第一篇：談FMS核算系統(tǒng)使用心得

談FMS核算系統(tǒng)使用心得--龍川公司 黃倩

如今，財(cái)務(wù)系統(tǒng)遍布華潤(rùn)集團(tuán)各個(gè)成員公司已十分普遍，華潤(rùn)集團(tuán)是一個(gè)信息化全面發(fā)展的企業(yè)，單單就我們財(cái)務(wù)涉及的就有8大系統(tǒng)，包括FMS核算系統(tǒng)、TMS資金系統(tǒng)、HFM合并系統(tǒng)、預(yù)算系統(tǒng)、5C報(bào)表系統(tǒng)、國(guó)資委決算系統(tǒng)、工程造價(jià)系統(tǒng)。這幾個(gè)超級(jí)實(shí)用的系統(tǒng)也給我們帶來(lái)許多的便捷，下面向大家簡(jiǎn)單介紹我們最常用每天都接觸的Oracle FMS系統(tǒng)。

一、什么是FMS FMS其實(shí)是一家目前全球最大的信息管理軟件及服務(wù)供應(yīng)商Oracle公司開發(fā)的財(cái)務(wù)核算管理軟件，F(xiàn)MS里面包括物資采購(gòu)供應(yīng)鏈-應(yīng)收模塊-應(yīng)付模塊-資產(chǎn)模塊-總賬模塊-支付模塊-現(xiàn)金流模塊-傳送HFM合并報(bào)表模塊這幾大塊，功能非常強(qiáng)大。

二、FMS的主要特點(diǎn)及使用流程

簡(jiǎn)單的說(shuō)FMS是財(cái)務(wù)數(shù)據(jù)核算的基礎(chǔ)，通過(guò)使用FMS核算核算匯總公司財(cái)務(wù)數(shù)據(jù)，簡(jiǎn)單從物資采購(gòu)到成本核算，再到費(fèi)用核算，再到在建工程轉(zhuǎn)固定資產(chǎn)核算，從采購(gòu)員采購(gòu)物資開始，在系統(tǒng)錄入采購(gòu)需求訂單，倉(cāng)管領(lǐng)料退庫(kù)等，月底統(tǒng)一請(qǐng)求傳送FMS系統(tǒng)總賬模塊，由于集團(tuán)物資是統(tǒng)一集中采購(gòu)，我們稱之為集采，綜合會(huì)計(jì)負(fù)責(zé)每月總賬、應(yīng)收應(yīng)付、資產(chǎn)、成本核算，月末統(tǒng)一核算并匯總傳送到總賬，在每月2號(hào)17：00前完成系統(tǒng)月結(jié)，并在當(dāng)天調(diào)整現(xiàn)金流量表，并及時(shí)傳送至HFM合并系統(tǒng)，進(jìn)行集團(tuán)數(shù)據(jù)合并生成合并數(shù)據(jù)，對(duì)與成員公司的ICP關(guān)聯(lián)方進(jìn)行對(duì)賬，對(duì)不符數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)整，減少對(duì)Excel的依賴，全部在系統(tǒng)上進(jìn)行操作，保證財(cái)務(wù)數(shù)據(jù)核算的準(zhǔn)確性，簡(jiǎn)化傳統(tǒng)數(shù)據(jù)核算不必要的繁瑣流程，優(yōu)化財(cái)務(wù)組織架構(gòu)和報(bào)告體系。

圖

核算系統(tǒng)到合并、預(yù)算系統(tǒng)、5C、國(guó)資委流程圖

三、系統(tǒng)問(wèn)題解決

自從2012年12月后各種系統(tǒng)上線以來(lái)，公司對(duì)各類系統(tǒng)操作可以說(shuō)已非常熟練，當(dāng)然，那么強(qiáng)大的系統(tǒng)也會(huì)有它缺陷，比如系統(tǒng)的一些設(shè)置可能就不能那么全面的滿足我們?nèi)粘５氖褂?，又或者系統(tǒng)常規(guī)出錯(cuò)導(dǎo)致崩潰用戶無(wú)法自行解決等等，盡管如此我們也有解決諸如此類問(wèn)題的辦法，我們可以通過(guò)JIRA平臺(tái)來(lái)提交問(wèn)題缺陷請(qǐng)求，讓大區(qū)核算運(yùn)維來(lái)幫助我們，大區(qū)系統(tǒng)運(yùn)維也會(huì)通過(guò)QQ交流群來(lái)解決系統(tǒng)常規(guī)問(wèn)題，如果連大區(qū)運(yùn)維層面都無(wú)法解決，那我們還可以提交至集團(tuán)項(xiàng)目組人員，讓這些問(wèn)題都能迎刃而解。當(dāng)今社會(huì)是一個(gè)信息化時(shí)代，集團(tuán)通過(guò)各種信息化系統(tǒng)來(lái)優(yōu)化、標(biāo)準(zhǔn)化我們業(yè)務(wù)操作和控制流程，讓一切都回到最基本的東西，變得簡(jiǎn)單起來(lái)，使公司成本、風(fēng)險(xiǎn)降到最低，利益最大化，簡(jiǎn)單化是財(cái)務(wù)管理的目標(biāo)，集團(tuán)推廣的各種系統(tǒng)都是一種創(chuàng)新和發(fā)展，給我們成員公司帶來(lái)了便利、更是創(chuàng)造了無(wú)限的價(jià)值。

第二篇：飛行管理系統(tǒng)(FMS)學(xué)習(xí)小結(jié)

飛行管理系統(tǒng)（FMS）學(xué)習(xí)小結(jié)

