶，Cytb5和末端去飽和酶。NADH—Cytb5還原酶是一種黃素蛋白，其催化作用是將電子從NA DH傳至Cytb5。Cytb5只作為去飽和酶的電子供體，對去飽和并未起到實質(zhì)性的作用，而去飽和酶才是產(chǎn)生不飽和酸的關(guān)鍵。在脂肪酸鏈延長機理方面，人們也作了一些探索。Heath等[15]在研究E.coli菌株時發(fā)現(xiàn)，循環(huán)過程中有關(guān)的酶主要有ACP轉(zhuǎn)酰基酶(fabO)β-酮?；?ACP合成酶Ⅲ(fabH）、β-酮?；?ACP還原酶(fabG)、β-羥癸酰-ACP脫水酶(fabA)和烯酰-ACP 還原酶(fabI)，其中fabH和fabI在鏈延長循環(huán)中引發(fā)脂肪酸合成。

五 微生物發(fā)酵產(chǎn)生油脂的前景

利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生油脂具有比動植物更大的優(yōu)越性，它不受時間和空間的限制，能大量生產(chǎn)人們所需的脂肪酸。到目前為止，雖然日本、英國等國家已有γ-亞麻酸、雙高γ-亞麻酸和花生四烯酸的發(fā)酵產(chǎn)品問世，但除γ-亞麻酸外的其他特種油脂，目前均未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此其他脂肪酸, 特別是不飽和脂肪酸還需要人們?nèi)ヅ﹂_發(fā)和探索?？偟膩碚f，微生物產(chǎn)生油脂研究還處在起步階段，還有待于去發(fā)現(xiàn)和分離更多更有效的高產(chǎn)油脂的菌株，還有待去對微生物產(chǎn)脂的生理及調(diào)控機理作更深的研究。由于生物技術(shù)的飛速發(fā)展，人們可以通過基因克隆、基因突變和細(xì)胞融合等手段來獲取大量的高產(chǎn)油脂的菌株，也可以借助反應(yīng)器技術(shù)提高發(fā)酵效率。

因此，以微生物為資源生產(chǎn)脂肪酸，特別是不飽和脂肪酸在醫(yī)藥學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、生物學(xué)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

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in

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coli.Journal

of

Biological

第二篇：真菌微生物的研究進(jìn)展

論文題目：真菌微生物的研究進(jìn)展

作者：華江濤 專業(yè)：生物化工工藝 班級： 生化1321 學(xué)號： 2013277102 指導(dǎo)老師：劉磊

2016年4 月12日

真菌微生物的研究進(jìn)展

目錄

第1章 傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法.................................3 第2章 分子生物學(xué)方法...................................3 2．1基于PCＲ的克隆文庫方法..........................3 2．2變性梯度凝膠電泳（DGGE）.........................3 2．3末端限制性長度多態(tài)性（T-ＲFLP）...................4 2．4實時熒光定量PCＲ..................................4 2．5熒光原位雜交（FISH）...............................4 2．6序列標(biāo)簽標(biāo)記的高通量測序..........................4 第3章 宏基因組學(xué)技術(shù)（Metagenomics）.....................5 前景與展望........................................5 致謝......................................................6 參考文獻(xiàn)..................................................6

摘要

真菌廣泛存在于自然界，在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在微生物多樣性研究中的廣泛應(yīng)用以及宏基因組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，打破了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法的局限性，人們對于真菌多樣性的認(rèn)識日漸提高。該文主要綜述了研究真菌多樣性方法的主要發(fā)展歷程，介紹幾種有關(guān)真菌多樣性研究常用的分子生物學(xué)方法，包括基于PCＲ的克隆文庫方法、變性梯度凝膠電泳、末端限制性長度多態(tài)性、實時熒光定量PCＲ、熒光原位雜交、序列標(biāo)簽標(biāo)記的高通量測序以及宏基因組技術(shù)，并且闡述宏基因組學(xué)技術(shù)在此領(lǐng)域蘊含的巨大發(fā)展?jié)摿?/p>

關(guān)鍵詞

真菌；多樣性；研究方法 Abstract Fungiwidelyexistsinnatureplayinganimportantroleintheecosystem．Thepervasiveapplicationofmolecularbiol-ogytechnologyinmicrobialdiversityandtheemergenceofmetagenomicbreakedthelimitationsoftraditionalmicrobialculturemeth-odsothatimprovethehumansrecognitionoffungaldiversity．ThispaperreviewedthemaindevelopmentcourseofstudyingfungaldiversityapproachesintroducedseveralcommonlyusedmethodsofmolecularbiologyonfungaldiversityresearchmainlyincludingclonelibraryPCＲbased，DenaturinggradientgelelectrophoresisTerminalrestrictionfragmentlengthpolymorphismeal-timeflu-orescentquantitativePCFluorescenceinsituhybridizationandbarcodedpyrosequencingndexpoundedthehugepotentialofmetagenomicsinthisfield．

Keyword fungi；diversity；method 正文

自然界中的微生物分布廣、種類多、資源極其豐富，主要包括細(xì)菌、病毒、真菌等。迄今人們已發(fā)現(xiàn)的微生物物種僅為自然界中微生物總數(shù)的1%～10%［1］。微生物群落多樣性是環(huán)境微生物多樣性研究的核心內(nèi)容。目前微生物多樣性研究多局限于細(xì)菌，而對真菌的研究相對較少。研究真菌群落多樣性可以了解真菌群落結(jié)構(gòu)、真菌的種類和數(shù)量分布特點，并且可以進(jìn)一步為控制和優(yōu)化真菌群落結(jié)構(gòu)提供參考，同時也是研究微生物群落多樣性的重要內(nèi)容。真菌遍布于自然界，據(jù)估計約有數(shù)百萬種，已發(fā)現(xiàn)的僅9萬余種，已發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致人類疾病的僅約400種。人類也生活在真菌包圍的環(huán)境中，日常工作、生活中所接觸到的真菌種類目 前的認(rèn)知。因此，不論是自然環(huán)境還是人體都具有較高的真菌多樣性。真菌多樣性的研究方法很多，從國內(nèi)外目前采用的方法來看，大致上可分為：傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法、分子生物學(xué)方法以及宏基因組學(xué)技術(shù)。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)、新方法用于真菌多樣性領(lǐng)域的研究，使人們對真菌多樣性的認(rèn)識更加全面深入。

1傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法

從傳統(tǒng)上講，真菌多樣性的研究主要利用分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)檢測的方法，該技術(shù)在實驗室被廣泛使用。盡管各種新的培養(yǎng)技術(shù)不斷出現(xiàn)，但此方法費時費力，敏感度和特異性也較低，也不能反應(yīng)全部的真菌群落信息。Amann等曾根據(jù)微生物原位的、不依賴于培養(yǎng)的微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究結(jié)果認(rèn)為：在自然界中，通過實驗室人工培養(yǎng)方法已經(jīng)被分離和描述的微生物物種數(shù)量僅占估計數(shù)量的1%～5%，而其余大多數(shù)微生物種群還仍然未被分離和認(rèn)識，因此，人們不能利用傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)獲得真菌多樣性的全部信息，極大的限制了研究的廣泛性。在臨床致病菌的鑒定方面，培養(yǎng)的方法更為常用。Ｒasi等利用培養(yǎng)法對從伊朗花斑糠疹患者皮膚上分離得到的馬拉色酵母菌進(jìn)行鑒定過程中，發(fā)現(xiàn)球形馬拉色菌是最常分離到的菌種，大約占31．3%，其次是糠秕馬拉色菌（20．5%）等。Findley等［7］通過微生物培養(yǎng)法從10個健康成人的14個部位的皮膚分離真菌，經(jīng)鑒定11個剛體部位和胳膊表面的優(yōu)勢真菌是馬拉色菌屬，通過比較，腳底、腳趾甲和趾間具有較高的真菌多樣性。

