第一篇：分解纖維素的微生物的分離 教案

分解纖維素的微生物的分離

一、教材分析

本課題作為課題1的應(yīng)用和課題2的深入，分離某種特定的微生物，難度較大、探索性更強(qiáng)，在高考中考查的可能性也很大。教材在課題背景中利用學(xué)生已經(jīng)學(xué)過的纖維素的化學(xué)組成推廣到生活中纖維素的廣泛分布和應(yīng)用。而若要充分利用纖維素，就應(yīng)將其分解，引導(dǎo)學(xué)生自然而然地過渡到分解纖維素的微生物及其產(chǎn)生的相關(guān)酶。之后，教材緊接介紹了纖維素、纖維素酶以及如何從土壤中分離分解纖維素的微生物，通過對(duì)課題中實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路的深入學(xué)習(xí)，要求學(xué)生掌握從土壤中分離某種特定微生物的操作技術(shù)。

二、教學(xué)目標(biāo)

1、知識(shí)與技能

（1）能簡(jiǎn)單敘述纖維素酶的種類和作用。

（2）能從土壤中分離出分解纖維素的微生物，了解這類微生物的應(yīng)用。

（3）掌握從土壤中分離某種特定微生物的操作技術(shù)。

2、過程與方法

分析分離分解纖維素的微生物的實(shí)驗(yàn)流程，掌握實(shí)驗(yàn)操作的原理。

3、情感、態(tài)度與價(jià)值觀

（1）通過自主設(shè)計(jì)、完成實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)勇于探究的科學(xué)精神。

（2）通過了解土壤中能分解纖維素的微生物在保護(hù)環(huán)境中的作用，增強(qiáng)社會(huì)責(zé)任感。

三、教學(xué)重難點(diǎn)

1．重點(diǎn)

從土壤中分離分解纖維素的微生物。2．難點(diǎn)

從土壤中分離分解纖維素的微生物。

四、教學(xué)準(zhǔn)備

多媒體課件。

五、課時(shí)安排

1課時(shí)。

六、教學(xué)過程

【課程導(dǎo)入】 糖類是生物體進(jìn)行生命活動(dòng)的主要能源，人類以淀粉作為能量的主要來源，但完全不能消化纖維素，二反芻動(dòng)物和大量的微生物卻能以纖維素作為能量的主要來源，此中奧妙何在？讓我們一起來了解這種能分解纖維素的微生物。

【基礎(chǔ)知識(shí)】

（一）纖維素和纖維素酶

1、棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。

2、纖維素酶的組成及作用：纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。

（二）纖維素分解菌的篩選

1、方法：剛果紅染色法

2、纖維素分解菌篩選方法的原理:剛果紅是一種染料，它可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，但并不和纖維二糖、葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后剛果紅—纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解為中心的透明圈。這樣我們可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。

【實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)】

（一）分離分解纖維素的微生物的實(shí)驗(yàn)流程

土壤取樣→選擇培養(yǎng)→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→挑選產(chǎn)生透明圈的菌落

1、土壤取樣

選擇纖維素豐富的環(huán)境，依賴于生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對(duì)提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。

2、選擇培養(yǎng)

（1）目的：增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物（2）操作：將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)1～2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)。

3、梯度稀釋

按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)液進(jìn)行等比稀釋101~107倍，之后，將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上。

4、將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上（1）制備培養(yǎng)基：參照旁欄中的比例。（2）倒平板操作。

（3）涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1ml涂布在培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)，菌落周圍會(huì)出現(xiàn)明顯的透明圈。

5、挑選產(chǎn)生透明圈的菌落

參照課本剛果紅染色法，挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落

（二）剛果紅染色法

方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng) 方法二：在倒平板時(shí)就加入剛果紅 方法一

缺點(diǎn)是操作煩瑣，加入剛果紅溶液會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜； 優(yōu)點(diǎn)是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。方法二

優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，不存在菌落混雜問題；

缺點(diǎn)一是由于培養(yǎng)基中還含有淀粉類物質(zhì)，可以使能產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應(yīng)；缺點(diǎn)二有些微生物具有降解色素的能力，它們?cè)陂L(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中會(huì)降解剛果紅，形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。

（三）土壤中纖維素分解菌的分離實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟

1、土樣采集

土樣采集的方法與本專題課題2類似。土樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因?yàn)樵诶w維素含量豐富的環(huán)境，通常會(huì)聚集較多的分解纖維素的微生物。如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，過一個(gè)月左右也會(huì)有能分解纖維素的微生物生長(zhǎng)。

2、選擇培養(yǎng)

選擇培養(yǎng)需要的儀器有：250 mL錐形瓶、無菌稱量瓶、藥匙、1 mL和10 mL的移液管、天平、搖床、溫度計(jì)等。

培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在250 mL錐形瓶中裝入30 mL培養(yǎng)基，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層包裝紙（或報(bào)紙），用線繩扎緊，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

選擇培養(yǎng)的操作：稱取土樣20 g，在無菌條件下加入裝有30 mL培養(yǎng)基的搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30 ℃下振蕩培養(yǎng)1～2 d，至培養(yǎng)基變混濁。此時(shí)可以吸取0.1 mL培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板，也可以按課本中所述，重復(fù)選擇培養(yǎng)的步驟一次，然后再進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板。

3、剛果紅染色法分離纖維素分解菌

這一步所需要的儀器有：無菌培養(yǎng)皿、涂布器、1 mL移液管，裝有9mL無菌水的20 mL大試管，溫箱等。

培養(yǎng)基的制備參照課本旁欄中的比例配制。在500 mL三角瓶中裝入200 mL培養(yǎng)基，在121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

倒平板操作：將滅菌后的固體培養(yǎng)基熔化，按無菌操作的要求，在無菌的培養(yǎng)皿中倒入15～20 mL培養(yǎng)基，凝固后待用。

制備菌懸液：按照本專題課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋，稀釋最大倍數(shù)至106。

涂布平板：將稀釋度為104～106的菌懸液各取0.1 mL，滴加在平板培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻，在30 ℃倒置培養(yǎng)，至菌落長(zhǎng)出。每個(gè)稀釋度下需涂布3個(gè)平板，并注意設(shè)置對(duì)照。剛果紅染色的具體操作步驟參照課本［資料三］。

