第一篇：分銷系統(tǒng)使用心得

分銷系統(tǒng)使用心得

在使用分銷系統(tǒng)給客戶分配具體卷煙數(shù)量時(shí)，我們經(jīng)常遇到對不同類型的客戶分配不同數(shù)量卷煙的情況，比如對以下幾類客戶分配卷煙時(shí)，會出現(xiàn)以下幾種情況：

1、一周訂貨一次客戶：一次分配A品牌煙10條；

2、半月訂貨一次客戶：一次分配A品牌煙20條；

3、一周訂貨一次客戶：已辦電子結(jié)算的，一次分配A品牌煙15條；

4、半月訂貨一次客戶：已辦電子結(jié)算的，一次分配A品牌煙25條；

在將上述幾種情況輸入系統(tǒng)時(shí)，我們以前通常的做法是：

1、逐個(gè)尋找客戶后將所分配的卷煙數(shù)量輸入；

2、把客戶名單列出來，憑記憶找到各個(gè)客戶后輸入信息。這兩種方法雖然行的通，但是就實(shí)際操作來說非常麻煩，而且容易錯(cuò)漏。

以下方法是我從事客戶經(jīng)理后集大家智慧所成，具體操作如下：

一、設(shè)置客戶類型。

在“客戶類型”里設(shè)定3個(gè)屬性，單擊右上方“增加”這一選項(xiàng)。

1、在客戶類型類別中選擇“類型2”，在“客戶類型編碼”中輸入“半月”，在“類型描述”中輸入“半月一訪”后單擊保存。這樣第一個(gè)屬性就設(shè)置好了。

2、在客戶類型類別中選擇“類型5”，在“客戶類型編碼”中輸入“電結(jié)半”，在“類型描述”中輸入“電子結(jié)算半月訪”后單擊保存。這樣第二個(gè)屬性就設(shè)置好了。

3在客戶類型類別中選擇“類型5”，在“客戶類型編碼”中輸入“電結(jié)周”，在“類型描述”中輸入“電子結(jié)算一周訪”后單擊保存。這樣第三個(gè)屬性就設(shè)置好了。周訪”后單擊保存。這樣第三個(gè)屬性就設(shè)置好了。

二、設(shè)置單個(gè)客戶屬性。

進(jìn)入分銷系統(tǒng)，在“客戶”--->“經(jīng)營客戶信息”--->“經(jīng)營客戶維護(hù)”中，選擇對應(yīng)訪銷員，選擇訪銷線路，點(diǎn)擊查詢。

選定要修改的客戶，單擊“修改”，在第一頁“客戶類型2”選擇“半月一訪”，如果是電結(jié)客戶，在“客戶類型5”中根據(jù)情況選擇“電結(jié)半”、“電結(jié)周”，之后點(diǎn)擊“保存”。

選擇下個(gè)客戶并根據(jù)該客戶實(shí)際情況改動，這個(gè)步驟需要花很長的時(shí)間，但是“磨刀不誤砍柴功”。

三、修改限量。

設(shè)置好每個(gè)客戶的屬性和類型后，在“銷售”--->“銷 售管理”--->“客戶商品限量”中點(diǎn)擊“客戶單品增加”，在“商品編碼”中輸入對應(yīng)編碼，選定相應(yīng)屬性，本屬性的客戶可以全部出現(xiàn)，從而實(shí)現(xiàn)批量修改。

這樣對客戶限量的操作時(shí)間將從原來的半小時(shí)縮短到2分鐘不到。

以上是我使用分銷系統(tǒng)的一點(diǎn)心得，希望對大家有所裨益。

第二篇：酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得

Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得

甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)有不少優(yōu)點(diǎn)，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)最為人熟知，并廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)。雖然說酵母表達(dá)操作簡單表達(dá)量高，但是在實(shí)際操作中，并不是每個(gè)外源基因都能順利得到高表達(dá)的。不少人在操作中會遇到這樣那樣的問題，收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個(gè)被譽(yù)為最簡單的畢赤酵母表達(dá)的經(jīng)典試劑盒過程中的心得體會。其中Xiang Yang是來自美國喬治城大學(xué)（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lombardi Cancer Center），部分用戶來自國內(nèi)。甲醇酵母部分優(yōu)點(diǎn)：

1.屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達(dá)； 2.AOX強(qiáng)效啟動子，外源基因產(chǎn)物表達(dá)量高，表達(dá)產(chǎn)物可以達(dá)到每升數(shù)克的水平； 3.酵母培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，遠(yuǎn)較真核系 統(tǒng)簡單，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；

4.可以誘導(dǎo)表達(dá)，也可以分泌表達(dá)，便于產(chǎn)物純化；

5.可以甲醇代替IPTG作為誘導(dǎo)物，部分甲醇酵母更可以用工業(yè)甲醇替代葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本低。

產(chǎn)品性能：優(yōu)點(diǎn)——使用簡單，表達(dá)量高，His-tag便于純化；缺點(diǎn)——酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會出現(xiàn)蛋白切割問題。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達(dá)重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達(dá)出來的蛋白可以進(jìn)行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。

畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ在多克隆位點(diǎn)（MCR）3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測和純化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表達(dá)，并且在表達(dá)后α-factor可以自動被切除。在進(jìn)行克隆的時(shí)候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標(biāo)蛋白中增加兩個(gè)氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標(biāo)記，而誘導(dǎo)表達(dá)的載體需要甲醇——甲醇比一般用于大腸桿菌表達(dá)誘導(dǎo)使用的IPTG便宜。第一步——構(gòu)建載體

Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點(diǎn)可供選擇，同時(shí)也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。

