第一篇：分子生物學電子教案第九章剖析

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第九章 分子生物學研究方法

1．課程教學內容

(1)核酸技術1—基本操作(2)核酸技術2—克隆技術(3)核酸技術3—測序

(4)基因表達和表達分析基因定點誘變(5)蛋白質與核酸的相互作用(6)其他（熱點）技術 2．課程重點、難點

基因克隆技術、雜交技術、測序技術、蛋白質與核酸的相互作用檢測技術 3．課程教學要求

掌握基因克隆技術、雜交技術、測序技術、蛋白質與核酸的相互作用檢測等各種技術的原理。

本章內容

? 核酸的凝膠電泳 ? DNA分子的酶切割 ? 核酸的分子雜交 ? 基因擴增

? 基因的克隆和表達 ? 細菌的轉化 ? DNA核苷酸序列分析 ? 蛋白質的分離與純化

? 研究DNA與蛋白質相互作用的方法

一、核酸的凝膠電泳

基本原理：當一種分子被放置在電場當中時，它們會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。電泳的遷移率：電泳分子在電場作用下的遷移速度，它同電場的強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷成正比。

由于在電泳中使用了一種無反應活性的穩(wěn)定的支持介質，如瓊脂糖和丙烯酰胺，從而降低了對流運動，故電泳的遷移率又同分子的摩擦系數(shù)成反比。在生理條件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的。從這個意義上講，DNA和RNA的多核苷酸鏈可叫做多聚陰離子，因此，當核酸分子放置在電場中時，它就會向正極移動。

在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移率，取決于核酸分子本身大小和構型。分子量較小的DNA 分子，比分子量較大的 分子，具有較緊密的構型，所以其電泳遷移率也就比同等分子量的松散型的開環(huán)DNA分子或線性DNA分子要快些。

Gel matrix(膠支持物)is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose(瓊脂糖):(1)a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kb DNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide(EB 溴化乙錠)Polyacrylamide(聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differ from each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range(1 to a few hundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis(脈沖電泳)(1)The electric field is applied in pulses that are oriented orthogonally(直角地)to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as well as to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up to several Mb in length.二、DNA分子的酶切割

Restriction endonucleases(限制性內切酶)cleave DNA molecules at particular sites Restriction endonucleases(RE)are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize(識別)short(4-8bp)target sequences that are usually palindromic(回文結構), and cut(切割)at a defined sequence within those sequences.e.g.EcoRI The random occurrence of the hexameric(六核苷酸的)sequence: 1/4096(4-6=1/46)(1)Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2)Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3)Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends(平末端), sticky/staggered ends(粘性末端).(4)Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子雜交

原理：帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結構。如果彼此退火的核酸來自不同的生物有機體，那么如此形成的雙鏈分子就叫做雜種核酸分子。

在大多數(shù)的核酸雜交反應中，經過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細血管作用或電導作用被轉移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地吸印上去。

常用的濾膜有尼龍膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙和二乙氨基乙基纖維素濾膜

核酸雜交通常包括兩個步驟：

第一，將核酸樣品轉移到固體支持物濾膜上，這個過程稱為核酸印跡轉移

第二，將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交。Southern Blotting：

根據(jù)毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的 DNA片段轉移并結合在適當?shù)臑V膜上，然后通過同標記的單鏈DNA 或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉移的DNA片段，這種實驗方法叫做DNA 印跡雜交技術。是由E.Southern于1975年首先設計出來的，故又叫做Southern DNA印跡技術。Northern Blotting 1979年，J.C.Alwine 等人發(fā)展出的一種用于RNA雜交的新方法。將電泳凝膠中的RNA轉移到疊氮化的或其它化學修飾的活性濾紙上，通過共價交聯(lián)作用而使它們永久地結合在一起。稱為Northern Blotting 將蛋白質從電泳凝膠中轉移并結合到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射同位素標記的特定蛋白的抗體反應，這種技術叫做Western Blotting.定義：將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。

斑點印跡雜交（dot Blotting）：基本原理和操作步驟是通過抽真空的方式將加在多孔過濾進樣器上的核酸樣品，直接轉移到適當?shù)碾s交濾膜上，然后同Southern 印跡一樣的方式同核酸探針分子雜交。菌落（噬菌斑）雜交：

1975 年，Mgrunstein和D Hogness根據(jù)檢測重組體DNA分子的核酸雜交技術原理，對Southern 吸引技術做了一些修改，發(fā)展出了一種雜交技術。

在1977年，W.D.Benton和R.W.Davis又發(fā)展出了與此類似的篩選含有克隆DNA噬菌體的雜交技術。

菌落雜交或噬菌斑雜交有時也叫做原位雜交，因為生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，按其原來的位置不變地轉移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交。

四、基因擴增

基因擴增的五個方面的內容：

第一，在體外應用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction）技術和合成的寡核苷酸引物，導致特定基因的拷貝數(shù)發(fā)生快速大量的擴增。

第二，通過體外 DNA重組，將目的基因插入到高拷貝數(shù)的質粒載體分子上，并轉化到適當?shù)募闹骷毎谑窃隗w內隨著載體分子的大量復制，目的基因的拷貝數(shù)也得到了有效的擴增。

第三，在有些外界環(huán)境因子的脅迫下，真核生物的有關細胞被誘發(fā)產生適應性反應，從而導致相應的保衛(wèi)基因的產生和明顯的擴增。

第四，程序基因擴增

第五，在生物的進化過程中發(fā)生的基因加倍與擴增，結果使相關基因在基因組上聚集成簇。

聚合酶鏈式反應：是美國Cetus公司人類遺傳研究室的科學家K B Mullis于1983年發(fā)明的一種在體外快速擴增特定基因 或DNA序列的方法。

PCR技術 的 基本原理：首先使雙鏈的DNA分子變性為單鏈DNA分子

然后DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生 DNA 互補鏈。

DNA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來啟動新鏈的合成。因此新合成的DNA鏈的起點，是由加入在反應混合物中的一對寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火決定的。在為每一條鏈均提供一段寡核苷酸引物的情況下，兩條單鏈都可以作為合成新生互補鏈的模板。

在每一條新合成的DNA鏈上都具有新的引物結合位點，然后反應混合物經再次加熱使新舊鏈分開，并加入下輪的反應循環(huán)，即引物雜交、DNA合成和鏈的分離。

PCR反應的最后結果是，經過幾次循環(huán)之后，反應混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的拷貝數(shù)2n.PCR技術的兩個特點：第一，能夠知道特定DNA序列的合成；第二，特定的DNA區(qū)段得到了迅速大量的擴增。例如，經過30次循環(huán)，便可使靶DNA得到109 倍的擴增。

PCR反應及多次重復進行的溫度周期，而每一個溫度循環(huán)周期均是由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等三個步驟：首先是將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫環(huán)境加熱1分鐘，使雙鏈 DNA發(fā)生變性，分離出單鏈的模板DNA；然后降低反應溫度使專門設計的一對寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用，結合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列位置上；最后，將反應混合物的溫度上升到72度左右保溫1.5分鐘,這時 在DNA 聚合酶的作用下，鏈得到延伸。寡核苷酸引物：

引物長度：通常在15-30mers 簡并引物：是一類由寡核苷酸組成的混合物，彼此僅有一個或幾個核苷酸的差異。嵌套引物

Taq DNA聚合酶：Klenow片段熱敏感，易失活；反應溫度低，出現(xiàn)錯配堿基；1986年，從75度的熱泉中的細菌中分離純化出Taq酶。與大腸桿菌DNA聚合酶相比，Taq酶使PCR的特異性和敏感性高

PCR 技術的應用：基因組克隆、反向PCR和染色體步移、不對稱 PCR 與DNA序列測定、RT-PCR 與RNA分析、基因的體外誘變、基因組的比較研究

五、基因的克隆和表達

Processes(過程)of DNA cloning：

1）Form the recombinant DNA molecules(重組DNA)by inserting your interested DNA fragments into a proper vector(載體).(Require restriction enzymes and ligase)2）Transform(轉化)the recombinant DNA molecules into competent cells(感受態(tài)細胞).3）Propagation of the cells containing the recombinant DNA to form a clone(克隆), a set of identical cells containing the same recombinant DNA.4）Select the desired clones using the selective marker.5）Host organisms/cells（宿主）: where the plasmids get multiplied and propagated faithfully, which is crucial for DNA cloning.---Prokaryotic host(原核宿主): E.coli(most cases)---Eukaryotic host（真核宿主）: Yeast Saccharomyces cerevisiae(large fragments of human genome)General features of a Vector（作為載體的一般特征）：1）They contain an origin of replication and can autonomously replicating DNA independent of host’s genome.2）Easily to be isolated from the host cell.Most are circular, some are linear(e.g.YAC vector).3）Contains at least one selective marker, which allows host cells containing the vector to be selected amongst those which do not.4）Contains a multiple cloning site(MCS)to be cut by restriction enzymes for DNA manipulation.Cloning vectors(克隆載體): allowing the exogenous DNA to be inserted, stored, and manipulated at DNA level.E.coli cloning vector(circular): plasmids(質粒)、bacteriophages(l and M13)(噬菌體)、plasmid-bacteriophage l hybrids(cosmids)(考斯質粒－質粒和噬菌體雜和體)。

Yeast cloning vector: yeast artificial(Linear)。

Plasmids: small, extrachromosomal circular molecules, from 2 to ~200 kb in size, which exist in multiple copies within the host cells.Contain an origin of replication（復制起點）, at least one selective marker（選擇標記）and multiple cloning site（多克隆位點）.Example of selective marker: ampr gene encoding the enzyme b-lactamse which degrades penicillin antibiotics such as ampicillin.（抗氨芐）The commonly used plasmid are small in size(~ 3 kb)Libraries of DNA molecules can be created by cloning(Genomic library and cDNA library)：

A DNA library(DNA文庫)is a population of identical vectors that each contains a different DNA insert.Genomic Library(基因組文庫): the DNA inserts in a DNA library is derived from restriction digestion or physical shearing of the genomic DNA.cDNA library(cDNA文庫): the DNA inserts in a DNA library is converted from the mRNAs of a tissue, a cell type or an organism.cDNA stands for the DNA copied from mRNA.chromosomes(YACs，酵母人工染色體)cDNA library generation：The mRNAs are firstly reverse transcript into cDNA, and these cDNA, both full length and partial, are cloned to make the cDNA library.Colony screening ：

1）Antibiotic screening(抗生素選擇)： only the recombinant plasmids grow on the antibiotic-containing plate.2）Blue-white screening(藍白斑選擇): DNA insertion in the vector shuts down the LacZ gene expression, and turns the colony（菌落）to white.3）Colony hybridization screening(菌落雜交篩選)from a library.Analysis of a clone ：1）Restriction mapping: digestion of the plasmid prepared from a clone with restriction enzymes to investigate if the interested DNA is inserted the recombinant plasmid.2）Sequencing the cloned DNA to see if the inserted DNA maintains the correct sequence.六、細菌的轉化

轉化：指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA，而導致性狀特征發(fā)生遺傳性改變的生命過程。

感受態(tài)：處于感受態(tài)的細胞，某種蛋白能夠同核酸作用的復合形式。

大腸桿菌的轉化：1）用CaCl2處理大腸桿菌細胞，制備感受態(tài)細胞；2）將正在生長的大腸桿菌在0度下加入到低滲的氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質球）；3）同加入在轉化混合物中的質粒DNA形成一種粘著在細胞表面上的對Dnase抗性的復合物。4）轉移到42 度下作短暫的熱應激，這種復合物便會被細菌吸收；5）在富裕培養(yǎng)基中生長一段時間，再涂布在選擇性的培養(yǎng)基中分離轉化子。細菌轉化效率