（四）課題成果評(píng)價(jià)

1、培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落：對(duì)照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長(zhǎng)則說明培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。

2、分離的結(jié)果是否一致：由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，學(xué)生也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。

七、課堂小結(jié)

纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素分解菌的篩選方法是剛果紅染色法，它有兩種方法，一是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)；二是在倒平板時(shí)就加入剛果紅。

八、教學(xué)反思

這節(jié)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)思路清晰，從基礎(chǔ)知識(shí)導(dǎo)入到提取微生物的實(shí)驗(yàn)方法，學(xué)生在借鑒尿素分解菌的分離以及微生物接種培養(yǎng)的過程中，掌握速度很快，難度不大，但關(guān)鍵仍在于進(jìn)一步的應(yīng)用和提升，組件拓展到熟練掌握提取土壤中的特定微生物的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。

第二篇：課題3 分解纖維素的微生物的分離 教學(xué)設(shè)計(jì) 教案

教學(xué)準(zhǔn)備

1.教學(xué)目標(biāo)

1、簡(jiǎn)述纖維素酶的種類及作用，從土壤中分離出分解纖維素的微生物

2、掌握從土壤中分離某種特定微生物的操作技術(shù)

3、分析分離分解纖維素的微生物的實(shí)驗(yàn)流程，弄懂實(shí)驗(yàn)操作的原理

4、領(lǐng)悟科學(xué)探究的方法，發(fā)展科學(xué)思維和創(chuàng)新能力

2.教學(xué)重點(diǎn)/難點(diǎn)

教學(xué)重點(diǎn)：

從土壤 中分離分解纖維素的微生物 教學(xué)難點(diǎn)：

從土壤中分離分解纖維素的微生物

3.教學(xué)用具

多媒體、板書

4.標(biāo)簽

教學(xué)過程

（一）引入新課

上節(jié)課我們探討學(xué)習(xí)了土壤中尿素分解菌的分離與計(jì)數(shù)，這節(jié)課我們以纖維素分解菌的分離與純化為例，鞏固加深對(duì)這方面技術(shù)的理解和掌握。纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是含量最豐富的多糖類物質(zhì)。纖維素能被土壤中某些微生物分解利用，這是因?yàn)樗鼈兡軌虍a(chǎn)生纖維素酶。

延伸：草食性動(dòng)物是怎樣消化食物中纖維素的？腸胃中的共生物生物。

草食性動(dòng)物腸胃中的共生微生物。除自然環(huán)境中存在分解纖維素的微生物外，在草食性動(dòng)物等的消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素的微生物，其原理也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。

（二）基礎(chǔ)知識(shí)

活動(dòng)1：閱讀“纖維素與纖維素酶”，回答下列問題：

棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物。纖維素的分解需要在纖維素酶的催化作用下完成，請(qǐng)完成下列過程：

〖思考1〗實(shí)驗(yàn)分析：投影的小實(shí)驗(yàn)是如何構(gòu)成對(duì)照的？

在一支試管中添加纖維素酶，另一支試管不添加纖維素酶；盡管醋酸－醋酸鈉緩沖液用量不同，但都能維持相同的pH。

〖思考2〗1個(gè)酶活力單位是指在溫度為 25 ℃，其它反應(yīng)條件最適宜情況下，在 1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化 1mmol 的底物所需要的酶量。

活動(dòng)2：閱讀“纖維素分解菌的篩選”，回答下列問題：

篩選纖維素分解菌的方法是剛果紅染色法。該方法可以通過顏色反應(yīng)直接篩選。其原理是：剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，紅色復(fù)合物無法形成，出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈，我們可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。

（三）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

活動(dòng)3：完成實(shí)驗(yàn)方案流程圖，討論回答問題

〖思考3〗實(shí)驗(yàn)流程中“選擇培養(yǎng)”的培養(yǎng)基類型是什么？該培養(yǎng)的目的是什么？ 液體選擇培養(yǎng)基。其目的是使纖維素分解菌增殖，含量增多。〖思考4〗本實(shí)驗(yàn)流程與尿素分解菌的分離實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？

尿素分解菌的分離實(shí)驗(yàn)流程是將土樣制成的菌懸液直接涂布在選擇培養(yǎng)基上；本課題通過選擇培養(yǎng)使細(xì)菌增殖后，再涂布在鑒別培養(yǎng)基上。其它操作基本基本共同。活動(dòng)4：閱讀投影資料一“土壤取樣”，回答下列問題：

1、纖維素分解菌大多分布在富含纖維素的環(huán)境中。

2、為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？

生物適應(yīng)一定環(huán)境，環(huán)境對(duì)生物具有選擇作用，只有在纖維素含量豐富的環(huán)境中纖維素分解菌的含量才會(huì)高于其它普通環(huán)境，從而提高獲得目的微生物的幾率。

3、將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？

人工設(shè)置適宜環(huán)境，使纖維素分解菌相對(duì)聚集。將紙埋于深約250px的腐殖土壤中?；顒?dòng)5：閱讀投影資料二“選擇培養(yǎng)基”，回答以下三個(gè)問題：

4、纖維素分解菌選擇培養(yǎng)基屬于液體培養(yǎng)基，原因是沒有添加瓊脂成分。[來源:Z|xx|k.Com]

5、培養(yǎng)基選擇作用機(jī)制是以纖維素粉為唯一碳源，只有纖維素分解菌才能生存。

6、若設(shè)置一個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)說明選擇培養(yǎng)的作用，應(yīng)控制的變量是將纖維素粉改為葡萄糖?；顒?dòng)5：閱讀投影資料三“剛果紅染色法”，填表比較兩種染色法的各自的優(yōu)缺點(diǎn)：

〖思考5〗為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？

在選擇培養(yǎng)條件下，可使能夠適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。

（四）、結(jié)果分析與評(píng)價(jià) 活動(dòng)6：閱讀“課題延伸”，回答：

1、為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶實(shí)驗(yàn)，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵。

2、纖維素酶測(cè)定方法是對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖維素所產(chǎn)生的 葡萄糖 含量進(jìn)行定量測(cè)定。

課堂小結(jié)

板書

專題二 第三節(jié) 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

一、有關(guān)纖維素的基礎(chǔ)知識(shí)

二、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

三、實(shí)驗(yàn)分析與評(píng)價(jià)