紅葉山莊：有關(guān)是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在原核表達(dá)，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點(diǎn)，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對于大小合適（30—50KD）的蛋白在產(chǎn)量上是pPIC9K無法比擬的。

leslie：要做畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)，首先當(dāng)然就要了解這個(gè)可愛的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛），她和大腸桿菌長得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測。大家做畢赤表達(dá)的時(shí)候應(yīng)該都遇過這種情況吧，表達(dá)過程中染菌（我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)污染過各種顏色形狀的細(xì)菌，那真是一段可怕的經(jīng)歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就是浪費(fèi)大把的

時(shí)間了。

基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長的周期等等情況后，當(dāng)然更多的精力還是應(yīng)該花在表達(dá)的目的蛋白上，我的表達(dá)蛋白有些恐怖，有100KD，本來當(dāng)然應(yīng)該放在大腸桿菌中表達(dá)，但是為了分泌表達(dá)（其實(shí)后來發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pET系列分泌表達(dá)系列也不錯(cuò)）和糖基化修飾（主要是這個(gè)方面，因?yàn)槲业牡鞍资侨嗽吹模磉_(dá)出來用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長，所以在做克隆的時(shí)候也要非常小心，需要注意的是：

①酶切位點(diǎn)不能出現(xiàn)在目的DNA片段中——如果片段長無法避免，可以采用平末端連接；

②雖然α-factor可以自動切除，但是在設(shè)計(jì)表達(dá)的時(shí)候，如果在N端不能出現(xiàn)任何多余的aa（比如藥物蛋白表達(dá)），需要特別留意（說明書上有詳細(xì)說明：P13）；

③有三種不同的讀碼框（對于pPICZα系列來說就是對上α-factor序列），在設(shè)計(jì)克隆的時(shí)候要反復(fù)確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問題；

④無論pPICZ還是pPICZα都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒有ATG（起始密碼子），有人認(rèn)為酵母啟動子與外源基因的ATG之間的距離越短對于表達(dá)的該基因越有利；

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；

⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關(guān)基因表達(dá)偏好密碼子的問題有人認(rèn)為沒有必要更換，有人認(rèn)為一定要換，個(gè)人認(rèn)為以產(chǎn)量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過長就比較麻煩，不過有許多真核保守蛋白其實(shí)是和酵母密碼子相似的；

⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因?yàn)榕掠绊懙娇股刈饔茫╖eocin平板要避光保存）；

⑧測序引物可以用α-factor信號引物，也可以用5'AOX1引物；

⑨如果需要高量表達(dá)，可以考慮做克隆的時(shí)候串聯(lián)基因片段進(jìn)行表達(dá)，另外也可以在轉(zhuǎn)化酵母的時(shí)候重復(fù)轉(zhuǎn)化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因?yàn)檫@個(gè)序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會影響表達(dá)，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因?yàn)檫@些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄，也需要多加注意。

第二步就是將線性化的DNA轉(zhuǎn)化入Pichia酵母中：

Xiang Yang：EasySelect試劑盒準(zhǔn)備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因?yàn)檫@個(gè)菌株轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量相對而言較高，如果你有電轉(zhuǎn)儀（electroporator），可以嘗試一下。如果沒有的話，EasySelect也準(zhǔn)備了化學(xué)轉(zhuǎn)化試劑——EasyComp Transformation，但是由于轉(zhuǎn)化率的緣故，我建議使用電轉(zhuǎn)儀。

leslie：在得到了正確的序列之后就可以準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點(diǎn)有些不盡相同

（Manual上寫的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔(dān)心轉(zhuǎn)化率的話可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT＋表現(xiàn)型，也就是說可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長，但是據(jù)說會對外源基因表達(dá)有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護(hù)表達(dá)產(chǎn)物免受降解，促進(jìn)表達(dá)量的提高。

一般來說，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用Mut－細(xì)胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對較多(約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進(jìn)行。而對于分泌蛋白的表達(dá)，無論是甲醇利用慢(Mut-)還是甲醇利用快(Mut+)的細(xì)胞都可應(yīng)用，如在人血清白蛋白(HSA)(為分泌型蛋白)的表達(dá)中就看不出兩種類型的細(xì)胞之間有什么明顯差別。

所以一般手冊都會建議同時(shí)在這幾種菌株中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這主要是因?yàn)椴煌幕蛟诓煌慕湍妇锌赡鼙磉_(dá)量截然不同，因此在最開始的時(shí)候建議多用幾種酵母菌實(shí)驗(yàn)。

另外有個(gè)保存問題，原始酵母菌一定要保存好，因?yàn)榻湍冈趥鞔啻魏髸绊懫滢D(zhuǎn)化率和表達(dá)量，所以一方面分多管分裝保存于-80℃，另一方面如果出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化或者表達(dá)的問題，在其它方面都沒有出錯(cuò)的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。

在準(zhǔn)備酵母菌的同時(shí)也需要準(zhǔn)備質(zhì)粒，由于酵母菌轉(zhuǎn)化對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的要求較高，量也較大（5-10ug），因此許多時(shí)候都會用PEG大提質(zhì)粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準(zhǔn)備好足夠量的質(zhì)粒，并且不要忘記也要同時(shí)準(zhǔn)備空載體以做對照。在轉(zhuǎn)化前質(zhì)粒需要進(jìn)行線性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達(dá)量高的一個(gè)重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達(dá)）。線性化位點(diǎn)個(gè)人認(rèn)為也會影響到表達(dá)量，對于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個(gè)線性化位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機(jī)會少，而且也有可能遇上沒有合適的線性化位點(diǎn)的情況，這個(gè)時(shí)候也不是說不能進(jìn)行表達(dá)，但是準(zhǔn)備的質(zhì)粒就要增加10倍，另外也可以進(jìn)行部分酶切（即先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，掐定時(shí)間和酶量保證被切開的質(zhì)粒有部分是在線性化位點(diǎn)切開而基因片段保存完好）。