影響細菌轉化效率的因素：DNA濃度、純度和構型，轉化細胞的生理狀態(tài)及其在 CaCl2處理和貯藏之后的成活率，以及轉化的環(huán)境條件（溫度、PH值、離子濃度）。

環(huán)型的質粒DNA分子進入細胞，能夠抗御細胞中固有的核酸酶的作用，而線性的DNA分子，則對自由末端的降解作用是極其敏感的，環(huán)型DNA比線性的高出10-100倍。

對于同樣的轉化DNA而言，大分子量的轉化效率要比小分子量的低一些。以每微克質粒DNA 出現(xiàn)的轉化子菌落數(shù)表示的轉化頻率。

應用與大腸桿菌轉化程序相類似的方法，也可以成功地轉化各種真核細胞，將酵母用酶處理消化細胞壁之后，就會變成原生質體

在具有PEG和CaCl2的轉化反應體系中，讓酵母原生質體同轉化DNA接觸，那么由于原生質體在生理上得到恢復并再生出細胞壁后，將其涂布在選擇性培養(yǎng)基上便可以鑒定出轉座子。

七、DNA核苷酸序列分析

1、Sanger 雙脫氧鏈終止法：

利用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測定DNA核苷酸順序的方法，是由英國科學家 Sanger 等1977年發(fā)明的。

其基本原理是利用了DNA聚合酶所具有的兩種酶催化反應的特性：第一，DNA聚合酶能夠利用單鏈的DNA作模板，合成出其互補鏈；第二，DNA聚合酶能夠利用2 ’,3’-雙脫氧核苷三磷酸作底物，使之參入到寡核苷酸鏈的3’末端，從而終止 鏈的生長。2）Maxam-Gilbert化學修飾法：

原理：用化學試劑處理具末端放射性標記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產生不同長度的 鏈的反應混合物，經凝膠電泳按大小分離和放射自顯影后，便可根據(jù)x光片底版上所顯現(xiàn)的相應譜帶，直接讀出待測DNA片段的核苷酸序列。3）DNA雜交測序：

步驟：將待測定的靶 DNA分子同一組已知其核苷酸順序的寡核苷酸探針進行雜交；對能夠同靶 DNA分子形成完全雙鏈體分子之間的堿基重疊關系比較分析，并據(jù)此推算 靶DNA的核苷酸序列結構。

八、蛋白質相關技術

Protein purification(蛋白質純化)、Affinity chromatography can facilitate more rapid protein purification(親和層析純化)、Protein separation by PAGE gel electrophoresis(蛋白質分離)and identification by Western analysis、Protein sequencing(蛋白質測序)、Proteomics(蛋白質組學)。

九、研究DNA與蛋白質相互作用的方法 凝膠阻滯試驗 DNaseI足跡實驗 甲基化干擾實驗

凝膠阻滯試驗：又叫 DNA遷移率變動實驗（DNA mobility shift assay）,是1980年代初出現(xiàn)的用于體外研究與蛋白質相互作用的一種特殊的電泳技術。

當DNA 分子結合上一種蛋白質,由于分子量加大在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，朝正極移動的距離相應的縮短了。所以當特定的 DNA片段同細胞提取物混合之后，如果其在凝膠中的距離縮小了說明它同細胞提取物中的某種特殊的蛋白質分子發(fā)生了結合作用。

DNaseI足跡實驗

是一類用于檢測與特定的蛋白質結合的DNA序列及特性的專門技術 足跡實驗的一個明顯的優(yōu)點是可以形象地展示出一種特殊的蛋白因子同特定 DNA 片段之間的結合區(qū)域。

甲基化干擾實驗（methylation interference assay）

根據(jù)DMS能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理還設計出另一種研究DNA與蛋白質相互作用的實驗方法。

甲基化干擾試驗的具體操作：先用DMS處理靶DNA，并控制反應條件，使之達到平均每條DNA分子只有一個G殘基被甲基化；而后將這些局部甲基化的DNA群體同含有DNA結合蛋白的適當?shù)募毎崛∥镆坏罍赜⒆瞿z阻滯試驗。

第二篇：分子生物學電子教案第二章

第二章 核酸的結構和功能

1、主要內容

v 細胞內的遺傳物質

v 核酸的化學組成與共價結構

v DNA的二級結構

v DNA分子的高級結構

v 真核生物的染色體及其組裝

v RNA的結構與功能

v 核酸的變性、復性與分子雜交

2、教學要求

v 掌握遺傳物質的只要特點和種類；

v 掌握DNA雙螺旋結構特點，核酸的變性、復性和分子雜交原理；

v 熟悉核酸的物理化學性質

v 熟悉DNA 多種高級結構

第一節(jié) 細胞的遺傳物質

一、DNA攜帶兩類不同的遺傳信息

1.遺傳物質必須具有的特性

a.貯存并表達遺傳信息

b.能把信息傳遞給子代

c.物理和化學性質穩(wěn)定

d.具有遺傳變化的能力

l DNA的特征

a)各異的堿基序列儲存大量的遺傳信息

b)堿基互補是其復制、轉錄表達遺傳信息的基礎

c)生理狀態(tài)下物理、化學性質穩(wěn)定

d)有突變和修復能力，可穩(wěn)定遺傳是生物進化的基礎

！遺傳物質核酸是如何被證明的？

2、DNA攜帶兩種遺傳信息

a、編碼蛋白質和RNA的信息(編碼tRNA、rRNA)：64個三聯(lián)體密碼子：3個終止密碼子，編碼氨基酸的61個密碼子具有簡并性、通用性

b、編碼基因選擇性表達的信息

¨原核生物的結構基因占Genome的比例很大，Φx174phage 5386bp，結構基因用去5169bp比例達96％。

¨真核生物的結構基因占Genome的比例很小，哺乳動物中結構基因只占10％～15％。

¨其余80％以上的DNA起什么作用目前還無法精確解釋，但可以肯定其中大部分DNA序列是編碼基因選擇性表達的遺傳信息。

¨表現(xiàn)在：細胞周期的不同時相中

個體發(fā)育不同階段

不同的器官和組織

不同的外界環(huán)境下各種基因的表達與否以及量的差異

¨所以又稱－－調控序列

二、RNA也可作為遺傳物質

n RNA病毒：傳染媒介是病毒顆粒（病毒基因組RNA、蛋白質外殼）

n Tobacco Mosaic Virus

(TMV)

n 類病毒（viroid）: 使高等植物產生疾病的傳染性因子，只由RNA組成。

三、是否存在核酸以外的遺傳物質

n Prion(proteinaccous infections particle)引起的**

n 朊病毒－－－蛋白質樣的感染因子

1)羊搔癢病(scripie)

2)人類庫魯（kuru）病

3)牛海綿狀腦炎(瘋牛病)

n 均由傳染性病原蛋白顆粒引起，統(tǒng)稱Prion(朊病毒)資料：1982年，美國加利福尼亞大學教授斯坦利?普利西納提出雅克氏病的病原體是一種“蛋白質性質的感染顆?！?，并用prion（普利昂）一詞表示這種因子，國內曾譯為朊病毒或鋸蛋白。但這種蛋白質粒子缺乏核酸，稱為病毒并不妥當，故現(xiàn)在稱為朊毒體。

瘋羊病、瘋牛病及人類所患的新型雅克氏癥等海綿狀腦病，都是由朊毒體發(fā)生變異引起的。包括人在內的哺乳動物體內都存在朊毒體，它在正常形態(tài)下呈折疊狀，但變異時會張開如同鋸齒狀，在大腦中撐出大量的小洞，引起人或動物患上癡呆型的傳染性海綿狀腦病。

朊毒體的致病過程是：首先經一定傳播途徑（如進食患病動物的肉和內臟）侵入機體并進入腦組織，其后沉積于不同的神經元溶酶體內，導致被感染的腦細胞受損、壞死，釋出的朊毒體又侵犯其它腦細胞，使病變不斷發(fā)展；病變的神經細胞死亡后，腦組織中留下大量小孔呈海綿狀，并出現(xiàn)相應的臨床癥狀，這就是眾所周知的海綿狀腦病。

普利西納學說公布之初，在學術界曾遭到猛烈反對，多數(shù)人持否定態(tài)度。因為分子生物學的中心命題是“生物的遺傳基因以核糖核酸和脫氧核糖核酸為本體”，在此之前，人們普遍認為，不存在沒有核酸的病原體，這已成為常識，但普利西納的學說卻與這種認識背道而馳。經過10多年的研究和爭論，大量事實確證了朊毒體的存在，普利西納的學說最終得到了認可。鑒于這一發(fā)現(xiàn)的重大科學價值，普利西納榮獲1997諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

第二節(jié) 核酸的化學組成一、含氮堿基、核苷、核苷酸

l DNA is a nucleotide polymer with covalent bonds between the sugar and Phosphate groups.l A long molecular chain containing a sugar, a phosphate and one of four different nucleotide bases.l Chemical Composition（化學組成）:

Sugar(糖): Deoxyribose(ribose核糖in RNA)Phosphate(磷酸):-phosphodiester

Bases(堿基):(G)guanine

(C)cytosine

(A)adenine

(T)thymine！稀有堿基：假尿苷（?）、二氫尿嘧啶（DHU）、2`-O-甲基腺苷、N6，N6-二甲基腺苷。

名稱與縮寫(1)? RNA：ribonucleic acid

核糖核酸

? DNA：deoxyribonucleic acid

脫氧核糖核酸

? pyrimidine：

cytosine(Cyt)

胞嘧啶

嘧啶

thymine(Thy)

胸腺嘧啶

uracil(Ura)

尿嘧啶

? purine：

adenine(Ade)

腺嘌呤

嘌呤

guanine(Gua)

鳥嘌呤

名稱與縮寫(2)? ribonucleoside

核糖核苷（不帶磷酸）

adenosine(Ado)

腺(嘌呤核)苷

guanosine(Guo)

鳥(嘌呤核)苷

cytidine(Cyd)

胞(嘧啶核)苷

thymidine(Thd)

胸(腺嘧啶脫氧核)苷

uridine

(Urd)

尿(嘧啶核)苷

? ribonucleotide

核糖核苷酸（帶磷酸）

adenosine 5’-mono(di, tri)phosphaste；

AMP, ADP, ATP ? deoxyribonucleoside

脫氧核糖核苷

deoxyadenosine(dAdo)…… ? deoxyribonucleotide

脫氧核糖核苷酸

dAMP, dADP, dATP……dNTP

二、DNA分子的一級結構

1.多聚核苷酸鏈主鏈是核糖和磷酸，側鏈為堿基，由3’,5’磷酸二酯鍵連接

2.鏈的方向：同一個磷酸基的5’酯鍵到3’酯鍵的方向(5’→3’)