第三篇：微生物分離實(shí)驗(yàn)報(bào)告（定稿）

微生物分離實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)儀器及材料

土樣：18號(hào)土樣 試劑及培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：果膠酶篩選培養(yǎng)基；幾丁質(zhì)酶真菌篩選培養(yǎng)基；果膠酶劃線分

離培養(yǎng)基；幾丁質(zhì)酶劃線培養(yǎng)基；細(xì)菌半固體培養(yǎng)基；淀粉培養(yǎng)基；葡萄糖酵解培養(yǎng)基；乳糖酵解培養(yǎng)基；蛋白胨水培養(yǎng)基

a)試劑：草酸銨結(jié)晶紫染液、番紅復(fù)染液等各種染料以及盧戈氏碘液、95%

乙醇、5%孔雀綠水溶液、無菌水等

儀器

錐形瓶（500mL×2；300mL×2；100mL×3）、培養(yǎng)皿（20套）、試管（20支）、移液管（3支）、燒杯、玻璃棒、載玻片、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡、涂布棒、U型管、德漢氏小管、酒精燈、漏斗、接種環(huán)、濾紙、棉塞、牛皮紙、無菌操作臺(tái)、滅菌鍋、紗布等

細(xì)菌的篩選，分離純化及鑒定 細(xì)菌的篩選

土樣處理

配制生理鹽水：在燒杯中配置200ml0.85％的生理鹽水，用移液管各移取9ml于五支潔凈試管，再移取90ml配置好的生理鹽水于三角燒瓶，并放入少許玻璃珠，包好滅菌；

加土樣：冷卻后準(zhǔn)確稱取10g土樣放入盛有90ml無菌生理鹽水并帶有少許玻璃珠的三角燒瓶中，充分震蕩搖勻，然后放在30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min。

果膠酶菌種篩選

梯度稀釋：用一支無菌吸管吸取1ml土壤懸液加入到盛有9ml無菌水的試管中充分混勻，此為10-1稀釋液，以此類推制成10-

2、10-3兩種稀釋度的土壤溶液（如下圖）；

涂布：配制果膠酶篩選培養(yǎng)基，110度滅菌20-30分鐘，冷卻后倒平板在培養(yǎng)皿蓋周邊用記號(hào)筆做好標(biāo)記，分別寫上10-

1、10-3兩種稀釋度字樣，每稀釋度標(biāo)記三皿，然后用無菌吸管分別由10-

3、10-1兩管土壤稀釋液中吸取適量對(duì)好放入已寫好稀釋度的平板中央位置，每皿準(zhǔn)確放入0.2ml，用無菌玻璃棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，其方法是將菌液先沿一條直線輕輕地來回推動(dòng)，使之均勻分布，然后改變方向90度沿另一垂直線來回推動(dòng)，平板內(nèi)邊緣處改變方向用涂布棒再涂布幾次；

培養(yǎng)：將平板倒置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)1-2天；

果膠酶透明圈平板檢測(cè)：取10-1涂布平皿，用0.5％的剛果紅染色15-20min后，倒掉剛果紅，用1mol/L的NaCl脫色幾分鐘至觀察到透明圈，則說明水解圈內(nèi)的菌有水解果膠的能力；

菌落描述：取此菌進(jìn)行菌落形態(tài)描述，就菌落的大?。ù蟆⒅?，小），顏色（白，黃，粉紅等），干濕（干、濕），邊緣（整齊，不整齊），表面（光滑，粗糙，有無突起等）分別進(jìn)行闡述并詳細(xì)記錄； 細(xì)菌的分離純化

劃線分離：制備果膠酶劃線培養(yǎng)基，滅菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌種，第一次劃線分離培養(yǎng)1-2天后取分離所得單菌落再進(jìn)行第二次劃線分離，劃線分離的具體方法是：先在平皿上劃定區(qū)域，然后將接種針在火焰上進(jìn)行滅菌操作，取含菌種的培養(yǎng)皿，在火焰上方（注意：不

圖 細(xì)菌的劃線分離示意圖

能離火焰太近）打開培養(yǎng)皿蓋，先拿接種針在上蓋處劃線以降溫，然后用接種針輕挑所選菌落一到兩下，將平皿蓋上放好，再取剛剛冷卻了的干凈平皿在1區(qū)進(jìn)行劃線接種操作。操作完畢后對(duì)接種針進(jìn)行滅菌操作，完成后在火焰上方打開平皿蓋，將接種針冷卻后從1區(qū)引線到2區(qū)，再如圖所示劃線，劃完后引線到3區(qū)，同上進(jìn)行劃線，劃線完畢后蓋蓋平放；

純種保藏：再配制一份普通細(xì)菌培養(yǎng)基，分裝試管后滅菌，制得斜面，將純種劃線接種在斜面上培養(yǎng)保存并進(jìn)行下一步的鑒定。

a)純種果膠酶水解能力的測(cè)定

配制果膠酶篩選培養(yǎng)基，110度滅菌20-30分鐘，冷卻后倒平板在培養(yǎng)皿蓋周邊用記號(hào)筆做好標(biāo)記，將分離純化的細(xì)菌點(diǎn)種于平板上（注意：點(diǎn)種的量不宜過多，以3～4個(gè)為宜），在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，取培養(yǎng)后的平皿用0.5％的剛果紅染色15-20min后，倒掉剛果紅，用1mol/L的NaCl脫色幾分鐘至觀察到透明圈，測(cè)量并記錄透明圈的大小

b)簡(jiǎn)單染色步驟 i.涂片 取一塊載玻片，在上邊用膠頭滴管加半滴無菌水，用接種環(huán)無菌操作將沾有菌的接種環(huán)置于載玻片上的無菌水種涂抹，待看到微弱的渾濁即可；（注意取菌不要太多）

ii.干燥與固定

涂菌面朝上，通過火焰以干燥并固定菌物，固定過程應(yīng)使載玻片通過火焰2-3次，注意溫度的控制，過熱的溫度會(huì)將細(xì)菌殺死，溫度以手背感覺微微發(fā)燙為標(biāo)準(zhǔn)；

iii.染色

將載玻片平放于載波片支架上，滴加結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位即可，染色1.5min iv.水洗

