附件13

食品中玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)

膠體金免疫層析法

(KJ201913)

1.范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中玉米赤霉烯酮快速檢測(cè)膠體金免疫層析法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用玉米、小麥及其碾磨加工品中玉米赤霉烯酮快速篩選測(cè)定。

第一法

比色法

2.原理

本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條中檢測(cè)線（T線）上的抗原結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化。通過檢測(cè)線（T線）與控制線（C線）顏色深淺的比較，對(duì)樣品中玉米赤霉烯酮進(jìn)行結(jié)果判定。

3.試劑及材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為GB/T

6682規(guī)定的二級(jí)水。

3.1.試劑

3.1.1.乙腈。

3.1.2.甲醇+水（7+3，體積比）。

3.1.3.稀釋緩沖液（膠體金免疫層析檢測(cè)試劑盒專用提取液或根據(jù)產(chǎn)品使用說明書配置）。

3.2.參考物質(zhì)

玉米赤霉烯酮的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見表1，純度≥95%。

表1

玉米赤霉烯酮參考物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號(hào)

分子式

相對(duì)分子量

玉米赤霉烯酮

Zearalenone

17924-92-4

C18H22O5

318.36

注：或等同可溯源物質(zhì)。

3.3.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

3.3.1.標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈（3.1.1）溶解，配制成濃度為100

μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。﹣18

℃避光保存，有效期6個(gè)月。

3.3.2.標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100

μg/mL）（3.3.1）100

μL，置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1

μ稀/mL的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液，2

℃～8

℃避光保存，有效期1個(gè)月。

3.4.材料

玉米赤霉烯酮膠體金免疫層析試劑盒，適用基質(zhì)為玉米、小麥及其碾磨加工品。

4.儀器和設(shè)備

4.1.移液器：100

μL、200

μL、1

mL和5

mL。

4.2.旋渦混合器。

4.3.離心機(jī)。

4.4.電子天平：感量為0.01

g。

5.環(huán)境條件

環(huán)境溫度：20

℃～30

℃。

空氣相對(duì)濕度：最佳測(cè)定濕度45

%～65

%。若濕度低于45

%，相應(yīng)延長(zhǎng)待測(cè)液-試紙條反應(yīng)時(shí)間，以質(zhì)控實(shí)驗(yàn)為準(zhǔn)；若濕度為65

%～80

%，微孔與試紙條拆開后立即使用，避免微孔與試紙條長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中受潮；避免在濕度80

%以上濕度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

6.分析步驟

6.1.試樣制備

按GB

5491扦取的樣品充分碾磨或粉碎混勻，過40目篩。

6.2.提取

準(zhǔn)確稱取試樣5.0

g（精確至0.01

g）于50

mL離心管中，加入20

mL

甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3

min，離心分層或靜置分層，上清液備用。

準(zhǔn)確移取0.8

mL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5

mL離心管中，加入25

μL上清液，混勻，待檢。

6.3.測(cè)定步驟

依檢驗(yàn)所需，取相應(yīng)數(shù)量的金標(biāo)微孔和試紙條，做好標(biāo)記。吸取待檢液200

μL于金標(biāo)微孔中，抽吸至孔底的紫紅色顆粒完全溶解，孵育10

min。將試紙條插入金標(biāo)微孔中，反應(yīng)3

min～5

min。

從金標(biāo)微孔中取出試紙條，棄去試紙條下端的樣品墊，觀察顯色情況，進(jìn)行結(jié)果判定。（若試劑盒冷藏保存，使用前需恢復(fù)至實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度。）

7.質(zhì)控試驗(yàn)

每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和陽性質(zhì)控試驗(yàn)，可根據(jù)檢測(cè)樣品量制定適宜頻次的質(zhì)控試驗(yàn)。

7.1.空白試驗(yàn)

7.1.1.試劑空白試驗(yàn)：除不稱取試樣外，均按6.2和6.3所述步驟操作。

7.1.2.基質(zhì)空白試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取空白試樣，按6.2和6.3所述步驟操作。

7.2.陽性質(zhì)控試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取玉米赤霉烯酮含量為60

μg/kg的質(zhì)控樣，按6.2和6.3步驟操作。或準(zhǔn)確稱取空白試樣，加入一定體積的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量為60

μg/kg，按6.2和6.3步驟操作。

8.結(jié)果判定

通過對(duì)比控制C線和檢測(cè)T線的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。

8.1.無效結(jié)果

無論樣品中有無玉米赤霉烯酮存在，控制C線均會(huì)出現(xiàn)一條紫紅色條帶。若C線未顯色，表明操作不正確或試紙條已失效，檢測(cè)結(jié)果無效（見圖1）。

