第一篇：微生物學(xué)實驗總結(jié)大全

微生物學(xué)實驗總結(jié)

高熹

1120152430 時間如清風般從你我指間滑過,無聲無息,快得我們都不曾駐足一望,莫然回首間,本學(xué)期的微生物學(xué)實驗已接近尾聲。一學(xué)期的時間雖短，但老師的諄諄教誨、同學(xué)們的良好配合和嚴格的實驗操作，都將為微生物學(xué)實驗課程畫上一個完美的句號。

眾所周知，微生物學(xué)是一門實驗與理論高度結(jié)合的科目，是一門以實驗為基礎(chǔ)與生活生產(chǎn)息息相關(guān)的課程。需要我們不斷地做實驗，在實驗中觀察、分析相應(yīng)的結(jié)果。所以我認為，要做好微生物學(xué)實驗要有以下的四個能力：

1、獨立思考能力

我想，在這個過程中，其中一個重要的感悟就是獨立思考的重要性。當在試驗中發(fā)現(xiàn)與預(yù)料過程所不符，那么必定是過程中出現(xiàn)錯誤，而尋找并解決的這個過程是書本中無法給予的。做實驗絕對不能人云亦云，要有自己的看法，這樣就要有充分的準備，若是做了也不知道是個什么實驗，那么做了也是白做。在實驗過程中，自己看書，獨立思考，最終解決問題，從而也就加深了我們對課本理論知識的理解，達到了“雙贏”的效果。

2、突破創(chuàng)新能力

實際上，在弄懂了實驗原理的基礎(chǔ)上，我們的時間是充分的，做實驗應(yīng)該是游刃有余的，如果說創(chuàng)新對于我們來說是件難事，那改良總是有可能的。試著通過自己現(xiàn)有的知識，多想，多做，多總結(jié)，我想首先是作為一個求知者在追求知識的道路上必須堅守的原則，其次就是要敢于突破，我們都站在巨人的肩膀上，踮起腳尖即使觸不到天空，也可以更加拓寬自己的視野。

3、現(xiàn)代信息技術(shù)的使用能力

在微生物學(xué)實驗學(xué)習(xí)中，有很多特殊的、特定的實驗，如有毒有害物質(zhì)參與且不易排污的實驗、不易操作或難以成功的實驗、需要反復(fù)觀察的實驗、反應(yīng)慢導(dǎo)致單位課時中難以完成的實驗等。我們在研究改進措施的同時，也可以借助于現(xiàn)代信息技術(shù)手段制作視頻資料或多媒體課件進行輔助學(xué)習(xí)。

4、動手能力

動手操作對激發(fā)微生物學(xué)學(xué)習(xí)興趣、幫助理解微生物學(xué)知識、培養(yǎng)解決問題能力、創(chuàng)新能力等具有重要作用。尤其是微生物學(xué)這樣一種學(xué)科，動手能力的強弱與知識的掌握其實是同等重要的。如果動手能力太弱，所學(xué)習(xí)到的知識就無法通過有效的方式真正組織起來，那么學(xué)到的知識就只是輸入而沒有輸出，只有理論而沒有實踐，對于這樣一門學(xué)科，這樣的缺陷是致命的，而這樣的能力是必須具備的。

本學(xué)期我們一共完成了十個實驗，分別是：顯微鏡油鏡的使用、細菌形態(tài)觀察和細菌的革蘭氏染色、放線菌、酵母菌、霉菌的形態(tài)觀察和微生物的顯微鏡計數(shù)法、培養(yǎng)基的制備、周圍環(huán)境中微生物的觀察以及從土壤中分離純化微生物、細菌生長曲線的測定、環(huán)境因素對微生物生長發(fā)育的影響、細菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)、微生物的誘變育種、水中大腸菌群的計數(shù)—MPN法、乳酸菌發(fā)酵實驗、甜酒釀發(fā)酵實驗、固定化酵母細胞發(fā)酵啤酒實驗。

通過這些微生物學(xué)實驗，不僅是對我理論課程的加深，更是對我實驗?zāi)芰Φ?一個顯著的提高。其中，做實驗的過程中，我認為以下的幾點對于我未來的學(xué)習(xí)和科研具有重大意義：