傾去染液，將載玻片的涂菌面朝下，自來水沖洗，水流不宜太急、太大，至洗出水無色為止；

v.干燥

用吸水紙吸去多余水分后自然干燥； vi.鏡檢

將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)。

c)革蘭氏染色步驟 i.涂片

先在載玻片一側(cè)用記號(hào)筆標(biāo)記間隔的四個(gè)區(qū)域，在另一側(cè)四個(gè)區(qū)域的位置分別滴加半滴無菌水。分別取四種活躍生長(zhǎng)期菌種（大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌和一種自選菌）按常規(guī)方法涂片（不宜過厚），用酒精燈按照簡(jiǎn)單染色中所述干燥和固定的方法對(duì)四種菌進(jìn)行干燥和固定。

ii.初染

滴加草酸銨結(jié)晶紫染液使之覆蓋涂菌部位，染色1.5min后水洗； iii.媒染

先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min后水洗； iv.脫色

先用乙醇沖去水跡，然后用95%乙醇覆蓋脫去色素，脫色約30s，立即用水沖洗；

v.復(fù)染

先用番紅洗去水跡，然后滴加番紅復(fù)染1.5min后水洗； vi.鏡檢

將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細(xì)菌。分別以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌所染顏色作為對(duì)照，來判斷枯草桿菌以及另一種自選菌的染色結(jié)果。

d)芽孢染色步驟 i.涂片，加熱干燥及固定

在潔凈蓋玻片接近中部?jī)商幏謩e滴一滴無菌水，分別接種枯草芽孢桿菌及梭狀芽孢桿菌。然后按照常規(guī)方法加熱干燥及固定；

ii.孔雀綠加熱染色

用木夾夾住載玻片，向載玻片上滴加5%孔雀綠水溶液使之完全覆蓋涂菌部位，然后在酒精燈上微微加熱（孔雀綠著色能力強(qiáng)，加熱可使較難染色的芽孢染成綠色，且再難洗脫）至染液冒蒸汽開始計(jì)時(shí)并維持5min，注意加熱時(shí)應(yīng)以有蒸汽微微冒出為宜，過熱或加熱不足均會(huì)影響觀察效果，且加熱時(shí)在載玻片上隨時(shí)補(bǔ)加染液，切勿讓涂片干涸；

iii.水洗

水洗一定要等載玻片冷卻后進(jìn)行，否則可能導(dǎo)致載玻片的破裂。具體水洗按常規(guī)方法進(jìn)行； iv.復(fù)染

用0.5%番紅水溶液復(fù)染2min； v.水洗并干燥

按常規(guī)方法水洗后自然干燥； vi.鏡檢

先在低倍鏡下尋找視野范圍，然后換用高倍鏡調(diào)焦，最后加香柏油在油鏡下仔細(xì)尋找兩種細(xì)菌以及其周圍或內(nèi)部染成綠色的芽孢。

e)半固體穿刺法觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性 i.配制培養(yǎng)基

配制半固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分裝于4支試管內(nèi)，110度滅菌20-30分鐘，正立于燒杯中冷卻至室溫；

ii.在無菌操作臺(tái)上右手握接種針,以針挑取菌苔.垂直刺入半固體瓊脂培養(yǎng)的中心直至接近(但勿觸及)試管底,然后循原路退出。如圖所示：

iii.接種完成后在30℃條件下培養(yǎng)兩天觀察并判斷其運(yùn)動(dòng)性。

第四篇：分離工程部分解答題匯總

1.試描述“逆行精餾” 效應(yīng)，實(shí)際操作中如何減弱或消除？

答：精餾塔的作用是使輕、重關(guān)鍵組分的摩爾分率比從再沸器中的最低值提到冷凝器中的較高值，接近最小回流比下操作時(shí)，在進(jìn)料板上下區(qū)域會(huì)出現(xiàn)隨蒸汽逐級(jí)上升，此比值反而下降，及精餾成果被抵消的情況，稱為“逆行精餾”效應(yīng)。提高回流比或改變進(jìn)料位置均可以減弱或消除該效應(yīng)。

2.萃取精餾流程中，溶劑加入口如何確定？解釋原因。

答：因?yàn)槿軇┑姆悬c(diǎn)比被分離組分高，為了使塔內(nèi)維持較高溶劑濃度，溶劑加入口一定要位于進(jìn)料板之上，但需要與塔頂保持有若干塊塔板，起到回收溶劑的作用，稱為溶劑回收段。

3.某廠一多組分精餾塔，正常操作時(shí)塔頂?shù)桩a(chǎn)品都合格，乙班接班后操作兩小時(shí)分析發(fā)現(xiàn)塔頂產(chǎn)品不合格，請(qǐng)你告訴操作工如何調(diào)節(jié)操作參數(shù)? 答：所謂塔頂產(chǎn)品不合格，是指塔頂餾出物中重組分含量較多。因此，可以通過適當(dāng)加大回流量或適當(dāng)降低塔釜操作溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)。

4．非均相催化反應(yīng)精餾的定義是什么？利用非均相催化反應(yīng)精餾進(jìn)行反應(yīng)與固定床反應(yīng)器相比有什么優(yōu)點(diǎn)? 答：非均相催化反應(yīng)精餾，即將催化劑填充于精餾塔中，它既起加速反應(yīng)的催化作用，又作為填料起分離作用。優(yōu)點(diǎn): 1).對(duì)于受平衡制約的反應(yīng)，采用催化精餾能夠大大超過固定床的平衡轉(zhuǎn)化率。2).由于精餾作用移出物系中較重的污染物，使催化劑保持清潔，延長(zhǎng)了催化劑的壽命。5．萃取精餾和共沸精餾的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)是什么？ 答：相同點(diǎn)：

都是加入溶劑改變?cè)芤旱南鄬?duì)揮發(fā)度，使其可以用精餾方法分離。不同點(diǎn)：

1)可供選擇的共沸劑數(shù)目遠(yuǎn)不及萃取劑多，且萃取劑用量不像共沸劑受限制； 2)共沸劑從塔頂蒸出，萃取劑從塔底出，因此消耗能量多；

3)共沸精餾受組成限制，操作條件比較苛刻，萃取精餾可在較大范圍變化，操作比較容易，流程較簡(jiǎn)單，只用于連續(xù)操作；

4)同樣壓力下共沸精餾溫度低，適于熱敏性物料。

6．畫出萃取精餾的流程簡(jiǎn)圖，指出萃取劑的加入位置，并說明原因？ 答：

加入位置：溶劑的加入口一定要位于進(jìn)料板以上，但需要與塔頂保持有若干塊塔板。原因：溶劑的沸點(diǎn)比被分離組分高，為了使塔內(nèi)維持較高的溶劑濃度，溶劑的加入口一定要位于進(jìn)料板以上。但需要與塔頂保持有若于塊塔板，起回收溶劑的作用。