在線性化之后的質(zhì)粒就可以酒精沉淀回收了——中間步驟需要使酶失活，說明書建議是熱失活或者EDTA，個(gè)人認(rèn)為前者比較好，主要是擔(dān)心EDTA對于轉(zhuǎn)化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65℃/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風(fēng)干，這一步需要多加注意保證風(fēng)干完全，因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)證明殘留的酒精對于轉(zhuǎn)化的影響頗大。

接下來就是酵母轉(zhuǎn)化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實(shí)驗(yàn)決定表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)化方法有不少，例如電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，其方法的難易程度和轉(zhuǎn)化率高低呈反向遞減的，也就是說電轉(zhuǎn)最容易，轉(zhuǎn)化率較高（但要求有電轉(zhuǎn)儀），而原生質(zhì)體最麻煩，而且效果不好（比較傳統(tǒng)），因此不建議使用，EasySelect說明書上這么建議，并且也詳細(xì)說明了電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化（EasyComp和LiCl）方法的過程，可以按部就班。需要注意的是（電轉(zhuǎn)過程）：

①最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過的酵母放置時(shí)間不要超過一個(gè)星期；

②擴(kuò)大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，個(gè)人認(rèn)為不需要OD600達(dá)到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，這個(gè)時(shí)候的酵母比較新鮮，轉(zhuǎn)化率比較高； ③整個(gè)感受態(tài)制作過程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機(jī)，這是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵——為了進(jìn)一步保證這一點(diǎn)，無菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉(zhuǎn)杯都要預(yù)冷；

④電轉(zhuǎn)儀需要預(yù)熱，所以準(zhǔn)備感受態(tài)的時(shí)候就可以把電轉(zhuǎn)儀打開了，電轉(zhuǎn)后山梨醇的加入要快，曾有人做實(shí)驗(yàn)證明晚一秒就會降低轉(zhuǎn)化的數(shù)量級，雖然不一定可信，但是我個(gè)人也認(rèn)為這個(gè)過程要快，電轉(zhuǎn)后可以看看時(shí)間，如果時(shí)間過短（比如(4)就可能說明雜質(zhì)較多，會影響轉(zhuǎn)化率；

⑤轉(zhuǎn)化后溫育是個(gè)增加同源重組，增加存活率的過程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30℃搖一段時(shí)間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉(zhuǎn)化率。

(化學(xué)轉(zhuǎn)化)

如果沒有電轉(zhuǎn)儀，LiCl轉(zhuǎn)化是一種可供選擇的方法，轉(zhuǎn)化率是102到103cfu/ug。

主要過程為： 取過夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8-1.0；4℃，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預(yù)冷的無菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL，4℃，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50μl冰預(yù)冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至80-90ml。

LiCl轉(zhuǎn)化 取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞12 000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入 50%PEG240ml 1mmol/L LiCl

ml 單鏈鮭精DNA

25ml 線性化質(zhì)粒DNA 10 ml(約10mg)用吸頭反復(fù)吹打，使細(xì)胞沉淀與加入的溶液混勻，30℃靜置溫育30min，42℃熱擊20-25min，4500rpm離心10min，吸棄轉(zhuǎn)化液，細(xì)胞沉淀加1ml YPD培養(yǎng)基于30℃ 200 rpm培養(yǎng)2-4hr，取轉(zhuǎn)化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培養(yǎng)2-3天。

第三步——挑克隆篩選

Xiang Yang：在protocol中用了許多篇幅來指導(dǎo)這一步，包括如何去通過平板篩選，觀測生長速率來確定Mut表現(xiàn)型等。這個(gè)過程需要3到5天，而我一般只用用了4個(gè)小時(shí)進(jìn)行PCR（AOX引物）篩選。

leslie：完成轉(zhuǎn)化后就是克隆鑒定的過程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因?yàn)楸容^快），具體過程protocol上說的很清楚，其實(shí)也很簡單，就是凍融破菌進(jìn)行菌落PCR，但是其中許多具體細(xì)節(jié)問題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問題，許多人用PCR方法進(jìn)行鑒定都無法得到結(jié)果，甚至在表達(dá)出了以后還是無法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無法正常釋放酵母基因組，一般通過培養(yǎng)菌然后進(jìn)行沸水和-20℃冷凍循環(huán)過程裂解細(xì)胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內(nèi)是可以得到好的結(jié)果的，但是有時(shí)候片段過長，模壁就會阻礙擴(kuò)增，所以我們實(shí)驗(yàn)室會用蝸牛酶（很便宜的酶來的）來幫助溶菌，我看許多實(shí)驗(yàn)室也會這么做，不過加入的時(shí)間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。

第二就是是模板量，個(gè)人建議模板真的不要加太多了，按照說明書的上的5ul我覺得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當(dāng)然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來凍融的菌數(shù)量有關(guān)。其次是假陽性和假陰性結(jié)果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會出現(xiàn)3.6kb的片段，而Mut+則會出現(xiàn)AOX1基因原本長度的片段——大約長2.2kb，因此如果的基因片段長度相似，要注意區(qū)分。建議PCR過程中使用多對引物進(jìn)行反應(yīng)，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各種對照多了有利于比較——當(dāng)然前提是你不能暈了頭。