2分子生物學(xué)方法

鑒于分離培養(yǎng)技術(shù)的局限性，近年來，利用不依賴培養(yǎng)的方法分析和鑒定微生物群落多樣性的實驗越來越普遍。自從Pace提出將分子生物學(xué)方法用于微生物多樣性研究，微生物分子生態(tài)學(xué)得到了長足的發(fā)展。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析使得對環(huán)境樣品中占大部分的不可培養(yǎng)微生物的研究成為了可能。目前，大多數(shù)用于分析微生物群落結(jié)構(gòu)的方法是基于PCＲ擴增的。在分析微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性時，rＲNA是目前應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記，它具有在功能上高度保守，其序列上的不同位置具有不同的變異速率，存在于所有的有機體（病毒除外）內(nèi)等優(yōu)點。對于細(xì)菌而言，16SrＲNA分析在實際應(yīng)用中最為廣泛，與細(xì)菌相比，使用真菌18SrDNA只能鑒定到屬或科的水平。真菌的非編碼rＲNA區(qū)域，如ITS區(qū)域（Inter-naltranscribedspacer），進(jìn)化快速，序列上的變化更加廣泛，因此提供了更多的分類信息，彌補了18SrＲNA的局限性。雖然如此，在實際研究內(nèi)容中仍然要根據(jù)對分類等級的不同要求來選擇合適的分子標(biāo)記。分子生物學(xué)方法的應(yīng)用使在遺傳水平上研究微生物多樣性成為了可能，該方法可歸納為三方面：①基于PCＲ技術(shù)的研究方法，這些方法是對樣品直接提取DNA或者ＲNA，然后對特定基因設(shè)計引物進(jìn)行PCＲ擴增，再利用不同的方法進(jìn)行分析，（Fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)I可以對微生物在特定環(huán)境中的存在與否、分布模式及豐度等情況進(jìn)行研究，具有較高的靈敏性和特異性。③基于DNA序列測定的研究方法，分析具體堿基序列的分布情況，通過與生物信息學(xué)結(jié)合，進(jìn)行數(shù)據(jù)比較分析，如元基因組（Metagenome）測序技術(shù)，成為研究難培養(yǎng)微生物或不可培養(yǎng)微生物多樣性的重要方法。

2．1基于PCＲ的克隆文庫方法

基于PCＲ的克隆文庫方法使對不可培養(yǎng)微生物的分析成為可能，Pace提出將PCＲ產(chǎn)物進(jìn)行克隆后測序，大大提高了對微生物群落結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，是使用較為廣泛的一種方法。目前已有研究采用針對18SrDNA及ITS的克隆文庫構(gòu)建技術(shù)對腸道內(nèi)真菌群落的多樣性進(jìn)行分析，研究結(jié)果表明人腸道真菌多樣性比較低，主要以不同亞型的芽囊原蟲屬為主

2．2變性梯度凝膠電泳（DGGE）

DGGE最初是lerman等［12-13］發(fā)明的，起初主要用來檢測DNA片段中的點突變。1993年，Muyzer等［14］首次將其用于微生物群落多樣性的研究。DGGE普遍用于分析環(huán)境中細(xì)菌、真菌、病毒群落的生物多樣性。Kim等利用PCＲ-DGGE技術(shù)分析了日本和中國發(fā)酵豆瓣醬中的細(xì)菌和真菌群落多樣性，確定了米曲霉和魯氏酵母的存在。We-erasekera等［16］通過PCＲ-DGGE方法研究人唾液中的酵母菌，在其中六個樣品中鑒定出兩種酵母菌，分別是白色念珠菌和杜氏假絲酵母，有力的證明利用DGGE技術(shù)研究口腔中的酵母菌是一種相對快速便捷的方法。

2．3末端限制性長度多態(tài)性（T-ＲFLP）

T-ＲFLP技術(shù)是在末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，依據(jù)rDNA序列的保守性和特異性，選擇具有系統(tǒng)進(jìn)化標(biāo)記特征的序列作為目 的序列。T-ＲFLP技術(shù)靈敏度高，對于評估復(fù)雜環(huán)境樣品的多樣性和快速的比較不同生態(tài)系統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性是一種有力的工具。Curlevski等［17］使用T-ＲFLP方法研究了澳大利亞商業(yè)化混交林和單一種植南洋杉林場土壤真菌群落的不同，通過對真菌的ITS區(qū)域進(jìn)行分析表明子囊菌門的豐度最高，其次是擔(dān)子菌門和接合菌門，但在不同類型的林場中它們的相對豐度存在差異。

2．4實時熒光定量PCＲ

（qPCＲ技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosys-tems公司推出，是將熒光能量傳遞技術(shù)（Fluores-cenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)ＲET）應(yīng)用于PCＲ，實現(xiàn)了PCＲ從定性到定量的飛躍。qPCＲ技術(shù)目前已得到廣泛應(yīng)用。李曉然等在對汾酒發(fā)酵過程和汾酒酒曲制作過程中細(xì)菌和真菌多樣性的研究中，利用qPCＲ技術(shù)對整個過程中的細(xì)菌和真菌進(jìn)行了定量，發(fā)現(xiàn)在汾酒發(fā)酵過程中真菌的數(shù)量保持相對穩(wěn)定，在酒曲制作過程中真菌的數(shù)量整體上呈下降趨勢。Li等通過qPCＲ方法研究了老年人舌背的真菌多樣性，表明老年人口腔中的真菌多樣性極高，并不僅限于念珠菌屬，其多樣性與老年人的健康狀態(tài)也具有密切的關(guān)系。

2．5熒光原位雜交（FISH）

比起費時費力且難以展現(xiàn)全部微生物群落信息的依賴于培養(yǎng)的方法和難以實現(xiàn)定量分析的多種依賴于PCＲ擴增的分子生物學(xué)方法，使用探針雜交來研究微生物群落多樣性是一種更為快速的方法。熒光原位雜交是以熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針來探測生態(tài)系統(tǒng)中微生物細(xì)胞的一種技術(shù)，不僅能研究自然或人工環(huán)境中的微生物個體，并且可以對微生物群落進(jìn)行評估。Lepère等使用酪胺信號放大技術(shù)與FISH結(jié)合的方法，用18SrDNA特異性的引物分析了湖水中的真核超微浮游生物的主要類群，獲得了真核浮游微生物的定量結(jié)果。雖然分子生物學(xué)方法目前是闡述微生物多樣性的強有力技術(shù)手段，并且在真菌多樣性研究中具有傳統(tǒng)培養(yǎng)法無法比擬的優(yōu)勢，但是基于PCＲ擴增的各種方法及FISH等方法仍然存在著多種弊端，例如引物的偏向性、PCＲ存在的其他系統(tǒng)偏差以及FISH方法中由于引物的不匹配造成對分析結(jié)果的錯誤估計等。在實際的研究中，通常將多種技術(shù)綜合使用，以避免由于方法原理本身所帶來的不可避免的偏差，可提供更加全面準(zhǔn)確的微生物多樣性變化的信息

2．6序列標(biāo)簽標(biāo)記的高通量測序

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，被稱為“第二代測序（next-generationsequencing［NGS］）”技術(shù)在過去幾年中不斷涌現(xiàn)。其特點是：高通量，低成本，可以同時對多個單獨的DNA分子進(jìn)行測序，這一改進(jìn)比

起每條序列需要單獨分析的Sanger法具有巨大的優(yōu)勢。第二代測序技術(shù)主要包括羅氏454公司的GS-FLX測序平臺、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer測序平臺和ABI公司的Solid測序平臺［25］。自從Hamady等建立了在不同的樣品PCＲ引物上分別添加序列標(biāo)簽（barcode）來作為高通量測序后根據(jù)序列區(qū)分不同樣品的標(biāo)記，高通量測序技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用到微生物群落多樣性的分析中。綜合比較二代測序平臺，在研究微生物多樣性方面應(yīng)用較廣泛的是焦磷酸測序（Pyro-sequencing）。李曉然等［18］利用真菌ITS1的焦磷酸測序，研究了中國傳統(tǒng)汾酒發(fā)酵過程中的真菌群落多樣性，分析了在汾酒發(fā)酵過程中真菌的變化以及主要存在的真菌菌種，其中有60%的ITS序列屬于酵母菌科，豐度最高的是東方伊薩酵母，其次為啤酒酵母。Delhaes等利用焦磷酸測序的方法對囊泡纖維癥患者的真菌多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明肺功能下降及臨床狀態(tài)不好的患者真菌多樣性明顯降低。Hoffmann等對人體腸道的真菌多樣性進(jìn)行研究，通過焦磷酸測序表明人腸道中的真菌共66個屬，豐度較高的是子囊菌綱和擔(dān)子菌類。