SA+BSAB1B+S2S1：萃取精餾塔 2：溶劑回收塔

7．計(jì)算最小回流比所用恩特伍德公式的假設(shè)條件是什么？當(dāng)簡(jiǎn)單精餾塔在最小回流比下操作時(shí)，當(dāng)輕重組分均為分配組分和均為非分配組分兩種情況下，塔內(nèi)恒濃區(qū)的位置分布情況。答：假定：

1)塔內(nèi)汽相和液相均為恒摩爾流率； 2）各組分的相對(duì)揮發(fā)度均為常數(shù)；

8．物理吸收過程與精餾相比，傳質(zhì)特點(diǎn)是什么？吸收塔內(nèi)氣液相濃度和溫度如何變化？ 答：物理吸收過程是氣相分子向液相的單方向分子擴(kuò)散和傳質(zhì)過程。吸收塔內(nèi)從塔頂?shù)剿?，氣、液相濃度都是上升的，溫度也是上升的?．如何判斷閃蒸問題是否成立？

答：方法一：分別用泡點(diǎn)方程和露點(diǎn)方程計(jì)算在閃蒸壓力下進(jìn)料混合物的露點(diǎn)和泡點(diǎn)溫度，然后核實(shí)閃蒸溫度是否處于泡露點(diǎn)溫度之間。若該條件成立，則閃蒸問題成立。

方法二：計(jì)算ΣKizi和Σzi/Ki,若ΣKizi>1, 說明TB1，說明TD>T。綜合兩種試算結(jié)果，只有TB

答：1）按相對(duì)揮發(fā)度遞減的順序逐個(gè)從塔頂分離出各組分；

2）最困難的分離應(yīng)放在塔序的最后；

3）應(yīng)使各個(gè)塔的餾出液的摩爾數(shù)與釜液的摩爾數(shù)盡量接近； 4）分離很高揮手率的組分的塔應(yīng)放在塔序的最后； 5）進(jìn)料中含量高的組分盡量提前分出。

第五篇：微生物的分離與培養(yǎng)

病原物的分離與培養(yǎng)

病原物的分離與培養(yǎng)在植物病害的研究中具有重要意義，分離、培養(yǎng)病原菌的方法是植物病理學(xué)研究工作中最常應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。一方面，在一個(gè)新的病害研究中，通過分離與培養(yǎng)獲得病原物的純培養(yǎng)，完成柯氏法則，以明確該病病原；研究病原物的生物學(xué)特性和病害循環(huán)（侵染、病程等等）。所謂病原物的分離，即把該病原菌從發(fā)病組織上與其他微生物分開；所謂病原物的培養(yǎng)，即將分離的病原菌移到可以讓這種病原菌正常生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)即培養(yǎng)基上，從而獲得其純培養(yǎng)。病原物的分離與培養(yǎng)，需經(jīng)以以幾個(gè)步驟: 1.有關(guān)器皿的滅菌和消毒； 2.制作培養(yǎng)基； 3.病原菌的分離 4.病原菌的培養(yǎng)。－、滅菌與消毒

滅菌與消毒是兩個(gè)不同的概念。滅菌則是指殺死一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體和孢子。消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營(yíng)養(yǎng)體，在植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場(chǎng)所都要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒和滅菌。消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過濾、輻射和使用化學(xué)藥品等方法。

(一)熱力滅菌

熱力滅菌分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。

1．干熱滅菌

干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)疑固性與其本身的含水量有關(guān)。在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高(160～170℃)，時(shí)間長(zhǎng)1～2 h。但干熱滅菌溫度不能超過180 ℃，否則包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的儀器是烘箱。

干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種?；鹧鏌茰缇m用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，無菌操作時(shí)酌試管口和瓶口也在火焰上作短暫燒灼滅菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后進(jìn)行灼燒滅菌。通常所說的干熱滅菌是在烘箱內(nèi)利用高溫干燥空氣(160～170℃)進(jìn)行滅菌。此法適用于玻璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等的滅菌。

進(jìn)行干熱滅菌要注意以下問題：物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通；滅菌物品不要接觸烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火；在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內(nèi)停止加溫；電烘箱內(nèi)溫度未降到70℃以前，切勿自行打開箱門以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。濕熱滅菌

(1)高壓蒸汽滅菌 此法是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，0.1MPa，121℃保持15～30 min進(jìn)行滅菌。時(shí)間的長(zhǎng)短可根據(jù)滅菌物品種類和數(shù)量的不同而有所變化，以達(dá)到徹底滅菌。這種滅菌適用于培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的滅菌。

(2)常壓蒸汽滅菌 在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下：常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌法。對(duì)于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法可用阿諾氏流動(dòng)蒸汽滅菌器進(jìn)行，也可用普通蒸籠進(jìn)行滅菌。由于常壓，其溫度不超過100℃，僅能使大多數(shù)微生物被殺死，而芽孢細(xì)菌卻不能在短時(shí)間內(nèi)殺死，因此可采用間歇滅菌以殺死芽孢細(xì)菌，達(dá)到徹底滅菌的目的。

常壓間歇滅菌是將滅菌培養(yǎng)基放人滅菌器內(nèi)，每天加熱100℃，30 min，連續(xù)3 d，第一天加熱后，其中的營(yíng)養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物取出放室溫下18～24 h，使其中的芽孢發(fā)育成營(yíng)養(yǎng)體，第二天再加熱100℃，30 min，發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)體又被殺死，但可能仍留有芽孢，故再重復(fù)一次，使徹底滅菌。

(二)過濾除菌

許多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加熱消毒滅菌方法，—均會(huì)被熱破壞，因此采用過濾除菌的方法。應(yīng)用最廣泛的過濾器有：

