附件10

食用油中苯并（a）芘的快速檢測

膠體金免疫層析法

(KJ201910)

范圍

本方法規(guī)定了食用油中苯并（a）芘的膠體金免疫層析快速檢測方法。

本方法適用于食用油中苯并（a）芘的快速測定。

原理

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的苯并（a）芘經(jīng)提取后與膠體金標記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條或檢測卡中檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中苯并（a）芘進行定性判定。

試劑和材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T

6682規(guī)定的二級水。

3.1

試劑

3.1.1

正己烷：色譜純。

3.1.2

乙腈：色譜純。

3.1.3

二甲基亞砜（DMSO）。

3.1.4

NaH2PO4?2H2O。

3.1.5

Na2HPO4?12H2O。

3.1.6

氯化鈉。

3.1.7

吐溫-20。

3.1.8

氫氧化鈉溶液（2

mol/L）：稱取80g氫氧化鈉用水溶解，并定容至1L。

3.1.9

PBST溶液：稱取0.2965

g

NaH2PO4?2H2O、2.9

g

Na2HPO4?12H2O、8.76

g氯化鈉與0.55

g吐溫-20用水溶解并定容至1

L。

3.2

參考物質(zhì)

苯并（a）芘參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量見表1，純度均≥95%。

表1

苯并（a）芘參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質(zhì)量

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號

分子式

相對分子質(zhì)量

苯并（a）芘

Benzo(a)pyrene

50-32-8

C20H12

252.32

注：或等同可溯源物質(zhì)。

3.3

標準溶液的配制

苯并（a）芘標準儲備液（0.1?mg/mL）：精密稱取適量苯并（a）芘標準品（3.2），置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.1?mg/mL的苯并（a）芘標準儲備液；或可直接購買苯并（a）芘標準儲備液。0