3宏基因組學(xué)技術(shù)（Metagenomics）

利用基于rDNA的分子生物學(xué)方法研究微生物多樣性，對于龐大的微生物世界仍然是不足夠的，遠(yuǎn)不能闡明微生物的生理生化代謝特征。1998年，Handelman等［29］首次提出宏基因組的概念，并第1次使用了Metagenomics這個詞。宏基因組學(xué)技術(shù)是通過提取某一環(huán)境樣品所有微生物的基因組DNA，或通過鳥槍法直接測序探究環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能，或構(gòu)建宏基因組文庫及對文庫進(jìn)行篩選尋找和發(fā)現(xiàn)新的功能基因及活性代謝產(chǎn)物。通過這兩方面的研究，極大地豐富了我們對環(huán)境樣品微生物多樣性和其功能的認(rèn)知。宏基因組學(xué)技術(shù)避開傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法，直接從樣品中提取總DNA來展開研究，理論上覆蓋了環(huán)境樣品中的全部微生物，在分析環(huán)境微生物復(fù)雜群落結(jié)構(gòu)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。該技術(shù)在微生物多樣性領(lǐng)域的研究，有關(guān)細(xì)菌方面的居多，而關(guān)于真菌群落多樣性的研究為數(shù)并不多。Il-leghems等利用宏基因組學(xué)技術(shù)研究了可可豆自然發(fā)酵過程中的真菌和細(xì)菌群落多樣性，研究結(jié)果表明，葡萄汁有孢漢遜酵母、仙人掌有孢漢遜酵母、啤酒酵母、發(fā)酵乳桿菌和巴氏醋桿菌是主要存在的菌種，并且確定了主要以乳桿菌為宿主的肌病毒科和長尾噬菌體的存在。這是第1篇利用宏基因組學(xué)技術(shù)并結(jié)合454焦磷酸測序研究自然發(fā)酵可可豆中群落多樣性種系發(fā)生分析的報道，顯示了宏基因組學(xué)技術(shù)相比于之前研究方法的優(yōu)越性，能夠獲得更加全面的微生物群落信息。宏基因組學(xué)技術(shù)不僅在研究微生物群落結(jié)構(gòu)方面蘊含巨大潛力，在發(fā)現(xiàn)新功能基因及活性物質(zhì)方面也具有極大的優(yōu)勢。Cardoso等 在對被蝸牛侵襲的農(nóng)作物進(jìn)行宏基因組學(xué)分析中，第1次對其微生物群落和參與生物化學(xué)通路的主要基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)變形菌門是主要的細(xì)菌門，其次是擬桿菌門和硬壁菌門，而病毒、真菌及古細(xì)菌的多樣性稍低。另外，通過功能分析發(fā)現(xiàn)其中存在的大量微生物基因有助于宿主降解木質(zhì)纖維素、對異生物質(zhì)脫毒以及合成必需氨基酸和維生素，同時有利于蝸牛的適應(yīng)性和廣泛攝食，并且檢測到2700多種編碼糖苷水解酶區(qū)域和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因。通過宏基因組學(xué)技術(shù)不僅能夠避免PCＲ擴增帶來的偏差，全面而準(zhǔn)確的研究微生物群落多樣性，同時也為研究樣品中微生物生化代謝、發(fā)現(xiàn)新功能基因和活性物質(zhì)提供了極大的便利。宏基因組學(xué)技術(shù)在分析群落多樣性中不可避免地也會存在一些弊端，例如測序產(chǎn)生的大量數(shù)據(jù)為后續(xù)的序列分析和處理帶來了挑戰(zhàn)，同時對計算機以及數(shù)據(jù)庫的要求也在不斷提高。盡管如此，宏基因組學(xué)技術(shù)本身所具有的巨大優(yōu)勢是目前其他研究方法不可比擬的。近年來，宏基因組學(xué)技術(shù)已經(jīng)開始影響真菌生物學(xué)，逐漸成為研究真菌多樣性的一個新的發(fā)展方向和研究熱點，也增加了獲得新生物活性物質(zhì)的機會，顯示宏基因組學(xué)技術(shù)在此方面蘊含的巨大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

前景與展望

近年來，隨著各種新技術(shù)的不斷完善與發(fā)展，對真菌多樣性的研究逐漸深入，利用這些新技術(shù)可以從不同的角度來研究真菌多樣性，為環(huán)境微生物多樣性和人體真菌病的診斷治療奠定堅實的基礎(chǔ)。值得一提的是，為了獲得更為全面的真菌多樣性信息，在條件許可的情況下可將幾種方法結(jié)合起來使用。目前對于真菌多樣性的研究是多方面的，不論是環(huán)境中、食品中還是定植于人體各部位的真菌，通過對其多樣性的研究必能為指導(dǎo)實踐提供理論基礎(chǔ)。因此，真菌多樣性研究方法的不斷完善必將推動真菌多樣性研究的快速發(fā)展。做生物的多樣性和微生物代謝產(chǎn)物的多樣性，永遠(yuǎn)是發(fā)現(xiàn)新藥的無窮寶藏。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，一些新的抗真菌藥物作用靶點的發(fā)現(xiàn)，必將有更多更有效的抗真菌抗生素被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。在過去的 20年間，刺白菌素類抗生素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，更增強了從微生物代謝產(chǎn)物中尋找抗真菌抗生素的信心。在今后的若干年間，將會有更多的作用靶位用于抗真菌抗生素的篩選，并一定能夠由此獲得更多更有效的抗生素。

致謝

大學(xué)三年學(xué)習(xí)時光已經(jīng)接近尾聲，在此我想對我的母校，我的父母、親人們，我的老師和同學(xué)們表達(dá)我由衷的謝意。感謝我的家人對我大學(xué)三年學(xué)習(xí)的默默支持;感謝我的母校安徽職業(yè)技術(shù)學(xué)院給了我我在大學(xué)三年深造的機會，讓我能繼續(xù)學(xué)習(xí)和提高;感謝生化班的老師和同學(xué)們?nèi)陙淼年P(guān)心和鼓勵。老師們課堂上的激情洋溢，課堂下的諄諄教誨;同學(xué)們在學(xué)習(xí)中的認(rèn)真熱情，生活上的熱心主動，所有這些都讓我的三年充滿了感動。這次畢業(yè)論文設(shè)計我得到了很多老師和同學(xué)的幫助，其中我的論文指導(dǎo)老師劉磊老師對我的關(guān)心和支持尤為重要。每次遇到難題，我最先做得就是向劉磊老師尋求幫助，而劉磊老師每次不管忙或閑，總會抽空來找我面談，然后一起商量解決的辦法。

我做畢業(yè)設(shè)計的每個階段，從選題到查閱資料，論文提綱的確定，中期論文的修改，后期論文格式調(diào)整等各個環(huán)節(jié)中都給予了我悉心的指導(dǎo)。這幾個月以來，劉磊老師不僅在學(xué)業(yè)上給我以精心指導(dǎo)，同時還在思想給我以無微不至的關(guān)懷，在此謹(jǐn)向劉磊老師致以誠摯的謝意和崇高的敬意。

同時，本片畢業(yè)論文的寫作也得到了白楊，江雙雙等同學(xué)的熱情幫助。感謝在整個畢業(yè)設(shè)計期間和我密切合作的同學(xué)，和曾經(jīng)在各個方面給予過我?guī)椭幕锇閭?，在此，我再一次真誠地向幫助過我的老師和同學(xué)便是感謝!

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第三篇：室內(nèi)空氣中微生物污染的研究進(jìn)展

室內(nèi)環(huán)境與微生物 環(huán)境污染與防治 網(wǎng)絡(luò)版 第9期 2008年9月 1 王毓丹1 段俊超2（1.重慶市環(huán)境科學(xué)研究院，重慶 400067； 2.重慶工商大學(xué)廢油資源化技術(shù)與裝備教育部工程研究中心，重慶 400067）介紹了室內(nèi)空氣微生物的危害、原因、來源及其控制措施，重點分析了在室內(nèi)空氣微生物的調(diào)查研究、毒理學(xué)研究、檢測技術(shù)研究及空氣凈化和抗菌技術(shù)方面取得的成就及存在的問題，最后討論了室內(nèi)空氣微生物污染的研究發(fā)展趨勢。室內(nèi)空氣品質(zhì) 空氣污染 室內(nèi)空氣 微生物 趨勢

室內(nèi)空氣品質(zhì)（IAQ）是一門年輕的跨學(xué)科的科學(xué)，它的研究成果對人類的健康和幸福有著很大的影響，并將影響未來的社會結(jié)構(gòu)。IAQ科學(xué)是環(huán)境可持續(xù)發(fā)展不可分割的一部分，其主要研究對象是人類停留90以上時間的室內(nèi)環(huán)境。研究IAQ的科學(xué)家們必須為室內(nèi)環(huán)境的質(zhì)量問題提供依據(jù)，揭示室內(nèi)污染物對人類的危害，并在充分的科學(xué)依據(jù)基礎(chǔ)上提出降低危險的措施1。