飛管的主要作用及意義：

飛行管理系統(tǒng)（FMS）是通過(guò)組織、協(xié)調(diào)和綜合機(jī)上多個(gè)電子和機(jī)電子系統(tǒng)的功能與作用，生成飛行計(jì)劃，并在整個(gè)飛行進(jìn)程中全程保證該飛行計(jì)劃的實(shí)施，建立及執(zhí)行LNAV和VNAV的導(dǎo)航，優(yōu)化飛機(jī)性能，實(shí)現(xiàn)飛行任務(wù)的自動(dòng)控制，使飛機(jī)在飛行過(guò)程中以最佳飛行路徑、最佳的飛行剖面和最省油的飛行方式完成從起飛到進(jìn)近著陸的整個(gè)飛行過(guò)程。裝有飛行管理系統(tǒng)的飛機(jī)，不僅可以大量節(jié)省燃油，提高機(jī)場(chǎng)的吞吐能力，保證飛機(jī)的飛行安全和飛行品質(zhì)，而且可以大大提高駕駛艙的綜合化、自動(dòng)化程度，減輕駕駛員的工作負(fù)擔(dān)，帶來(lái)巨大的無(wú)可估量的經(jīng)濟(jì)效益。

飛管的組成及功能：

組成：

現(xiàn)代飛機(jī)上FMS是一整套包括一堆子系統(tǒng)的系統(tǒng)，由一個(gè)許多計(jì)算機(jī)、傳感器、無(wú)線電導(dǎo)航系統(tǒng)、控制板、電子顯示儀表、電子告警組件以及執(zhí)行機(jī)構(gòu)聯(lián)系起來(lái)的大設(shè)備系統(tǒng)。不同的機(jī)型飛行管理系統(tǒng)的構(gòu)成不盡相同，典型的飛管系統(tǒng)主要是由四個(gè)部分組成：

1、傳感器分系統(tǒng)——慣性基準(zhǔn)系統(tǒng)（IRS）、大氣數(shù)據(jù)系統(tǒng)（DADC）及無(wú)線電導(dǎo)航、發(fā)動(dòng)機(jī)控制等系統(tǒng)

IRS是FMC基本傳感器，向FMC提供2~3臺(tái)IRU輸出的導(dǎo)航數(shù)據(jù)（飛機(jī)緯度位置，真航向，磁航向，南北和東西向速度，俯仰和傾斜角，高度，升降速度，地速），F(xiàn)MC進(jìn)行加權(quán)平均，主要參數(shù)有PPOS、GS、TRK、WIND等。

DADC通過(guò)ARINC429向FMC提供高度、溫度、馬赫數(shù)、空速等信息。

2、處理分系統(tǒng)——飛行管理計(jì)算機(jī)系統(tǒng)（FMCS）

FMCS包括FMC和CDU，是飛管系統(tǒng)的中樞。

3、執(zhí)行分系統(tǒng)——自動(dòng)飛行系統(tǒng)（AFCS）AFCS也有稱作自動(dòng)駕駛/飛行指引儀系統(tǒng)，由飛行控制計(jì)算機(jī)（FCC）、方式控制板（MCP）以及一些其他部件組成。

AFCS是FMCS的執(zhí)行部分，對(duì)AP、FD、STB/TRIM、A/T提供綜合控制。AFCS-MCP給FMC提供LNAV、VNAV制導(dǎo)銜接，選擇目標(biāo)空速、目標(biāo)馬赫數(shù)，F(xiàn)MC向飛行控制計(jì)算機(jī)（FCC）提供經(jīng)濟(jì)目標(biāo)空速、目標(biāo)馬赫數(shù)。

A/T（自動(dòng)油門）是FMCS的執(zhí)行部分，F(xiàn)MC通過(guò)FCC向A/T提供目標(biāo)推力，從而控制飛行速度。

A/T包括油門伺服機(jī)構(gòu)（放大器、電機(jī)）和油門桿。

4、顯示分系統(tǒng)一般是EFIS和ECAM。

組成及數(shù)據(jù)流關(guān)系，如下圖所示：

功能：

飛管系統(tǒng)的基本功能包括飛行計(jì)劃、導(dǎo)航與制導(dǎo)、性能優(yōu)化與預(yù)測(cè)、電子飛行儀表系統(tǒng)顯示。目前，一個(gè)典型的飛行管理系統(tǒng)不僅能夠根據(jù)飛機(jī)、發(fā)動(dòng)機(jī)性能、起飛著陸機(jī)場(chǎng)、航路設(shè)施能力、航路氣象條件及其裝載情況，生成具體的全剖面飛行計(jì)劃，而且能夠?qū)崿F(xiàn)多種功能，包括：通過(guò)主飛行顯示系統(tǒng)顯示和指示有關(guān)飛行信息；通過(guò)無(wú)線電通信與導(dǎo)航系統(tǒng)獲得通信、空中交通和無(wú)線電導(dǎo)航數(shù)據(jù)；通過(guò)飛行操縱系統(tǒng)控制飛機(jī)的姿態(tài)；通過(guò)自動(dòng)油門系統(tǒng)調(diào)節(jié)發(fā)動(dòng)機(jī)功率；通過(guò)中央數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)收集、記錄和綜合處理數(shù)據(jù)；通過(guò)空地?cái)?shù)據(jù)鏈系統(tǒng)收發(fā)航行數(shù)據(jù)；通過(guò)機(jī)上告警系統(tǒng)提供系統(tǒng)監(jiān)控和告警等功能。

飛行計(jì)劃：

導(dǎo)航：

性能：

具體功能后續(xù)補(bǔ)充。

飛管的發(fā)展及國(guó)內(nèi)外現(xiàn)狀： 飛管最初是從導(dǎo)航演變而來(lái)，逐步整合性能、顯示等功能，大致經(jīng)歷以下5個(gè)發(fā)展階段：區(qū)域?qū)Ш较到y(tǒng)、性能管理系統(tǒng)、飛行管理系統(tǒng)、四維導(dǎo)航和新一代飛行管理系統(tǒng)。