1、嚴格的無菌操作，在微生物實驗中，由于空氣和環(huán)境中存在大量的微生物，所以很可能造成培養(yǎng)基的污染，影響最終的實驗結(jié)果，所以實驗中，無菌操作尤為重要。各種實驗用具要嚴格高溫滅菌，防止用具本身污染。實驗時，接種環(huán)、接種針、移液管口和涂布器等要在酒精燈下灼燒徹底，防止其上面附著著的微生物污染。在微生物實驗操作時，有條件要在超凈工作臺下操作，降低被污染的概率，相關(guān)操作也要在酒精燈附近進行。使用超凈工作臺時要嚴格紫外滅菌和打開排風扇，手和相關(guān)器材進入操作臺前要用酒精仔細擦拭，清除表面的微生物。無菌操作往往能決定著一個實驗的成敗，學(xué)會無菌操作尤為重要。

2、微生物實驗中儀器的使用，我學(xué)會了高壓滅菌鍋的使用，以前的實驗從未接觸過，并且還復(fù)習(xí)了紫外-可見分光光度計和分析天平等儀器的使用，使我更加熟練。

3、微生物實驗中，平板劃線和涂布是最重要的兩項操作，平板劃線要注意畫的連續(xù)性和可分辨性，平板涂布要涂均勻，否則都會影響后期的實驗觀察和結(jié)果。另外實驗中其他操作，比如稱量準確性，移液管的使用都很重要，所以操作要十分規(guī)范。

4、實驗中的部分思想對未來的科研工作尤為重要，比如每一步都要設(shè)立空白對照組，在實驗結(jié)果中做出比較討論，這在未來的自我進行的實驗設(shè)計中，這種思想的培養(yǎng)尤為重要。

5、另外，實驗中模式菌的學(xué)習(xí)和使用為未來科研打好良好基礎(chǔ)，比如典型的革蘭氏陰性菌大腸桿菌和典型的革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌都是實驗室的常用菌，如果未來還要從事微生物相關(guān)工作，這幾種模式菌都必不可少。

6、實驗結(jié)束后要及時觀察結(jié)果，過了兩天才去觀察，結(jié)果部分平板已長出菌苔，對實驗結(jié)果的觀察造成了很大的困難，所以，結(jié)果觀察同實驗操作一樣重要。

與實驗操作相比，本學(xué)期的微生物學(xué)另一個重要的是學(xué)會團隊的重要性，每個實驗憑借一己之力是無法完成的，而一個團隊就可以游刃有余。本學(xué)期的實驗讓我最感動是我們一個小組四名成員的精妙配合，造就了這學(xué)期的良好的微生物學(xué)實驗的結(jié)果

總之，這學(xué)期的實驗給我留下了深刻的印象，在最后，謝謝老師一學(xué)期的辛苦付出，為我未來的微生物學(xué)的學(xué)習(xí)和科研打好了良好的基礎(chǔ)。

第二篇：微生物學(xué)實驗

細菌群體生長表現(xiàn)為細胞數(shù)目的增加或細胞物質(zhì)的增加。測定細胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過濾法(membrane filtration)等。測定細胞物質(zhì)的方法有細胞干重的測定，細胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測定，代謝產(chǎn)物的測定等?？傊?，測定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點，工作中應(yīng)根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實驗主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法和光電比濁計數(shù)法。

一 顯微鏡直接計數(shù)法

（一）目的要求

1．明確血細胞計數(shù)板計數(shù)的原理。

2．掌握使用血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。

（二）基本原理

顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計菌器有：血細胞計數(shù)板、Peteroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數(shù)，基本原理相同。后兩種計菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數(shù)。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細菌學(xué)檢查。顯微鏡直接計數(shù)法的優(yōu)點是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時間）以及加細胞分裂抑制劑等方法來達到只計數(shù)活菌體的目的。本實驗以血球計數(shù)板為例進行顯微鏡直接計數(shù)。另外兩種計菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。

用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常用的微生物計數(shù)方法。該計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。血細胞計數(shù)板構(gòu)造如圖l5-1。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(圖15—2)；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。