3、DNA一級結構的特點

a.脫氧核糖是其顯著特點－－－－DNA極其穩(wěn)定的根本原因

b、磷酸呈四面體構型，脫氧核糖呈折疊的五元環(huán)，堿基是平面的c、主鏈是親水的，側鏈（堿基）是疏水的

n 主鏈的脫氧核糖的羥基能與水形成氫鍵，而磷酸基團在生理條件下離解為負離子, 這些特點保證了多核苷酸鏈可形成穩(wěn)定的構象。

4、一級結構的概念

n 指DNA分子中的核苷酸排列順序

n 不同生物借此貯存遺傳信息

n 決定DNA的二級結構和高級結構

第三節(jié) 核酸二級結構

一、DNA雙螺旋模型的提出

依據(jù)

n a.1938.W.T.Astbury 首次用X－射線分析DNA

n b.1950 Chargaff

A + G / T + C = 1

A+T ≠

G + C n c.1952 Alexander Todd

發(fā)現(xiàn)了核苷酸和核苷酸之間由磷酸二酯鍵聯(lián)接

n d.1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin

得到了高度定向的DNA纖維的X-射線照片

發(fā)現(xiàn)原子長軸存在0.34和3.4nm兩種周期性

n 此外，之前的密度測定表明螺旋由兩條多核苷酸鏈組成，且直徑恒定（2nm)。

Watson-Crick的DNA雙螺旋

n 兩條相互獨立的單鏈DNA分子以螺旋方式相互纏繞，形成右手雙螺旋；

n 帶有負電的戊糖-磷酸骨架在分子的外側；

n 堿基則平面堆積于螺旋的內部；

n 由于骨架雙鏈在螺旋軸上的間距不相等，從而在分子表面形成大溝和小溝。大溝和小溝。雙螺旋表面的溝對DNA和蛋白質的相互識別是很重要的，因為在溝內才能覺察到堿基的順序，而在雙螺旋的表面，是脫氧核糖和磷酸重復結構，沒有信息可言。（蛋白質

核酸，核酸

核酸、鋅指結構）

n

雙螺旋模型參數(shù)

n 直徑20?

n 螺距為34?(任一條鏈繞軸一周所升降的距離)n 每圈有10個核苷酸(堿基)

n 兩個堿基之間的垂直距離是3.4?。螺旋轉角是36度。

n 有大溝和小溝，配對堿基并不充滿雙螺旋空間，且堿基對占據(jù)的空間不對稱。

二、影響雙螺旋結構穩(wěn)定性的因素

氫鍵

范德華力（Van de waals force）

疏水作用力(Hydrophobic interaction)* 不穩(wěn)定因素

n 磷酸基團間的靜電斥力

n 堿基內能增加(溫度), 使氫鍵因堿基排列有序狀態(tài)的破壞而減弱

三、雙螺旋結構多樣性

B-DNA：資料來自相對濕度為92％所得到的DNA鈉鹽纖維。

此外人們還發(fā)現(xiàn)了A、C、D、E等右手雙螺旋和左手雙螺旋Z構象等形式。

DNA結構的多態(tài)性：幾種不同的DNA雙螺旋結構以及同一種雙螺旋結構內參數(shù)存在差異的現(xiàn)象。

原因：多核苷酸鏈的骨架含有許多可轉動的單鍵，磷酸二酯鍵的兩個P-O鍵、糖苷鍵、戊糖環(huán)各個鍵。

第四節(jié) DNA的高級結構

1、反向重復序列與二級結構

n 反向重復序列（inverted repeatitive sequence or inverted

repeats, IR）,又稱回文序列（廻文）：指兩段同樣的核苷酸序列同時存在于一個分子中，但具有相反的方向。有時也有不完全相同的情況。

¨RNA和DNA中都可能存在

n 此外還可有directed repeatitive sequence---正向重復序列

n 較短的回文序列可能是作為一種信號

n

如：限制性內切酶的識別位點

n

一些調控蛋白的識別位點

n 例如限制性內切酶 EcoRⅠ的識別位點

5′－－GAATTC－－3′

3′－－CTTAAG－－5′

2.DNA(Trible Helix DNA, T.S DNA)的三股螺旋結構

（1）發(fā)現(xiàn)和證實

1953年，Watson & Crick D.S DNA model證明沿大溝存在多余的氫鍵給體與受體

潛在的專一與DNA(蛋白質)結合的能力

形成T.S DNA 可能性

1957 年Felsenfeld等發(fā)現(xiàn)一股為嘌呤，另一股為嘧啶的核苷酸雙鏈能夠形成三鏈

如： polyA/polyU

polydA/polydT

polyd(AG)/polyd(CT)——三螺旋DNA的概念提出

1987年Mirkin.S.M證明plasmid DNA在 pH= 4.3的溶液中, 有T.S DNA的存在，這些發(fā)現(xiàn)促進了三螺旋DNA的研究

（2）組成形式

a、D.S.DNA + D.S.DNA→T.S.DNA + S.S.DNA b、分子組成

☆ PY/PU + PU(偏堿性介質中穩(wěn)定)

G＊G、A＊A、G＊C＋

☆ PY/PU + PY(偏酸性介質中穩(wěn)定)常見類型

G＊C＋

A＊T

3、四股螺旋DNA(tetraplex DNA, Tetrable Helix DNA 結構特點：基本結構單元－－鳥嘌呤四聯(lián)體

可能的功能：

A、穩(wěn)定真核生物染色體結構

B、保證DNA末端準確復制

C、與DNA分子的組裝有關

D、與染色體的meiosis & mitosis 有關

4、DNA的超螺旋結構

⑴超螺旋(superhelix

OR

supercoil)的形成和類型

l形成

松馳態(tài)DNA（relax form）

低能量

常態(tài)

超螺旋（Supercoied）DNA

正超螺旋

負超螺旋

DNA的超螺旋結構

正超螺旋（positive supercoiled）緊纏overwinding(右旋)負超螺旋（Negative Supercoiled）

松纏unwinding(左旋)原核生物DNA的三級結構：

n 絕大多數(shù)原核生物的DNA都是共價封閉的環(huán)狀雙螺旋。如果再進一步盤繞則形成麻花狀的超螺旋三級結構。

⑵超螺旋的定量描述

n White方程： L=T+W

n 連接數(shù)L（Linking nnmber）：指cccDNA中一條鏈繞另一條鏈的總次數(shù)。其特點是

(1)L是整數(shù)；

(2)在cccDNA的任何拓撲學狀態(tài)中其值保持不變；

(3)右手螺旋對L取正值。

n T（Twisting number）：盤繞數(shù)，即DNA分子中Watson-Crick螺旋數(shù)，初級螺旋圈數(shù)。其特點是：

(1)可以是非整數(shù)；

(2)是變量；

(3)右手螺旋時T為正值。

n W（Writhing number）：超盤繞數(shù)，即超螺旋數(shù)，直觀上為雙螺旋在空間的轉動數(shù)。其特點是：

(1)可以是非整數(shù)；

(2)是變量；

l(3)右手螺旋時，W取負值。

l 拓撲異構酶解超螺旋的特點。

第五節(jié) 真核生物的染色體及其組裝

一、真核細胞染色體組成

1、組成：DNA和蛋白質,以及少量的 RNA.2、染色體體和染色質的概念

v 染色質(chromatin)：是指細胞周期間期細胞核內由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成的復合結構，因其易被堿性染料染色而得名。

v 染色體(chromosome)：是指在細胞分裂期出現(xiàn)的一種能被堿性染料強烈染色，并具有一定形態(tài)、結構特征的物體。攜帶很多基因的分離單位。只有在細胞分裂中才可見的形態(tài)單位。

！分類：

v 常染色質(euchromatin)

（間期纖絲的包裝密度度比分裂期染色體的要小很多）

v 異染色質(heterochromatin)

（間期纖絲染色質區(qū)的包裝密度十分致密，可與有絲分裂期染色體相比）

組成型異染色質(constitutive

heterochromatin)

兼性異染色質(facultative heterochromatin)

3、染色體中的蛋白質

組蛋白分為H1、H2A、H2B、H3和H4。其特性：

v 進化上的極端保守性

不同種生物組蛋白的氨基酸組成是十分相似的，特別是H3和H4。

v 無組織特異性

到目前為止，僅發(fā)現(xiàn)鳥類、魚類及兩棲類紅細胞不含H1而帶有H5，精細胞染色體的組蛋白是魚精蛋白兩個例外。

v 肽鏈上氨基酸分布不對稱性

堿性氨基酸集中分布在N端的半條鏈上。

v 組蛋白的修飾作用

包括甲基化、乙酰化、磷酸化及ADP核糖基化等。

v 富含賴氨酸的組蛋白H5

非組蛋白：

(1)HMG 蛋白（high mobility group protein）, 這類蛋白可能與DNA的超螺旋結構有關。

(2)DNA結合蛋白

可能是一些與DNA復制或轉錄有關的酶或調節(jié)物質。

(3)A24非組蛋白

位于核小體內功能不詳。

4、核小體的形成

八聚體在中間，DNA盤繞在外而H1則在核小體的外面，每個核小體只有一個H1。所以核小體中組蛋白和DNA的比例是每200bpDNA有H2A，H2B，H3，H4各兩個，H1各一個。

5、染色體的高級包裝

v 核小體的形成是染色體壓縮的第一階段，約1/7；

v 螺旋管的每個螺旋包含6個核小體，壓縮比為6；

v 中期的染色質是一個細長中空的圓筒，為400nm, 由30nm螺旋管纏繞而成，壓縮比為40;

v 這個超螺旋圓筒進一步壓縮1/5便成為染色單體，總壓縮比是7x6x40x5，將近10000倍。

第六節(jié) RNA的結構與功能

一、RNA 的功能：

l 信息分子

遺傳信息由DNA到蛋白質的中間體 的核心作用。

l 功能分子

1.作為細胞內蛋白質生物合成的主要參與者，參與在蛋白質合成中核蛋白復合物的結構組成和功能發(fā)揮；

2.具有生物催化的功能，作用于初始轉錄產物的剪接加工；

3.與生物機體的生長發(fā)育密切相關，參與基因的表達調控；

4.與生物體的進化有很大的關系。

5.核糖體

6.信息體

7.拼接體

8.編輯體

二、RNA的分類

v mRNA的結構

v tRNA的結構

v rRNA的結構

v snRNA v snoRNA

v 非編碼mRNA！每種RNA的基本結構和功能?。?！

第七節(jié) 核酸的物理化學性質

DNA雙股鏈的互補是其結構和功能上的一個基本特征，也是DNA研究中一些實驗技術的基礎。

一、DNA分子的變性

1、條件：加熱，極端pH，有機溶劑（尿素、酰胺)，低鹽濃度等

2、變性過程的表現(xiàn)

¤ 是一個爆發(fā)式的協(xié)同過程，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍

¤ 導致一些理化性質發(fā)生劇烈變化

3、熔解曲線與Tm值

緩慢而均勻地增加DNA 溶液的溫度（現(xiàn)可做到 0.1 ℃／分）可根據(jù)各點的A260值繪制成DNA的熔解曲線。

Tm=℃ of Ct = C0/2 = OD增加值的中點溫度(一般為85-95℃)或DNA雙螺旋結構失去一半時的溫度

這也是一般PCR實驗技術中把變性溫度定為94 ℃的原因。

4、影響 Tm值的因素

（1）在 A, T, C, G 隨機分布的情況下，決定于GC含量

n GC%愈高

→

Tm值愈大

n GC%愈低

→

Tm 值愈小

（2）GC%含量相同的情況下

AT形成變性核心，變性加快，Tm 值小。

堿基排列對Tm值具有明顯影響

?生物體內僅UAA為最有效的終止密碼子

n 因為：UAA、AUU的Tm值是最低的一個，即使生理溫度下也不穩(wěn)定。

二、DNA分子的復性

（anneal or renaturation）

n 概念：變性DNA在適當條件下，兩條彼此分開的鏈又可以 重新地合成雙螺旋結構的過程（退火）。

根據(jù)復性動力學公式我們可以知道什么？

(1)單鏈濃度隨著時間的增大而減??；

(2)反應速率取決于初始的單鏈濃度Co；

(3)以反應濃度和COt1/2為座標可繪復性曲線;(4)通過COt1/2值可測原核生物基因組的大小;