(1)蔡氏過濾器 該過濾器是由石棉制成的圓形濾板和一個(gè)特制的金屬（銀或鋁）漏斗組成，分上、下兩節(jié)。過濾時(shí)，用螺旋把石棉板緊緊夾在上、下兩節(jié)濾器之間，然后將溶液臵于濾器中抽濾。每次過濾必須用一張新濾板。根據(jù)其孔徑大小，濾板分為3種型號(hào)：K型最大，作一般澄清用；EK濾孔較小，用來除去一般細(xì)菌；EK-S濾孔最小，可阻止大病毒通過。使用時(shí)可根據(jù)需要選用。

(2)微孔濾膜過濾器 這是一種新型濾器，其濾膜是用醋酸纖維酯和硝酸纖維酯的混合物制成的薄膜。微孔濾膜過濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝臵的塑料蓋盒組成。出口處可連接針頭，入口處可連接針筒。使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達(dá)到除菌的目的。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過濾除菌。實(shí)驗(yàn)室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm，但若要將病毒除掉，則需更小孔徑的微孔濾膜。微孔濾膜過濾除菌的主要操作步驟為：

① 組裝、滅菌 將0.22μm孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊。壓平，包裝滅菌后待用(0.1MPa、121.5℃滅菌：20 min)。連接。將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接于裝有待濾溶液注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無菌試管中。

② 壓濾 將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠壓過濾到無菌試管中。濾畢，將針頭撥出。壓濾時(shí)，用力要適當(dāng)，不可太猛太快，以免細(xì)菌被擠壓通過濾膜。

提示: 整個(gè)過程應(yīng)在無菌條件下嚴(yán)格無菌操作以防污染，過濾時(shí)應(yīng)避免各連接處出現(xiàn)滲透現(xiàn)象。

(三)輻射滅菌 紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的。波長(zhǎng)為200～300 nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260 nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長(zhǎng)一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線殺菌機(jī)理主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成過氧化氫(H2O2)。O3和H2O2有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以只適用于無菌室、接種箱的空氣及物體表面的滅菌。

注意事項(xiàng): 紫外線對(duì)眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用，對(duì)皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光，更不能在紫外線燈光下工作。紫外線燈距照射物以不超過1.2 m為宜。

此外，采用60Co-γ射線滅菌，也已廣泛用于不能進(jìn)行加熱滅菌的紙、塑料薄膜，各種積層材料制作的容器以及醫(yī)用生物敷料皮等的滅菌。γ射線滅菌的最大優(yōu)點(diǎn)是穿透力強(qiáng)，可在厚包裝完好條件下滅菌。

(四)化學(xué)藥品滅菌

化學(xué)藥品消毒滅菌法是應(yīng)用能抑制或殺死微生物的化學(xué)制劑進(jìn)行消毒滅菌的方法。能破壞細(xì)菌代謝機(jī)能并有致死作用的化學(xué)藥劑為殺菌劑，如重金屬離子等；只是阻抑細(xì)菌代謝機(jī)能，使細(xì)菌不能增殖的化學(xué)藥劑為抑菌劑，如磺胺類及大多數(shù)抗生素等?；瘜W(xué)藥品對(duì)微生物的作用是抑菌還是殺菌以及作用效果還與化學(xué)藥品濃度的高低、處理微生物的時(shí)間長(zhǎng)短、微生物的種類以及微生物所處的環(huán)境等有關(guān)。

植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用的化學(xué)藥品有2％煤酚皂溶液(來蘇爾)、0.25％新潔爾滅、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。

消毒與滅菌不僅是從事植物病理學(xué)和整個(gè)生命科學(xué)研究必不可少的重要環(huán)節(jié)和實(shí)用技術(shù)，而且在醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、食品、生物制品等各方面均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)不同的使用要求和條件選用合適的消毒滅菌的方法。

二、培養(yǎng)基的制作

1、目的要求

了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握培養(yǎng)基的制備方法。

2、基本原理

在植物病理學(xué)研究工作中經(jīng)常要使用各種不同的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基是按照生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)，用人工方法配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。其中含有碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素以及水分等。微生物在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖還必須在最適pH范圍內(nèi)才能生長(zhǎng)得更好，因此，對(duì)不同種類的微生物應(yīng)將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到一定的pH范圍。－般而言，真菌調(diào)節(jié)到微酸，細(xì)菌調(diào)節(jié)到微堿。

培養(yǎng)基的種類很多，不同的微生物所需要的培養(yǎng)基不同。依物理性狀可分為液體的、固體的和半固體的三種。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入1.5 %～2 %的瓊脂，半固體培養(yǎng)基是加入0.2 %～0.5 %的瓊脂。瓊脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。

根據(jù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來源的不同，培養(yǎng)基可分為天然、半合成和合成培養(yǎng)基三類。天然培養(yǎng)基是以自然界原有的有機(jī)物為材料經(jīng)滅菌后制成，如馬鈴薯、胡蘿卜、水果、大麥粒、高粱粒等。半合成培養(yǎng)基中既有一些天然的有機(jī)物質(zhì)，又有一些成分簡(jiǎn)單或明確的化合物。如常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、肉汁胨培養(yǎng)基(NA)等。合成培養(yǎng)基是由一些成分明確的化合物配制而成的，無任何成分不明確的物質(zhì)，常用于研究微生物的生理生化性狀，如查氏(Czapek)培養(yǎng)基等。

根據(jù)培養(yǎng)基用途不同，可分為生長(zhǎng)繁殖培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基、貯存培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基等。在植物病理學(xué)研究中，最常用培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，主要用于分離培養(yǎng)病原真菌。

在培養(yǎng)基配制完之后，必須經(jīng)過滅菌，以便徹底殺死其中原有的一切微生物。

3、材料、試劑與儀器 材料 馬鈴薯。

試劑 葡萄糖、瓊脂等。

儀器與用品 高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(或酸度計(jì))、試管、鋁鍋、攪拌棒、三角瓶、燒杯、漏斗、量筒、紗布、棉花、天平等。

4、操作步驟

PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20g、蒸餾水1000 ml，自然pH。

在PDA培養(yǎng)基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，這樣配制的培養(yǎng)基也稱為PSA培養(yǎng)基。(1)稱量 稱量去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g。提示：瓊脂加入的量取決于瓊脂的質(zhì)量，質(zhì)量好的15 g就夠了，質(zhì)量差的應(yīng)適當(dāng)增加。另外，在夏天氣溫較高時(shí)，適當(dāng)增加用量。