掉了毛的鴕鳥：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動子的轉(zhuǎn)錄終止子(5’AOX1和3’AOX1),他們被多克隆位點(diǎn)分開,外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標(biāo)記（HIS4區(qū)的整合方式為位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4）恢復(fù)野生型.HIS4區(qū)或AOX1區(qū)位點(diǎn)的整合都使轉(zhuǎn)化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進(jìn)行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS＋表型以篩選轉(zhuǎn)化子.）及3’AOX1區(qū),當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí),他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個(gè)載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,外源基因在5’AOX1啟動子的控制下表達(dá).在載體中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關(guān),通過篩選抗G418能力強(qiáng)的酵母即可獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.第四步——表達(dá)

Xiang Yang：將你的克隆在YPD培養(yǎng)基中培育到OD600值達(dá)到6.0，就可以離心收菌。用表達(dá)培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30oC培育過夜。

leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達(dá)，有許多人在酵母表達(dá)上花費(fèi)了大量的時(shí)間——不同于大腸桿菌的兩天出結(jié)果，一次畢赤酵母的表達(dá)就需要起碼一周的時(shí)間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場空，我個(gè)人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉(zhuǎn)化的酵母菌，另外調(diào)整進(jìn)行重新轉(zhuǎn)化。

另外剛開始的時(shí)候可以用小量表達(dá)，可以用5ml：生長慢型，生長快型，陰性對照（空質(zhì)粒），陽性對照（可以是曾經(jīng)表達(dá)成功的重組子）和沒有進(jìn)行轉(zhuǎn)化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值2-6，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時(shí)間，一半為20-30分鐘，讓菌沉淀下來，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉(zhuǎn)入BMMY中誘導(dǎo)表達(dá)，這些步驟都需要在超凈工作臺里進(jìn)行，如果要區(qū)分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表達(dá)，有可能會在沒有達(dá)到4天的時(shí)間培養(yǎng)基就干了，所以可以適當(dāng)補(bǔ)充一些，以及在搖床里放置盛有無菌水的深口瓶，來保持搖床里濕度。

誘導(dǎo)物甲醇注意要在超凈臺中打開，可以分裝到滅過菌的瓶子中——當(dāng)然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過甲醇瓶口的時(shí)候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。另外如果覺得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過紗布添加甲醇，這個(gè)方法可能會造成染菌，慎選。說到紗布就想到了通氣性問題，酵母在無氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導(dǎo)的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對于這一基因的表達(dá)影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個(gè)搖床進(jìn)行三十度酵母表達(dá)，這樣可以考慮將紗布減少到3—5層，同時(shí)需要注意的是搖瓶內(nèi)菌液體積不要超過10-30%。

每天取樣出來進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過每天做膠跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時(shí)跑，不過樣品一定要煮過凍存，而且每次取樣不要反復(fù)凍融，最好分裝保存——因?yàn)榈鞍捉?jīng)煮沸變性會不穩(wěn)定，容易降解。另外為了防止蛋白在分泌出來的過程就降解了（特別是小分子蛋白），也可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說明書講解得詳細(xì)），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護(hù)物質(zhì)，競爭性抑制蛋白水解酶 的活性來防止表達(dá)產(chǎn)物降解。

如果使用的是分泌型培養(yǎng)基，按道理收集培養(yǎng)基上清就可以進(jìn)行下一步分析了，但是由于培養(yǎng)基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測不出來的——除非你的表達(dá)蛋白量非常大。所以需要進(jìn)行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當(dāng)然最簡單的就是煮沸蒸發(fā)水分濃縮了。另外跑膠的時(shí)候同時(shí)對照酵母胞內(nèi)蛋白，以防沒有分泌出來。SDS-PAGE的配置參見分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對應(yīng)性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過是個(gè)需要全盤重新準(zhǔn)備的過程，要考慮清楚。如果選用的載體是帶有信號肽的，雖說是分泌表達(dá)好純化，但實(shí)際上畢赤酵母本身還是有本底表達(dá)的，而且有時(shí)候會造成假陽性，所以最后表達(dá)過程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細(xì)節(jié)可見Western Blotting前傳：想成為高手嗎？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒有合適抗體（如果是利用從大腸表達(dá)出來的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統(tǒng)表達(dá)出來的蛋白無法發(fā)生免疫作用），可以選用anti-myc或者anti-his的，前提當(dāng)然是你的蛋白沒有提前終止。

其它在表達(dá)中可能出現(xiàn)的情況包括表達(dá)量低，沒有分泌表達(dá)（針對pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無法重復(fù)，表達(dá)出來的蛋白偏大等等，需要分各個(gè)方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號肽，但是就是無法分泌出來，這可能是蛋白結(jié)構(gòu)在通過細(xì)胞膜的時(shí)候受到了阻礙，可能需要重新轉(zhuǎn)化，更換線性化位點(diǎn)或者更換菌株；如果蛋白表達(dá)第一天較高，但是之后越來越少，這很有可能是蛋白降解了或者產(chǎn)生了競爭表達(dá)；畢赤酵母無法重復(fù)的問題比較嚴(yán)重，許多情況下在第一次獲得了高量表達(dá)之后就再怎么也重復(fù)不了這個(gè)結(jié)果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達(dá)出來的蛋白分子量偏大則是個(gè)正?，F(xiàn)象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進(jìn)行WB或進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

第五步——發(fā)酵和產(chǎn)物純化

Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE Healthcare），經(jīng)過簡單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一個(gè)大小為45kDa，可以通過二硫鍵形成反向平行二聚體(antiparallel homodimer)的糖蛋白，經(jīng)過純化，我通過一個(gè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(cell proliferation assay)檢測了其活性，結(jié)果表明表達(dá)出來的蛋白在體外有完全的活性。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結(jié)合活性，與對照(通過大腸桿菌和Bacular細(xì)胞未帶tag的蛋白)相比，his-tag有一點(diǎn)副作用。