圖15—1 血細胞計數(shù)板構(gòu)造

（一）圖15—2 血細胞計數(shù)板構(gòu)造

（二）A.正面圖；B.縱切面圖； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計數(shù)室

1.血細胞計數(shù)板；2.蓋玻片；3.計數(shù)室

計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。

設(shè)五個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個中方格的計數(shù)板，則

1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個）

同理，如果是16個中方格的計數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B（個）

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母

2．儀器或其他用具 血細胞計數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。

（四）操作步驟

l．菌懸液制備

以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當?shù)木鷳乙骸?/p>

2．鏡檢計數(shù)室

在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數(shù)。

3．加樣品

將清潔干燥的血細胞計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。

取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。

4．顯微鏡計數(shù)

加樣后靜止5min，然后將血細胞計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。

調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。

在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個菌體為宜。每個計數(shù)室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算樣品的含菌量。

5．清洗血細胞計數(shù)板

使用完畢后，將血細胞計數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。

（五）實驗報告

l．結(jié)果

將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。

各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml

12345

第一室

第二室

2．思考題

(1)根據(jù)你的體會，說明用血細胞計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差．力求準確?

(2)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請設(shè)計1～2種可行的檢測方法。

二平板菌落計數(shù)法

（一）目的要求

學(xué)習(xí)習(xí)近平板菌落計數(shù)的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可來自樣品中的2～3或更多個細胞。因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming units，cfu)而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。

平板菌落計數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且測定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計數(shù)方法的最大優(yōu)點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。

（三）器材

1．菌種 大腸桿菌菌懸液。

2．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。

3．儀器或其他用具lm1無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5ml無菌水的試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。

（四）操作步驟

l．編號

取無菌平皿9套，分別用記號筆標明10-

4、10-

5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無菌水的試管，依次標是10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-6。

2．稀釋

用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。

OptionsEmail Replies將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋?！溆嘁来晤愅疲麄€過程如圖15-3所示。

放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。

3，取樣

用三支1mL無菌吸管分別吸取10-

4、10-5和10-6。的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復(fù)平板間的操作誤差。

圖15—3平板菌落計數(shù)操作步驟

4．倒平板．

盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。由于細菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應(yīng)盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數(shù)。

待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5．計數(shù)

培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進行計算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重復(fù)對照的菌落數(shù)不應(yīng)相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復(fù)對照平板不能少于三個，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，減少誤差。由10-

4、10-

5、10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。

平板菌落計數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調(diào)整。

平板菌落計數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。

涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。

五、實驗報告

1．結(jié)果

2．將培養(yǎng)后菌落計數(shù)結(jié)果填入下表

稀釋度10-410-510-6

Cfu數(shù)/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

2．思考題

(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?

(2)要使平板菌落計數(shù)準確，需要掌握哪幾個關(guān)鍵?為什么?

(3)試比較平板菌落計數(shù)法和顯微鏡下直接計數(shù)法的優(yōu)缺點及應(yīng)用。

(4)當你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時，你認為問題出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法計數(shù)，其平板上長出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長時間(48h)后觀察結(jié)果?

三 光電比濁計數(shù)法

一、目的要求

1．了解光電比濁計數(shù)法的原理。

2．學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計數(shù)法的操作方法。

二、基本原理

當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內(nèi)，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖15-4)。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數(shù)標準曲線。然后，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線中查出對應(yīng)的菌數(shù)。制作標準曲線時，菌體計數(shù)可采用血細胞計數(shù)板計數(shù)，平板菌落計數(shù)或細胞干重測定等方法。本實驗采用血細胞計數(shù)板計數(shù)。

光電比濁計數(shù)法的優(yōu)點是簡便、迅速，可以連續(xù)測定，適合于自動控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長等因素的影響。因此，對于不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數(shù)應(yīng)采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標準曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經(jīng)過最大吸收波長以及穩(wěn)定性試驗來確定。另外，對于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質(zhì)的懸液不適合用此法進行測定。

圖15—4 比濁法測定細胞濃度的原理

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母培養(yǎng)液

2．儀器或其他用具 721型分光光度計，血細胞計數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。

（四）操作步驟

1．標準曲線制作

（1）編號 取無菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為1、2、3、4、5、6、7。

（2）調(diào)整菌液濃度 用血細胞計數(shù)板計數(shù)培養(yǎng)24小時的釀酒酵母菌懸液，并用無菌生理鹽水分別稀釋調(diào)整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數(shù)的細胞懸液。再分別裝入已編好號的1至7號無菌試管中。