室內(nèi)空氣品質(zhì)極大地影響著人們的生活質(zhì)量、健康水平和生產(chǎn)效率。室內(nèi)空氣污染在近年來引起了廣泛關(guān)注，“非典”病毒肆虐的事實也充分說明，室內(nèi)生物性污染不可輕視。目前造成城市寫字樓和家庭室內(nèi)的生物污染主要有細(xì)菌、霉菌和螨蟲等，有的如軍團菌、霉菌性肺炎也可傷害人的性命。微生物污染作為室內(nèi)環(huán)境污染的一個重要組成部分，現(xiàn)今已經(jīng)成為世界各國研究的熱點問題。2005年第251次香山科學(xué)會議主題就是室內(nèi)空氣污染問題。

細(xì)菌和真菌等空氣微生物是室內(nèi)空氣質(zhì)量的重要參數(shù)。室內(nèi)空氣微生物污染，可引起人們出現(xiàn)眼刺激感、哮喘、過敏性皮炎、過敏性肺炎和傳染性疾病，重者甚至導(dǎo)致死亡，也可稱為“不良建筑物綜合征”SBS2。室內(nèi)空氣污染及由此引起的SBS等健康問題開始受到普遍關(guān)注。研究表明，空氣微生物污染也是造成SBS的主要原因之一。

細(xì)菌和真 1第一作者：王毓丹，男，1963年生，高級工程師，主要從事環(huán)境工程設(shè)計。環(huán)境污染與防治 網(wǎng)絡(luò)版 第9期 2008年9月 2 菌等微生物在室內(nèi)孳生繁殖而污染空氣，已經(jīng)成為目前重要的公共環(huán)境衛(wèi)生問題，在美、日、德、法等國家，是人們最為關(guān)注的課題之一。1999年在英國召開第8屆室內(nèi)空氣環(huán)境國際會議講演的700篇論文中，以微生物為議題的就有126篇之多，僅次于揮發(fā)性有機物218篇。室內(nèi)空氣微生物污染影響人體健康甚至危及生命案例時有發(fā)生。近幾年，結(jié)核在全球死灰復(fù)燃，在防治結(jié)核的措施中，人們再次認(rèn)識到環(huán)境受污染后進(jìn)行消毒的重要性3。美國已開始在全國范圍內(nèi)對空氣微生物的種屬、濃度及季節(jié)變化等進(jìn)行監(jiān)測4。1.1 污染造成的危害

微生物是室內(nèi)環(huán)境污染源之一，加拿大的一項調(diào)查表明，室內(nèi)空氣質(zhì)量問題，有21％是微生物污染造成的。國內(nèi)外大量的調(diào)查研究證實，空氣微生物是引發(fā)各種中毒、感染和過敏疾病的主要原因之一，主要引起的疾病有軍團病、結(jié)核病、呼吸系統(tǒng)疾病和SBS。室內(nèi)空氣中的微生物主要有青霉、芽枝菌、曲霉、葡萄球菌、微球菌、白霉及各種病毒等，其濃度主要與室內(nèi)濕度、溫度、人員活動等有關(guān)，室外空氣也是室內(nèi)細(xì)菌、真菌的重要來源之一?？諝庵写嬖诖罅课⑸?，它們通常附著在一定粒徑的顆粒物上，以氣溶膠的形式存在，如微塵、飛沫核等，主要通過呼吸侵入機體，造成呼吸道感染。經(jīng)空氣傳播的傳染病，如流行性感冒、結(jié)核等的暴發(fā)流行，都與空氣微生物污染有密切關(guān)系。一般來說，當(dāng)空氣中致病性物質(zhì)達(dá)到感染劑量時，往往會引起人類患流感、皮炎、肺炎等急性疾病。細(xì)菌可引起人體出現(xiàn)不適、頭痛、干咳、胸疼、腹瀉等癥狀，還是昆士蘭熱、肺結(jié)核等呼吸傳染病的重要致病原。真菌污染與過敏性鼻炎、哮喘及呼吸感染等疾病有關(guān)。長期接觸室內(nèi)真菌代謝產(chǎn)物對人體免疫功能尤其是呼吸防疫功能構(gòu)成威脅。室內(nèi)環(huán)境還是一些病毒的溫床，如青猴病毒、埃博拉病毒、拉沙病毒，這些病毒可引發(fā)出血熱。

室內(nèi)生物氣溶膠主要包括細(xì)菌、病毒、真菌、花粉、原生動物及生物有機體成分等幾大類，它們主要通過與人皮膚接觸、呼吸道吸人、消化道攝人等途徑進(jìn)入人體，導(dǎo)致易感人員的身體健康損害，文獻(xiàn)5列出了幾類具有代表性的室內(nèi)生物氣溶膠及其危害。一般來說，當(dāng)空氣中致病性物質(zhì)達(dá)到感染劑量時，往往會引起人類患流感、皮炎、肺炎等急性疾病，并且還會隨著患者打噴嚏、咳嗽等生理活動形成二次生物氣溶膠并加以傳播，CROFT等對居民抱怨有咳嗽、咽喉腫痛、頭疼、疲勞等癥狀的樓房進(jìn)行了研究，當(dāng)采取一系列空氣凈化措施，并去除室內(nèi)可能造成微生物大量繁殖的建筑材料后，樓內(nèi)居民的上述癥狀得到明顯改善6。許多細(xì)菌的細(xì)胞成分如內(nèi)毒素、B-葡聚糖也是重要的病原7。真菌通過其孢子在空氣中傳播，作為條件致病菌主要引起多種呼吸疾病和過敏反應(yīng)，真菌毒素也可能導(dǎo)致多種中毒反應(yīng)，SOMERS等8觀測到吸人污染空氣顆粒的小鼠發(fā)生基因突變，這也為空氣真菌可能導(dǎo)致肺癌提供了間接證據(jù)。室內(nèi)空氣生物污染不僅危害人體的呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，ANYANWU研究證明產(chǎn)毒真菌的長時間暴露可能影響到兒童神經(jīng)生理功能，研究人員通過神經(jīng)行為學(xué)問卷調(diào)查和一系列的神經(jīng)生理學(xué)測試，問卷結(jié)果證明生活在真菌環(huán)境污染與防治 網(wǎng)絡(luò)版 第9期 2008年9月 3 污染空氣環(huán)境中的兒童發(fā)生高水平行為異?，F(xiàn)象，而暴露組和對照組的腦電圖測試EEG異常率分別是70％和10％，腦干誘發(fā)電位BAEP波形異常率分別是90％和0，上述研究部分揭示產(chǎn)毒真菌可能對人體神經(jīng)系統(tǒng)的健康也存在威脅9。此外，從生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的角度來說，室內(nèi)生物氣溶膠污染直接影響到其生產(chǎn)的順利進(jìn)行并可能污染其產(chǎn)品，對于實驗室來說，還有一種潛在的危險，即遺傳物質(zhì)可能從基因修飾微生物中轉(zhuǎn)移到環(huán)境的野生物種中，造成基因污染10。

在注重生活質(zhì)量和公共衛(wèi)生的今天，SBS近年來得到人們的極大關(guān)注。世界衛(wèi)生組織提出的SBS是如今越來越多的寫字樓上班族常感到的一種身體不適，其癥狀主要有鼻咽發(fā)炎、頭疼發(fā)熱、上呼吸道感染、不明原因的過敏、皮膚干燥等，還伴有整個人感覺懶散惡心11。

1.2 污染類型

（1）真菌（酵母菌和霉菌）真菌是自然界分布最廣的一類生物體，在亞洲、非洲的溫、濕度較高的地區(qū)，適合真菌生長。人們受真菌的感染，易患腳氣、皮炎、皮癬、濕疹等癥。有些真菌能通過其毒性代謝物霉菌毒素致癌。

（2）細(xì)菌和病毒 室內(nèi)空氣中，特別在通風(fēng)不良、人員擁擠的環(huán)境中可有較多的致病微生物存在。除空氣中原有的一些微生物外，也存在來自由人體、動物、土壤和植物碎屑攜帶的細(xì)菌和病毒的某些病原微生物。許多病毒如流感、非典型性肺炎等病毒可以通過空氣、唾

液傳染，一般過濾、濾毒裝置對它們毫無辦法。

（3）塵螨 塵螨是一種非常小的微生物，在絕大多數(shù)住處和辦公場所都能被發(fā)現(xiàn)。塵螨適合在空氣不流通，溫度、濕度適合，且密閉的環(huán)境中生存，對環(huán)境的抵抗力很弱。塵螨是一種極強的變應(yīng)原，能引起呼吸過敏和皮膚過敏，主要癥狀是哮喘、過敏性皮炎、過敏性鼻炎、蕁麻疹等。目前對塵螨的研究很多。