伊可麗：由于在搖瓶培養(yǎng)中巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的水平往往不能準(zhǔn)確地反映罐發(fā)酵中的表達(dá)情況，使之成為令人頭痛的問題。主要原因是在搖瓶培養(yǎng)中，培養(yǎng)液的pH值無法控制，培養(yǎng)物通氣不充分及無法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對每一個(gè)表達(dá)菌株進(jìn)行繁瑣的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)，仍需摸索表達(dá)菌株的搖瓶培養(yǎng)條件，使其產(chǎn)物的表達(dá)量與預(yù)期的發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果相近。

總而言之，EasySelect系統(tǒng)是一個(gè)便于操作的酵母表達(dá)系統(tǒng)，我已經(jīng)使用這一系統(tǒng)表達(dá)過15個(gè)類似物了，每一個(gè)我都獲得了超過1mg/1升培養(yǎng)液的純化蛋白。

第三篇：《景區(qū)分銷系統(tǒng)》需求說明書

成都易旅網(wǎng)絡(luò)科技有限公司

《電子票務(wù)代理分銷系統(tǒng)》

需求說明書易旅網(wǎng)絡(luò)科技 背景與目標(biāo)

1.1 背景

旅游行業(yè)近年來發(fā)展迅速,傳統(tǒng)有實(shí)力的旅行社順勢不斷發(fā)展，但隨著自身的資源越來越豐富，代理的景區(qū)票務(wù)、酒店越來越多時(shí)，讓旅行社自身在資源管理、價(jià)格體系管理等方面越來越力不從心，此外，由于自身長久經(jīng)營積累下來的價(jià)格優(yōu)勢也不斷促使旅行社發(fā)展自已的二級代理或多級代理，但發(fā)展自己的代理無疑進(jìn)一步加劇了管理的壓力。隨著互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的長足發(fā)展，電子票務(wù)已經(jīng)成為了現(xiàn)實(shí)，如果有一套在線的網(wǎng)絡(luò)電子票務(wù)軟件，將供應(yīng)商、自身與代理商之間的價(jià)格體系、現(xiàn)金流系統(tǒng)地管理起來，將無疑大大地減輕甚至從根本上解決旅行社、票務(wù)代理商的難題

渠道中心：略

1.2 系統(tǒng)目標(biāo)

? 系統(tǒng)應(yīng)具有行業(yè)通用性，能夠滿足一般旅行社、票務(wù)代理商使用

1.3 運(yùn)行環(huán)境

? Windows Server 2003 或2008 ? IIS7.0或以上

? Net Framework 4.0或以上 ? SQLServer 2008

易旅網(wǎng)絡(luò)科技 功能需求

2.1 系統(tǒng)登錄

? 管理員登錄 ? 供應(yīng)商登錄 ? 代理商登錄 ? 驗(yàn)票員登錄

2.2 管理員功能需求

2.2.1 管理員首頁

? 今日經(jīng)營情況 ? 產(chǎn)品統(tǒng)計(jì)圖表 ? 代理商統(tǒng)計(jì)圖表 ? 供應(yīng)商統(tǒng)計(jì)圖表 ? 公告

2.2.2 供應(yīng)商管理

? 供應(yīng)商列表與查詢 ? 新增供應(yīng)商 ? 編輯供應(yīng)商 ? 刪除供應(yīng)商 ? 供應(yīng)商詳情 ? 付款操作 ? 提現(xiàn)操作 ? 授信操作

2.2.3 產(chǎn)品類別管理

? 類別列表 易旅網(wǎng)絡(luò)科技

? 添加類別 ? 刪除類別 ? 更新類別 ? 類別Index設(shè)置

2.2.4 產(chǎn)品管理

產(chǎn)品性質(zhì)：團(tuán)體票與散票類型

產(chǎn)品類型：景區(qū)，酒店，影院，線路，其它。其中景區(qū)、酒店、影院、其它具有通用的屬性，線路的屬性則具有行業(yè)特殊性，部分屬性需要單獨(dú)定義 條碼類型分為：系統(tǒng)自有條碼，導(dǎo)入外部條碼，無需條碼 支付類型分為：預(yù)付，到付 說明：1.導(dǎo)入條碼不能選擇團(tuán)體票

2.無需條碼類型操作流程如下，代理商下單，填寫客人手機(jī)號、身份證等，提交訂單，管理員收到訂單（短信自動提醒），登錄景區(qū)系統(tǒng)，獲取條碼，單擊訂單上的轉(zhuǎn)發(fā)憑證到客人手機(jī)，完成訂單(申請退款)

? 添加產(chǎn)品 ? 刪除產(chǎn)品 ? 更新產(chǎn)品 ? 鎖定產(chǎn)品 ? 下架產(chǎn)品 ? 復(fù)制產(chǎn)品

? 復(fù)制產(chǎn)品到其它類別 ? 產(chǎn)品詳情 ? 產(chǎn)品列表展示 ? 添加導(dǎo)碼產(chǎn)品 ? 編輯導(dǎo)碼產(chǎn)品 易旅網(wǎng)絡(luò)科技