已知大腸桿菌的基因組為4.2x106bp, COt1/2 = 9M.Sec

則

(5)原核生物基因組大小不同，復性曲線也不同;(6)可用以區(qū)分真核生物和原核生物基因組。

在復性反應中如何知道單鏈已經結合成雙鏈了呢？可以通過哪些法來檢測？

(1)減色效應（hpochromic effcef）

測定光密度，即OD值(optical density），DNA從單鏈變成雙鏈，OD260減少30%(2)羥基磷灰石柱層析

羥基磷灰石對雙鏈DNA吸附較牢，不易吸附單鏈。

四、核酸分子雜交（hybridization）※ 雜交形式：

n 液相雜交

n 固相雜交(濾膜雜交)¨1975 E.M.Southern ¨Southern blot

S.S.DNA × S.S.DNA ¨1977.J.C.Alwine ¨Northern blot

S.S.RNA × S.S.DNA ¨1978.Hany Towbin ¨Western blot

Protein(antigen)× antibody ＊固相分子雜交(1975 E.M.Southern)

！復習思考題

1、堿基、核苷、核苷酸的化學組成2、核酸的一級結構

書寫方向

3、Watson ＆ Crick 的Double Helix Model

參數(shù)

大小溝

二級結構的多態(tài)性

4、影響二級結構的作用力：

穩(wěn)定因素

不穩(wěn)定因素

5、DNA的不尋常結構：

反向重復序列

三螺旋DNA

四鏈DNA

6、真核生物的染色體：核小體的組成和組裝

染色體的多級包裝

7、RNA的種類及其相關結構和功能與及應用

8、變性：溶解曲線

Tm

影響因素（GC、化學試劑、鹽、pH）

9、復性

C0t曲線

C0t（1／2）

10、核酸分子雜交的類型

11、DNA的超螺旋結構

形成、類型

組蛋白和非組蛋白

第三篇：分子生物學電子教案第六章

第六章 遺傳重組

1．課程教學內容(1)同源重組(2)位點特異性重組(3)轉座重組(4)逆轉座子 2．課程重點、難點 幾種重組的機理。3．課程教學要求

（1）理解重組產生的遺傳效應；（2）掌握不同重組產生的機理。

一、概述

重組是完整DNA分子的斷裂和重接

1930年，細胞學觀察：染色單體斷裂，重接，發(fā)生交換。

1955年，遺傳學家發(fā)現(xiàn)交換可以發(fā)生在基因內部，推測重組是在復制時發(fā)生的，拷貝選擇（copy choice）。

結論：重組是DNA分子斷裂后重新連接形成的。更進一步研究證明末復制的DNA分子也可以發(fā)生重組。

遺傳重組 廣義地說，任何造成基因型變化的基因交流過程都稱為遺傳重組。狹義上的遺傳重組指涉及到DNA分子內斷裂-復合的基因交流。

根據(jù)對DNA序列和所需蛋白質因子的要求，可以分為四類包括：

– 同源重組（homologous recombination）

– 位點專一性重組（site-specific recombination）

– 轉座重組（transposition），被移動的DNA片段叫轉座子（transposon）– 異常重組

同源重組 發(fā)生在DNA的同源序列之間。真核生物非姊妹染色子體的交換、細菌及某些低等真核生物的轉化、細菌的轉導、接合、噬菌體的重組都屬于這種類型。大腸桿菌的同源重組需要RecA蛋白。

位點特異性重組 發(fā)生在兩條DNA的特異性位點上，λ噬菌體DNA通過其attp位點和大腸桿菌DNA的attB 之間的位點特異性重組而實現(xiàn)整合過程 轉座過程中，轉座成分從染色體的一個區(qū)段轉移到另一個區(qū)段或從一條染色體的轉移到另一條染色體。轉座作用既不依靠轉座成分和插入區(qū)段的同源性，又不需要RecA蛋白質。由于轉座作用總是伴隨著轉座成分的復制，故又稱為復制重組。

異常重組不需要DNA序列的同源性和RecA蛋白質，而且它也不需要轉座酶。

二、同源重組的機制

同源重組的行為本身是DNA序列的交換：兩個同源的DNA雙螺旋分子相互接近，接觸，然后有關的部分發(fā)生交換。它的特征是任意一對同源系列都可以作為底物由有關的酶催化重組。這些酶對DNA無堿基序列的特異性，只要兩個DNA序列相同或接近相同，就可催化重組。

同源重組發(fā)生在染色體上具有相同或相近序列的DNA區(qū)域 重組的起動需要DNA分子上有斷裂或缺口

事實表明，DNA斷裂能夠大大提高重組率。因此紫外照射、X光和一些能夠使DNA斷裂的化學物質可大大提高重組率。在大腸桿菌中，DNA 聚合酶Ⅰ和連接酶基因的突變也有同樣作用。酵母整合載體，若是線狀則可提高整合率1000倍。

RecA 蛋白使單鏈DNA與染色體上互補序列配對。RecA蛋白: – 依賴于DNA的水解三磷酸核苷的功能 – 在兩條互補的單鏈間促進配對的功能 – 依賴于ATP和寡聚核苷酸的蛋白水解酶的

Rec A蛋白能專一性地識別單鏈DNA，使它與同源染色體雙鏈DNA的互補序列退火，替換原來的互補鏈。

Rec A蛋白以一定比例與單鏈DNA結合，一般1個蛋白多肽5個核苷酸，形成DNA-蛋白絲。在ATP存在時，Rec A可使雙鏈解旋，形成新的雜種DNA。

在有些噬菌體，如T7和λ噬菌體中，僅有核酸酶和SSB，隨機碰撞可重組。高等生物的重組需要Rec A蛋白。Rec BCD和其它蛋白在重組中的作用

若沒有Rec BC，在細菌接合過程中重組率可降低100倍，這種復合酶大約300kd，具有DNA解旋和核酸酶的活性。它可以幫助有游離末端的DNA形成單鏈DNA片段，從而有利于RecA 蛋白作用。它識別并切割Chi序列：5'GCTGGTGG-3' 在大腸桿菌接合過程中易形成雙鏈DNA游離末端，在P1噬菌體轉導和λDNA侵染的細胞中RecBC對重組率影響極大。

一種核酸酶切開霍利迪結合點，從而完成重組?；衾辖Y構 它是DNA重組過程中的一個中間體，重組時兩個DNA雙鏈體以四股DNA在連結點形成的十字形DNA分子構象。

異源雙鏈體(Heteroduplexes)：異源雙鏈體是指重組DNA分子上兩條鏈不完全互補的區(qū)域。

分支遷移（Branch migration）：一旦兩個重組的DNA分子形成霍利迪結構，交叉連接點很容易像拉鏈一樣移動，從而擴大異源雙鏈體區(qū)域，這一程 叫分支遷移。

三、位點專一性重組

是指噬菌體基因組插到細菌的染色體中，這個過程也叫整合（integrate），需要噬菌體DNA與細菌DNA的專一序列。

在位點專一性重組中沒有DNA的合成，每條DNA鏈上的斷裂和重接十分精確。λ噬菌體的整合和解離

λ 噬菌體：裂解周期和溶源化周期。

附著位點（attachment site，Att）：大腸桿菌23bp；噬菌體 240bp，相同的核心序列。

整合需要整合酶(integrase，int)和一種細菌蛋白integration Host factor(IHF)；解離需要Xis gene產物，int和IHF。

在溶源lysogenic周期中，噬菌體λ DNA是細菌染色體的一個整合部分，成為原噬菌體prophage。

在裂解lytic周期中，λDNA以獨立的環(huán)狀分子存在于被侵染的細菌中。兩種狀態(tài)的改變就包括了位點專一性重組。要進入溶源狀態(tài)，游離的λDNA必須被整合(integrate)進寄主DNA；要從整合的溶源狀態(tài)釋放，進入裂解狀態(tài)，原噬菌體DNA必須從染色體上剪切下來excise。

整合作用 整合與剪切發(fā)生在噬菌體和細菌的特殊位點上，這個位點叫附著點attachment site（att）。細菌的位點叫attB，由BOB’組成。噬菌體的位點叫attP，由POP’組成。序列O是att B和att P的共同序列，叫核心序列core sequence，重組就發(fā)生在這里。側翼的序列B、B’、P、P’是臂，序列各不相同。原噬菌體由重組產生的新位點界定。左邊的位點叫att L，由BOP’組成，右邊的位點叫att R，由POB’組成。整合作用發(fā)生在att B和att P之間（att B×att P），而剪切作用發(fā)生在att L和attR之間（att L×attR），四、轉座子重組（Recombination via transposon）重組不依賴DNA的序列，使一段DNA序列從染色體的一個位置移動到另一個位置，甚至從一個染色體移動到另一個染色體，這種重組叫轉座重組（transposition），被移動的DNA片段叫轉座子（transposon）。

轉座子（或transposalole elements）：可以轉移到新位置的DNA序列。

轉座因子可以直接或間接造成基因組重排： ① 直接造成缺失一倒位或序列移位。② 作為小的同源區(qū)域在細胞同源重組體系作用下，相互重 組造成缺失、插入、倒位和易位(translocation)。1 細菌中的轉座重組

簡單轉座子、復合轉座子、轉座的機制、TnA家族的轉座子 1）簡單轉座子

? 最簡單的轉座子就叫插入序列(Insertion sequences ,IS)。λ:IS1表示IS1插入λ噬菌體的基因組。

? IS序列可以編碼自己轉座所需的轉座酶.IS兩端帶有反向重復序列，中間是一個轉座酶基因，不帶其它標記基因。

? 在IS 轉座時，插入位點的DNA序列重復了(正向重復)。不同IS插入位點不同，但重復序列大多為5-9bp。

? 每個插入序列的末端都是短的反向末端重復序列inverted terminal repeats，兩個反向末端重復序列往往很相似但不一定相同。不同IS序列轉座率不同，一般每代為10-3—10-4。

? 轉座完成后，靶位點形成兩個拷貝，位于轉座子的兩端，形成同向重復序列direct repeats。

2）復合轉座子Composite Transposons ? 有些轉座子除了與轉座有關的功能外，還帶有抗藥性或其它標記，這些轉座子命名為Tn加數(shù)字。復合轉座子是一種大的轉座子，中間區(qū)帶有抗藥標記，兩邊各帶一個由IS因子組成的臂，這兩個臂可以是同向或反向的。

? 由于IS序列成為復合轉座子的一個組成部分，所以又把IS序列稱為IS元件module。因為每個元件都有一對反向末端重復，所以整個復合轉座子的末端也是反向重復序列。? 轉座使靶位點加倍。

? Tn5的兩個邊界IS50R序列只差一個堿基，IS50R是有功能的，IS50L無轉座功能

3）TnA家族的轉座子

? Tn A家族的轉座子不與IS元件復合，只含有長度為37－38bp的反向末端重復。? 這類轉座子在靶位點上產生5bp的同向重復。

? TnA家族轉座子的運動需要轉座 酶的作用，解離需要一個特殊解離位點，這是TnA家族的特征。

? 這類轉座子含有3個基因，beta-內酰胺酶，解離酶，轉座酶。4）轉座子的轉移機制

① 轉座子能夠精確的轉座，帶著在原來位置上的所有DNA序列，而不帶任何相鄰序列，這可能就涉及到轉座酶能夠準確地識別兩個轉座子的末端。② 在目標DNA的位置有3-12 個堿基(決定于轉座子)被精確地復制了，在轉座子兩端各有一個拷貝。所以，在轉座子過程中一定有DNA的合成。③ 雖然大部分轉座子可插入基因組任何區(qū)域，但它們的移動也不是完全隨機的，而是更易于插入某些區(qū)段。5）轉座作用的遺傳效應