FMS的研究，國(guó)外開展要比國(guó)內(nèi)早，其研究已經(jīng)趨于穩(wěn)定，并且有相應(yīng)的FMS產(chǎn)品應(yīng)用于大型民用飛機(jī)上。例如波音和空客等。目前的飛管系統(tǒng)產(chǎn)品的核心技術(shù)主要控制在美國(guó)霍尼韋爾等少數(shù)公司手中。從當(dāng)前世界上飛行管理系統(tǒng)的應(yīng)用情況來(lái)看，目前生產(chǎn)飛行管理系統(tǒng)產(chǎn)品的公司主要有美國(guó)的霍尼韋爾、羅克韋爾·柯林斯和通用航空電子，英國(guó)的史密斯航空航天公司，法國(guó)的泰萊斯航空電子公司和加拿大的CMC。

國(guó)內(nèi)對(duì)于飛管的研究還處于初期階段，目前國(guó)內(nèi)飛行管理系統(tǒng)的產(chǎn)品較少。

第三篇：材料核算系統(tǒng)會(huì)同

材料核算系統(tǒng)會(huì)同__ABCD___系統(tǒng)發(fā)生數(shù)據(jù)聯(lián)系。

A.賬務(wù)系統(tǒng)B.成本系統(tǒng)C.應(yīng)收帳款系統(tǒng)D.應(yīng)付帳款系統(tǒng)

標(biāo)準(zhǔn)答案： A、B、C、D

12.下列會(huì)計(jì)檔案中，保管期限為15年的有___ACD___。

A.原始憑證B.現(xiàn)金日記賬C.會(huì)計(jì)移交清冊(cè)D.記賬憑證

13.從計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)管理技術(shù)的發(fā)展來(lái)看，會(huì)計(jì)核算軟件經(jīng)歷的階段有__ACD____。

A.人工管理B.手工核算C.文件管理系統(tǒng)D.數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)

14.會(huì)計(jì)軟件安全可靠性措施的完備性具體是指__ABCD____。

A.操作人員的使用權(quán)限的控制B.憑證輸入過(guò)程中的錯(cuò)誤檢查

C.未審核的憑證不允許記賬D.強(qiáng)制備份、數(shù)據(jù)恢復(fù)

會(huì)計(jì)電算化的重要作用體現(xiàn)在__ACD____。

A.提高會(huì)計(jì)數(shù)據(jù)處理的時(shí)效性和準(zhǔn)確性，提高會(huì)計(jì)核算的水平和質(zhì)量，減輕會(huì)計(jì)人員的勞動(dòng)強(qiáng)度

B.會(huì)計(jì)電算化已經(jīng)成為一門金融會(huì)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、信息科學(xué)和管理科學(xué)為一體的邊緣科學(xué)

C.推動(dòng)會(huì)計(jì)技術(shù)、方法、理論創(chuàng)新和觀念更新，促進(jìn)會(huì)計(jì)工作進(jìn)一步發(fā)展

D.提高經(jīng)營(yíng)管理水平，使財(cái)務(wù)會(huì)計(jì)管理由事后管理向事先預(yù)測(cè)、事中控制轉(zhuǎn)變，為管理信息化打下基礎(chǔ)一般會(huì)計(jì)報(bào)表的數(shù)據(jù)來(lái)源有ABC。

A.從本表或其他報(bào)表取數(shù)B.從賬務(wù)處理系統(tǒng)的總賬、明細(xì)賬、輔助賬，以及其他核算子系統(tǒng)取數(shù)

C.從系統(tǒng)外部取數(shù)，包括直接手工輸入、軟盤或通訊線路傳入等D.公式取數(shù)

計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)按通信介質(zhì)分類，可分為__AC____。

A.光纖網(wǎng)B.專用網(wǎng)C.同軸電纜網(wǎng)D.星型網(wǎng)

會(huì)計(jì)電算化的意義有__ABCD____。

A.提高會(huì)計(jì)工作效率B.提高會(huì)計(jì)人員素質(zhì)C.推動(dòng)企業(yè)管理現(xiàn)代化D.促進(jìn)工作職能的轉(zhuǎn)變 《會(huì)計(jì)核算軟件基本功能規(guī)范》中對(duì)記賬憑證的編號(hào)有以下__AD____規(guī)定。

A.同一類型的記賬憑證必須保證當(dāng)月憑證編號(hào)的連續(xù) B.同一類型的記賬憑證當(dāng)月憑證編號(hào)可以不連續(xù)

C.不可以由鍵盤手工輸入憑證編號(hào)D.可以由會(huì)計(jì)核算軟件自動(dòng)產(chǎn)生憑證編號(hào)

固定資產(chǎn)管理子系統(tǒng)應(yīng)具備的功能有___ABCD___。

A.管理固定資產(chǎn)的增減變動(dòng)情況B.管理固定資產(chǎn)卡片C.計(jì)提折舊D.計(jì)算固定資產(chǎn)凈值

第四篇：酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得

Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得

甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)有不少優(yōu)點(diǎn)，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)最為人熟知，并廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)。雖然說(shuō)酵母表達(dá)操作簡(jiǎn)單表達(dá)量高，但是在實(shí)際操作中，并不是每個(gè)外源基因都能順利得到高表達(dá)的。不少人在操作中會(huì)遇到這樣那樣的問(wèn)題，收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個(gè)被譽(yù)為最簡(jiǎn)單的畢赤酵母表達(dá)的經(jīng)典試劑盒過(guò)程中的心得體會(huì)。其中Xiang Yang是來(lái)自美國(guó)喬治城大學(xué)（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lombardi Cancer Center），部分用戶來(lái)自國(guó)內(nèi)。甲醇酵母部分優(yōu)點(diǎn)：

1.屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達(dá)； 2.AOX強(qiáng)效啟動(dòng)子，外源基因產(chǎn)物表達(dá)量高，表達(dá)產(chǎn)物可以達(dá)到每升數(shù)克的水平； 3.酵母培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，遠(yuǎn)較真核系 統(tǒng)簡(jiǎn)單，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；

4.可以誘導(dǎo)表達(dá)，也可以分泌表達(dá)，便于產(chǎn)物純化；

5.可以甲醇代替IPTG作為誘導(dǎo)物，部分甲醇酵母更可以用工業(yè)甲醇替代葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本低。

