附件5

水產(chǎn)品中氯霉素的快速檢測

膠體金免疫層析法

（KJ201905）

范圍

本方法規(guī)定了水產(chǎn)品中氯霉素的膠體金免疫層析快速檢測方法。

本方法適用于水產(chǎn)品中氯霉素的快速測定。

原理

本方法的測定以競爭抑制免疫層析原理為基礎(chǔ)。樣品中的氯霉素經(jīng)有機(jī)試劑提取，固相萃取小柱凈化，濃縮復(fù)溶后，氯霉素與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體和微孔膜檢測線（T線）上抗原的結(jié)合，從而導(dǎo)致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線顏色深淺比較，對樣品中氯霉素含量進(jìn)行定性判定。

試劑和材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為

GB/T

6682

規(guī)定的二級(jí)水。

3.1

試劑

3.1.1

正己烷。

3.1.2

丙酮。

3.1.3

乙酸乙酯。

3.1.4乙腈

3.1.5磷酸二氫鈉，NaH2PO4·2H2O。

3.1.6磷酸氫二鈉，Na2HPO4·12H2O。

3.1.7

氯化鈉

3.1.8

復(fù)溶液：稱取0.12

g磷酸二氫鈉

(3.1.5)置于100

mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成溶液A；稱取磷酸氫二鈉7.16

g

(3.1.6)置于100

mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，制成溶液B。取溶液A

2.8

mL、溶液B

7.2

mL、氯化鈉(3.1.7)0.85

g，用水溶解并稀釋至100

mL，得磷酸鹽緩沖液，即為復(fù)溶液。

3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按體積比1：9混勻。

3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按體積比6：4混勻。

3.2

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分之式、相對分子質(zhì)量見表1，純度≥98.6%。

表1

氯霉素參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對分子質(zhì)量

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號(hào)

分子式

相對分子量

氯霉素

Chloramphenicol

56-75-7

C11H12Cl2N2O5

323.13

注：或等同可溯源物質(zhì)。

3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

3.3.1

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1

mg/mL）：精密稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（3.2）10

mg，置于10

mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1

mg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。4℃避光保存，有效期6個(gè)月。

3.3.2

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液A（10

μg/mL）：精密量取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1

mg/mL）（3.3.1）0.1

mL，置于10

mL

容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀釋至刻度，搖勻，制成10

μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液A。4℃避光保存，有效期3個(gè)月。

3.3.3

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.01

μg/mL）：精密移取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間液A（10

μg/mL）（3.3.2）0.01

mL分別置于10

mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.01

μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液。臨用新配。

3.4材料

3.4.1固相萃取小柱：Cleanert

Silica，200

mg/6mL。LOT：0170198。

3.4.2免疫膠體金試劑盒（在2～30℃、干燥陰涼條件下保存，在產(chǎn)品有效期內(nèi)使用）。

3.4.2.1

金標(biāo)微孔。

3.4.2.2

試紙條或檢測卡。

儀器和設(shè)備

4.1

移液器：200

μL、1

mL和5

mL。

4.2

渦旋混合器。

4.3

離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000

r/min。

4.4

電子天平：感量分別為

0.01

mg和

0.01

g。

4.5

樣品濃縮儀：如有需要。

4.6

環(huán)境條件：

溫度：15～25℃，相對濕度：≤60%。

5分析步驟

5.1試樣制備

取具有代表性樣品約500

g，充分粉碎混勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為試樣和留樣，密封，標(biāo)記，于常溫保存。

5.2試樣提取和凈化

準(zhǔn)確稱取試樣6

g（精確至0.01

g）置于50

mL具塞離心管中，依次加入1

mL水和8

mL乙酸乙酯（3.1.3），渦旋提取5

min，以4000

r/min離心5

min。轉(zhuǎn)移全部乙酸乙酯層于50

mL具塞離心管中，加入正己烷25

mL，氯化鈉1

g渦旋混勻，4000

r/min

離心1

min，上清液待凈化。5

mL丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅膠小柱，棄去淋洗液，將待凈化溶液轉(zhuǎn)移到固相萃取小柱上，棄去流出液，用5

mL丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脫，收集洗脫液，洗脫液于40℃氮?dú)獯蹈?，精密加?00