? 轉座引起插入突變 各種IS, Tn 都可以引起插入突變

? 轉座產生新基因 如果轉座子上帶有抗藥性基因，它一方面造成靶DNA序列上的插入突變，同時也使這個位點帶有抗藥性

? 轉座產生染色體畸變 當復制性轉座發(fā)生在縮主染色體DNA原有的位置附近時，往往導致轉座子兩個拷貝的重組，引起DNA的缺失和倒位。當重組發(fā)生在兩個正向重復轉座區(qū)之間，就導致宿主染色體缺失。如果重組發(fā)生在兩個反向重復轉座區(qū)，則引起染色體DNA 倒位。? 轉座引起生物的進化 6）轉座子轉座的特征

? 轉座不依賴于靶序列的同源性 ? 轉座后靶序列重復 ? 轉座子的插入具有專一性 ? 轉座子具有排它性 ? 轉座具有極性效應 ? 活化鄰近的的沉默基因 ? 區(qū)域性優(yōu)先 2真核生物中的轉座 1）玉米的轉座子

四十年代玉米遺傳學研究發(fā)現(xiàn)，在體細胞分裂過程中所發(fā)生的變異是由一些控制因子(controlling elements)決定的，這些因子可以從一個位置移動到另外一個位置。這些控制因子是由McClintock 鑒定的，現(xiàn)在都可以認為是轉座子。

? 自主成分autonomous elements：它們具備使自身切除或轉座的能力，它們可在任意位點插入并產生不穩(wěn)定的或可變化的等位基因。? 非自主成分nonautonomous elements：它們只有在同家族的自主成分存在時才能切除或轉座，它們自身很穩(wěn)定，不能單獨移動。非自主成分由自主成分衍生而來，當自主成分丟失了某些對轉座必需的功能后，就形成了非自主成分。

玉米有幾組不同的控制因子，每組又都有自主型和非自主型（autonomous and nonautonomous elements）。

2）果蠅的轉座子

果蠅的P轉座子引起的雜種不育

3）逆轉錄轉座子

? 逆轉錄轉座：將從DNA到DNA的轉移過程稱為轉座，從DNA到RNA到DNA的轉移過程稱為逆轉座子。

? 經RNA中間體介導的轉座是真核生物所特有的過程。逆轉錄病毒能夠將RNA病毒基因組的DNA拷貝整合到宿主細胞染色體中。

? 逆轉錄子：一類移動因子在轉錄過程中需要以RNA為中間體，經過逆轉錄再分散到基因組中。? 酵母的Ty轉座子 ? 果蠅的copia轉座子 逆轉錄子的結構特點：

? 逆轉錄子轉座關鍵酶是逆轉錄酶和整合酶 ? 逆轉錄子自身編碼逆轉錄酶和（或）整合酶 ? 結構特征：

具有與逆轉錄病毒類似的長末端重復，并有gag和pol基因。如酵母的Ty, 果蠅的copia和gypsy,人類的THEI。不具有LTR，但有3polyA,中心區(qū)含有gag，pol類似序列。如果蠅I因子，哺乳類的長分散因子L1.

第四篇：分子生物學電子教案第一章

?

第一章 緒論

1．課程教學內容

（1）十九世紀和二十世紀生命科學的回顧（2）分子生物學的概念

（3）二十一世紀分子生物學展望 2．課程重點、難點

分子生物學的概念、研究內容和發(fā)展歷史 3．課程教學要求

（1）理解分子生物學研究的內容；

（2）掌握分子生物學領域一些具有里程碑意義的事件。

一、什么是分子生物學？

分子生物學：是研究核酸、蛋白質等生物大分子的形態(tài)、結構特征及其重要性和規(guī)律性和相互關系的科學，是人類從分子水平上真正揭示生物世界的奧秘，由被動地適應自然界主動地改造和重組自然界的基礎學科。創(chuàng)世說與進化論

?許多年來，人們反復提出的3個與生命和一切生物學現(xiàn)象有關的問題：生命怎樣起源？為什么有其父必有其子？動植物個體怎樣從一個受精卵發(fā)育而來？

?十九世紀初葉，對于這些問題只能從宗教或迷信的角度進行回答---上帝創(chuàng)造了一切。?1859年，偉大的英國生物學家達爾文發(fā)表了物種起源一書，確立了進化論。

細胞學說

?17世紀末葉，荷蘭籍顯微鏡專家 Leewenhoek 制作成功了世界第一架光學顯微鏡。?與Leewenhoek同時代的Hooke, 第一次用細胞這個概念來形容組成軟木的最基本單元。雖然這一概念到十九世紀中葉，才正式被科學界接受，但它對生物學的貢獻是不可估量的。?細胞學說是由德國植物學家 Schleiden和動物學家Schwann建立的。這一發(fā)現(xiàn)被稱為十九世紀的三大發(fā)現(xiàn)之一。

?Schleiden出生于德國漢堡，22歲就獲得了法學博士學位，但他并不喜歡當律師，28歲時他到哥廷根和柏林學習植物學和醫(yī)學，36歲獲得醫(yī)學和哲學博士學位。

?Schwann是首飾匠的兒子，16歲高中畢業(yè)后，沒有按照父母的意愿學習神學，而是到柏林學醫(yī)，24歲獲得了博士學位。在柏林解剖博物館工作時結識了Schleiden.?他們雖然個性、經歷迥然不同，但共同的志趣促成了他們多年的合作。Schleiden研究植物的囊胚，Schwann研究蛙類的胚胎組織，相同的研究方向，相似的研究方法，使他們取得了一致的見解，共同創(chuàng)立了生物科學色基礎理論。

?所有組織的最基本的單元是形狀非常相似而有高度分化的細胞。細胞的發(fā)生和形成是生物學界普遍和永久的規(guī)律。

?細胞學說對生命現(xiàn)象實際上是細胞活動的總和，所以細胞可以而且應該成為生物學研究的主要對象。

經典的生物化學和遺傳學

?進化論和細胞學說相結合，產生了作為主要實驗科學之一的現(xiàn)代生物學，而以研究動、植物遺傳變異規(guī)律為目標遺傳學和以分離純化、鑒定細胞內含物質為目標的生物化學則是這一學科的兩大支柱。

?在十九世紀中葉，人們發(fā)現(xiàn)動物和植物細胞的提取液中主要是一些能受熱或酸變性形成纖維狀沉淀的物質。DNA的發(fā)現(xiàn)

早在 1928年英國科學家Griffith等人就發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌使小鼠引起死亡的原因是引起肺炎。細菌的毒性是由細胞表面夾膜中的多糖所決定的。具有光滑外表的S型肺炎鏈球菌因為帶有夾膜的多糖而能使小鼠發(fā)病，具有粗糙外表的R型細菌因為沒有夾膜多糖而失去致病力。首先實驗證明基因就是DNA分子的是美國著名的微生物學家Avery.實驗過程

? 首先將光滑型致病菌（S型）燒煮殺滅活性以后再侵染小鼠，發(fā)現(xiàn)這些死細菌自然喪失致病能力。? 再用活的粗糙型細菌來侵染小鼠，也不能使之發(fā)病，因為粗糙型細菌天然無致病力。

? 然而當他們將經燒煮殺死的S 型細菌和活的R型細菌在混合感染小鼠時，實驗小鼠每次都死去。

? 解剖死亡的小鼠發(fā)現(xiàn)大量的活的S 型細菌。

Hershey和他的學生Chase的噬菌體侵染細菌的實驗

? 噬菌體用尾部的末端吸附細菌表面

? 噬菌體通過尾軸把DNA全部注入細菌細胞內，噬菌體的蛋白外客則留在細胞外面。

? 噬菌體的 電腦啊一旦進入細菌體內，它就能利用細菌的生命過程合成噬菌體自身的DNA和蛋白質

? 新合成的DNA和蛋白質外殼，能組裝成許多與親代完全相同的子代噬菌體； ? 子代噬菌體由于細菌的解體而被釋放出來，再去侵染其他細菌。在整個過程中，DNA起了關鍵的作用。

二、分子生物學的發(fā)展簡史

? 從1847年提出細胞學說至今一百多年間，我們對生物大分子即細胞的組成有了深刻的認識。為了全面了解分子生物學的的發(fā)展，我們不妨來看一看部分諾貝爾生理醫(yī)學獎和化學獎作為紐帶的分子生物學發(fā)展簡史。

? 1910年，德國科學家Kossel因為蛋白質、細胞和核酸化學的研究而獲得諾貝爾生理醫(yī)學獎，他首先分離出腺嘌呤、胸腺嘧啶和組氨酸

在量子力學家薛定諤的《生命是什么?》(1944年)一書的影響下，許多物理學家和化學家投身于生命的分子基礎和基因的自我復制這兩個生物學中心問題的研究,將現(xiàn)代物理學和化學的最新成果、理論和方法帶入了生物學研究中。

(1)1953年4月25日出版的Nature雜志上，沃森(Watson)和物理學家克里克(Crick)提出了DNA雙螺旋結構模型，標志著遺傳學以及整個生物學進入分子水平的新時代。(2)50年代初，Barbara Mclintock 在玉米中發(fā)現(xiàn)可動遺傳因子即轉座因子，但是這個過于超時代的發(fā)現(xiàn)當時并未得到承認，甚至受到譏笑。(3)1961年克里克等證明了他于1958年提出的關于遺傳三聯(lián)密碼的推測。1969年Nirenberg 等解譯出全部遺傳密碼。

(4)60年代，闡明mRNA、tRNA 及核糖體的功能、蛋白質生物合成的過程、“中心法則”等。（5）70年代，發(fā)現(xiàn)限制性核酸內切酶、人工分離和合成基因取得進展，1972年P.Berg 成功實現(xiàn)了DNA體外重組;1973年S.N.Cohen 通過DNA的體外重組成功地構建了第一個有生物學功能的細菌雜交質粒，從而興起以DNA重組技術為核心的基因工程研究。

（6）80年代，基因工程技術飛速發(fā)展，基因工程藥物和疫苗投入臨床使用，轉基因動植物產品上市銷售，轉基因動植物生物反應器研究成為熱點并實現(xiàn)商品化。

（7）90年代，1992年“人類基因組計劃”開始實施，投資30億美元旨在測定人類基因組全部30億個核苷酸對的堿基序列，是在破譯生物體全部遺傳密碼的征途上邁出的第一步，將為揭開人類和生物體生長、發(fā)育、疾病、衰老和死亡的奧秘奠定基礎，其意義與原子彈研究曼哈頓計劃和載人登月阿波羅計劃相比有過之而無不及?？寺⊙颉岸嗬颉?Dolly)誕生之后，克隆牛、羊、小鼠等動物紛紛獲得成功。

（8）21世紀初人類基因組計劃提前完成，遺傳學面臨新的挑戰(zhàn)和使命，即進入了“基因組后研究”時代，在搞清楚基因組的全部序列的基礎上，還要 徹底闡明基因組所包含的全部遺傳信息的生物學功能，及其所編碼的蛋白質的結構和功能，所以又稱為“蛋白質組”研究。同時，還要應用基因工程和蛋白質工程技術，改造蛋白質，使人類對生命活動的認識和支配由必然王國進入自由王國。

三、分子生物學的研究內容

分子生物學的三條基本原理：構成生物體各類有機體大分子的單體在不同生物中都是相同的；生物體內一切有機大分子的建成都遵循共同的規(guī)則；某一特定生物體所擁有的核酸及蛋白質分子決定了它的屬性。

分子生物學涉及的范圍極為廣泛，研究內容也似乎包羅萬象，事實上它研究的內容不外乎以下四個方面：DNA重組技術、基因表達與調控、生物大分子的結構與功能研究、基因組、功能基因組和生物信息學。1）DNA重組技術 DNA重組技術（基因工程）是20世紀70年代初興起的技術科學，目的是將不同的DNA片段按照人們的設計定向連接起來，在特定的受體細胞中與載體同時復制并得到表達，產生影響受體細胞的新的遺傳性狀。