℃~5

℃避光保存?zhèn)溆茫行?年。

3.4

材料

苯并（a）芘膠體金免疫層析試劑盒，適用基質(zhì)為食用油。

3.4.1金標微孔（含膠體金標記的特異性抗體）。

3.4.2

試紙條或檢測卡。

儀器和設(shè)備

4.1

移液器：100

μL、1

mL、5

mL和10

mL。

4.2

渦旋混合器。

4.3

離心機：轉(zhuǎn)速≥4000

r/min。

4.4

電子天平：感量為0.01

g。

4.5

氮吹儀或空氣吹干儀（帶溫度控制）。

分析步驟

5.1

試樣制備

取適量有代表性樣品充分混勻。

5.2

試樣提取和凈化除脂

稱取10

g油樣于離心管中，加入5

mL

正己烷（3.1.1）和15

mL

DMSO（3.1.3）并混合均勻。漩渦振蕩2min，然后4000

r/min離心2

min。棄去上層正己烷層。加入5

mL

正己烷（3.1.1），漩渦振蕩30

s，然后4000

r/min離心30

s。棄去上層正己烷層。加入10

mL

氫氧化鈉溶液（2

mol/L）（3.1.8）和15

mL正己烷（3.1.1），漩渦振蕩30s，然后4000

r/min離心30

s。吸取上層正己烷層于15

mL離心管，4000

r/min離心2

min。取全部正己烷層于氮吹管中，50℃氮吹或空氣吹10

min，吹干后加入200μL

DMSO（3.1.3）復(fù)溶，混合均勻，此為待測液。

5.3

測定步驟

打開試紙筒，取出所需數(shù)量的紅色反應(yīng)微孔（取出微孔后，立即蓋好桶蓋，以防受潮）。往微孔中加入200

μL的PBST溶液，再加入50

μL待測液，上下抽吸5~10次至微孔試劑混合均勻，室溫（20℃~25℃）反應(yīng)7

min。將已做好標記的試紙條插入至上述紅色微孔中，使樣品墊充分進

入樣品中，并計時7

min。從微孔中取出試紙條，棄去試紙條下端的樣品墊，進行結(jié)果判定。

5.4

質(zhì)控試驗

每批樣品應(yīng)同時進行空白試驗和加標質(zhì)控試驗。

5.4.1

空白試驗

稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

5.4.2

加標質(zhì)控試驗

準確稱取空白試樣（精確至0.01

g）置于玻璃試劑瓶中，加入一定體積的苯并（a）芘標準儲備液（0.1

mg/mL）（3.3.1），使試樣中苯并（a）芘濃度為10

μg/kg，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

結(jié)果判定方式

由于長時間放置會引起質(zhì)控線（C線）與檢測線（T線）顏色的變化，需在規(guī)定時間內(nèi)進行結(jié)果判定。試紙條與檢測卡如圖1所示。結(jié)果判定也可根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。

6.1

讀數(shù)儀測定結(jié)果

通過讀數(shù)儀對結(jié)果進行判讀，根據(jù)不同廠家儀器規(guī)定進行判讀。

無效：質(zhì)控線（C線）不顯色，無論檢測線（T線）是否顯色，均表示實驗結(jié)果無效。

陽性：若檢測結(jié)果顯示“+”（陽性），表示試樣中含有待測組分且其含量大于等于方法檢出限。

陰性：若檢測結(jié)果顯示“-”（陰性），表示試樣中不含待測組分或其含量低于方法檢出限。

6.2

目視判定

通過對比質(zhì)控線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進行結(jié)果判定。

無效：質(zhì)控線（C線）不顯色，無論檢測線（T線）是否顯色，均表示實驗結(jié)果無效。

陽性：質(zhì)控線（C線）顯色，若檢測線（T線）不出現(xiàn)或出現(xiàn)但顏色淺于質(zhì)控線（C線），表示試樣中含有待測組分且其含量高于方法檢出限，判為陽性。

陰性：質(zhì)控線（C線）顯色，若檢測線（T線）顏色深于或等于質(zhì)控線（C線），表示試樣中不含待測組分或其含量低于方法檢出限，判為陰性。

6.3

質(zhì)控實驗要求

空白試驗測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標質(zhì)控試驗測定結(jié)果應(yīng)為陽性。

C

T

S

C

S

T

C

T

S

C

T

S

C

T

S

C

T

S

加樣孔

無效

陰性

陽性

B．檢測卡

吸水紙

NC膜

樣品墊

無效

陰性

陽性

C線

T線

A．試紙條

圖1目視判定示意圖

結(jié)論

當檢測結(jié)果為陽性時，應(yīng)對結(jié)果進行確證。

性能指標

8.1

檢測限

10μg/kg。

8.2

靈敏度

≥95%。

8.3

特異性

≥85%。

8.4

假陰性率

≤5%。

8.5

假陽性率

≤15%。

注：性能指標計算方法參見附錄A。

其他

本方法分析步驟和結(jié)果判定可以根據(jù)廠家試劑盒的說明書進行，但應(yīng)符合或優(yōu)于本方法規(guī)定的性能指標。

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項性能指標。

本方法參比標準為GB

5009.27-2016《食品安全國家標準

食品中苯并（a）芘的測定》。

本方法使用試劑盒可能與苯并（a）蒽、苯并（b）熒蒽、苯并（e）芘、苯并（j）熒蒽等物質(zhì)存在交叉反應(yīng)，當結(jié)果判定為陽性時應(yīng)對結(jié)果進行確證。

附錄A

定性方法性能計算表

表A.1性能指標計算方法

樣品情況a

檢測結(jié)果b

總數(shù)

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數(shù)

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異（χ2）

χ2=（|N12-N21|-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對準確度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a由參比方法檢驗得到的結(jié)果或者樣品中實際的公議值結(jié)果。

b由待確認方法檢驗得到的結(jié)果。靈敏度的計算使用確認后的結(jié)果。

N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測結(jié)果相對準確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。

本方法負責起草單位：廣東省食品檢驗所。

驗證單位：成都市食品藥品檢驗研究院、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所。

本方法主要起草人：熊含鴻、王立亞、簡德威、陳思敏、雷毅