1.3 室內(nèi)空氣微生物污染來源

細(xì)菌和真菌種類繁多，分布很廣，幾乎無所不在。在一般居住環(huán)境中，空氣中的細(xì)菌和真菌種類通常也有數(shù)十至數(shù)百種之多，濃度約在102～l05 cfu/m3。在室內(nèi)有污染源時，空氣污染更加嚴(yán)重，細(xì)菌和真菌的濃度可達(dá)106～108 cfu/m3，甚至高達(dá)1010 cfu/m3。一般來說，空氣缺乏微生物生長所需水分和養(yǎng)料，不是微生物生長的適宜環(huán)境。由于人們的生產(chǎn)和生活活動，使得空氣中可存在某些微生物，包括一些病原微生物在內(nèi)，并通過空氣引起疾病的傳播。室內(nèi)空氣特別在通風(fēng)不良、人員擁擠的環(huán)境中，可有較多的微生物存在。據(jù)監(jiān)測，通風(fēng)不良、密封的房間空氣中細(xì)菌含量一般較高。開窗通風(fēng)的房間，每立方米含細(xì)菌約5 800個，而密閉的房間每立方米含量可高達(dá)19 000個。致病微生物可附著在室內(nèi)的塵埃上被吸入呼吸道。除大氣中原有的一些微生物外，也可能存在來自人體、植物和寵物的某些病原微生物，可能成為空氣傳播疾病的病原。研究發(fā)現(xiàn)，空調(diào)機中細(xì)菌和真菌可以誘發(fā)或加重呼吸系統(tǒng)的過敏性反應(yīng)而引起哮喘。環(huán)境污染與防治 網(wǎng)絡(luò)版 第9期 2008年9月 4 在室內(nèi)有污染源時，空氣污染更加嚴(yán)重，細(xì)菌和真菌的濃度可達(dá)106～108 cfu/m3，甚至高達(dá)1010 cfu/m3。產(chǎn)生微生物污染最主要因素：

（1）有營養(yǎng)物質(zhì)：室內(nèi)的食物、被污染的地毯、潮濕的墊褥、空調(diào)系統(tǒng)中長期存在的冷卻水；（2）持續(xù)潮濕且通風(fēng)不佳的環(huán)境：如冰箱和空調(diào)機組的滴水盤。室內(nèi)的污染源可分為人體活動、建筑部件和家具、設(shè)備。（1）室內(nèi)建筑材料導(dǎo)致空氣微生物污染。在室內(nèi)潮濕、結(jié)露的地方或受水侵害的地方，如廚房、浴室和衛(wèi)生間，環(huán)境的相對濕度高達(dá)90％～100％，室內(nèi)的建筑材料和設(shè)備，就必然容易孳生細(xì)菌和真菌等微生物，特別是真菌，這是個普遍存在的問題12-15。據(jù)報道，在北美問卷調(diào)查結(jié)果顯示，有27％～36％的室內(nèi)建筑材料和設(shè)備有霉菌污染問題，實際測定的結(jié)果更高，達(dá)到42％～56％；在歐洲，英國為17％～46％，荷蘭為15％～18％，芬蘭為l5％12。在德國的8幢住宅里，地毯中的塵埃真菌總數(shù)為103～106 cfu/g，能產(chǎn)生毒素的花斑曲霉為10～105 cfu/g13。室內(nèi)塵埃中的真菌數(shù)達(dá)到102～107 cfu/g。受污染的內(nèi)墻表面的真菌數(shù)超過104 cfu/cm2以上。舊建筑材料中往往孳生著大量的真菌，釋放出來污染室內(nèi)空氣，特別在拆除舊建筑材料時，污染更為嚴(yán)重，比未拆除前高出4～25倍，達(dá)102～107 cfu/m3，拆除舊建筑材料的工人容易發(fā)生呼吸道疾病16。由于空氣流動，導(dǎo)致在建筑材料和設(shè)備中的真菌氣溶膠化，懸浮于空氣中，造成室內(nèi)空氣污染。在家庭里的廢物處理設(shè)備中的空氣細(xì)菌和真菌濃度達(dá)103～105 cfu/m3。

美國政府工業(yè)衛(wèi)生學(xué)家協(xié)會ACGIH指出，任何一種真菌的濃度≥500 cfu/m3時，表明建筑物內(nèi)可能存在相關(guān)污染源。REYNOLDS等14測定6處住宅和辦公室環(huán)境中的空氣真菌總數(shù)≥500 cfu/m3980～18 900 cfu/m3，真菌濃度比室外高10至數(shù)百倍，表明建筑物內(nèi)環(huán)境處于不正常狀態(tài)，影響室內(nèi)人員的身體健康，出現(xiàn)自覺癥狀。

（2）家用設(shè)備導(dǎo)致空氣微生物污染。室內(nèi)家用設(shè)備如空調(diào)器和加濕器中也容易孳生細(xì)

菌和真菌等微生物，成為室內(nèi)空氣微生物潛在污染源。家用空調(diào)器過濾器上真菌數(shù)高達(dá)102～104 cfu/cm3?？照{(diào)設(shè)備中孳生細(xì)菌和真菌，導(dǎo)致室內(nèi)空氣污染，嚴(yán)重影響人體健康?？照{(diào)設(shè)備的空氣過濾器、制冷盤管、通風(fēng)管和冷卻水中孳生細(xì)菌和真菌，導(dǎo)致室內(nèi)空氣污染，嚴(yán)重影響人體健康。國內(nèi)的一些專業(yè)人員通過對一些公共場所、醫(yī)院的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，軍團菌普遍存在于空調(diào)冷卻塔，已對暴露人群的健康造成威脅17-20。而軍團菌污染在國外有許多案例。例如，1976年美國費城召開退伍軍人會議，與會者中182人突然生病，其中29人死亡。癥狀是發(fā)熱、咳嗽、胸痛、肺炎。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病癥由空調(diào)系統(tǒng)內(nèi)孳生的一種革蘭陰性桿菌在空氣中傳播引起。這些致病菌后命名為“軍團菌”，“軍團病”由此得名。l988年，英國廣播公司BBC空調(diào)設(shè)備也引發(fā)軍團病，BBC的職員和周邊的居民約有70人生病，3人死亡。1998年，日本東京1所養(yǎng)老院，由于空調(diào)設(shè)備污染引起職員和病人123人中11人感染軍團病，1人死亡。家庭里廢物處理設(shè)備中空氣細(xì)菌和真菌濃度達(dá)103～105 cfu/m3。另外，超聲波加濕器中孳生的細(xì)菌，隨著超聲波加濕器中的加濕用水生成的水霧一起散發(fā)出去，可引發(fā)感染癥狀21。

（3）人體活動產(chǎn)生微生物污染 日常生活中因不良生活習(xí)慣等造成的污染卻是長期環(huán)境污染與防治 網(wǎng)絡(luò)版 第9期 2008年9月 5 的，需要更多的重視。室內(nèi)微生物污染程度與周圍環(huán)境、居住密度和室內(nèi)空氣溫度、濕度、灰塵含量及采光通風(fēng)等因素有關(guān)。環(huán)境不潔、通風(fēng)不良、居住擁擠的室內(nèi)微生物污染比較嚴(yán)重。另外居民在室內(nèi)飼養(yǎng)的貓、狗等寵物會使微生物包括細(xì)菌、病毒、真菌、芽孢、霉菌、螨等大量繁殖。人在咳嗽或打噴嚏時，可噴射出上百萬個細(xì)小的飛沫小滴。如果在室內(nèi)吸煙，往往比馬路上一輛汽車的尾氣對人體危害更大。研究發(fā)現(xiàn)，使用吸塵器、中央空調(diào)和冷熱水系統(tǒng)為室內(nèi)制造了新的污染源。

（4）建筑部件和家具濕度很高的浴室、廚房容易繁殖霉菌；長期未清潔的地毯上容易滋生螨蟲；一般家具的后面和下面都很難清掃，造成灰塵堆積，給微生物繁殖創(chuàng)造了良好的條件。建筑材料中的縫隙，也是藏污納垢的場所。2.1 調(diào)查研究

目前，有關(guān)空氣微生物的研究多為調(diào)查研究，即對某種場所在一定時間內(nèi)進(jìn)行空氣微生物采樣，了解微生物的濃度、種屬等情況。國內(nèi)、外都對多種場所的空氣微生物進(jìn)行了調(diào)查研究。所涉及的場所包括室內(nèi)及室外多種公共場所，室內(nèi)如：醫(yī)院各科室22，23、室內(nèi)娛樂場所舞廳、網(wǎng)吧、保健品生產(chǎn)廠房、居室