（3）測OD值 將1至7號不同濃度的菌懸液搖均勻后于560nm波長、1cm比色皿中測定OD值。比色測定時，用無菌生理鹽水作空白對照，并將OD值填入下表

管號12345678

細胞數(shù)106/ml

光密度（OD）

每管菌懸液在測定OD值時均必須先搖勻后再倒入比色皿中測定

(4)以光密度(OD)值為縱坐標，以每毫升細胞數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。

2．樣品測定

將待測樣品用無菌生理鹽水適當稀釋，搖均勻后，用560nm波長、lcm比色皿測定光密度。測定時用無菌生理鹽水作空白對照。

各種操作條件必須與制作標準曲線時的相同，否則，測得值所換算的含菌數(shù)就不準確。

3．根據(jù)所測得的光密度值，從標準曲線查得每毫升的含菌數(shù)。

（五）實驗報告

l．結(jié)果

每毫升樣品原液菌數(shù)=從標準曲線查得每毫升的菌數(shù)×稀釋倍數(shù)

2．思考題

(1)光電比濁計數(shù)的原理是什么?這種計數(shù)法有何優(yōu)缺點?

(2)光電比濁計數(shù)在生產(chǎn)實踐中有何應(yīng)用價值?

(3)本實驗為什么采用560nm波長測定酵母菌懸液的光密度?如果你在實驗中需要測定大腸桿菌生長的OD值，你將如何選擇波長?

四 大腸桿菌生長曲線的測定

(一)目的要求

1．通過細菌數(shù)量的測量了解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長線。

2．復(fù)習(xí)光電比濁法測量細菌數(shù)量的方法。

(二)基本原理

大多數(shù)細菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時期的大腸桿菌細胞每20min分裂一次。將一定量的細菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細胞要經(jīng)歷延遲期，對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以細菌數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標作圖所繪制的曲線稱為該細菌的生長曲線。不同的細菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長曲線不同，同樣的細菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長曲線也不相同。測定細菌的生長曲線，了解其生長繁殖規(guī)律，這對人們根據(jù)不同的需要，有效地利用和控制細菌的生長具有重要意義。

用于測定細菌細胞數(shù)量的方法已在上述實驗作了介紹。本實驗用分光光度計(spectrophotometer)進行光電比濁測定不同培養(yǎng)時間細菌懸浮液的OD值，繪制生長曲線。也可以直接用試管或帶有測定管的三角瓶(圖15-5)測定“klett units”值的光度計。如圖15—6所示，只要接種1支試管或1個帶測定管的三角瓶，在不同的培養(yǎng)時間(橫坐標)取樣測定，以測得的klett units為縱坐標，便可很方便地繪制出細菌的生長曲線。如果需要，可根據(jù)公式1 klett units=OD/0.002換算出所測菌懸液的OD值。

圖15—5 帶側(cè)臂試管的三角燒瓶

(三)器材

1．菌種 大腸桿菌

2．培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩余60ml裝入250ml的三角瓶。

3．儀器或其他用具 722型分光光度計，水浴振蕩搖床，無菌試管，無菌吸管等。

圖15—6 直接用試管測OD值

(四)操作步驟

1．標記

取11支無菌大試管，用記號筆分別標明培養(yǎng)時間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接種

分別用5ml無菌吸管吸取2.5ml大腸桿菌過夜培養(yǎng)液(培養(yǎng)10~12h)轉(zhuǎn)入盛有50ml LB液的三角瓶內(nèi)，混合均勻后分別取5ml混合液放入上述標記的11支無菌大試管中。

3．培養(yǎng)

將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(yǎng)(振蕩頻率250r/min)，分別培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，將標有相應(yīng)時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測定其光密度值。

4．比濁測定

用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對照，選用600nm波長進行光電比濁測定。從早取出的培養(yǎng)液開始依次測定，對細胞密度大的培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基適當稀釋后測定，使其光密度值在0.1~0.65之內(nèi)(測定OD值前，將待測定的培養(yǎng)液振蕩，使細胞均勻分布)。

本操作步驟也可用簡便的方法代替：

1．用1ml無菌吸管取0.25ml大腸桿菌過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入盛有3~5ml LB液的試管中、混勻后將試管直接插入分光光度計的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個大的暗環(huán)境，另以1支盛有LB液但沒有接種的試管調(diào)零點，測定樣品中培養(yǎng)0h的OD值。測定完畢后，取出試管置37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。