? 旅游線路產(chǎn)品編輯 ? 旅游線路產(chǎn)品新增 ? 旅游線路與電子印章映射 ? 電子印章管理

? 電子印章與合同模板映射 ? 合同模板管理 ? 合同模板與產(chǎn)品映射

2.2.5 代理商管理

? 添加代理商 ? 刪除代理商 ? 更新代理商 ? 鎖定代理商 ? 代理商列表展示 ? 代理商充值 ? 代理商提現(xiàn) ? 代理商信用額設(shè)置

? 代理商權(quán)限設(shè)置（預(yù)訂、導(dǎo)碼）? 代理級別設(shè)置

2.2.6 驗(yàn)票員管理

? 添加驗(yàn)票員 ? 編輯驗(yàn)票員 ? 刪除驗(yàn)票員 ? 驗(yàn)票員列表與查詢

2.2.7 訂單管理

? 訂單展示列表 易旅網(wǎng)絡(luò)科技

? 訂單查詢 ? 作廢 ? 短信轉(zhuǎn)發(fā)

2.2.8 統(tǒng)計(jì)報(bào)表

? 訂單統(tǒng)計(jì) ? 財(cái)務(wù)統(tǒng)計(jì) ? 產(chǎn)品統(tǒng)計(jì) ? 代理商統(tǒng)計(jì) ? 供應(yīng)商統(tǒng)計(jì)

? 代理商導(dǎo)出條碼統(tǒng)計(jì)

2.2.9 公告管理 2.2.10 用戶管理 2.2.11 系統(tǒng)設(shè)置

2.3 供應(yīng)商功能需求

2.3.1 供應(yīng)商首頁

? 系統(tǒng)公告 ? 本周經(jīng)營情況 ? 統(tǒng)計(jì)圖表

2.3.2 驗(yàn)票員管理

參見上面

2.3.3 訂單管理

? 訂單列表（未驗(yàn)證不能顯示條碼）? 訂單查詢 ? 作廢 易旅網(wǎng)絡(luò)科技

2.3.4 統(tǒng)計(jì)報(bào)表 2.3.5 個(gè)人中心

2.4 代理商功能需求

2.4.1 代理商首頁

? 系統(tǒng)公告 ? 本周經(jīng)營情況 ? 圖表統(tǒng)計(jì)

2.4.2 訂票業(yè)務(wù)（個(gè)人，團(tuán)隊(duì)訂票）

? 團(tuán)體票下單 ? 散票下單 ? 到付消費(fèi)下單

2.4.3 自助充值

? 收款賬號配置 ? 支付寶相關(guān)參數(shù)配置 ? 支付寶接口實(shí)現(xiàn) ? 代理商自助充值實(shí)現(xiàn)

2.4.4 訂單管理

? 訂單展示列表 ? 訂單查詢 ? 短信重發(fā)

? 退款（導(dǎo)碼不能退款，自有條碼直接退款，無需條碼：在未發(fā)貨直接退款，已審批只能申請，管理員再審批）易旅網(wǎng)絡(luò)科技

2.4.5 報(bào)表統(tǒng)計(jì) 2.4.6 個(gè)人中心

? 修改密碼 ? 個(gè)人資料

2.4.7 導(dǎo)出條碼業(yè)務(wù)

? 生成條碼 ? 生成條碼文件

2.5 驗(yàn)票員功能需求

2.5.1 驗(yàn)票業(yè)務(wù)

? 條碼有效性驗(yàn)證 ? 各種非法條碼提示 ? 驗(yàn)票通過 ? 到付收銀

2.5.2 當(dāng)日驗(yàn)票 2.5.3 當(dāng)日統(tǒng)計(jì) 2.5.4 驗(yàn)票歷史 2.5.5 個(gè)人中心

? 修改密碼 ? 個(gè)人資料

2.6 渠道中心功能需求

2.6.1 產(chǎn)品發(fā)布

? 產(chǎn)品基本信息發(fā)布 ? 商務(wù)信息發(fā)布 易旅網(wǎng)絡(luò)科技

? 產(chǎn)品價(jià)格體系發(fā)布

2.6.2 申請合作

? 提交申請 ? 取消申請

2.6.3 建立合作

? 同意合作 ? 拒絕合作

? 添加渠道產(chǎn)品到產(chǎn)品列表

2.6.4 產(chǎn)品預(yù)訂

? 渠道產(chǎn)品預(yù)訂頁面 ? 下單

2.6.5 產(chǎn)品驗(yàn)票 2.6.6 渠道供應(yīng)商管理

? 渠道供應(yīng)商展示 ? 中止合作 ? 自助充值

2.6.7 渠道代理商管理

? 渠道代理商展示

? 刪除代理商（中止合作）? 代理商充值 ? 代理商提現(xiàn)

2.6.8 渠道產(chǎn)品管理

? 渠道產(chǎn)品展示 ? 刪除產(chǎn)品 易旅網(wǎng)絡(luò)科技

? 設(shè)置代理價(jià)格 ? 上線 ? 下線

2.6.9 我發(fā)布的產(chǎn)品管理

? 產(chǎn)品展示 ? 修改價(jià)格 ? 編輯基本信息 ? 刪除產(chǎn)品 ? 下架產(chǎn)品 ? 上架產(chǎn)品

? 查看產(chǎn)品渠道代理商

2.6.10 我的申請管理

? 我的申請列表 ? 取消申請

2.6.11 待審批合作管理

? 待審批合作列表 ? 審批通過 ? 審批拒絕

2.6.12 渠道產(chǎn)品中心

? 渠道產(chǎn)品查詢 ? 申請合作入口

2.6.13 入駐商戶中心

? 入駐商戶展示 ? 編輯入駐商戶信息 易旅網(wǎng)絡(luò)科技

2.6.14 公用驗(yàn)票插件

? 驗(yàn)票插件實(shí)現(xiàn) ? 獨(dú)立運(yùn)行插件實(shí)現(xiàn) ? 與景區(qū)系統(tǒng)整合 易旅網(wǎng)絡(luò)科技

需求要點(diǎn) 易旅網(wǎng)絡(luò)科技 其它需求

? ? ? ? ? ? ?