μL復(fù)溶液（3.1.8），渦旋混合1

min，作為待測液。

5.3

測定步驟

5.3.1

檢測卡與金標(biāo)微孔測定步驟

吸取150

μL樣品待測液于反應(yīng)微孔（3.4.2.1）中，抽吸

5～10次使混合均勻，室溫溫育3

min；溫育結(jié)束后，將金標(biāo)微孔中溶液滴加到檢測卡（3.4.2.2）上的加樣孔中，室溫溫育5～8

min，對結(jié)果進(jìn)行判定。

5.3.2

試紙條與金標(biāo)微孔測定步驟

吸取150

μL樣品待測液于反應(yīng)微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均勻，室溫溫育3

min；溫育結(jié)束后，將檢測試紙條（3.4.2.2）吸水海綿端垂直向下插入反應(yīng)微孔中，室溫溫育3

min，從微孔中取出試紙條，去掉試紙條下端的吸水海綿，并于5

min內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判定。

5.3.3

檢測卡測定步驟

吸取150

μL樣品待測液滴加到檢測卡（3.4.2.2）上的加樣孔中，室溫溫育5～8

min，對結(jié)果進(jìn)行判定。

5.4質(zhì)控試驗(yàn)

每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)。

5.4.1

空白試驗(yàn)

稱取空白試樣，按照5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

5.4.2

加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取空白樣品6

g或適量（精確至0.01

g）置于15

mL具塞離心管中，加入180

μL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.01

μg/mL）（3.3.3），使氯霉素濃度為0.3

μg/kg，一式2份，按照

5.2和5.3步驟與樣品同法操作。

結(jié)果判定要求

通過對比控制線和檢測線的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定。由于長時(shí)間放置會(huì)引起檢測線顏色的變化，需在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判定。目視結(jié)果判讀依據(jù)如圖1所示。

6.1

無效

控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條/檢測卡無效。

6.2

陽性結(jié)果

檢測線（T線）不顯色或檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺，表明樣品中氯霉素含量高于方法檢測限，判定為陽性。

6.3

陰性結(jié)果

檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或者檢測線（T線）顏色與控制線（C線）顏色相當(dāng)，表明樣品中氯霉素含量低于方法檢測限，判定為陰性。

6.4質(zhì)量控制要求

空白試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陰性，加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測定結(jié)果應(yīng)為陽性。

結(jié)論

如被測樣品中氯霉素檢測結(jié)果為陽性時(shí)，應(yīng)采用確證方法進(jìn)行確證檢測。

性能指標(biāo)

8.1

檢測限

氯霉素為0.1

μg/kg。

8.2

靈敏度

靈敏度應(yīng)≥98%。

8.3

特異性

特異性應(yīng)≥90%。

8.4

假陰性率

假陰性率應(yīng)≤1%。

8.5

假陽性率

假陽性率應(yīng)≤10%。

注：性能指標(biāo)計(jì)算方法見附錄A

9其他

本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時(shí)不做限定。方法使用者在使用替代試劑、試劑盒或操作步驟前，須對其進(jìn)行考察，應(yīng)滿足本方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)。

本方法參比標(biāo)準(zhǔn)為GB/T

22338-2008

動(dòng)物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定

(包括所有修改單)。

附錄

A

定性方法性能計(jì)算表

樣品情況a

檢驗(yàn)結(jié)果b

總數(shù)

陽性

陰性

陽性

N11

N12

N1.=N11+N12

陰性

N21

N22

N2.=N21+N22

總數(shù)

N.1=N11+N21

N.2=N12+N22

N=N1.+N2.或N.1+N.2

顯著性差異(χ2)

χ2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1

靈敏度（p+）

p+=N11/N1.特異性（p-）

p-=N22/N2.假陰性率(pf-)

pf-=N12/N1.=1-靈敏度

假陽性率(pf+)

pf+=N21/N2.=1-特異性

相對準(zhǔn)確度

（N11+N22）/(N1.+N2.)

注：N:任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個(gè)下標(biāo)指行，第二個(gè)下標(biāo)指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。

a由基準(zhǔn)方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果；

b由本方法檢驗(yàn)得到的結(jié)果。靈敏度的計(jì)算使用確認(rèn)后的結(jié)果。

本方法負(fù)責(zé)起草單位：山西省食品藥品檢驗(yàn)所。

驗(yàn)證單位：陜西省食品藥品檢驗(yàn)所、廣東省藥品檢驗(yàn)所、四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院。

主要起草人：李倩、閻安婷、陳煜、楊國偉。