DNA重組技術是核酸化學、蛋白質化學、酶工程及微生物學、遺傳學、細胞學長期深入研究的結果，而限制性內切酶、DNA連接酶及其他工具酶的發(fā)現(xiàn)和應用則是這一技術得以建立的關鍵。

DNA重組技術的應用：大量生產某些在正常細胞代謝中產量很低的多肽，如激素、抗生素、酶類及抗體等；可以定向改造某些生物的基因組結構，是它們所具備的特殊經濟價值或功能得以成百上千倍的提高。DNA重組技術還被用來進行基礎研究。2）基因表達調控研究

? 基因表達調控主要表現(xiàn)在信號轉導研究、轉錄因子研究和RNA剪輯3個方面。? 信號傳導是指外部信號通過細胞膜上的受體蛋白傳到細胞內部、并激發(fā)諸如離子通透性、細胞形狀或其他細胞功能方面的應答過程。信號轉導之所以能引起細胞功能的改變，主要是由于信號最后活化某些蛋白質分子，使之發(fā)生構型的變化，從而直接作為靶位點，打開或關閉某些基因

? 轉錄因子是是一群能與基因5?端上游特定序列專一結合，從而保證目的基因以特定的強度在特定的時間與空間表達的蛋白質分子。

? 真核基因轉錄成前體mRNA后，除了在5?端加帽及3?端加多聚A之外，還要切去隔開各個相鄰編碼區(qū)的內含子，使外顯子相連后成為成熟mRNA.3）生物大分子的結構功能研究

? 生物大分子發(fā)揮生物學功能時，必須具備兩個前提：有特定的空間結構；在發(fā)揮生物學功能過程中必定存在著結構和和構象的變化。

? 結構分子生物學就是研究生物大分子特定的空間結構及結構的運動變化與其生物學功能關系的科學。

4）基因組、功能基因組與生物信息學研究 ? 基因組學 ? 功能基因組學 ? 蛋白組學 ? 生物信息學

四、分子生物學展望

人類基因組計劃的開展到其他生物的基因組測序。

基因工程----轉基因動物植物，提高產量、質量到生產藥物蛋白，轉基因克隆技術等。生物學在各個學科之間廣泛滲透，相互促進，不斷深入和發(fā)展。科學家從分子水平、細胞水平、個體和群體等不同層次深入探索各種生物現(xiàn)象。

分子生物學與其他學科的融合：與細胞生物學、神經生物學、與遺傳學、與分類學和生物進化研究、與發(fā)育生物學

1、生命科學可望成為21世紀的領銜學科

在科學發(fā)展的歷史上，各門學科并非齊頭并進，總有一門或一組學科走在其他學科的前面，從理論觀念、思維方式或科研方法上對其他學科發(fā)揮重要的影響，人們稱之為帶頭學科。近代科學的帶頭學科是力學，現(xiàn)代科學的帶頭學科是物理學，21世紀的帶頭學科將是什么？人們看好生命科學?；仡櫩茖W的發(fā)展史，我們就能看到力學和物理學成為近代和現(xiàn)代科學的帶頭學科的必然性。

20世紀下半葉以來，生命科學文獻在科學文獻中的比重、從事生命科學研究的科學家人數(shù)在自然科學家中所占的比重都在迅速增長。生命科學的發(fā)展對科學技術的發(fā)展產生重要影響。

生命現(xiàn)象中還有狠多重大問題需要人們去解釋。例如生物體產生的有機分子為什么都有特定的結構？遺傳密碼是怎樣形成的？當代許多新興學科（系統(tǒng)論、信息論、控制論、耗散結構理論等等）都是從生命科學知識中受到啟發(fā)，生命現(xiàn)象中的許多問題的解決必將給科學的發(fā)展帶來新的啟迪。生命科學的發(fā)展必將促進海洋科學、空間科學、能源科學、材料科學等當代新興科學技術的發(fā)展。

2、分子生物學對社會發(fā)展的影響 1）與醫(yī)學

繁殖性克隆動物克隆是指由一個動物經無性繁殖產生多個后代個體，同一克隆內所有成員的遺傳信息是完全相同的。治療性克隆概念利用核重組技術培育早期胚胎及由此衍生的胚胎干細胞來生產人類所需要的器官和組織。

基因是一種有限的資源，一個基因可成就一家企業(yè)，帶動一個產業(yè)，下一個創(chuàng)造更大財富的人將有可能出現(xiàn)在基因領域？

PPL公司成功獲得GT-knockout 豬：2001年12月25日，PPL公司成功地獲得了5頭“Knock-out”（基因敲除）母豬，命名為Noel, Angel, Star, Joy 和 Mary。這些豬基因組上的alpha 1,3

galactosyl transferase 被敲除，而該酶是負責將糖基加入到豬細胞膜上，產生被人體免疫系統(tǒng)視為抗原的物質，從而激發(fā)人體免疫系統(tǒng)對移植的豬器官產生超急性排斥反應。因此，對豬阿爾法1,3半乳糖苷轉移酶基因的敲除成功，是人類為實現(xiàn)異種器官移植邁進了決定性的一步

2）分子生物學與農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展

轉基因植物（Transgenic Plants）；轉基因動物（Transgenic Animals)；動物克隆(Animal Cloning)

3）分子生物學與能源問題

地球上的煤和石油化石能的枯竭指日可待，核燃料也有告罄之時。而利用太陽能有條件的限制。

人們把希望寄托于生物技術來解決能源問題：用農副產品發(fā)酵生產酒精，代替汽油做燃料；培育含油量高的植物生產燃料用油；研究清楚植物光合作用中將水分子分解為氫氣與氧氣的機制及其催化劑酶的結構，人工模擬光合作用，利用太陽能分解水得到氫燃料。4）與倫理道德問題It has been realized that it would also raise a number of complex ethical, legal and social issues.復習思考題

1.現(xiàn)代分子生物學的含義和包括的研究范圍? 2.分子生物學發(fā)展史史上的重大事件？ 3.談談你對分子生物學在今后的生物科學有什么樣的重要意義？

第五篇：分子生物學電子教案第四章資料

第四章 DNA的復制

第四章 DNA復制(DNA Replication)1．主要內容 1)DNA復制概覽 2)細菌DNA復制 3)真核DNA復制 2．教學要求

1)掌握原核生物和真核生物DNA的復制特點 2)熟悉原核生物和真核生物DNA復制的酶系統(tǒng)

第一節(jié) DNA復制概述 第二節(jié) DNA復制的酶學

第三節(jié) 原核生物DNA復制 第四節(jié) 真核生物DNA復制

第一節(jié) DNA復制概述(DNA Replication: An Overview)

一、基本概念

二、DNA的半保留復制

三、復制起點、方式和方向

四、DNA復制的半不連續(xù)性

一、基本概念

復制子(Replicon，復制單位或復制元)?

DNA中含有一定復制起點和復制終點的復制單位。1.3萬— 90萬不等

A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator

復制體(Replisome)：復制叉處的許多酶和蛋白組成的復合體，協(xié)同動作合成DNA。?

The multi? protein(30±)structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA

二、DNA的半保留復制

（Semi-Conservation Replication）

CsCl(Cesium chloride)density gradient ultracentrifugation（CsCl密度梯度超離心）Labeled E.Coli DNA with 15N 14N?

三、復制起點、方向和方式

? All prokaryotic chromosomes and many bacteriophage and viral DNA molecules are circles and comprise single replications.（單復制子）

1、復制起點（origin，ori 或 O，復制原點）復制開始處DNA分子的特定位置 原核生物（Prokaryote）：單復制起點，即——整個染色體只有一個復制單位 真核生物（Eukaryote）： 多復制起點，即－－一個genome中有多個復制單位

2、復制方向（復制過程的順序性）復制叉（Replication fork）：染色體中參與復制的活性區(qū)域，即復制正在發(fā)生的位點 復制眼（replication eye）：電子顯微鏡下觀察正在復制的DNA，復制的區(qū)域形如一只眼睛 真核生物的多復制子 多個復制眼（1）單雙向復制取決于起點處有一個還是兩個復制叉（2）復制的多模式

單起點、單方向（原核）多起點、單方向（真核）單起點、雙方向(原核)多起點、雙方向（真核）

3、復制方式

（1）從新起始（de novo initiation）或復制叉式（replication fork）（2）置換式（Displacement form）又稱 D 環(huán)復制

（3）共價延伸方式（covalence elongation）或滾環(huán)式復制（rolling circle replication）DNA復制方式

（1）從新起始（de novo initiation）或復制叉式（replication fork）或θ 復制 A replication eye forms a theta structure in circular DNA.?

（2）置換式 Displacement form，又稱 D 環(huán)復制

線粒體和葉綠體 DNA的復制方式

（3）共價延伸方式（covalence elongation）或滾環(huán)式復制（rolling circle replication）由于復制時產生的滾環(huán)結構形狀象σ，又稱σ復制 病毒、細菌因子

四、DNA復制的半不連續(xù)性

（Semi-Discontinuous Replication）

復制方向的問題：

岡崎片段（Okazaki fragment）

1968年岡崎（Reiji Okazaki）設計了兩組實驗，其一是脈沖標記實驗（pilse－labeling experiment）。岡崎利用T4噬菌體侵染E.cili(t-)菌株，并分別用dTTP(3H-T)進行2’’，7’’,15’’,30’’,60’’,120’’的脈沖標記，分離提取T4噬菌體DNA，變性后，進行Cscl密度梯度離心，以檢測具放射性的沉降片斷，判斷片斷大小。結果表明經不同標記時間的，被3H-T標記的新合成的DNA片段幾乎都為10-20s，即均為1000-2000核苷酸大?。▓D3-）。第二組實驗是脈沖追蹤實驗（pulse－chase experiment），為了研究在脈沖標記實驗中所發(fā)現(xiàn)的10－20s的小片段在復制全過程中的發(fā)展結局，岡崎將實驗菌株先進行同位素標記培養(yǎng)30秒，然后轉入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)分鐘，分離DNA進行密度梯度離心，發(fā)現(xiàn)小片段已被連接成為70－120S的大片段。為此將DNA的這種復制方式稱為不連續(xù)復制模式，將最初合成的10－20s片段稱為岡崎片段（圖3－）。