產(chǎn)品性能：優(yōu)點(diǎn)——使用簡(jiǎn)單，表達(dá)量高，His-tag便于純化；缺點(diǎn)——酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問(wèn)題。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達(dá)重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達(dá)出來(lái)的蛋白可以進(jìn)行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長(zhǎng)速度快，可以將表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。

畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ在多克隆位點(diǎn)（MCR）3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測(cè)和純化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表達(dá)，并且在表達(dá)后α-factor可以自動(dòng)被切除。在進(jìn)行克隆的時(shí)候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標(biāo)蛋白中增加兩個(gè)氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標(biāo)記，而誘導(dǎo)表達(dá)的載體需要甲醇——甲醇比一般用于大腸桿菌表達(dá)誘導(dǎo)使用的IPTG便宜。第一步——構(gòu)建載體

Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點(diǎn)可供選擇，同時(shí)也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。

紅葉山莊：有關(guān)是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在原核表達(dá)，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點(diǎn)，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽(yáng)性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對(duì)于大小合適（30—50KD）的蛋白在產(chǎn)量上是pPIC9K無(wú)法比擬的。

leslie：要做畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)，首先當(dāng)然就要了解這個(gè)可愛的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛），她和大腸桿菌長(zhǎng)得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過(guò)程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測(cè)。大家做畢赤表達(dá)的時(shí)候應(yīng)該都遇過(guò)這種情況吧，表達(dá)過(guò)程中染菌（我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)污染過(guò)各種顏色形狀的細(xì)菌，那真是一段可怕的經(jīng)歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就是浪費(fèi)大把的

時(shí)間了。

基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長(zhǎng)的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長(zhǎng)的周期等等情況后，當(dāng)然更多的精力還是應(yīng)該花在表達(dá)的目的蛋白上，我的表達(dá)蛋白有些恐怖，有100KD，本來(lái)當(dāng)然應(yīng)該放在大腸桿菌中表達(dá)，但是為了分泌表達(dá)（其實(shí)后來(lái)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pET系列分泌表達(dá)系列也不錯(cuò)）和糖基化修飾（主要是這個(gè)方面，因?yàn)槲业牡鞍资侨嗽吹模磉_(dá)出來(lái)用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長(zhǎng)，所以在做克隆的時(shí)候也要非常小心，需要注意的是：

①酶切位點(diǎn)不能出現(xiàn)在目的DNA片段中——如果片段長(zhǎng)無(wú)法避免，可以采用平末端連接；

②雖然α-factor可以自動(dòng)切除，但是在設(shè)計(jì)表達(dá)的時(shí)候，如果在N端不能出現(xiàn)任何多余的aa（比如藥物蛋白表達(dá)），需要特別留意（說(shuō)明書上有詳細(xì)說(shuō)明：P13）；

③有三種不同的讀碼框（對(duì)于pPICZα系列來(lái)說(shuō)就是對(duì)上α-factor序列），在設(shè)計(jì)克隆的時(shí)候要反復(fù)確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問(wèn)題；

④無(wú)論pPICZ還是pPICZα都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒(méi)有ATG（起始密碼子），有人認(rèn)為酵母啟動(dòng)子與外源基因的ATG之間的距離越短對(duì)于表達(dá)的該基因越有利；

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；

⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關(guān)基因表達(dá)偏好密碼子的問(wèn)題有人認(rèn)為沒(méi)有必要更換，有人認(rèn)為一定要換，個(gè)人認(rèn)為以產(chǎn)量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過(guò)長(zhǎng)就比較麻煩，不過(guò)有許多真核保守蛋白其實(shí)是和酵母密碼子相似的；

⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因?yàn)榕掠绊懙娇股刈饔茫╖eocin平板要避光保存）；

⑧測(cè)序引物可以用α-factor信號(hào)引物，也可以用5'AOX1引物；

⑨如果需要高量表達(dá)，可以考慮做克隆的時(shí)候串聯(lián)基因片段進(jìn)行表達(dá)，另外也可以在轉(zhuǎn)化酵母的時(shí)候重復(fù)轉(zhuǎn)化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因?yàn)檫@個(gè)序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會(huì)影響表達(dá)，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因?yàn)檫@些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會(huì)由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄，也需要多加注意。

第二步就是將線性化的DNA轉(zhuǎn)化入Pichia酵母中：

Xiang Yang：EasySelect試劑盒準(zhǔn)備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因?yàn)檫@個(gè)菌株轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量相對(duì)而言較高，如果你有電轉(zhuǎn)儀（electroporator），可以嘗試一下。如果沒(méi)有的話，EasySelect也準(zhǔn)備了化學(xué)轉(zhuǎn)化試劑——EasyComp Transformation，但是由于轉(zhuǎn)化率的緣故，我建議使用電轉(zhuǎn)儀。

leslie：在得到了正確的序列之后就可以準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點(diǎn)有些不盡相同

（Manual上寫的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔(dān)心轉(zhuǎn)化率的話可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT＋表現(xiàn)型，也就是說(shuō)可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)，但是據(jù)說(shuō)會(huì)對(duì)外源基因表達(dá)有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護(hù)表達(dá)產(chǎn)物免受降解，促進(jìn)表達(dá)量的提高。

一般來(lái)說(shuō)，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用Mut－細(xì)胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對(duì)較多(約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進(jìn)行。而對(duì)于分泌蛋白的表達(dá)，無(wú)論是甲醇利用慢(Mut-)還是甲醇利用快(Mut+)的細(xì)胞都可應(yīng)用，如在人血清白蛋白(HSA)(為分泌型蛋白)的表達(dá)中就看不出兩種類型的細(xì)胞之間有什么明顯差別。

所以一般手冊(cè)都會(huì)建議同時(shí)在這幾種菌株中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這主要是因?yàn)椴煌幕蛟诓煌慕湍妇锌赡鼙磉_(dá)量截然不同，因此在最開始的時(shí)候建議多用幾種酵母菌實(shí)驗(yàn)。