敏感信息進(jìn)行加密存儲;定期數(shù)據(jù)庫備份和建立恢復(fù)機(jī)制

重要服務(wù)高健壯性設(shè)計(jì)，滿足7*24不間斷運(yùn)行 程序具有適當(dāng)?shù)娜蒎e(cuò)功能;維護(hù)一份web站點(diǎn)發(fā)布程序一致的安全拷貝 不能留有后門程序和漏洞 目標(biāo)程序不能進(jìn)行反編譯

技術(shù)支持：成都易旅網(wǎng)絡(luò)科技有限公司 聯(lián)系電話：*** 聯(lián)系QQ： 2940034565

第四篇：二維碼票務(wù)分銷系統(tǒng)介紹

? http://二維碼票務(wù)官網(wǎng)

? 還在為產(chǎn)品積壓而郁悶嗎？

還在為賺不到沉淀資金而郁悶嗎？

? 還在為沒有會員數(shù)據(jù)而苦惱嗎？

? 二維碼是以一種彩信的模式接收的多位數(shù)字或字母組成的消費(fèi)憑證，顧客持手機(jī)到商家進(jìn)行刷卡消費(fèi)，迅速快捷，票務(wù)公司按消費(fèi)數(shù)量與商家進(jìn)行結(jié)款。? 二維碼的及時(shí)性、成本低、統(tǒng)計(jì)方便等特點(diǎn)，將會越來越受到商家、消費(fèi)者的青睞，傳統(tǒng)紙質(zhì)票將退出歷史的舞臺。

公司推出電子票務(wù)系統(tǒng)1.4版，支持個(gè)人分銷、企業(yè)分銷、系統(tǒng)接口分銷 適合景點(diǎn)、影院、餐飲、商場等，可以電子化的地方。

一、系統(tǒng)采用語言開發(fā)。支持多種數(shù)據(jù)庫

二、系統(tǒng)分三種角色：系統(tǒng)管理員、供應(yīng)商、分銷商。（注：每種角色都可以再建立子角色）。

三、系統(tǒng)模塊包括：

1.系統(tǒng)管理員權(quán)限包括：分銷商管理、供應(yīng)商管理、訂單管理、商品管理、財(cái)務(wù)管理、電子碼管理（導(dǎo)入第三方電子碼、導(dǎo)出本系統(tǒng)電子碼）、電子碼驗(yàn)證管理、系統(tǒng)接口管理（支持與第三方整合）、員工管理、公告管理、權(quán)限管理、系統(tǒng)設(shè)置（支付設(shè)置（支付寶、財(cái)付通）、郵箱設(shè)置、短信模板設(shè)置）。

2.分銷商權(quán)限：商品購買、訂單管理（包括退貨、重發(fā)）、財(cái)務(wù)管理（包括充值、賬戶資金明細(xì)、充值記錄）、公告管理、系統(tǒng)對接管理、賬號密碼、退款鎖定。

3.供應(yīng)商權(quán)限：

電子碼驗(yàn)證管理、產(chǎn)品管理、訂單管理、賬戶密碼、分店管理、財(cái)務(wù)管理。

第五篇：暢言語音教具系統(tǒng)使用心得

暢言語音教具系統(tǒng)使用心得

作為一名農(nóng)村小學(xué)的英語教師，我一直都有一個(gè)愿望：讓學(xué)生在每節(jié)課的課堂上都能聽到地地道道的英語口語，師生暢言語音在課堂上用英語暢所欲言。但是由于多方原因，要達(dá)到這種境界似乎很難。

最近“暢言智能語音教具系統(tǒng)”的到來，讓我的教學(xué)工作有了新的起色。一開始看到暢言智能教具，并沒有在意。后來在慢慢的摸索，逐步使用的過程中，我終于體驗(yàn)到了它強(qiáng)大而奇妙的功能。現(xiàn)在，我在教學(xué)中已越來越離不開它了。我認(rèn)為這套教具對于英語教師自身素質(zhì)、英語課堂教學(xué)效果和學(xué)生的綜合能力等各方面的提高有著重大作用。

下面就簡單談?wù)勈褂脮逞哉Z音教具的體會：

一、簡單方便易操作，提高教學(xué)效率。

首先，暢言智能語音教具系統(tǒng)用法非常簡單，教師只需用識別筆點(diǎn)擊課本上的內(nèi)容，主機(jī)就朗讀相應(yīng)的英文單詞、句子，唱歌曲歌謠等等，不但節(jié)省了錄音機(jī)倒帶的時(shí)間，而且解放了教師。這樣一來教師可以巡視、關(guān)注每一個(gè)學(xué)生的情況，了解學(xué)生學(xué)習(xí)效果，適時(shí)指導(dǎo)，增大了課堂容量。

其次，識別筆可以一筆多用，除了點(diǎn)擊要播放的內(nèi)容以外，識別筆的激光燈可以當(dāng)作教鞭使用，引導(dǎo)學(xué)生觀看要學(xué)習(xí)的目標(biāo)；識別筆上的任意功能鍵還可以幫助維護(hù)課堂秩序，提醒學(xué)生們集中注

意力；另外在課堂上需要結(jié)束學(xué)生熱烈討論的時(shí)候，用此鍵可以起“喚醒”和“終止”的作用，提高了各個(gè)教學(xué)環(huán)節(jié)的學(xué)習(xí)效果。