如果兩條極性單鏈的DNA復制均按這種不連續(xù)的模式進行，后隨鏈的合成可以在模板單鏈暴露到1000－2000核苷酸長度后，開始從5’ → 3’合成岡崎片段，而先導鏈的合成從進化的原則講，大可不必按岡崎片段的模式不斷地啟動小片段的合成，既耗時又費能。換言之, DNA的復制應該是按一種半不連續(xù)的方式進行，即先導鏈以連續(xù)復制的方式完成子代DNA的合成，而后隨鏈以不連續(xù)復制的方式完成岡崎片段的合成。但在Okazaki的脈沖標記實驗結果中，被標記的DNA全部為小片段。其實在E.coli的細胞內存在dUTP和dTTP兩種類似物, 其比例大約為1：300，而DNA聚合酶III又不能區(qū)分這兩者，一旦將dUMP聚合到DNA分子中，必然會導致生物的基因表達與進化過程中的潛在危險，實際上E.coli 依靠了兩種機制阻止了dUMP 摻入到DNA分子的過程。由dut基因編碼的dUTP酶（dUTPase）能有效地將dUTP，dUDP分解為dUMP,從而避免了dUMP作為底物而摻入到DNA分子中。即使dUTPase能將絕大部分的dUTP降解，但仍有約1／1200的幾率dUTP分子的逃逸，細胞內的ung基因編碼的尿嘧啶－N－糖苷酶（ungase）可以迅速地將已經摻入到DNA分子中的dUMP切除，形成一個無嘌呤或嘧啶的Ap位點（apurinic 或apyrimidinic），再由Ap內切酶進一步將Ap位點酶解成缺口，以與其對應的親代鏈為模板 重新聚合和連接，完成切補修復過程.顯然在先導鏈合成的初期過程中，約1200個核苷酸就有一個dUMP被切除的可能，在Ap內切酶未完全作用前提取DNA并進行變性分析，就會得到與岡崎片段相似大小的1000－2000核苷酸的片段，這種片段也被稱為dUMP片段，Okazaki對dut－和ung－兩種突變體的研究結果證實。在dut－突變體的脈沖標記實驗中，由于dUMP摻入的幾率增加，岡崎片段變短。而在ung－突變體的脈沖標記實驗中，由于已摻入的dUMP被切除的幾率降低，岡崎片段變長。岡崎選用連接酶突變體（lig-）進行的脈沖追蹤實驗中，先導鏈的dUMP片段均不能被連接成大片段，（圖3－）。進一步證明了在脈沖標記實驗中后隨鏈的岡崎片段與先導鏈的dUMP片段均以相似大小表現(xiàn)在其研究結果中。1978年Olivera據(jù)此提出了DNA復制的半不連續(xù)模式。

第二節(jié) DNA復制的酶學(Enzymology of DNA Replication)復制是在酶催化下的核苷酸聚合過程，需要多種高分子物質共同參與.DNA復制的體系

底物： dNTP(dATP dGTP dCTP dTTP)聚合酶（polymerase): DNA-pol 依賴DNA的DNA聚合酶(DDDP)模板（template): 解開成單鏈的DNA母鏈

引物（primer): 寡核苷酸片段,提供3’-OH末端,使dNTP聚合 其它酶和蛋白質因子: 解鏈酶，解旋酶，單鏈結合蛋白，連接酶

一、DNA聚合酶

二、DNA連接酶（DNA Ligase）

三、與DNA幾何學性質相關的酶

一、DNA聚合酶

催化dNTP聚合到核酸鏈上的酶。是DNA復制的主要酶。全稱叫依賴DNA的DNA聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或DNA指導的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），均縮寫為DDDP。(一)DNA聚合酶催化的反應

5′→3′的聚合活性

5′→3′外切酶活性

3′→5′外切酶活性1、5′至3′的聚合活性

催化四種dNTP以磷酸二酯鍵一個一個地接到DNA鏈上去

(dNMP)n + dNTP →(dNMP)n+1 + PPi 聚合反應的特點：

(1)以單鏈DNA為模板

(2)以dNTP為原料

(3)引物或DNA鏈提供3′-OH(4)聚合方向為5′→3′2、3’－5’ 外切核酸酶活性

校對功能(proofreading)

3、5’－3’外切核酸酶活性(二)原核生物的DNA聚合酶（E.coli）

1957 Arthur Kornberg 首次發(fā)現(xiàn)?

In fact, there are 5 polymerases to date, although we will focus only on? 3 DNA pol Ⅰ? DNA pol Ⅱ? DNA pol Ⅲ?

1.DNA Polymerase I 2.DNA Polymerase Ⅱ和 Ⅲ

DNA pol Ⅱ：5` → 3`聚合酶活性及3` → 5`外切核酸酶活性。?

DNA pol Ⅲ:? 由10個亞基組成，分別為α、ε、θ、τ、δ、δ`、β、κ及ψ。是原核生物體內真正起復制作用的酶。

– α亞基： 5` → 3`聚合酶活性

– ε亞基：3` → 5`外切酶,校對和編輯 – θ亞基為裝配所必須

亞基決定了Pol?– III全酶的持續(xù)合成能力 3.三種大腸桿菌DNA聚合酶特性之比較

三種大腸桿菌DNA聚合酶的主要功能

DNApolⅠ----主要功能是切除引物，填補岡崎片段產生的空隙及DNA損傷的修復。? DNApol? Ⅱ----是主要的修復酶 DNApol? Ⅲ----是主要的復制酶

三種DNA聚合酶在決定DNA合成方面的共同特性 ①三種酶都只有５’→３’聚合酶的功能，而沒有３’→５’聚合酶功能，說明DNA鏈的延伸只能從5’向3’端進行。

②他們都沒有直接起始合成DNA的能力，只能在引物存在下進行鏈的延伸，因此，DNA的合成必須有引物引導才能進行。

③三種酶都有核酸外切酶的功能，可對合成過程中發(fā)生的錯誤進行校正，而保證DNA復制的高度準確性。

為什么子鏈DNA延伸方向只能是5’ →3’

二、DNA連接酶（DNA Ligase）

催化單鏈DNA切口上5’-P和3’-OH形成磷酸二酯鍵

三、與DNA幾何學性質相關的酶

(一)解螺旋酶(helicase)

模板對復制的指導作用在于堿基的準確配對，而堿基卻埋在雙螺旋的內部。只有把DNA解開成單鏈，它才能起模板作用。?

解螺旋酶是最早發(fā)現(xiàn)的與復制有關的蛋白質，當時稱為rep蛋白。作用是利用ATP供能，解開DNA雙鏈。?

復制相關蛋白的基因：dna A、dna B、dna C… …dna X?

相應的表達產物蛋白質：Dna A、Dna B、Dna C …? …Dna X

Dna A：辨認復制起始位點

Dna B：解螺旋酶

Dna C：輔助解螺旋酶使其在起始點上 結合并打開雙鏈。(二)DNA拓撲異構酶(topoisomerase)拓撲：是指物體或圖像作彈性移位而又保持物體不變的性質。?

拓撲異構酶：是一類可改變DNA拓撲性質的酶。對DNA分子的作用是既能水解、又能連接磷酸二酯鍵?？伤沙贒NA超螺旋，有利于DNA解鏈。? 拓撲異構酶I（topo I）

－蛋白。? 在原核生物曾被稱為?

主要作用是切開DNA雙鏈中的一股，使DNA解鏈旋轉中不打結，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)再封閉切口。?

反應不需要ATP 拓撲異構酶II（topo II）

? 在原核生物又叫旋轉酶(gyrase)。

? 能切斷DNA雙鏈，使螺旋松弛。在ATP參與下，松弛的DNA進入負超螺旋，再連接斷端。TopoI和TopoII松弛DNA負超螺旋(三)單鏈DNA結合蛋白(SSB): 在大腸桿菌，它是由177個氨基酸殘基組成的同四聚體，結合單鏈DNA的跨度約32個核苷酸單位。?

SSB與解開的DNA單鏈緊密結合，?

①防止重新形成雙鏈，維持模板處于單鏈狀態(tài)；

②免受核酸酶降解。

表4 參與DNA復制的酶及蛋白質 酶或蛋白質 主 要 作 用

拓撲異構酶類 克服解鏈時打結及纏繞、松馳或引進負超螺旋 解鏈酶類 解開DNA雙鏈

單鏈DNA結合蛋白 維持已解開單鏈DNA的穩(wěn)定 引物酶 合成RNA引物 DNA聚合酶Ⅲ DNA復制

DNA聚合酶Ⅰ 水解引物、填補空隙、修復作用 DNA連接酶 催化雙鏈DNA中單鏈缺口的連接

小結

1、基本概念 DNA復制 復制子 復制體 復制時期

2、半保留復制

3、復制起點：結構特征

復制方向：復制叉 復制眼 單雙向復制的決定條件 復制的多模式

復制方式：復制叉式（從頭起始）

D環(huán)復制（置換式）

σ復制（滾環(huán)復制）

4、復制酶學

1）三種DNApol DNApolⅠ和Ш的主要活性和功能 聚合活性 外切活性(兩種)延伸方向 2）DNA連接酶

3）和DNA的幾何學性質相關的酶

螺旋酶 旋轉酶

5、DNA復制的半不連續(xù)性

實驗證據(jù) 先導鏈 后隨鏈 4.3 Bacterial DNA replication 4.3.1 Initiation（起始）

4.3.2 Elongation（延伸）

4.3.3 Termination of DNA replication

4.3.1 Initiation（起始）

? Study system: the E.coli origin locus oriC is cloned into plasmids to produce more easily studied minichromosomes.? Initiation is divided into the following steps: – 1.recognition of the origin（識別原點）

– 2.separation of parental strands and stabilization of single strands（分開雙鏈，穩(wěn)定單鏈）

– 3.initiation of daughter strand synthesis through action of the PRIMOSOME（通過引發(fā)體起動子代鏈的合成反應）

How do we know that there is only one origin of replication in E.coli? ? 假定每個染色體都在同樣的一個起始點（i）開始復制，那么距 i近的基因將先被復制而復制得多些，遠離i 的基因將復制得少些。因此在一個群體中離 i 點越近的基因出現(xiàn)頻率越高。? 假如復制是

– 單向的，基因頻率呈單向梯度

– 雙向的，基因頻率以 i 為中心呈雙向梯度

How do we know that there is only one origin of replication in E.coli? 測定了大腸桿菌染色體上很多基因的頻率，發(fā)現(xiàn)以OriC基因附近為中心呈雙向下降。What does this experiment show? ? There is a single place on the chromosome where replication starts ? Replication proceeds in both directions ? The two replication forks meet at near 31’ on the genetic map The structure of OriC OriC How is replication initiated? ? DnaA protein binds to 9-mers(9nt聚合體)? DnaA together with HU類組蛋白 denature the DNA ? DnaB helicase解旋酶 binds the open DNA Initiation of DNA replication in E.coli 1.initial complex（起始復合體）

? Along with the HU protein, the dnaA protein-ATP complex binds to the DNA, encompassing包圍 the four nine-mers.In all, this complex covers about 200bp.（隨同HU蛋白一起，dnaA protein-ATP 復合體結合到DNA上，包圍4個9-mers區(qū)，總的覆蓋200bp）

2.Open complex（開放復合體）和Prepriming complex(前引發(fā)復合體)

DnaA 蛋白使13bp重復單位熔解而形成開放性復合體，這一過程需要ATP。?