另外有個(gè)保存問(wèn)題，原始酵母菌一定要保存好，因?yàn)榻湍冈趥鞔啻魏髸?huì)影響其轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量，所以一方面分多管分裝保存于-80℃，另一方面如果出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化或者表達(dá)的問(wèn)題，在其它方面都沒(méi)有出錯(cuò)的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。

在準(zhǔn)備酵母菌的同時(shí)也需要準(zhǔn)備質(zhì)粒，由于酵母菌轉(zhuǎn)化對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的要求較高，量也較大（5-10ug），因此許多時(shí)候都會(huì)用PEG大提質(zhì)粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準(zhǔn)備好足夠量的質(zhì)粒，并且不要忘記也要同時(shí)準(zhǔn)備空載體以做對(duì)照。在轉(zhuǎn)化前質(zhì)粒需要進(jìn)行線性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達(dá)量高的一個(gè)重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達(dá)）。線性化位點(diǎn)個(gè)人認(rèn)為也會(huì)影響到表達(dá)量，對(duì)于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個(gè)線性化位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機(jī)會(huì)少，而且也有可能遇上沒(méi)有合適的線性化位點(diǎn)的情況，這個(gè)時(shí)候也不是說(shuō)不能進(jìn)行表達(dá)，但是準(zhǔn)備的質(zhì)粒就要增加10倍，另外也可以進(jìn)行部分酶切（即先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，掐定時(shí)間和酶量保證被切開的質(zhì)粒有部分是在線性化位點(diǎn)切開而基因片段保存完好）。

在線性化之后的質(zhì)粒就可以酒精沉淀回收了——中間步驟需要使酶失活，說(shuō)明書建議是熱失活或者EDTA，個(gè)人認(rèn)為前者比較好，主要是擔(dān)心EDTA對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65℃/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風(fēng)干，這一步需要多加注意保證風(fēng)干完全，因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)證明殘留的酒精對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響頗大。

接下來(lái)就是酵母轉(zhuǎn)化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實(shí)驗(yàn)決定表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)化方法有不少，例如電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，其方法的難易程度和轉(zhuǎn)化率高低呈反向遞減的，也就是說(shuō)電轉(zhuǎn)最容易，轉(zhuǎn)化率較高（但要求有電轉(zhuǎn)儀），而原生質(zhì)體最麻煩，而且效果不好（比較傳統(tǒng)），因此不建議使用，EasySelect說(shuō)明書上這么建議，并且也詳細(xì)說(shuō)明了電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化（EasyComp和LiCl）方法的過(guò)程，可以按部就班。需要注意的是（電轉(zhuǎn)過(guò)程）：

①最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過(guò)的酵母放置時(shí)間不要超過(guò)一個(gè)星期；

②擴(kuò)大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，個(gè)人認(rèn)為不需要OD600達(dá)到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，這個(gè)時(shí)候的酵母比較新鮮，轉(zhuǎn)化率比較高； ③整個(gè)感受態(tài)制作過(guò)程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機(jī)，這是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵——為了進(jìn)一步保證這一點(diǎn)，無(wú)菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉(zhuǎn)杯都要預(yù)冷；

④電轉(zhuǎn)儀需要預(yù)熱，所以準(zhǔn)備感受態(tài)的時(shí)候就可以把電轉(zhuǎn)儀打開了，電轉(zhuǎn)后山梨醇的加入要快，曾有人做實(shí)驗(yàn)證明晚一秒就會(huì)降低轉(zhuǎn)化的數(shù)量級(jí)，雖然不一定可信，但是我個(gè)人也認(rèn)為這個(gè)過(guò)程要快，電轉(zhuǎn)后可以看看時(shí)間，如果時(shí)間過(guò)短（比如(4)就可能說(shuō)明雜質(zhì)較多，會(huì)影響轉(zhuǎn)化率；

⑤轉(zhuǎn)化后溫育是個(gè)增加同源重組，增加存活率的過(guò)程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30℃搖一段時(shí)間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉(zhuǎn)化率。

(化學(xué)轉(zhuǎn)化)

如果沒(méi)有電轉(zhuǎn)儀，LiCl轉(zhuǎn)化是一種可供選擇的方法，轉(zhuǎn)化率是102到103cfu/ug。

主要過(guò)程為： 取過(guò)夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8-1.0；4℃，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL，4℃，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50μl冰預(yù)冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至80-90ml。

LiCl轉(zhuǎn)化 取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞12 000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入 50%PEG240ml 1mmol/L LiCl

ml 單鏈鮭精DNA

25ml 線性化質(zhì)粒DNA 10 ml(約10mg)用吸頭反復(fù)吹打，使細(xì)胞沉淀與加入的溶液混勻，30℃靜置溫育30min，42℃熱擊20-25min，4500rpm離心10min，吸棄轉(zhuǎn)化液，細(xì)胞沉淀加1ml YPD培養(yǎng)基于30℃ 200 rpm培養(yǎng)2-4hr，取轉(zhuǎn)化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培養(yǎng)2-3天。

第三步——挑克隆篩選

Xiang Yang：在protocol中用了許多篇幅來(lái)指導(dǎo)這一步，包括如何去通過(guò)平板篩選，觀測(cè)生長(zhǎng)速率來(lái)確定Mut表現(xiàn)型等。這個(gè)過(guò)程需要3到5天，而我一般只用用了4個(gè)小時(shí)進(jìn)行PCR（AOX引物）篩選。

leslie：完成轉(zhuǎn)化后就是克隆鑒定的過(guò)程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過(guò)程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因?yàn)楸容^快），具體過(guò)程protocol上說(shuō)的很清楚，其實(shí)也很簡(jiǎn)單，就是凍融破菌進(jìn)行菌落PCR，但是其中許多具體細(xì)節(jié)問(wèn)題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問(wèn)題，許多人用PCR方法進(jìn)行鑒定都無(wú)法得到結(jié)果，甚至在表達(dá)出了以后還是無(wú)法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無(wú)法正常釋放酵母基因組，一般通過(guò)培養(yǎng)菌然后進(jìn)行沸水和-20℃冷凍循環(huán)過(guò)程裂解細(xì)胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內(nèi)是可以得到好的結(jié)果的，但是有時(shí)候片段過(guò)長(zhǎng)，模壁就會(huì)阻礙擴(kuò)增，所以我們實(shí)驗(yàn)室會(huì)用蝸牛酶（很便宜的酶來(lái)的）來(lái)幫助溶菌，我看許多實(shí)驗(yàn)室也會(huì)這么做，不過(guò)加入的時(shí)間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。