(2)將馬鈴薯切成小塊，放入鍋中，加水1000 ml，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)?/p>

(3)將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂，加熱熔化。

提示：在瓊脂熔化的過程中，需要用玻璃棒不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入適量的水以補(bǔ)充加熱過程中損失的水分，定容至1000 ml。

提示：通常在制作培養(yǎng)基的鍋內(nèi)用紅藍(lán)鉛筆標(biāo)記出不同體積的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容時(shí)直接將水加至已標(biāo)記的刻度即可。

(5)分裝 根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可將配制的培養(yǎng)基分裝于試管內(nèi)或三角瓶?jī)?nèi)。分裝試管，其量為管高的1／5，滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的容量以不超過三角瓶容積之一半為宜。

(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脫脂的經(jīng)彈松的棉花，棉塞可過濾空氣，防止雜菌侵入并可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，故在植物病理學(xué)研究工作中普遍使用。

正確的棉塞是形狀、劃、、松緊與管口或瓶口完全適合，過緊時(shí)妨礙空氣流通，操作不便；過松則達(dá)不到濾菌的目的，且棉塞過小往往容易掉進(jìn)試管內(nèi)。正確的棉塞頭較大，約有1／3在外，2／3在試管內(nèi)。分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾染在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起污染。

(7)包扎 加塞后，將試管用線繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道線繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、組別、制作人等。

(8)滅菌 將上述培養(yǎng)基以0.1MPa，121℃，高壓蒸氣滅菌20 min。

(9)擱臵斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基豎臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱臵的斜面長(zhǎng)度以不超過試管總長(zhǎng)的一半為宜。

培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37℃溫箱培養(yǎng)24h，無菌生長(zhǎng)者方可使用。

PDA培養(yǎng)基一般不需要調(diào)pH。對(duì)于要調(diào)節(jié)pH的培養(yǎng)基，一般用pH試紙測(cè)定其pH。如果培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿破壞培養(yǎng)基成分。

三、病原菌的分離培養(yǎng)和純化

1、目的要求

(1)了解分離與純化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和組織分離、稀釋分離、平板劃線分離的基本操作技術(shù)。

(3)掌握在平板、斜面及液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原菌及觀察其培養(yǎng)性狀的方法。

2、基本方法

植物病原真菌的分離方法主要有組織分離法和稀釋分離法兩種。最常用的方法是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產(chǎn)生大量孢子的病原真菌的分離。病原細(xì)菌的分離方法以劃線分離法為最常用，在有些情況下也采用稀釋分離法。

為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須要進(jìn)行分離菌的純化，純化的方法類似于分離工作中采用的稀釋分離法或劃線分離法。

3、材料、儀器與用具 3.1 材料

(1)稻瘟?。ㄈ~、病節(jié)、病穗頸）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）。(3)黃瓜灰霉?。˙otrytis cineria）。(4)番茄灰霉?。ü?Botrytis cinerea)。

(5)黃瓜菌核?。ü?Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黃瓜細(xì)菌性角斑病（葉）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。

(7)水稻白葉枯病（葉）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜軟腐?。ㄈ~）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。

3.2．培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；肉膏蛋白脈培養(yǎng)基；加寄主組織煎汁的培養(yǎng)基等。

3.3．儀器與用品 超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、吸管、吸水紙、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、鑷子、接種鏟(針)、接種環(huán)(鉺)、70％酒精、0.1％升汞、酒精燈、火柴、記號(hào)筆、橡皮筋套、可調(diào)式電爐、不銹鋼鍋等。

4、實(shí)驗(yàn)操作

(一)病原真菌的分離

1．組織分離法 其步驟為：

(1)取滅菌培養(yǎng)皿一個(gè)，臵于濕紗布上，在皿蓋上用玻璃鉛筆注明分離日期、材料和分離人的姓名。提示：無菌操作應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：工作前將所需的物品都放在超凈工作臺(tái)內(nèi)；操作前用肥皂洗手，操作時(shí)還需用70 ％酒精擦拭雙手；無菌操作時(shí)，呼吸要輕，不要說話。

（2）用無菌操作法向培養(yǎng)皿中加入25％乳酸1～2滴(可減少細(xì)菌污染)，然后將融化而冷至60℃左右的PDA培養(yǎng)基倒人培養(yǎng)皿中，每皿倒10～15 ml，輕輕搖動(dòng)使之成平面。凝固后即成平板培養(yǎng)基。

提示：加入25％乳酸1～2滴，可減少平板上出現(xiàn)污染細(xì)菌菌落。除乳酸外，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)目咕匾种萍?xì)菌的生長(zhǎng)，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 細(xì)菌生長(zhǎng)；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-細(xì)菌生長(zhǎng)；加鏈霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分細(xì)菌的生長(zhǎng)。除了氯霉素可在滅菌前加入外，其他抗菌素都應(yīng)在滅菌后并冷卻到45℃左右(以手背觸三角瓶感到燙，但尚可以忍耐為宜)時(shí)加入。倒平板過程中只要遵循“穩(wěn)、輕、快”要領(lǐng)，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌葉斑病的新鮮病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個(gè)病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣(病健交界處，)切取小塊(每邊長(zhǎng)3～4 mm)病組織數(shù)塊。

提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機(jī)會(huì)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點(diǎn)病害應(yīng)在臨近健組織的部分分離。

（4）將病組織放入70％酒精中浸3～5s后，按無菌操作法將病組織移入0.1％升汞液中分別表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒劑)，如植物組織柔嫩，則表面消毒時(shí)間宜短；反之則可長(zhǎng)些。然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留的消毒劑。

提示：先用70％的酒精浸2～3 s是為了消除寄主表面的氣泡，減少表面張力，70％的酒精亦用于表面消毒，處理的時(shí)間較短(一般數(shù)秒至l min)升汞溶液消毒的時(shí)間因材料而異，可自30s至30min不等，一般情況下，需時(shí)間3～5 min。

(5)用無菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放4～6塊。

提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染。

(6)將培養(yǎng)皿倒臵放入25℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般3～4 d后觀察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果。