24、教室、實驗室等；室外則有：某些城市的交通樞紐區(qū)、步行街、校園及不同的風(fēng)景區(qū)等。研究中采用的檢測指標(biāo)有：菌落總數(shù)、真菌總數(shù)，以及有針對性的病原菌、條件致病菌及微生物耐藥情況等。張鳳川等25研究了某醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室的空氣細(xì)菌譜，劉汝青等26研究了廣州某綜合性大醫(yī)院各科門診候診室的空氣細(xì)菌污染狀況。國外對工業(yè)及醫(yī)療場所的空氣微生物狀況進(jìn)行了調(diào)查研究。工業(yè)化養(yǎng)豬場常預(yù)防性給豬喂食抗生素，周圍環(huán)境空氣、土壤及水都受到不同程度污染，在空氣中發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌，人們可通過多種方式暴露于耐藥菌，如食用豬肉、接觸農(nóng)場周圍土壤、飲用周圍地面水及地下水等27。某地工業(yè)冷卻塔水被嗜肺軍團菌污染，周圍空氣中也同樣檢出該菌

28。SHELTON等29在美國的一項大規(guī)模調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，空氣真菌濃度室內(nèi)低于室外，夏秋季高于冬春季，常見菌株為枝孢霉、青霉、不產(chǎn)孢子真菌、曲霉等。

2.2 毒理學(xué)研究

目前國內(nèi)空氣微生物的毒理學(xué)研究尚未見有關(guān)報，國外則多為空氣中真菌孢子及毒素的毒理學(xué)研究。HUTTUNEN等30研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)空氣中的真菌孢子暴露，只有黑葡萄穗霉孢子可增加人肺上皮細(xì)胞白細(xì)胞介素-6的合成。暴露于黑葡萄穗霉孢子及毒素的幼鼠，其肺泡超微結(jié)構(gòu)顯著改變，肺泡表面活性劑轉(zhuǎn)化酶活性降低。據(jù)報道，黑葡萄穗霉可使動物中毒，近來又發(fā)現(xiàn)它與嬰兒肺部血鐵質(zhì)有關(guān)。LANDER等31應(yīng)用嗜堿細(xì)胞組胺釋放試驗HRT來檢測真菌特異性血清IgE，發(fā)現(xiàn)大部分不良建筑物綜合征與HRT陽性顯著相關(guān)。環(huán)境污染與防治 網(wǎng)絡(luò)版 第9期 2008年9月 6

2.3 檢測技術(shù)研究

因為室內(nèi)外空氣微生物污染，嚴(yán)重影響人體健康，通過廣泛用于室內(nèi)外進(jìn)行空氣微生物采樣技術(shù)，研究和評價醫(yī)院、住宅、辦公室等室內(nèi)空氣質(zhì)量。

如何選擇空氣微生物采樣器以及相應(yīng)的分析方法，主要從待采集的空氣微生物的種類和濃度來考慮，在采樣時必須具有獲得最大的收集效率32。選擇檢測方法時要根據(jù)檢測目的來選取合適的采樣器和采樣介質(zhì)，要根據(jù)檢測環(huán)境來布設(shè)采樣點和采樣時間，此外還要考慮到檢測的特異性、準(zhǔn)確性、可操作性以及氣溶膠的粒子大小等33，34?？諝馕⑸锊蓸悠骺煞譃閮纱箢悾哼^濾式采樣器和撞擊式采樣器。有固定式和便攜式采樣器兩種。固定式采樣器主要用于室外采集空氣過敏源?？諝馕⑸锊蓸蛹夹g(shù)有過濾式空氣采樣器、撞擊式空氣采樣器、其他采樣器（表面空氣系統(tǒng)采樣器、縫隙式空氣采樣器、離心式空氣采樣器、旋風(fēng)式空氣采樣器、靜電式空氣采樣器和個體采樣器）和平皿法?？諝馕⑸锏臏y定方法也分為兩大類：培養(yǎng)基方法和非培養(yǎng)基方法。培養(yǎng)基方法是將采集的微生物經(jīng)過培養(yǎng)繁殖生長成菌落后計數(shù)和鑒別，非培養(yǎng)基方法是在采樣后不經(jīng)過培養(yǎng)就可進(jìn)行計數(shù)和鑒別的方法。在20世紀(jì)80年代建立了幾種非培養(yǎng)基方法，如光學(xué)顯微鏡方法、熒光顯微鏡、電子掃描顯微鏡和流通式血球計方法。目前國內(nèi)外最常用的檢測方法是利用空氣微生物采樣器主動抽取空氣于采樣介質(zhì)中，采樣介質(zhì)可以是液體也可以是固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)計數(shù)法是目前國內(nèi)外檢測生物氣溶膠應(yīng)用最廣泛，結(jié)果最可靠的方法35，36。但是培養(yǎng)計數(shù)法依賴于微生物的可培養(yǎng)性，首先不是所有的微生物都能夠在采樣培養(yǎng)基上生長，不同微生物有不同的生長要求。據(jù)PARKES和TAYLOR計算，可培養(yǎng)的微生物大約只占空氣微生物總數(shù)的0.1％～10.0％，所以說培養(yǎng)計數(shù)法很容易低估空氣中生物氣溶膠總量37。

由于傳統(tǒng)的菌落計數(shù)法不夠準(zhǔn)確而且耗時耗力，所以許多研究都開始嘗試將新方法引入空氣微生物檢測中，主要有以下幾種：①生物發(fā)光法。吖啶橙是常用的染色劑，它能夠與微生物染色質(zhì)結(jié)合發(fā)出黃色熒光，便于在顯微鏡下細(xì)胞計數(shù)；②免疫檢測。利用微生物的免疫原性檢測生物氣溶膠，SCHMECHEL等38制備了短密青霉的單克隆抗體，結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附檢測了實驗室發(fā)生的生物氣溶膠；③生物標(biāo)記分子的檢測。鱟變形細(xì)胞溶解物試驗廣泛用于檢定革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素，但是這種方法更適合于檢測微生物的活性而不是總數(shù)37，39。革蘭氏陽性細(xì)菌的胞壁酸，真菌細(xì)胞膜的麥角固醇也都可作為生物標(biāo)記37。分子生物學(xué)方法在生物氣溶膠檢測方面有巨大的應(yīng)用前景，針對微生物16SrRNA或18S rRNA基因的保守區(qū)設(shè)計種屬特異性的引物和探針，利用PCR和基因探針檢測生物氣溶膠，相對于培養(yǎng)法來說，該方法不依賴于微生物的生長或其他生理條件，具有良好的特異性、敏感性和分析速

度40，41。3.1 防止微生物污染的方法

室內(nèi)空氣是個小環(huán)境，各方面條件差異很大，因環(huán)境不同而微生物的來源和分布規(guī)律環(huán)境污染與防治 網(wǎng)絡(luò)版 第9期 2008年9月 7 也有所不同，了解不同環(huán)境因素對它的影響也有利于進(jìn)一步對室內(nèi)空氣質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。建筑物內(nèi)部有許多適合微生物生長的載體如植物、書籍、垃圾、窗簾等等。溫度和濕度是微生物生長的關(guān)鍵因素，寒冷干燥的空氣不利于微生物的存活。水浸和滲水的建筑物通常有高濃度的空氣微生物濃度，而且室內(nèi)吸水性的物品或建筑材料往往會成為室內(nèi)微生物的污染源?？刂瓶諝馑羝臐舛却蠹s60％以下可以降低微生物污染42。封閉的建筑物盡管避免了室外污染物的侵人，但是由于室內(nèi)外空氣得不到良好交換，所以同樣會發(fā)生室內(nèi)空氣生物污染，尤其是空調(diào)系統(tǒng)沒有定期清潔時，室內(nèi)微生物容易在HVAC的管道、風(fēng)口或濾網(wǎng)上繁殖，HVAC啟動就會造成整個建筑物內(nèi)空氣的污染43。同時，人員活動可以產(chǎn)生供微生物吸附的顆粒物，也有利于空氣微生物的傳播。因此，在人員密度較高的地方要采取清理措施，適度疏散人群對維持空氣潔凈有明顯效果。控制室內(nèi)空氣污染的關(guān)鍵措施是良好的通風(fēng)和較低的濕度。王琨等44研究認(rèn)為，通風(fēng)可以有效降低室內(nèi)空氣微生物濃度，最為經(jīng)濟、易行。