第二就是是模板量，個(gè)人建議模板真的不要加太多了，按照說(shuō)明書的上的5ul我覺得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當(dāng)然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來(lái)凍融的菌數(shù)量有關(guān)。其次是假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會(huì)出現(xiàn)3.6kb的片段，而Mut+則會(huì)出現(xiàn)AOX1基因原本長(zhǎng)度的片段——大約長(zhǎng)2.2kb，因此如果的基因片段長(zhǎng)度相似，要注意區(qū)分。建議PCR過(guò)程中使用多對(duì)引物進(jìn)行反應(yīng)，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各種對(duì)照多了有利于比較——當(dāng)然前提是你不能暈了頭。

掉了毛的鴕鳥：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄終止子(5’AOX1和3’AOX1),他們被多克隆位點(diǎn)分開,外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標(biāo)記（HIS4區(qū)的整合方式為位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4）恢復(fù)野生型.HIS4區(qū)或AOX1區(qū)位點(diǎn)的整合都使轉(zhuǎn)化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進(jìn)行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS＋表型以篩選轉(zhuǎn)化子.）及3’AOX1區(qū),當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí),他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個(gè)載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,外源基因在5’AOX1啟動(dòng)子的控制下表達(dá).在載體中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關(guān),通過(guò)篩選抗G418能力強(qiáng)的酵母即可獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.第四步——表達(dá)

Xiang Yang：將你的克隆在YPD培養(yǎng)基中培育到OD600值達(dá)到6.0，就可以離心收菌。用表達(dá)培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30oC培育過(guò)夜。

leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說(shuō)什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達(dá)，有許多人在酵母表達(dá)上花費(fèi)了大量的時(shí)間——不同于大腸桿菌的兩天出結(jié)果，一次畢赤酵母的表達(dá)就需要起碼一周的時(shí)間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場(chǎng)空，我個(gè)人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉(zhuǎn)化的酵母菌，另外調(diào)整進(jìn)行重新轉(zhuǎn)化。

另外剛開始的時(shí)候可以用小量表達(dá)，可以用5ml：生長(zhǎng)慢型，生長(zhǎng)快型，陰性對(duì)照（空質(zhì)粒），陽(yáng)性對(duì)照（可以是曾經(jīng)表達(dá)成功的重組子）和沒(méi)有進(jìn)行轉(zhuǎn)化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值2-6，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時(shí)間，一半為20-30分鐘，讓菌沉淀下來(lái)，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉(zhuǎn)入BMMY中誘導(dǎo)表達(dá)，這些步驟都需要在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行，如果要區(qū)分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表達(dá)，有可能會(huì)在沒(méi)有達(dá)到4天的時(shí)間培養(yǎng)基就干了，所以可以適當(dāng)補(bǔ)充一些，以及在搖床里放置盛有無(wú)菌水的深口瓶，來(lái)保持搖床里濕度。

誘導(dǎo)物甲醇注意要在超凈臺(tái)中打開，可以分裝到滅過(guò)菌的瓶子中——當(dāng)然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過(guò)甲醇瓶口的時(shí)候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。另外如果覺得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過(guò)紗布添加甲醇，這個(gè)方法可能會(huì)造成染菌，慎選。說(shuō)到紗布就想到了通氣性問(wèn)題，酵母在無(wú)氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導(dǎo)的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對(duì)于這一基因的表達(dá)影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個(gè)搖床進(jìn)行三十度酵母表達(dá)，這樣可以考慮將紗布減少到3—5層，同時(shí)需要注意的是搖瓶?jī)?nèi)菌液體積不要超過(guò)10-30%。

每天取樣出來(lái)進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過(guò)每天做膠跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時(shí)跑，不過(guò)樣品一定要煮過(guò)凍存，而且每次取樣不要反復(fù)凍融，最好分裝保存——因?yàn)榈鞍捉?jīng)煮沸變性會(huì)不穩(wěn)定，容易降解。另外為了防止蛋白在分泌出來(lái)的過(guò)程就降解了（特別是小分子蛋白），也可以通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說(shuō)明書講解得詳細(xì)），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護(hù)物質(zhì)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白水解酶 的活性來(lái)防止表達(dá)產(chǎn)物降解。

如果使用的是分泌型培養(yǎng)基，按道理收集培養(yǎng)基上清就可以進(jìn)行下一步分析了，但是由于培養(yǎng)基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測(cè)不出來(lái)的——除非你的表達(dá)蛋白量非常大。所以需要進(jìn)行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當(dāng)然最簡(jiǎn)單的就是煮沸蒸發(fā)水分濃縮了。另外跑膠的時(shí)候同時(shí)對(duì)照酵母胞內(nèi)蛋白，以防沒(méi)有分泌出來(lái)。SDS-PAGE的配置參見分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對(duì)應(yīng)性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過(guò)是個(gè)需要全盤重新準(zhǔn)備的過(guò)程，要考慮清楚。如果選用的載體是帶有信號(hào)肽的，雖說(shuō)是分泌表達(dá)好純化，但實(shí)際上畢赤酵母本身還是有本底表達(dá)的，而且有時(shí)候會(huì)造成假陽(yáng)性，所以最后表達(dá)過(guò)程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細(xì)節(jié)可見Western Blotting前傳：想成為高手嗎？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒(méi)有合適抗體（如果是利用從大腸表達(dá)出來(lái)的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統(tǒng)表達(dá)出來(lái)的蛋白無(wú)法發(fā)生免疫作用），可以選用anti-myc或者anti-his的，前提當(dāng)然是你的蛋白沒(méi)有提前終止。