無效

圖1

試紙條目視判定圖

8.2.陽性結(jié)果

控制C線顯色，檢測(cè)T線顯色比C線淺或者沒有顏色，判定為陽性（見圖2）。

8.3.陰性結(jié)果

控制C線顯色，檢測(cè)T線顯色比C線深或者一致，判定為陰性（見圖2）。

比色法

圖2

試紙條目視判定圖

8.4.質(zhì)控試驗(yàn)要求

空白試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陰性，陽性質(zhì)控試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為陽性。

第二法

消線法

9.原理

本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中的玉米赤霉烯酮經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條中檢測(cè)線（T線）上的抗原結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測(cè)線顏色深淺的變化。通過T線顯色與否進(jìn)行結(jié)果判定。

10.試劑及材料

同3。

11.儀器和設(shè)備

同4。

12.環(huán)境條件

環(huán)境溫度：10

℃～40

℃。

空氣相對(duì)濕度：同5。

13.分析步驟

13.1.試樣制備

同6.1。

13.2.提取

準(zhǔn)確稱取試樣5.0

g（精確至0.01

g）于50

mL離心管中，加入12.5

mL甲醇+水溶液（3.1.2），用旋渦混合器振蕩3

min，離心分層或靜置分層，上清液備用。

準(zhǔn)確移取400

μL稀釋緩沖液（3.1.3）于1.5

mL離心管中，加入上清液(小麥50

μL，玉米80

μL），混勻，待測(cè)。

13.3.測(cè)定步驟

同6.3。

14.質(zhì)控試驗(yàn)

每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和陽性質(zhì)控試驗(yàn)，可根據(jù)檢測(cè)樣品量制定適宜頻次的質(zhì)控試驗(yàn)。

14.1.空白試驗(yàn)

14.1.1.試劑空白試驗(yàn)：除不稱取試樣外，均按13.2和13.3所述步驟操作。

14.1.2.基質(zhì)空白試驗(yàn)：準(zhǔn)確稱取空白試樣，按13.2和13.3所述步驟操作。

14.2.陽性質(zhì)控試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取玉米赤霉烯酮含量為60

μg/kg的質(zhì)控樣，按13.2和13.3步驟操作?；驕?zhǔn)確稱取空白試樣，加入一定體積的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.2），使玉米赤霉烯酮添加量為60

μg/kg，按13.2和13.3步驟操作。

15.結(jié)果判定

通過觀察檢測(cè)T線顯色與否進(jìn)行結(jié)果判定。

15.1.無效

同8.1

15.2.陽性結(jié)果

控制C線顯色，檢測(cè)T線不顯色，判定為陽性（見圖3）。

15.3.陰性結(jié)果

控制C線顯色，檢測(cè)T線顯色，判定為陰性（見圖3）。

消線法

圖3

試紙條目視判定圖

16.質(zhì)控試驗(yàn)要求

同8.4

第三法

讀數(shù)儀法

17.具體檢測(cè)步驟及結(jié)果判定可參考相應(yīng)的說明書操作，質(zhì)控試驗(yàn)參照第一法與第二法。

18.結(jié)論

本方法篩查出的陽性樣品進(jìn)行確認(rèn)時(shí)，應(yīng)按GB

2761指定方法標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)并判定。

19.性能指標(biāo)

19.1.檢出限

μg/kg。

19.2.靈敏度

靈敏度≥95%。

19.3.特異性

特異性≥90%。

19.4.假陰性

假陰性≤5%。

19.5.假陽性

假陽性≤10%。

注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄A。

20.其他

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為了方便方法使用者，在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對(duì)其進(jìn)行考察，滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)時(shí)方可使用。

本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為GB

5009.209-2016

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定。

附錄A

快速檢測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算表

樣品情況a

檢測(cè)結(jié)果b

總數(shù)

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數(shù)

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異（c2）

c2=（?N12-N21?-1）2/（N12+N21），自由度（df）=1

靈敏度（p+，%）

p+=N11/N1.特異性（p-，%）

p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）

pf-=N12/N1.=100-靈敏度

假陽性率（pf+，%）

pf+=N21/N2.=100-特異性

相對(duì)準(zhǔn)確度，%c

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：

a樣品中實(shí)際的公議值結(jié)果；

b由玉米赤霉烯酮膠體金試紙條檢驗(yàn)方法得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。

N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

C為方法的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測(cè)趨勢(shì)情況綜合評(píng)價(jià)。

本方法起草單位：成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院。

本方法參與單位：江南大學(xué)、國(guó)家糧食局科學(xué)研究院、廣東省食品檢驗(yàn)所、山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院。

本方法主要起草人：肖全偉、姚蕾珺、王昕、張敏、胥傳來、田洪蕓、沈泓、周露