2．分別在培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培養(yǎng)物試管按上述方法測定OD值。該方法準確度高、操作簡便。但須注意的是使用的2支試管要很干凈，其透光程度愈接近，測定的準確度愈高。

(五)實驗報告

1．結(jié)果

(1)將測定的OD600值填入下表：

培養(yǎng)時間對照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20

光密度值OD600

(2)繪制大腸桿菌的生長曲線。

2．思考題

(1)如果用活菌計數(shù)法制作生長曲線，你認為會有什么不同？兩者各有什么優(yōu)缺點？

(2)細菌生長繁殖所經(jīng)歷的四個時期中，哪個時期其代時最短？若細胞密度為103/ml，培養(yǎng)4.5h后，其密度高達2×108/ml，計計算出其代時。

(3)次生代謝產(chǎn)物的大量積累在哪個時期？根據(jù)細菌生長繁殖的規(guī)律，采用哪些措施可使次生代謝產(chǎn)物積累更多？

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第三篇：微生物學(xué)實驗總結(jié)

1.抗“O”試驗（ASO test）：鏈球菌侵入體內(nèi)產(chǎn)生SLO，刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)抗體ASO，當兩者中和后，再加入SLO 乳膠試劑，因病人血清中ASO量很多，未被中和掉的抗體與乳膠試劑反應(yīng)，產(chǎn)生清晰凝集，為陽性；無凝集，為陰性。

原理：中和試驗

方法：間接凝集

結(jié)果：效價大于400單位為陽性

意義：鏈球菌感染指標或風濕熱及其活動性的輔助診斷

2.肥達試驗Widal test

原理：用已知傷寒沙門菌O、H抗原，以及引起副傷寒的甲型副傷寒沙門菌、肖氏沙門菌和希氏沙門菌H抗原的診斷菌液與受檢血清作定量凝集試驗，測定受檢血清中有無相應(yīng)抗體及其效價的試驗。

用途：輔助診斷傷寒，副傷寒

結(jié)果：考慮正常人群抗體水平

動態(tài)觀察：恢復(fù)期效價增加≥4倍

OIgM,出現(xiàn)早，維持時間短，特異性差

HIgG,出現(xiàn)遲，維持時間長，特異性強

O高H高腸熱癥可能性大

O低H低排除

O高H低早期或有交叉反應(yīng)的其它沙門菌感染

O低H高預(yù)防接種或曾患過傷寒

3.抗酸染色法(acid-fast stain)：以5％石炭酸復(fù)紅加溫染色，再用3％鹽酸酒精脫色，然后用美藍復(fù)染，則分枝桿菌呈紅色(+)，其他細菌和背景物質(zhì)為藍色(-)。

4.結(jié)核菌素試驗定義：是應(yīng)用結(jié)核菌素進行皮膚試驗來測定機體對結(jié)核分枝桿菌是否能引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)（Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)）的一種試驗

材料：舊結(jié)核菌素、純蛋白衍生物(PPD)

方法：前臂皮內(nèi)注射PPD5單位

結(jié)果：注射后72h，紅腫硬節(jié)≤5mm陰性→未感染；＞ 5mm 陽性→已感染（接種BCG等）≥ 15mm 強陽性→活動性感染

假陰性：感染初期、嚴重結(jié)核病患者、細胞免疫功能降低（麻疹、AIDS、腫瘤、免疫抑制劑)應(yīng)用：①選擇卡介苗接種對象和測定卡介苗接種后的免疫效果。結(jié)核菌素試驗陰性者應(yīng)接種或補種卡介苗