其它在表達(dá)中可能出現(xiàn)的情況包括表達(dá)量低，沒(méi)有分泌表達(dá)（針對(duì)pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無(wú)法重復(fù)，表達(dá)出來(lái)的蛋白偏大等等，需要分各個(gè)方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號(hào)肽，但是就是無(wú)法分泌出來(lái)，這可能是蛋白結(jié)構(gòu)在通過(guò)細(xì)胞膜的時(shí)候受到了阻礙，可能需要重新轉(zhuǎn)化，更換線性化位點(diǎn)或者更換菌株；如果蛋白表達(dá)第一天較高，但是之后越來(lái)越少，這很有可能是蛋白降解了或者產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)；畢赤酵母無(wú)法重復(fù)的問(wèn)題比較嚴(yán)重，許多情況下在第一次獲得了高量表達(dá)之后就再怎么也重復(fù)不了這個(gè)結(jié)果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達(dá)出來(lái)的蛋白分子量偏大則是個(gè)正常現(xiàn)象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進(jìn)行WB或進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

第五步——發(fā)酵和產(chǎn)物純化

Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE Healthcare），經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一個(gè)大小為45kDa，可以通過(guò)二硫鍵形成反向平行二聚體(antiparallel homodimer)的糖蛋白，經(jīng)過(guò)純化，我通過(guò)一個(gè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(cell proliferation assay)檢測(cè)了其活性，結(jié)果表明表達(dá)出來(lái)的蛋白在體外有完全的活性。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結(jié)合活性，與對(duì)照(通過(guò)大腸桿菌和Bacular細(xì)胞未帶tag的蛋白)相比，his-tag有一點(diǎn)副作用。

伊可麗：由于在搖瓶培養(yǎng)中巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的水平往往不能準(zhǔn)確地反映罐發(fā)酵中的表達(dá)情況，使之成為令人頭痛的問(wèn)題。主要原因是在搖瓶培養(yǎng)中，培養(yǎng)液的pH值無(wú)法控制，培養(yǎng)物通氣不充分及無(wú)法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對(duì)每一個(gè)表達(dá)菌株進(jìn)行繁瑣的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)，仍需摸索表達(dá)菌株的搖瓶培養(yǎng)條件，使其產(chǎn)物的表達(dá)量與預(yù)期的發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果相近。

總而言之，EasySelect系統(tǒng)是一個(gè)便于操作的酵母表達(dá)系統(tǒng)，我已經(jīng)使用這一系統(tǒng)表達(dá)過(guò)15個(gè)類似物了，每一個(gè)我都獲得了超過(guò)1mg/1升培養(yǎng)液的純化蛋白。

第五篇：暢言語(yǔ)音教具系統(tǒng)使用心得

暢言語(yǔ)音教具系統(tǒng)使用心得

作為一名農(nóng)村小學(xué)的英語(yǔ)教師，我一直都有一個(gè)愿望：讓學(xué)生在每節(jié)課的課堂上都能聽到地地道道的英語(yǔ)口語(yǔ)，師生暢言語(yǔ)音在課堂上用英語(yǔ)暢所欲言。但是由于多方原因，要達(dá)到這種境界似乎很難。

最近“暢言智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)”的到來(lái)，讓我的教學(xué)工作有了新的起色。一開始看到暢言智能教具，并沒(méi)有在意。后來(lái)在慢慢的摸索，逐步使用的過(guò)程中，我終于體驗(yàn)到了它強(qiáng)大而奇妙的功能?，F(xiàn)在，我在教學(xué)中已越來(lái)越離不開它了。我認(rèn)為這套教具對(duì)于英語(yǔ)教師自身素質(zhì)、英語(yǔ)課堂教學(xué)效果和學(xué)生的綜合能力等各方面的提高有著重大作用。

下面就簡(jiǎn)單談?wù)勈褂脮逞哉Z(yǔ)音教具的體會(huì)：

一、簡(jiǎn)單方便易操作，提高教學(xué)效率。

首先，暢言智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)用法非常簡(jiǎn)單，教師只需用識(shí)別筆點(diǎn)擊課本上的內(nèi)容，主機(jī)就朗讀相應(yīng)的英文單詞、句子，唱歌曲歌謠等等，不但節(jié)省了錄音機(jī)倒帶的時(shí)間，而且解放了教師。這樣一來(lái)教師可以巡視、關(guān)注每一個(gè)學(xué)生的情況，了解學(xué)生學(xué)習(xí)效果，適時(shí)指導(dǎo)，增大了課堂容量。

其次，識(shí)別筆可以一筆多用，除了點(diǎn)擊要播放的內(nèi)容以外，識(shí)別筆的激光燈可以當(dāng)作教鞭使用，引導(dǎo)學(xué)生觀看要學(xué)習(xí)的目標(biāo)；識(shí)別筆上的任意功能鍵還可以幫助維護(hù)課堂秩序，提醒學(xué)生們集中注

意力；另外在課堂上需要結(jié)束學(xué)生熱烈討論的時(shí)候，用此鍵可以起“喚醒”和“終止”的作用，提高了各個(gè)教學(xué)環(huán)節(jié)的學(xué)習(xí)效果。

二、優(yōu)化英語(yǔ)課堂，調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)英語(yǔ)的積極性。

傳統(tǒng)的英語(yǔ)課堂教學(xué)，組織形式單一。只有老師的講解、提問(wèn)、學(xué)生的回答、跟錄音機(jī)反復(fù)讀，很難吸引學(xué)生的注意力，智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)給這樣的課堂注入了新的活力。