采取如下措施也可有效改善室內(nèi)空氣微生物狀況，改善和提高室內(nèi)空氣質(zhì)量45-50：（1）去除污染源，被褥經(jīng)常晾曬。采用降低和消除濕氣，防止結(jié)露，使細(xì)菌和真菌等微生物不能在室內(nèi)孳生繁殖，或者徹底清除污染建筑材料；（2）保持室內(nèi)清潔衛(wèi)生，可有效降低室內(nèi)空氣微生物污染；（3）經(jīng)常通風(fēng)，保持室內(nèi)干燥。通常室外空氣中微生物的數(shù)量較室內(nèi)低，將細(xì)菌和真菌等微生物排出，降低室內(nèi)空氣微生物濃度；（4）綠化，綠色植物可吸附塵埃從而降低空氣微生物含量；（5）定期清洗空調(diào)器和地毯。長期使用后，空調(diào)的濾網(wǎng)上可吸附大量臟物，有利于微生物的滋生；軍團菌常棲息在空調(diào)冷卻器處，可以氣霧形式播散到空氣中，使人感染軍團菌病；（6）凈化空氣：使用空氣凈化器去除室內(nèi)空氣中的微生物，或者用紫外線照射殺死室內(nèi)空氣中微生物，也可以采用有機抗菌劑和無機抗菌劑抑制和殺死微生物，試圖減少室內(nèi)環(huán)境中潛在的微生物污染源，達(dá)到控制室內(nèi)空氣微生物污染，改善和提高室內(nèi)空氣質(zhì)量的目的。

3.2 空氣凈化及微生物殺滅技術(shù)

現(xiàn)代人類生活大部分時間都是在室內(nèi)度過，尤其是辦公室工作人員，室內(nèi)空氣質(zhì)量受到人們的廣泛關(guān)注。針對空氣微生物污染，人們采取了多種空氣凈化消毒措施，同時，不斷研究新的方法，改進(jìn)和完善原有的空氣凈化消毒方法。

第四篇：微生物發(fā)酵制藥-總體工藝過程流程（定稿）

微生物發(fā)酵制藥-----總體工藝過程流程

工業(yè)微生物技術(shù)是可持續(xù)發(fā)展的一個重要支撐，是解決資源危機、生態(tài)環(huán)境危機和改造傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的根本技術(shù)依托。工業(yè)微生物的發(fā)展使現(xiàn)代生物技術(shù)滲透到包括醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、能源、化工、環(huán)保等幾乎所有的工業(yè)領(lǐng)域，并扮演著重要角色。歐美日等國已不同程度地制定了今后幾十年內(nèi)用生物過程取代化學(xué)過程的戰(zhàn)略計劃，可以看出工業(yè)微生物技術(shù)在未來社會發(fā)展過程中重要地位。

微生物制藥技術(shù)是工業(yè)微生物技術(shù)的最主要組成部分。微生物藥物的利用是從人們熟知的抗生素開始的，抗生素一般定義為：是一種在低濃度下有選擇地抑制或影響其他生物機能的微生物產(chǎn)物及其衍生物。(有人曾建議將動植物來源的具有同樣生理活性的這類物質(zhì)如魚素、蒜素、黃連素等也歸于抗生素的范疇，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為傳統(tǒng)概念的抗生素仍應(yīng)只限于微生物的次級代謝產(chǎn)物。)近年來，由于基礎(chǔ)生命科學(xué)的發(fā)展和各種新的生物技術(shù)的應(yīng)用，報道的微生物產(chǎn)生的除了抗感染、抗腫瘤以外的其他生物活性物質(zhì)日益增多，如特異性的酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗劑和抗氧化劑等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活動的范圍。但這些物質(zhì)均為微生物次級代謝產(chǎn)物，其在生物合成機制、篩選研究程序及生產(chǎn)工藝等方面和抗生素都有共同的特點，但把它們通稱為抗生素顯然是不恰當(dāng)?shù)?，于是不少學(xué)者就把微生物產(chǎn)生的這些具有生理活性（或稱藥理活性）的次級代謝產(chǎn)物統(tǒng)稱為微生物藥物。

微生物藥物的生產(chǎn)技術(shù)就是微生物制藥技術(shù)。可以認(rèn)為包括五個方面的內(nèi)容：

第一方面 菌種的獲得

根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。

1.分離思路：新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。具體分離操作從以下幾個方面展開。2.定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。3.采樣：有針對性地采集樣品。

4.增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。5.分離：利用分離技術(shù)得到純種。

6.發(fā)酵性能測定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。

第二方面 高產(chǎn)菌株的選育

工業(yè)上生產(chǎn)用菌株都是經(jīng)過選育過的。工業(yè)菌種的育種是運用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對某個用于特定生物技術(shù)目的的菌株進(jìn)行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。

工業(yè)菌種育種的方法：誘變、基因轉(zhuǎn)移、基因重組。

育種過程包括下列3個步驟：(1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改良菌種的評價(包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)。

選擇育種方法時需綜合考慮的因素(1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(例如分批或者連續(xù)發(fā)酵試驗)；(2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)方面認(rèn)識的明了程度；(3)經(jīng)濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術(shù)；如果對其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認(rèn)識，則可選擇基因重組等手段進(jìn)行定向育種。

工業(yè)菌種具體改良思路：(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟（通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。）(2)增加前體物的濃度。(3)改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。(5)改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。

第三部分 菌種保藏技術(shù) 轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?超低溫或在液氮中冷凍保藏；

土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏。第四部分 發(fā)酵工藝條件的確定 微生物的營養(yǎng)來源

能源，自養(yǎng)菌：光；氫，硫胺；亞硝酸鹽，亞鐵鹽。異養(yǎng)菌：碳水化合物等有機物，石油天然氣和石油化工產(chǎn)品，如醋酸。

碳源，碳酸氣；淀粉水解糖，糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等，石油、正構(gòu)石蠟，天然氣，醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產(chǎn)品

氮源，豆餅或蠶蛹水解液，味精廢液，玉米漿，酒糟水等有機氮，尿素，硫酸銨，氨水，硝酸鹽等無機氮，氣態(tài)氮

無機鹽，磷酸鹽，鉀鹽，鎂鹽，鈣鹽等其他礦鹽，鐵、錳、鈷等微量元素等 特殊生長因子，硫胺素、生物素、對氨基苯甲酸、肌醇等

培養(yǎng)基的確定

（1）首先必須做好調(diào)查研究工作，了解菌種的來源、生活習(xí)慣、生理生化特性和一般的營養(yǎng)要求。工業(yè)生產(chǎn)主要應(yīng)用細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類微生物。它們對營養(yǎng)的要求既有共性，也有各自的特性，應(yīng)根據(jù)不同類型微生物的生理特性考慮培養(yǎng)基的組成。（2）其次，對生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件，生物合成的代謝途徑，代謝產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)、一般提取方法和產(chǎn)品質(zhì)量要求等也需要有所了解，以便在選擇培養(yǎng)基時做到心中有數(shù)。（3）最好先選擇一種較好的化學(xué)合成培養(yǎng)基做基礎(chǔ)，開始時先做一些搖瓶實驗;然后進(jìn)一步做小型發(fā)酵罐培養(yǎng)，摸索菌種對各種主要碳源和氮源的利用情況和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力。注意培養(yǎng)過程中的pH變化，觀察適合于菌種生長繁殖和適合于代謝產(chǎn)物形成的兩種不同pH，不斷調(diào)整配比來適應(yīng)上述各種情況。

（4）注意每次只限一個變動條件。有了初步結(jié)果以后，先確定一個培養(yǎng)基配比。其次再確定各種重要的金屬和非金屬離子對發(fā)酵的影響，即對各種無機元素的營養(yǎng)要求，試驗其最高、最低和最適用量。在合成培養(yǎng)基上得出一定結(jié)果后，再做復(fù)合培養(yǎng)基試驗。最后試驗各種發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的關(guān)系。培養(yǎng)基內(nèi)pH可由添加碳酸鈣來調(diào)節(jié)，其他如硝酸鈉、硫酸銨也可用來調(diào)節(jié)。

（5）有些發(fā)酵產(chǎn)物，如抗生素等，除了配制培養(yǎng)基以外，還要通過中間補料法，一面對碳及氮的代謝予以適當(dāng)?shù)目刂?，一面間歇添加各種養(yǎng)料和前體類物質(zhì)，引導(dǎo)發(fā)酵走向合成產(chǎn)物的途徑。