②作為嬰幼兒(尚未接種過卡介苗者)結(jié)核病的輔助診斷

③在未接種卡介苗的人群中作結(jié)核桿菌感染的流行病學(xué)調(diào)查,了解人群自然感染率④測定腫瘤患者的細胞免疫功能

5.外斐反應(yīng)：變形桿菌代替相應(yīng)的立克次體抗原進行非特異性凝集反應(yīng)，檢測人類或動物血清中有無相應(yīng)的抗體

本質(zhì)：交叉凝集試驗，立克次體病的輔助診斷

6.革蘭染色法：制片→涂片→干燥→固定→染色

初染（結(jié)晶紫1min）→媒染（碘液1min）→（95%酒精 30sec）→復(fù)染（稀釋復(fù)紅30sec）→印干→油鏡鏡檢

第四篇：微生物學(xué)實驗考試題

《微生物學(xué)實驗》試題

1、在進行高壓蒸汽滅菌時，是否只要滅菌鍋壓力表到達所需的值時鍋內(nèi)就能獲得所需的滅菌溫度？為什么？

2、在手提式高壓滅菌鍋的蓋上有哪些部件？它們各起什么作用？

3、高壓蒸汽滅菌鍋的操作有哪幾個步驟？每一步驟應(yīng)注意哪些問題？

4、在微生物學(xué)實驗中，常用于配制固體培養(yǎng)基的凝固劑是什么？它有哪些特性？如何使用？

5、環(huán)境樣品梯度稀釋、涂布平板法分離微生物時，如何選擇不同稀釋梯度樣品的涂布順序？為什么？

6、在革蘭氏染色實驗中，為什么會出現(xiàn)假陽性和假陰性？如何避免？

7、在革蘭氏染色實驗中，不經(jīng)復(fù)染這一步，能否區(qū)別革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌？為什么？

8、為何用計數(shù)板可以計得樣品中的總菌值？如何計算樣品中的菌體濃度？

9、血球計數(shù)板計數(shù)時，計數(shù)室內(nèi)如有氣泡會對結(jié)果產(chǎn)生怎樣的影響？如何避免產(chǎn)生氣泡？

10、試分析血球計數(shù)板計數(shù)法的誤差來源，并提出減少誤差的方法和措施。

要求把題目和答案寫在實驗報告紙上，統(tǒng)一收齊后和第一次實驗報告一起送到我辦公室-生科樓104。

第五篇：微生物學(xué)實驗考核辦法

本科微生物學(xué)實驗考核辦法

考核方式：按學(xué)號順序逐一進場應(yīng)考?？己藘?nèi)容共8項，每位同學(xué)通過抽簽考其中的一項內(nèi)容。考核時間：每人限6分鐘內(nèi)完成。

考核地點：微免實驗課上課的實驗室

考核內(nèi)容及要求如下：

1、顯微鏡（油鏡）的使用和保護方法

（1）、提供一張細菌玻片標本，要求能正確使用油鏡觀察到細菌的基本形態(tài)。

（2）、掌握顯微鏡（油鏡）保護方法

2、血清對倍稀釋法

（1）、用生理鹽水將血清進行對倍稀釋，終濃度達到1/ 2、1/ 4、1 /8三個稀釋度。

（2）、掌握血清對倍稀釋的原理及方法，能正確使用刻度吸管。

3、玻片凝集試驗

（1）、要求用傷寒診斷血清，采用玻片凝集試驗的方法檢測待檢細菌是否為傷寒桿菌。

（2）、要求操作方法、步驟正確，能準確判斷結(jié)果。

（3）、無菌操作正確。

4、革蘭氏染色法

（1）、口試回答細菌涂片的制作方法

（2）、將一張已涂好的細菌玻片進行革蘭氏染色

（3）、要求染色步驟及各項染色時間正確，操作熟練。

5、細菌的劃線分離培養(yǎng)技術(shù)

（1）、將細菌分區(qū)劃線到普通瓊脂平碟上。

（2）、要求劃線分區(qū)正確，接種劃線手法正確、熟練。

（3）、無菌操作正確。

6、液體和半固體培養(yǎng)基的細菌接種方法（無菌操作）

（1）、將菌種接種到液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基內(nèi)。

（2）、要求各環(huán)節(jié)無菌操作正確。

7、細菌在培養(yǎng)基中生長情況及細菌特殊結(jié)構(gòu)觀察

（1）、正確描述固體培養(yǎng)基的菌落、菌苔。

（2）、正確描述液體培養(yǎng)基中的細菌生長情況。

（3）、正確觀察出鏡下細菌的特殊結(jié)構(gòu)。

8、抗酸染色法

（1）、正確回答抗酸染色的各個步驟（包括用加熱法或不加熱法 初染的時間）。

（2）、操作技術(shù)手法正確熟練

（3）、脫色程度控制較好。

注：經(jīng)一次考核不及格者，可在全班同學(xué)考核結(jié)束后，允許補考一次。補考成績通過后只計及格。