暢言智能語(yǔ)音教具中語(yǔ)音合成，自制教具的功能，可以把任意實(shí)物，圖片，卡片等制成生動(dòng)有趣的有聲教具，讓他們自己開口說(shuō)英語(yǔ)，還可以利用人與主機(jī)對(duì)話交流，使英語(yǔ)課堂變得更加直觀、形象、真實(shí)、從而課堂變得生動(dòng)活潑有趣。例如，在講動(dòng)物單詞的時(shí)候，我自己錄制了貓和狗的叫聲，來(lái)引入單詞教學(xué)；講蔬菜水果單詞時(shí)，我將相應(yīng)單詞讀音輸入識(shí)別碼中，然后貼到相應(yīng)圖片上，用筆一點(diǎn)就能說(shuō)話，這樣一來(lái)，學(xué)生覺得很奇妙，自然興趣就提高了。還可以利用合成聲音，選擇女聲或男聲朗讀，使學(xué)生在純正的語(yǔ)言中感知英語(yǔ)。并通過(guò)有聲實(shí)物，標(biāo)準(zhǔn)聲音，有聲圖片等把枯燥的單詞，抽象的敘述以生動(dòng)活潑的形象顯現(xiàn)出來(lái)，使學(xué)生的大腦變得異常興奮，注意力非常集中，學(xué)習(xí)的積極性隨之調(diào)動(dòng)起來(lái)。

三、提高教師自身素質(zhì)，促進(jìn)學(xué)生的發(fā)展。

暢言智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)提供的“發(fā)音評(píng)測(cè)”、“中英文朗讀”功能為我們教師自身發(fā)展提供了很好的學(xué)習(xí)工具，在一定程度上也促進(jìn)了學(xué)生的發(fā)展。

“發(fā)音評(píng)測(cè)”相當(dāng)于隨時(shí)隨地的口語(yǔ)校正“老師”，利用它可以對(duì)教師自己的發(fā)音進(jìn)行測(cè)試，比較差異，提高發(fā)音的標(biāo)準(zhǔn)度。也可以對(duì)學(xué)生單詞、句子和篇章的發(fā)音準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)測(cè)，系統(tǒng)立即打分，得出錯(cuò)對(duì)辨率，我們可以對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，改正錯(cuò)誤的發(fā)音。

“中英文朗讀”功能中的“每日推薦”板塊提供了大量的英文閱讀材料，是老師提升英語(yǔ)閱讀及聽力能力的絕妙的好機(jī)會(huì)，每日內(nèi)容不同，涉及面廣，我們不需要花大量的時(shí)間和精力去尋找或購(gòu)買英語(yǔ)報(bào)刊等，很輕松地就能增加我們的課外知識(shí)，提高我們的語(yǔ)言綜合運(yùn)用能力。

除此之外，暢言智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)還有許多重要的功能：

第一，暢言智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了中英文對(duì)照朗讀功能，這 是區(qū)別于其他英語(yǔ)語(yǔ)音教具的一大亮點(diǎn)。

一般的語(yǔ)音教具僅能播放英語(yǔ)課文的朗讀，很難實(shí)現(xiàn)英漢同步播放。為了能更好的利用暢言智能語(yǔ)音教具軟件系統(tǒng)解決此類矛盾，服務(wù)于現(xiàn)代英語(yǔ)教學(xué)，我的想法是：在語(yǔ)音合成過(guò)程中同時(shí)輸入英文和中文，對(duì)發(fā)音人進(jìn)行配合選擇，這樣便可以聽取中英文對(duì)照的朗讀，解決了部分學(xué)生的聽力理解較差的難題。具體的做法是將手頭的中英文對(duì)照文本，或者是一段中文一段英文的文本上傳至?xí)逞灾悄苷Z(yǔ)音教具軟件，在軟件的“高級(jí)朗讀模式”中，可以用中文發(fā)音人（“中文男聲”或者“中文女聲”）來(lái)朗讀中文，用英文發(fā)音人（“英文男聲”或者“英文女聲”）來(lái)朗讀英文，這樣，就可以聽到中英文對(duì)照朗讀了。若有的中英文對(duì)

照文本，英文較簡(jiǎn)單只需要朗讀英文部分，而中文部分不需要朗讀，那么可以這樣設(shè)置：選擇英文部分，選擇英文男聲或女聲發(fā)音人；選擇中文部分，選擇“不朗讀”即可。

第二，借助暢言智能語(yǔ)音教具中英文“高級(jí)朗讀模式”你還可以根據(jù)課文的難易，學(xué)生的反應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)朗讀的速度，獲取最佳的聽覺效果。

第三，系統(tǒng)軟件上附帶的“生詞表”可以說(shuō)是一本“活字典”，不僅可以幫助教師和學(xué)生查找任何一個(gè)生疏的單詞，還可以點(diǎn)讀、跟讀、模仿，一定程度上降低了學(xué)生出現(xiàn)啞巴英語(yǔ)的可能性。從“生詞表”中，可以看到生詞以字母順序進(jìn)行排列，當(dāng)鼠標(biāo)指向某個(gè)詞語(yǔ)或短語(yǔ)時(shí)，會(huì)給出詞語(yǔ)相應(yīng)的解釋，使用者可以點(diǎn)擊“試聽”來(lái)聽取標(biāo)準(zhǔn)的讀音。最為便捷的是，用戶還可以任意搜索需要的詞語(yǔ)或者選擇是否需要顯示詞語(yǔ)的解釋，這樣為使用者提供了很大的方便。

總之，智能語(yǔ)音教具的到來(lái)，對(duì)我們廣大英語(yǔ)教師來(lái)講真是增添了一個(gè)好幫手，它給我們帶來(lái)了很大的的方便，豐富了教學(xué)手段，使課堂生動(dòng)起來(lái)，給學(xué)生帶來(lái)了學(xué)習(xí)英語(yǔ)的好環(huán)境，大大調(diào)動(dòng)了學(xué)生學(xué)習(xí)英語(yǔ)的積極性，增強(qiáng)了學(xué)習(xí)興趣。相信，在我和它以后相處的日子里，我會(huì)進(jìn)一步加深對(duì)它的認(rèn)識(shí)，更好的將它應(yīng)用于現(xiàn)代英語(yǔ)教學(xué)中。