這時DnaB? 和DnaC蛋白進入DNA的熔解區(qū)與OriC結合形成前引發(fā)復合體。

Separated strands in the oriC region are? prevented from reannealing by the binding of single-stranded binding protein(SSB protein).3.The primosome complex forms ? A helicase(DnaB)begins to unwind the strands.? SSB binds to prevent reannealing.? Gyrase relieves the tension.旋轉酶解除鏈的張力 ? Primase引物酶 synthesizes a short strand of RNA.? Primase binds to dnaB protein at oriC and forms a primosome引發(fā)體.Let’s review the roles of the major players

? DnaA-Recognizes origin and denatures the duplex ? DnaB-Helicase that unwinds the DNA ? DnaC-Required for DnaB binding ? HU-histone-like protein stimulates initiation ? Primase(DnaG)Synthesizes RNA primers ? SSB-Single stranded DNA binding protein ? RNA polymerase Facilitates促進 DnaA activity ? DNA gyrase Relieves torsional扭轉的 strain ? Dam methylase Methylates GATC sequences at oriC Review Initiation of DNA replication in E.coli 1)oriC contains four 9 bp binding sites for the initiator protein DnaA.Synthesis of DnaA is coupled聯(lián)系 to growth rate so that initiation of replication is also coupled to growth rate.2)DnaA forms a complex of 30-40 molecules, facilitating促進 melting解鏈 of three 13 bp AT-rich repeat sequence for DnaB binding.3)DnaB is a helicase that use the energy of ATP hydrolysis水解to further melt the double-stranded DNA.4)SSB(single-stranded binding protein)coats the unwinded DNA to prevent DNA renaturing.5)DNA primase load to負擔 synthesizes a short RNA primer for synthesis of the leading strand.4.Primosome(引發(fā)體): DnaB helicase and DNA primase 4.3.2 Elongation（延伸）

? Elongation involves another complex of proteins called the REPLISOME(復制體，復制顆粒).It is assembled from its components each time replication occurs.E.coli replication machinery(Elongation phase)1)Helicase---unwind DNA at replication fork in a reaction coupled to ATP hydrolysis 2)Single-stranded DNA binding proteins(ssb)---bind and stabilize the DNA in a single-stranded conformation after melting by helicases 3)Primosome---synthesizes RNA primers on lagging strand 4)DNA Pol III----the true E.coli replicase 5)DNA Topoisomerase II – relaxes supercoiled DNA that forms ahead of replication fork – decatenates the fully replicated DNA

6)DNA Pol I----replaces RNA primers with DNA by nick-translation 7)DNA ligase連接酶----joins Okazaki fragments Concurrent協(xié)同的 DNA Synthesis The lagging template strand is looped to invert the physical direction of synthesis, but not the chemical direction-DNA polymerase III functions as a dimer, with each core enzyme achieving synthesis on one or the other strand ? If the polymerase complex is moving continuously along the leading strand, how does it discontinuously synthesize DNA along the lagging strand in the opposite direction?? 4.3.3 Termination of DNA replication

? Specific termination sites of DNA replication exist in E.coli.? Termination involves the binding of the tus gene product(tus protein)--ter binding protein, an inhibitor of the DnaB helicase（終止位點結合蛋白，是DnaB解旋酶的抑制劑）

? This ter binding protein may act to prevent helicase from unwinding DNA(will therefore halt停止 pol III and pol I action).? DNA replication produces two interlocking rings（連環(huán)）which must be separated.? This is accomplished via the enzyme topoisomerase.Termination of E.coli DNA replication Terminator sequences（終止序列）：

? Trap the replication forks（使復制叉受到限制）

? Contain sequences that facilitate decate-nation and partitioning of daughter chromosomes（包含促進連鎖分開和姐妹染色體分開的序列）.? <300 bp ? 需要TUS（Terminator Utilization Substance）識別終止序列

Summary of steps in E.coli DNA synthesis: 1.dnaA protein melts duplex in oriC region.2.dnaB(helicase), along with dnaC and ATP binds to replication fork(dnaC protein exits).(Pre-priming complex)

3.Single strand binding protein(ssb protein)binds to separated strands of DNA and prevents reannealing.4.Primase complexes with helicase, creates RNA primers(pppAC(N)7-10)on the strands of the open duplex2(Primase+helicase constitute the Primosome).5.After making the RNA primers, DNA pol III holoenzyme comes in and extends the RNA primer(laying down dNTP's)on the leading strand.4.As the replication fork opens up(via helicase + ATP action)leading strand synthesis is an uninterrupted不間斷的 process, the lagging strand experiences a gap.7.The gap region of the lagging strand can wind旋緊 around one active site unit of the Pol III complex, and bound阻止 Primase initiates an RNA primer in the gap region.8.On the lagging strand, Pol III extends the RNA primer with dNTP‘s as the lagging template strand is looped through the Pol III complex.9.After synthesis of a nascent初始 fragment the lagging strand loop is released and the single strand region further up near the replication fork is subsequently looped through the Pol III complex.10.Steps 7-9 are repeated.11.Meanwhile其間, Pol I removes the RNA primer regions of the Okazaki fragments via 5' to 3' exonuclease activity(nick translation Pol I exits and ligase joints the DNA fragments(on lagging strand).4.4 Eukaryotic DNA replication 4.4.1 Experimental system 4.4.2 cell cycle 4.4.3 initiation 4.4.4 replication forks 4.4.5 nuclear matrix 4.4.6 telomere replication 4.4.1 Experimental systems ? Yeast(Saccharomyces cerevisiae)酵母: has much smaller genome(1.4 X 107 bp in 16 chromosomes)and only 400 replicons.? SV40(simian virus 40 猿猴病毒40, 5 kb): is good mammalian models for replication fork.? Cell-free extract 無細胞提取物prepared from Xenopus laevis(非洲爪蟾)eggs containing high concentration of replication proteins and can support in vitro replication.4.4.2 細胞周期（cell cycle)的調控 1.細胞周期4個時期 2.檢驗點及其調控

3.細胞周期蛋白和依賴于細胞周期蛋白的激酶

1.細胞周期4個時期

? cell cycle——細胞從一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂完成所經歷的一個有序過程。? 細胞周期時相組成：

? 間期(interphase): G1 phase，S phase，G2 phase，細胞可由G1期進入一個非增殖期——G0期或稱靜止期。

? M phase: 有絲分裂期(Mitosis), 胞質分裂期(Cytokinesis)2.檢驗點（Checkpoint）及其調控

? 細胞周期檢驗點是細胞周期調控的一種機制。

? 細胞周期隨細胞周圍的環(huán)境而調整，以免受損傷的細胞發(fā)生增殖。

? 檢驗點是當外界條件不適合細胞分裂時，可以中斷細胞周期的一些階段。

? 主要檢驗點位于G1和G2的后期，在G1期的R點，當缺乏促細胞分裂原時，細胞會脫離細胞周期進入非增殖的G0期。

3.細胞周期蛋白和依賴細胞周期蛋白的激酶

細胞周期是通過多種蛋白激酶復合物催化的蛋白磷酸化來實施調控的，這些復合物包含:? regulatory? subunits（調節(jié)亞基）

——Cyclin（細胞周期蛋白）catalytic subunit（催化亞基）?

——Cyclin-dependent kinase(CDK)（依賴細胞周期蛋白的激酶）

不同的復合物調控細胞周期中的不同時期。? 圖Cyclin-dependent kinase(Cdk)4.4.3 Origins and Initiation Origins and? Initiation（起始點與起始）ARS（自主復制序列）?

Licensing factor controls eukaryotic? replication（特許因子）Differences in DNA between eukaryotes and prokaryotes Eukaryotic genomes are much bigger?

Replication in? eukaryotes occurs during a small portion of the cell cycle DNA in? eukaryotes is bound by histones Eukaryotic chromosomes are linear?

圖Multiple Replication Origins Origins and Initiation（起始點與起始）

? Only once in one cell cycle(每個細胞周期只有一次復制）

? Clusters of about 20-50 replicons(復制子)initiate simultaneously at defined times throughout S-phase（20-50個復制子在S期同時起始復制）

? Initiation of each replicon within an initiation zone may occur at random（復制子可能在起始區(qū)域內的任意位置起始）

不同區(qū)域的染色質起始復制的時間不同

? Early S-phase: euchromatin(常染色質)replication ? Late S-phase: heterochromatin(異染色質)replication ? Centromeric(著絲粒的)and telomeric(端粒的)DNA replicate at last Origins（起始點）

Yeast origin: the minimal 11 bp consensus: [A/T]TTTAT[A/G]TTT[A/T] Bound by origin recognition complex(ORC起始識別復合體)activated激活 by CDK.ARS: Autonomously Replicating Sequence（自主復制序列）。單細胞酵母的復制起點克隆進原核生物的質粒，由于這些復制起點序列允許質粒在酵母中復制而被稱之為ARS。The yeast ARS Licensing factor controls eukaryotic replication（特許因子控制真核生物DNA復制）Licensing factor controls eukaryotic rereplication DNA Replication ? The machinery of replication – Additional features of eurkaryotic cells ? One replication per cycle – control ? The origin of replication – passage through a series of steps ? Origin of replication bound by ORCs ? Licensing factors bind assemble the prereplication complex ? Licensing factors – at least six – Mcm2-Mcm7 ? Mcm proteins move with the replication fork ? Mcm proteins are then displaced from DNA but remain in nucleus ? Mcm proteins cannot reassociate with an origin of replication which has already ‘fired’

4.4.4 replicaton fork ? The machinery of replication：

? Additional features of eurkaryotic cells – Chromatin structure ? Nucleosomes and the replication fork – Histones – H3H4 tetramers四聚體 remain intact and are distributed between the daughter duplexes – Old and new H3H4 tetramers found on each duplex – H2A/H2B dimers – separate and bind randomly to H3H4 tetramers already in place Replication of Nucleosomes Eukaryotic DNA is? packaged with histones in structures called nucleosomes.What happens to? the nucleosome when the replication fork and the replication machinery pass by and open up the DNA double strand? Nucleosomes are found properly? spaced on both postreplicative DNA strands immediately after passage of replication fork.圖A model for nucleosome replication 圖A model for nucleosome replication Nucleosome and Replication fork New nucleosomes are assembled to DNA from a mixture of old and newly synthesized histones after the fork passes.Eukaryotic DNA synthesis ? DNA synthesis is very similar in prokaryotes and eukaryotes ? Many of the same enzyme activities are present – Helicases – Primases – Polymerases – ligases – Topoisomerases 4.4.5 Nuclear Matrix（核基質）

Nuclear matrix: Replication is spatially organized by a protein scaffold of insoluble不溶的 protein fibers.Replication factories are immobilized固定 on this matrix and the DNA moves through them.A scaffold of insoluble protein fibers which acts as an organizational framework for nuclear processing, including DNA replication, transcription Replication factories 4.4.6 Telomere replication ——The problem of linear replications ? Telomere replication ? Solving the problem of lagging strand synthesis--Chromosomal ends shortening 4.5 Regulation 0f DNA replication 4.5.1 大腸桿菌染色體DNA的復制調控 4.5.2 質粒DNA的復制調控 4.5.3 真核細胞DNA的復制調控 4.5.1大腸桿菌染色體DNA的復制調控

? 染色體的復制與細胞分裂同步但不直接偶聯(lián).? 復制子由復制起始物位點和復制起點組成：

– 復制起始物位點編碼復制調節(jié)蛋白質，復制起點與調節(jié)蛋白作用啟動復制。

– 基因編碼的調節(jié)蛋白通過與復制復合物的相互作用確定復制起始頻率和復制方式。4.5.2 質粒DNA的復制調控

? ColE1質粒DNA復制不依賴于本身編碼的蛋白質，而完全依賴宿主DNA聚合酶。4.5.3 真核細胞DNA的復制調控

（1）細胞生活周期水平調控：限制點調控，真核細胞DNA的復制發(fā)生在S期，促使細胞由G1期進入S期的多種因子調控；

（2）染色體水平的調控：決定復制子起始順序

（3）復制子水平的調控：復制子參與的多種因子均可參與調節(jié)，主要是復制起始調控，如酵母復制起始受時序調控。Summary Bacterial DNA? replication – Initiation – Elongation – Termination of DNA replication

Eukaryotic DNA replication? – cell cycle – Initiation – replication forks – telomere replication 原核生物與真核生物DNA復制的不同點 不同點 原核生物 真核生物 起始位點 一個 多個(多至千個)前導鏈合成 DNA聚合酶Ⅲ DNA聚合酶δ 隨后鏈合成 DNA聚合酶Ⅲ DNA聚合酶α 引物長短 50～100個核苷酸 10個核苷酸

岡崎片段長短 1000～2000個核苷酸 100～200個核苷酸 RNA引物水解 DNA聚合酶Ⅰ 核酸酶H 修補缺口 DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶β 復制速度 快 慢

Regulation 0f DNA? replication ─ 大腸桿菌染色體DNA的復制調控 ─ 質粒DNA的復制調控

─ 真核細胞DNA的復制調控