(7)若病組織小塊上均長(zhǎng)出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。在無菌條件下，用接種針(鏟)自菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上，在25 ℃左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，如無雜菌生長(zhǎng)即得該分離病菌純菌種，便可臵于冰箱中保存。

提示：除根據(jù)菌落的一致性初步確定長(zhǎng)出的菌落是否目標(biāo)菌外，還要在顯微鏡下檢查，進(jìn)一步確定。如果是對(duì)未知病原菌的組織分離，則要將長(zhǎng)出的菌落分別轉(zhuǎn)出，通過進(jìn)一步的接種實(shí)驗(yàn)明確哪一種為其病原菌。

在組織分離工作中，如果植物材料體積較大且較軟(如患灰霉病的番茄果實(shí))，在分離過程中可直接挖取內(nèi)部患病組織移入平板培養(yǎng)基上，完成分離工作。

2.稀釋分離法

(1)取滅菌培養(yǎng)皿三個(gè)，平放在濕紗布上，編號(hào)，并注明日期、分離材料及分離人姓名。

(2)用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一皿中分別注入0.5～1.0 ml。(3)用移植環(huán)蘸一滴孢子懸浮液，與第一個(gè)培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，再?gòu)牡谝粋€(gè)培養(yǎng)皿移三環(huán)到第二個(gè)培養(yǎng)皿中，混合后再移三環(huán)到第三個(gè)培養(yǎng)皿中。

(4)將熔化并冷卻到45～50℃的培養(yǎng)基，分別倒在三個(gè)培養(yǎng)皿中(為防止細(xì)菌污染，也可以向每個(gè)培養(yǎng)皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，搖勻，凝固，要使培養(yǎng)基與稀釋的菌液充分混勻。

提示： 倒平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度一定要掌握好，過熱易將病原菌燙死而使分離失敗，過冷則倒入培養(yǎng)皿中后難以形成平板，不利于分離。

(5)將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)后臵恒溫箱(25℃)中培養(yǎng)，數(shù)日后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

(6)挑菌 將培養(yǎng)后長(zhǎng)出較為整齊一致的單個(gè)菌落分別挑取，接種到斜面培養(yǎng)基上，臵25℃左右培養(yǎng)。待菌長(zhǎng)出后，檢查菌是否單純，若有其他菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離純化，直到獲得純培養(yǎng)。

(二)病原細(xì)菌的分離

病原細(xì)菌的分離方法以稀釋分離法和劃線分離法為最常用。在進(jìn)行分離之前，首先應(yīng)對(duì)病組織材料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)初步診斷，即經(jīng)過鏡檢確認(rèn)有噴菌現(xiàn)象以后，才對(duì)該病組織作分離工作。稀釋分離法是最經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)分離法，方法同上述真菌分離。

除去上述稀釋分離法以外，較為方便的是劃線分離法：(1)預(yù)先把熔化好的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝成平板后，翻轉(zhuǎn)放在30℃恒溫箱中2～4 h，使表面無水滴凝結(jié)。也可凝成平板后直接使用。(2)將病組織先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用無菌水換洗3次后，放在滅菌培養(yǎng)皿中的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并讓組織碎塊在水中浸泡20～60 min，讓細(xì)菌釋放到滅菌水中。

(3)用滅菌的接種鉺，(接種環(huán))；蘸取浸泡液在干燥的培養(yǎng)基平板表面劃線，盡量不要把平板表面劃破。劃過第一批線后的接種環(huán)應(yīng)放在火焰上燒灼，冷卻后直接在第一批劃線的末端向另一方向劃線。滅菌后再劃第三次線。

提示：劃過第一批線后接種鉺放在火焰上燒過這一步驟非常重要，這樣做可以使第一批線和第二批線上的細(xì)菌數(shù)量相差很大。

(4)用玻璃鉛筆在培養(yǎng)皿上寫上分離材料、日期和分離者姓名后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，放在26～28℃恒溫箱中培養(yǎng)。1～3 d后觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)，在哪些地方有單菌落生長(zhǎng)出來?其中的優(yōu)勢(shì)單菌落應(yīng)為待分離菌形成的。

(5)仔細(xì)挑取病原菌的單菌落，并移植到斜面培養(yǎng)基上。同時(shí)，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮液作第二次劃線分離，經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)的菌落在形態(tài)特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時(shí)，即表明已獲得純培養(yǎng)。最好要經(jīng)過連續(xù)三次單菌落的分離，才能確保純化。

(三)真菌、細(xì)菌培養(yǎng)性狀

1．真菌培養(yǎng)性狀觀察 取已分離，純化的某種真菌菌種；按前述稀釋分離法中(1)～(5)步驟進(jìn)行，待某培養(yǎng)皿中形成單個(gè)菌落后觀察。記載以下內(nèi)容：菌落顏色、菌叢密集及繁茂程度、是否有色素分泌出來而滲透到培養(yǎng)基中、菌落生長(zhǎng)速度快慢等。同時(shí)要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

2．細(xì)菌培養(yǎng)性狀觀察

(1)仿照上述真菌菌落形成步驟，觀察記載以下內(nèi)容：菌落顏色、菌落邊緣形狀、菌落表面是光亮還是粗糙或有皺折、、菌落隆起情況、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中，菌落生長(zhǎng)速度快慢，是否有特殊氣味形成等。同時(shí)要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

(2)用接種鉺(環(huán))蘸細(xì)菌菌種后，通過無菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培養(yǎng)基表面從下向上劃一直線，過2～3 d后長(zhǎng)出的細(xì)菌群體稱為菌苔，可仿照觀察記載細(xì)菌菌落的記載內(nèi)容，記載菌苔顏色、邊緣形狀、表面是光亮還是粗糙有皺折、隆起情況、是否有色素分泌到培養(yǎng)基中，是否有特殊氣味生成，生長(zhǎng)速度快慢等。也要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。

(3)用接種鉺(環(huán))蘸取細(xì)菌菌種后，通過無菌操作，將其接種在某種液體培養(yǎng)基中，數(shù)日后觀察記載培養(yǎng)基中是否變混濁、是否有色素、氣體、沉淀生成，培養(yǎng)液表面是否可生成菌膜等。也要記載培養(yǎng)基種類(成分及pH)和培養(yǎng)溫度、光照條件。