二、優(yōu)化英語課堂，調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)英語的積極性。

傳統(tǒng)的英語課堂教學(xué)，組織形式單一。只有老師的講解、提問、學(xué)生的回答、跟錄音機(jī)反復(fù)讀，很難吸引學(xué)生的注意力，智能語音教具系統(tǒng)給這樣的課堂注入了新的活力。

暢言智能語音教具中語音合成，自制教具的功能，可以把任意實(shí)物，圖片，卡片等制成生動有趣的有聲教具，讓他們自己開口說英語，還可以利用人與主機(jī)對話交流，使英語課堂變得更加直觀、形象、真實(shí)、從而課堂變得生動活潑有趣。例如，在講動物單詞的時(shí)候，我自己錄制了貓和狗的叫聲，來引入單詞教學(xué)；講蔬菜水果單詞時(shí)，我將相應(yīng)單詞讀音輸入識別碼中，然后貼到相應(yīng)圖片上，用筆一點(diǎn)就能說話，這樣一來，學(xué)生覺得很奇妙，自然興趣就提高了。還可以利用合成聲音，選擇女聲或男聲朗讀，使學(xué)生在純正的語言中感知英語。并通過有聲實(shí)物，標(biāo)準(zhǔn)聲音，有聲圖片等把枯燥的單詞，抽象的敘述以生動活潑的形象顯現(xiàn)出來，使學(xué)生的大腦變得異常興奮，注意力非常集中，學(xué)習(xí)的積極性隨之調(diào)動起來。

三、提高教師自身素質(zhì)，促進(jìn)學(xué)生的發(fā)展。

暢言智能語音教具系統(tǒng)提供的“發(fā)音評測”、“中英文朗讀”功能為我們教師自身發(fā)展提供了很好的學(xué)習(xí)工具，在一定程度上也促進(jìn)了學(xué)生的發(fā)展。

“發(fā)音評測”相當(dāng)于隨時(shí)隨地的口語校正“老師”，利用它可以對教師自己的發(fā)音進(jìn)行測試，比較差異，提高發(fā)音的標(biāo)準(zhǔn)度。也可以對學(xué)生單詞、句子和篇章的發(fā)音準(zhǔn)確性進(jìn)行評測，系統(tǒng)立即打分，得出錯(cuò)對辨率，我們可以對照標(biāo)準(zhǔn)，改正錯(cuò)誤的發(fā)音。

“中英文朗讀”功能中的“每日推薦”板塊提供了大量的英文閱讀材料，是老師提升英語閱讀及聽力能力的絕妙的好機(jī)會，每日內(nèi)容不同，涉及面廣，我們不需要花大量的時(shí)間和精力去尋找或購買英語報(bào)刊等，很輕松地就能增加我們的課外知識，提高我們的語言綜合運(yùn)用能力。

除此之外，暢言智能語音教具系統(tǒng)還有許多重要的功能：

第一，暢言智能語音教具系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了中英文對照朗讀功能，這 是區(qū)別于其他英語語音教具的一大亮點(diǎn)。

一般的語音教具僅能播放英語課文的朗讀，很難實(shí)現(xiàn)英漢同步播放。為了能更好的利用暢言智能語音教具軟件系統(tǒng)解決此類矛盾，服務(wù)于現(xiàn)代英語教學(xué)，我的想法是：在語音合成過程中同時(shí)輸入英文和中文，對發(fā)音人進(jìn)行配合選擇，這樣便可以聽取中英文對照的朗讀，解決了部分學(xué)生的聽力理解較差的難題。具體的做法是將手頭的中英文對照文本，或者是一段中文一段英文的文本上傳至?xí)逞灾悄苷Z音教具軟件，在軟件的“高級朗讀模式”中，可以用中文發(fā)音人（“中文男聲”或者“中文女聲”）來朗讀中文，用英文發(fā)音人（“英文男聲”或者“英文女聲”）來朗讀英文，這樣，就可以聽到中英文對照朗讀了。若有的中英文對

照文本，英文較簡單只需要朗讀英文部分，而中文部分不需要朗讀，那么可以這樣設(shè)置：選擇英文部分，選擇英文男聲或女聲發(fā)音人；選擇中文部分，選擇“不朗讀”即可。

第二，借助暢言智能語音教具中英文“高級朗讀模式”你還可以根據(jù)課文的難易，學(xué)生的反應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)朗讀的速度，獲取最佳的聽覺效果。

第三，系統(tǒng)軟件上附帶的“生詞表”可以說是一本“活字典”，不僅可以幫助教師和學(xué)生查找任何一個(gè)生疏的單詞，還可以點(diǎn)讀、跟讀、模仿，一定程度上降低了學(xué)生出現(xiàn)啞巴英語的可能性。從“生詞表”中，可以看到生詞以字母順序進(jìn)行排列，當(dāng)鼠標(biāo)指向某個(gè)詞語或短語時(shí)，會給出詞語相應(yīng)的解釋，使用者可以點(diǎn)擊“試聽”來聽取標(biāo)準(zhǔn)的讀音。最為便捷的是，用戶還可以任意搜索需要的詞語或者選擇是否需要顯示詞語的解釋，這樣為使用者提供了很大的方便。

總之，智能語音教具的到來，對我們廣大英語教師來講真是增添了一個(gè)好幫手，它給我們帶來了很大的的方便，豐富了教學(xué)手段，使課堂生動起來，給學(xué)生帶來了學(xué)習(xí)英語的好環(huán)境，大大調(diào)動了學(xué)生學(xué)習(xí)英語的積極性，增強(qiáng)了學(xué)習(xí)興趣。相信，在我和它以后相處的日子里，我會進(jìn)一步加深對它的認(rèn)識，更好的將它應(yīng)用于現(xiàn)代英語教學(xué)中。