(6)根據(jù)經(jīng)濟效益選擇培并基原料 考慮經(jīng)濟節(jié)約，盡量少用或不用主糧，努力節(jié)約用糧，或以其他原料代糧。糖類是主要的碳源。碳源的代用品主要是尋找植物淀粉、纖維水解物，以廢糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工業(yè)葡萄糖代替食用葡萄糖；石油作為碳源的微生物發(fā)酵也可以生產(chǎn)以糧食為碳源的發(fā)酵產(chǎn)品。有機氮源的節(jié)約和代替主要為減少或代替黃豆餅粉、花生餅粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有豐富蛋白質(zhì)的原料為目標(biāo)，代用的原料可以是棉籽餅粉、玉米漿、蠶蛹粉、雜魚粉、黃漿水或麩汁、飼料酵母、石油酵母、骨膠、菌體、酒糟，以及各種食品工業(yè)下腳料等。這些代用品大多蛋白質(zhì)含量豐富，價格低廉，便于就地取材，方便運輸。

培養(yǎng)工藝的確定：

培養(yǎng)條件：溫度、pH值、氧、種齡、接種量、溫度

工業(yè)微生物的培養(yǎng)法分為靜置培養(yǎng)和通氣培養(yǎng)兩大類型。

靜置培養(yǎng)法即將培養(yǎng)基盛于發(fā)酵容器中，在接種后，不通空氣進(jìn)行發(fā)酵，又稱為厭氧性發(fā)酵。通氣培養(yǎng)法的生產(chǎn)菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長的環(huán)境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發(fā)酵，又稱為好氣性發(fā)酵。

在靜置和通氣培養(yǎng)兩類方法中又可分為液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)兩大類型，其中每一類型又有表面培養(yǎng)與深層培養(yǎng)之分。

關(guān)于液體深層培養(yǎng)：

用液體深層發(fā)酵罐從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進(jìn)氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養(yǎng)方法，相對于由氣液界面靠自然擴散使氧溶解的表面培養(yǎng)法來講，稱為深層培養(yǎng)法。特點是容易按照生產(chǎn)菌種對于代謝的營養(yǎng)要求以及不同生理時期的通氣、攪拌、溫度、與培養(yǎng)基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養(yǎng)條件。

深層培養(yǎng)基本操作的3個控制點

①滅菌：發(fā)酵工業(yè)要求純培養(yǎng)，因此在發(fā)酵開始前必須對培養(yǎng)基進(jìn)行加熱滅菌。所以發(fā)酵罐具有蒸汽夾套，以便將培養(yǎng)基和發(fā)酵罐進(jìn)行加熱滅菌，或者將培養(yǎng)基由連續(xù)加熱滅菌器滅菌，并連續(xù)地輸送于發(fā)酵罐內(nèi)。②溫度控制：培養(yǎng)基滅菌后，冷卻至培養(yǎng)溫度進(jìn)行發(fā)酵，由于隨著微生物的增殖和發(fā)酵會發(fā)熱、攪拌產(chǎn)熱等，所以為維持溫度恒定，須在夾套中以冷卻水循環(huán)流過。③通氣、攪拌：空氣進(jìn)入發(fā)酵罐前先經(jīng)空氣過濾器除去雜菌，制成無菌空氣，而后由罐底部進(jìn)人，再通過攪拌將空氣分散成微小氣泡。為了延長氣泡滯留時間，可在罐內(nèi)裝擋板產(chǎn)生渦流。攪拌的目的除了溶解氧之外，可使培養(yǎng)液中微生物均勻地分散在發(fā)酵罐內(nèi)，促進(jìn)熱傳遞，以及為調(diào)節(jié)pH而使加入的酸和堿均勻分散等。

第五部分 發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取 提取方法： 過濾 離心與沉降 細(xì)胞破碎 萃取

吸附與離子交換 色譜分離

沉析（鹽析、有機溶劑沉析、等電點等）膜分離 結(jié)晶 干燥

分離提取過程的幾個注意的問題： 水質(zhì)

熱源去除（石棉板吸濾、活性碳吸附、過離子交換柱）溶劑回收 廢物處理 生物安全性

第五篇：高中生物微生物與發(fā)酵工程知識點總結(jié)

高中生物微生物與發(fā)酵工程知識點總結(jié)

微生物類群

細(xì)菌、放線菌、病毒

細(xì)菌分裂方式：二分裂。

多數(shù)抗生素由放線菌產(chǎn)生。

病毒的衣殼決定病毒抗原特異性。

一種病毒只含有一種核酸。

微生物營養(yǎng) 營養(yǎng)：

各種成分：碳源、氮源、生長因子、無機鹽和水。

碳源——構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物。

氮源——合成蛋白質(zhì)、核酸和含氮產(chǎn)物。

生長因子——合成酶和核酸。糖類（葡萄糖）是最常用的碳源。

不同種類微生物對碳源種類、數(shù)量有不同要求。

銨鹽、硝酸鹽是最常用的氮源。

生長因子：維生素、氨基酸、堿基等

天然物質(zhì)（酵母膏、蛋白胨、動植物組織提取液）可作為生長因子。

培養(yǎng)基配置原則：

目的明確、營養(yǎng)協(xié)調(diào)、PH要適宜

谷氨酸生產(chǎn)：

C：N = 4：1 菌體大量繁殖

C：N = 3：1 谷氨酸大量合成 PH：

細(xì)菌——6.5~7.5

放線菌——7.5~8.5

真菌——5~6

谷氨酸棒狀桿菌——7~8

培養(yǎng)基種類：記憶實例

分類 物理

固體：分離、鑒定

半固體：觀察運動、留種 液體：工業(yè)生產(chǎn)

化學(xué)

合成培養(yǎng)基：分類、鑒定 天然培養(yǎng)基：工業(yè)生產(chǎn)

用途

選擇培養(yǎng)基：抑制劑、促進(jìn)劑 鑒別培養(yǎng)基：指示劑、化學(xué)藥品

微生物代謝

代謝產(chǎn)物：初級代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物

代謝調(diào)節(jié)：酶合成調(diào)節(jié)、酶活性調(diào)節(jié)。

酶分類：組成酶、誘導(dǎo)酶。

代謝人工控制途徑：

誘變處理；改變細(xì)胞膜透性。（記憶實例）微生物代謝異常旺盛的原因：

表面積與體積比很大，能夠迅速與外界進(jìn)行物質(zhì)交換。

酶合成調(diào)節(jié)……保證代謝需要，避免胞內(nèi)物質(zhì)能量浪費，增強微生物適應(yīng)能力。

酶活性調(diào)節(jié)……（改變構(gòu)象）快速、精細(xì)調(diào)節(jié)方式。微生物生長

（記憶書本細(xì)節(jié)）

四個時期：調(diào)整期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期。

連續(xù)培養(yǎng)：縮短了培養(yǎng)周期，消除不利于微生物生長的某些環(huán)境因素，提高設(shè)備利用率，便于自動化管理。（穩(wěn)定期進(jìn)行）

影響因素：溫度、PH、氧。

測定培養(yǎng)生長情況：將少量某細(xì)菌接種到定容的液體培養(yǎng)基中觀察。測定方法：細(xì)胞數(shù)；測重。

生長曲線反映細(xì)菌菌體生長狀況。

調(diào)整期——代謝活躍，體積增長快，大量合成酶、ATP等。時間取決于：菌種、培養(yǎng)條件。

對數(shù)期——代謝旺盛，形態(tài)、特征穩(wěn)定。留種，科研材料。時間取決于：接種量、培養(yǎng)基。

穩(wěn)定期——動態(tài)平衡，活菌數(shù)最大，大量積累次級代謝產(chǎn)物。種內(nèi)斗爭最激烈，出現(xiàn)芽孢。

衰亡期——死亡率＞繁殖率，有多種形態(tài)和畸形。死細(xì)胞解體，釋放代謝產(chǎn)物。

發(fā)酵工

程 發(fā)酵工程概念和內(nèi)容：

發(fā)酵工程的應(yīng)用：

醫(yī)藥工程：代謝產(chǎn)物中的抗生素、激素、疫苗、干擾素、抗體等。

食品工程：傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，食品添加劑，單細(xì)胞蛋白。谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)實例。

菌種的選育：誘變育種、基因工程、細(xì)胞工程。

培養(yǎng)基的配制：根據(jù)配制三原則。

滅菌、擴大培養(yǎng)和接種。

發(fā)酵過程：控制影響微生物生長的環(huán)境因素。分離提純：菌體（過濾、沉淀），代謝產(chǎn)物（蒸餾、萃取、離子交換）。